CN108982436A - 一种氧化石墨烯对核酸负载量的分析方法 - Google Patents

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褚茂平
陈永辉
刘畅
林振坤
王洁
王瑶尧
曾静静
金其可
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Abstract

本发明公开了一种氧化石墨烯对核酸负载率的分析方法，包括以下步骤：（1）绘制核酸的荧光信号标准曲线（2）氧化石墨烯淬灭荧光（3）计算氧化石墨烯对核酸的负载率，负载率L为负载的核酸质量与氧化石墨烯质量的比值，计算公式：L=(C1‑C2) V/CGOV×%=(C1‑C2)/ CGO×%=(n1‑n2) M/CGO×%，其中C1和C2分别为负载前后溶液中核酸的质量浓度，CGO为溶液中GO的质量浓度，V为溶液体积，n1和n2分别为负载前后溶液中核酸的摩尔浓度，M为核酸的摩尔质量。本发明的优点是该方法基于氧化石墨烯的荧光淬灭特性，能够快速实现对氧化石墨烯所负载的核酸分子进行定量分析和计算。

Description

一种氧化石墨烯对核酸负载量的分析方法
技术领域
本发明属于生物大分子分析领域，具体是指一种对氧化石墨烯所负载的核酸分子进行定量分析和计算的方法。
背景技术
石墨烯是由碳原子以sp2杂化轨道形成的二维周期性蜂窝状点阵结构。石墨烯是构成其他石墨材料的基本单元，可以构筑零维富勒烯、一维碳纳米管和三维体相石墨。石墨烯的基本结构单元是有机材料中最稳定的苯六元环，因此它是当前最理想的二维纳米材料。石墨烯材料具有许多优异的性能，例如良好的导电和导热性能、超高的机械强度及独特的电学性质。石墨烯及其衍生物已被广泛应用包括材料科学、电子学、能源技术、催化科学等在内的众多领域。
氧化石墨烯（以下简称GO）是当前最为常见的石墨烯衍生物之一，由石墨烯氧化加工而成。GO碳层上富含环氧基、羟基、羧基等官能团，具有水溶性好、表面易于修饰等特性，因而在检测领域具有广泛的应用（参看Guo S et.al, Graphene nanosheet: synthesis,molecular engineering, thin film, hybrids, and energy and analyticalapplications, Chem Soc Rev 2011,40:2644-2672）。
目前氧化石墨烯（GO）已经成为一个通用的检测平台，可应用于核酸、蛋白质、核酸酶、小分子、金属离子等检测。将核酸分子探针与GO相结合是GO应用于检测领域的一个重要途径。例如，郭爽等以肽核酸为分子探针、以GO为检测平台，实现对DNA的荧光传感检测（参看郭爽，基于氧化石墨烯的荧光核酸生物传感器，湖北中医药大学硕士学位论文，2014）；张治红等利用GO可以吸附ssDNA的特性，现实对人源肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞的快速灵敏检测（参看谢琴等，基于氧化石墨烯的核酸适配体荧光传感器用于人肝癌细胞SMMC-7721的高灵敏检测，中国化学会第29届学术年会摘要集—第04分会：纳米生物传感新方法，2014）。
值得关注的是，GO-核酸体系能够顺利应用于检测各类目标物的前提是两者的有效结合，即核酸分子能够成功负载到GO表面。因此，对负载到GO表面的核酸分子进行定量分析十分重要。可采用负载率来表征核酸分子是否成功与GO相结合以及所结合的比例。遗憾的是，目前为止还没有文献报道关于GO对核酸分子负载率的分析和计算方法。
为此，本发明人研发一种快速灵敏的氧化石墨烯对核酸分子负载率的分析方法，以解决现有技术所存在的问题。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种氧化石墨烯对核酸负载率的分析方法，该分析方法基于氧化石墨烯的荧光淬灭特性，能够快速实现对氧化石墨烯所负载的核酸分子进行定量分析和计算。
为实现上述目的，本发明的技术方案是包括以下步骤：
（1）绘制核酸的荧光信号标准曲线，配置依照浓度梯步分布的多种的待测核酸溶液，该待测核酸溶液包括DNA和/或RNA并经荧光基团修饰；采用荧光分光光度计检测荧光信号值，获取待测核酸溶液在各浓度下的标准荧光信号值，并绘制基于浓度坐标的荧光信号标准曲线；
（2）氧化石墨烯淬灭荧光，将待测核酸溶液与已知浓度的氧化石墨烯溶液等体积充分混合得到混合溶液，待核酸负载到氧化石墨烯后，核酸荧光会因氧化石墨烯而发生淬灭，引起混合溶液的荧光值下降，采用荧光分光光度计检测经氧化石墨烯荧光淬灭后的核酸溶液的荧光信号值，利用所述的荧光信号标准曲线计算获得此时溶液中核酸的浓度；
（3）计算氧化石墨烯对核酸的负载率，负载率L为负载的核酸质量与氧化石墨烯质量的比值，计算公式：L= (C1-C2) V/CGOV×%= (C1-C2)/ CGO×%= (n1-n2) M/CGO×%，其中C1和C2分别为负载前后溶液中核酸的质量浓度，CGO为溶液中GO的质量浓度，V为溶液体积，n1和n2分别为负载前后溶液中核酸的摩尔浓度，M为核酸的摩尔质量。
进一步设置是所述的多种浓度的待测核酸溶液的浓度范围为0 - 20 纳摩尔/升。
