KR20140114714A - Pna 앱타머를 이용한 표적 분자의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA 또는 RNA 기반의 앱타머를 대체할 수 있는 PNA(peptide nucleic acid) 기반의 앱타머, 이의 제조 방법 및 PNA 앱타머를 이용한 표적 분자 검출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 (a) 상기 PNA 앱타머에 그라핀 산화물(Graphene oxide, GO)을 접촉시켜 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 연결시키는 단계; (b) 상기 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물에 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 시료 내의 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는 표적 분자의 검출 방법, 상기 DNA 또는 RNA 기반의 앱타머를 대체할 수 있는 PNA 기반의 앱타머, 이의 제조 방법 및 상기 앱타머를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

PNA 앱타머를 이용한 표적 분자의 검출방법 {Method for Dectecting of Target Molecules Using PNA Aptamers}
본 발명은 DNA 또는 RNA 기반의 앱타머를 대체할 수 있는 PNA(peptide nucleic acid) 기반의 앱타머, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 표적 분자 검출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 (a) 상기 PNA(peptide nucleic acid) 앱타머에, 그라핀 산화물(Graphene oxide, GO)을 접촉시켜 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 연결시키는 단계; (b) 상기 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물에 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 시료 내의 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는 표적 분자의 검출 방법, 상기 DNA 또는 RNA 기반의 앱타머를 대체할 수 있는 PNA 기반의 앱타머, 이의 제조 방법 및 상기 앱타머를 포함하는 키트에 관한 것이다.
앱타머(aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서, 금속이온, 단백질, 세포 등의 표적 분자에 높은 친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일 가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)을 말한다. 앱타머는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득한다. 올리고뉴클레오타이드 기반의 앱타머는 단백질 기반의 항체에 비해 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 앱타머의 수득은 생체 외(in vitro)에서 이루어지며, 둘째, 독소(toxin)를 비롯한 다양한 유기물과 무기물들이 앱타머의 표적 분자로 이용될 수 있으며, 셋째, 일단 표적 분자에 특이적으로 결합하는 특정 앱타머가 확인되어 수득되면 자동화된 올리고머 합성 방법에 의해 낮은 비용과 높은 일관성(batchconsistency)으로 재생산이 가능하다는 것이다.
화학적 항체(chemical antibody)라고 알려져 있는 앱타머는, 현재까지 앱타머 기반의 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 앱타머 기반의 바이오센싱(biosensing)과 바이오이미징(bioimaging), 그리고 의약개발(drug discovery), 약물전달(drug delivery) 분야 등에서 활발히 이용되고 있다. 앱타머 관련 무료 데이터베이스 웹사이트인 Aptamer Base (http:// aptamer.freebase.com)에 따르면 2013년 2월까지, 270여 가지의 타겟에 대한 1,400여 가지의 DNA 기반 또는 RNA 기반의 앱타머가 보고되어 있다.
또한, 앱타머는 형광분자 또는 광반응성 그룹 등과 같은 유용한 기능 그룹들을 도입하는 것이 항체에 비해 상대적으로 용이하며, 앱타머의 구조는 열에 의한 변성-회복(denaturation-renaturation) 과정이 가역적이므로, 항체에 비해 긴 시간의 활성을 가질 수 있다. 이러한 이점을 이용하여 앱타머의 한쪽 말단에 형광 주개(Fluorescent donor)를 라벨링하고, 다른쪽 말단에 형광물질(fluorophore) 또는 소광제(quencher)와 같은 받개(acceptor)를 라벨링하여, 주개 및 받개 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 이용하여 표적 분자를 검출하는, 분자 비콘(molecular beacon)에 기반한 어세이가 수행되고 있다.
PNA(peptide nucleic acid; 펩티드 핵산)는 DNA 또는 RNA와 유사하게 인공적으로 합성된 중합체를 말한다. 다만, 인산기를 포함하는 데옥시리보오스 또는 리보오스 당 골격을 갖는 DNA 또는 RNA와 달리 PNA는 펩티드 결합에 의해 골격이 이루어지며, N-(2-아미노에틸)-글리신을 단위로 갖는다. 상기 PNA는 주로 분자생물학적 과정, 진단 분석 및 안티센스 치료에 사용된다. 이러한 PNA는 DNA 또는 RNA와 유사한 특성을 가지면서도 열이나 pH 등의 자극에 보다 안정한 것으로 알려져 있다. 그러나 자연적으로 생성될 수 없고 합성으로만 제조될 수 있어 비용이 높다는 단점이 있어서 아직은 널리 상용화되지는 못하고 있다. 또한, PNA는 합성 라이브러리에 대한 in vitro 스크리닝 과정이 어려우며, PNA의 중성 골격(neutrally charged backbone)에 의하여 표적 분자에 대한 선택적인 결합을 저해시키므로, 이러한 이유로 DNA 또는 RNA와의 유사성에도 불구하고 앱타머의 한 종류로서 고려되지 않았다. 따라서, PNA가 앱타머의 한 종류로서 기능할 수 있는지 여부에 대해서는 정확히 규명된 바 없다.