本发明基于氧化石墨烯的荧光淬灭特性，氧化石墨烯是一种天然的荧光淬灭剂，荧光物质与GO结合后会导致荧光淬灭，使体系的荧光信号减弱（参看Reina G et.al,Promises, facts and challenges for graphene in biomedical applications, Chem Soc Rev 2017,46:4400-4416）。
本发明的有益效果是： 1）利用GO能够淬灭荧光的原理；2）采用原位分析方法，无需对体系中的成分（GO和核酸）进行分离处理；3）操作便捷，计算简单。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1绿色荧光双链RNA的荧光信号标准曲线；
图2本发明实施例1的绿色荧光双链RNA的序列图；
图3红色荧光双链RNA的荧光信号标准曲线；
图4本发明实施例2的红色荧光双链RNA的序列图；
图5绿色荧光单链DNA的荧光信号标准曲线；
图6本发明实施例3的绿色荧光单链DNA的序列图
图7 本发明氧化石墨烯基于淬灭荧光的检测原理图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：分析GO对一种绿色荧光双链RNA负载率的实施例。
该双链RNA的序列参见附图2所示，摩尔质量M为12112 g/mol，荧光修饰基团为FAM，发射波长480 nm，激发波长520 nm。
具体实施过程如下：配置浓度分别为0，2，4，6，8，10，20 nM该核酸的DEPC溶液，采用荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司，型号F96PRO，发射波长480 nm，激发波长520nm）进行检测，获取待测核酸溶液在各浓度下的标准荧光信号值，并绘制标准曲线（图1）。将体积为1.6 mL初始浓度为n1的该核酸的DEPC溶液（用处理过并经高温高压灭菌的超纯水）与GO的DEPC溶液（20 μg/mL）等体积混合于试管中，置于摇床，160转/分钟，反应1h，然后采用荧光分光光度计检测此时溶液中的荧光信号值，利用图1获得此时溶液中该核酸的浓度n2。利用公式(n1-n2) M/CGO×%计算负载率，其中M 为该核酸的摩尔质量12112 g/mol，CGO为该方法中所采用的GO浓度20 μg/mL。
我们通过上述方法分别获得了在不同初始浓度n1时GO对该核酸的负载率，如表1所示。
表1. GO对绿色荧光双链RNA负载率的分析结果
实施例2：分析GO对一种红色荧光双链RNA负载率的实施例。
该双链RNA的序列见附图4, 摩尔质量M为12112 g/mol，荧光修饰基团为CY3，发射波长550 nm，激发波长570 nm。
具体实施过程如下：配置浓度分别为0，2，4，6，8，10，20 nM该核酸的DEPC溶液，采用荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司，型号F96PRO，发射波长550 nm，激发波长570nm）进行检测，获取待测核酸溶液在各浓度下的标准荧光信号值，并绘制标准曲线（图2）。将体积为1.6 mL初始浓度为n1的该核酸的DEPC溶液与GO的DEPC溶液（20 μg/mL）等体积混合于试管中，置于摇床，160转/分钟，反应1h，然后采用荧光分光光度计检测此时溶液中的荧光信号值，利用图1获得此时溶液中该核酸的浓度n2。利用公式(n1-n2) M/CGO×%计算负载率，其中M 为该核酸的摩尔质量12112 g/mol，CGO为该方法中所采用的GO浓度20 μg/mL。
我们通过上述方法分别获得了在不同初始浓度n1时GO对该核酸的负载率，如表2所示。
表2. GO对红色荧光双链RNA负载率的分析结果
实施例3：分析GO对一种绿色荧光单链DNA负载率的实施例。
该单链DNA序列见附图6，摩尔质量M为23016 g/mol，荧光修饰基团为FAM（绿色荧光），发射波长480 nm，激发波长520 nm。
具体实施过程如下：配置浓度分别为0，2，4，6，8，10，20 nM该核酸的TE溶液，采用荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司，型号F96PRO，发射波长480 nm，激发波长520 nm）进行检测，获取待测核酸溶液在各浓度下的标准荧光信号值，并绘制标准曲线（图3）。将体积为1.6 mL初始浓度为n1的该核酸的TE溶液与GO的TE溶液（20 μg/mL）等体积混合于试管中，置于摇床，160转/分钟，反应1h，然后采用荧光分光光度计检测此时溶液中的荧光信号值，利用图1获得此时溶液中该核酸的浓度n2。利用公式(n1-n2) M/CGO×%计算负载率，其中M为该核酸的摩尔质量23016 g/mol，CGO为该方法中所采用的GO浓度20 μg/mL。
我们通过上述方法分别获得了在不同初始浓度n1时GO对该核酸的负载率，如表3所示。
表3. GO对绿色荧光单链DNA负载率的分析结果
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (2)

1.一种氧化石墨烯对核酸负载率的分析方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）绘制核酸的荧光信号标准曲线，配置依照浓度梯步分布的多种的待测核酸溶液，该待测核酸溶液包括DNA和/或RNA并经荧光基团修饰；采用荧光分光光度计检测荧光信号值，获取待测核酸溶液在各浓度下的标准荧光信号值，并绘制基于浓度坐标的荧光信号标准曲线；
（2）氧化石墨烯淬灭荧光，将待测核酸溶液与已知浓度的氧化石墨烯溶液等体积充分混合得到混合溶液，待核酸负载到氧化石墨烯后，核酸荧光会因氧化石墨烯而发生淬灭，引起混合溶液的荧光值下降，采用荧光分光光度计检测经氧化石墨烯荧光淬灭后的核酸溶液的荧光信号值，利用所述的荧光信号标准曲线计算获得此时溶液中核酸的浓度；
（3）计算氧化石墨烯对核酸的负载率，负载率L为负载的核酸质量与氧化石墨烯质量的比值，计算公式：L= (C1-C2) V/CGOV×%= (C1-C2)/ CGO×%= (n1-n2) M/CGO×%，其中C1和C2分别为负载前后溶液中核酸的质量浓度，CGO为溶液中GO的质量浓度，V为溶液体积，n1和n2分别为负载前后溶液中核酸的摩尔浓度，M为核酸的摩尔质量。
2.根据权利要求1所述的一种氧化石墨烯对核酸负载率的分析方法，其特征在于：所述的多种浓度的待测核酸溶液的浓度范围为0 - 20 纳摩尔/升。
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