이에 본 발명자들은 PNA가 앱타머로 기능할 수 있는지 여부를 규명하기 위하여 예의 노력한 결과, 트롬빈에 결합하고, 15-mer의 길이를 가지는 PNA가 앱타머로서 기능함을 확인하여, PNA가 앱타머에 속할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 이용하여 PNA 앱타머에 대한 표적 분자를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, (a) 표적 분자에 결합하며 형광 염료가 표지된 PNA(peptide nucleic acid) 앱타머에, 그라핀 산화물(Graphene oxide, GO)을 접촉시켜 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 연결시키는 단계; (b) 상기 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물에 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 시료 내의 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 표적 분자의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 염기를 PNA(peptide nucleic acid) 골격에, DNA 또는 RNA 앱타머의 염기서열 순으로 도입하는 단계를 포함하는, PNA 앱타머의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단일가닥 PNA(peptide nucleic acid) 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 PNA(peptide nucleic acid) 앱타머; 및 그라핀 산화물(graphene oxide, GO)을 포함하는, 표적 분자 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 표적 분자에 결합하며 형광 염료가 표지된 PNA 앱타머에, 그라핀 산화물을 접촉시켜 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 연결시키는 단계; (b) 상기 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물에 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 시료 내의 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 표적 분자의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서는, PNA(peptide nucleic acid)가 앱타머(aptamer)로서 기능할 수 있음을 확인하고, 표적분자에 높은 특이성 및 친화성을 가지는 대표적인 PNA 앱타머인 트롬빈 앱타머를 그라핀 산화물(Graphene Oxide, GO)에 적용하여 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 변화에 의해 표적분자를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 방법에서 표적 분자에 결합하고 형광 염료가 표지된 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 접촉시키는 경우, PNA 앱타머에 표지된 형광 염료와 그라핀 산화물 간의 FRET에 의하여 형광염료가 소광되고, 여기에 표적 분자를 포함하는 시료를 반응시키는 경우, PNA 앱타머와 표적 분자 간의 강한 결합에 의하여 PNA 앱타머가 그라핀 산화물에 떨어져나오면서 형광이 회복되는 원리를 이용하여 PNA 앱타머를 이용한 표적 분자 검출 방법을 개발하였다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계는 표적 분자에 결합하며 형광 염료가 표지된 PNA 앱타머에, 그라핀 산화물을 접촉시켜 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 연결시키는 단계이다. 이때, 본 발명의 (a) 단계에서 그라핀 산화물 표면과 PNA 앱타머 부분이 강한 비공유결합을 형성하게 되며, 이 경우 FRET 현상에 의해 그라핀 산화물이 인접한 형광물질을 소광시키게 된다. 따라서, 상기 (a) 단계는 형광 염료가 표지된 PNA 앱타머에, 그라핀 산화물을 접촉시켜 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 연결시켜 형광 염료를 소광시킴을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "앱타머"는 그 자체로 안정된 3차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산) 또는 펩티드를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 앱타머는 PNA 형태일 수 있다.
본 발명에서 용어, "PNA"는 DNA 또는 RNA와 유사하게 인공적으로 합성된 중합체이다. DNA 및 RNA는 각각 인산기를 포함하는 데옥시리보오스 및 리보오스 당 골격을 갖는 반면, PNA의 골격은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 이루어진다. 상기 PNA에서는 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기가 메틸렌 카보닐 결합에 의해 골격에 결합할 수 있다. DNA 또는 RNA와는 달리 PNA 골격은 음으로 하전된 인산기(phosphate group)를 함유하지 않으므로 가닥 사이의 정전기적 반발력이 부재하므로 PNA/DNA 가닥 간의 결합이 DNA/DNA 가닥의 결합보다 강한 것으로 알려져 있다. 또한 PNA는 상보적인 염기서열의 DNA에 대한 높은 특이성을 갖는다. 이로 인해 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥 보다 염기 불일치에 보다 민감하게 반응한다. 상기 결합력과 서열 특이적 인식력은 PNA/RNA 이중가닥에도 적용된다. 또 다른 PNA의 장점은 핵산분해효소 또는 단백질분해효소에 의해 쉽게 인식되지 못하므로 이들 효소에 의한 분해로부터 안정하다는 것이다. 더불어 넓은 범위의 pH 영역에 대해서도 안정하다. 다만 소수성 골격으로 인해 인체에 적용시 세포 내 침투가 용이하지 않다는 것이 단점이나 이는 세포투과성 펩타이드를 공유결합시키는 등의 변형을 가하여 개선할 수 있다. 다만, 상기 PNA는 중성인 골격으로 인하여 상보적인 핵산에 대한 결합력은 뛰어나나, 반대로 단백질과 같은 표적분자에 대한 선택적인 결합을 저해시킬 수 있다는 문제점이 제기되어, DNA 또는 RNA 유래의 앱타머와 달리, 앱타머의 한 종류로 인식되지 않았으며, 본 발명자들에 의해 PNA 역시 앱타머로 이용될 수 있음이 규명되었다.
본 발명에서 용어, "PNA 앱타머"는 안정된 3차 구조를 가지며, 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 PNA를 의미한다. 상기 PNA 앱타머의 예로 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; PSMA(Prostate-specific membrane antigen)에 특이적으로 결합하는 PNA 앱타머; HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)에 결합하는 PNA 앱타머; Muc1(Mucin 1)에 결합하는 PNA 앱타머; His 태그(tag)에 결합하는 PNA 앱타머; 또는 ATP(Adenosine triphosphate)에 결합하는 PNA 앱타머가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, PNA 앱타머는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는, 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, PSMA에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 4 또는 5의 염기서열을 포함하는, HER2에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 6의 염기서열을 포함하는, Muc1에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 His 태그에 결합하는 PNA 앱타머; 또는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 ATP에 결합하는 PNA 앱타머를 모두 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 상기 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 PNA 앱타머는 동일한 염기서열을 포함하는 DNA 앱타머에 비하여 표적 분자인 트롬빈에 높은 친화도 및 특이도를 지니므로, 표적 분자의 검출 등에 유용하게 사용될 수 있는 이점을 가진다.
본 발명에서 언급되는 "표적 분자"는 PNA 앱타머가 결합할 수 있는 소분자, 단백질, 핵산, 세포, 조직 등의 모든 분자를 일컬으며, 구체적으로 트롬빈, PSMA, HER2, Muc1, His 태그, ATP 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 표적 분자 중, 트롬빈은 혈액 응고에 관계되는 단백질 분해효소로서, 혈장 내에서는 프로트롬빈(prothrombin)으로 존재한다. PSMA는 주로 전립선 조직에서 발견되는 2형 내재막 당단백질(type 2 integral membrane glycoprotein)로서, 전립선암 치료의 표적이 되고 있다. HER2는 암관련 막 단백질로서, 특히 유방암 및 직장결장암의 능동 특이면역요법에서 면역원으로 기능한다. Muc1은 악성인 암세포에서 과발현된다고 알려진 종양 마커 중 하나로서 당단백질의 일종이다. His 태그에서 히스티딘(histidine)의 경우 크기도 작고 원래의 단백질 구조에도 영향이 적어 태그로 가장 많이 사용되는 아미노산으로서, His 태그는 보통 히스티딘이 연속적으로 결합된 태그를 말한다. ATP는 아데노신에 인산기가 3개 달린 유기화합물로, 모든 생물의 세포 내에 존재하여 에너지대사에 매우 중요한 역할을 한다.
본 발명에서 용어, "그라핀 산화물"은 탁월한 전자적, 열적, 그리고 역학적 성질을 가진 단일원자-두께 2D 탄소 나노소재인 그라핀의 수용성 형태의 화합물로, 흑연을 산화시켜 제조될 수 있는 경제적인 소재를 의미한다. 그라핀 산화물은 소수성 소형분자 또는 단일가닥 DNA와 강하게 결합하고, 인접한 형광물질을 소광시키는 능력이 있다. 본 발명의 목적상 상기 그라핀 산화물은 PNA의 앱타머로서의 기능 확인 또는 PNA 앱타머를 이용한 표적 분자 검출에 사용되는 화합물로서, PNA와 결합하는 특성을 지니는 것이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 DNA 또는 RNA가 아닌 PNA도 그라핀 산화물에 결합할 수 있음을 확인하였다(도 2a 및 실시예3 참고).
본 발명에서 용어, "형광 염료" 는 형광을 띄는 물질로서 특정한 파장의 에너지를 흡수하여 다른 특정한 파장에서 재방출하는 물질을 의미한다. 상기 형광 염료가 방출하는 에너지의 양과 파장은 형광물질 자체와 그 화학적 환경에 의존한다. 본 발명의 방법에서 상기 형광 염료는 단일가닥 PNA에 표지되어 그라핀 산화물과 근접했을 때 에너지 전이를 통해 형광이 소광될 수 있는 특징이 있다. 본 발명에서 상기 형광 염료는 그라핀 산화물에 의해 FRET으로 소광될 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 공지의 형광 염료를 사용할 수 있고, 그 예로서, FAM(fluorecein amidite), HEX(Hexachloro-fluorescein), NEDTM, ROXTM(6-Carboxyl-X-Rhodamine), Texas RedTM 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법에서 상기 (b) 단계는 상기 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물에 분리된 시료를 접촉시키는 단계이다. 상기 (b) 단계는 PNA 앱타머와 표적 분자가 서로 결합하게 되면 그라핀 산화물에 결합되어 있던 PNA 앱타머가 떨어져 나오면서 PNA 앱타머에 표지된 형광 물질의 형광이 다시 회복되는 것을 이용하는 단계이다. 상기 (b) 단계는 PNA 앱타머와 표적 분자가 서로 결합하는 경우 소광되었던 형광이 다시 증가한다는 점을 이용하여, 분리된 시료를 상기 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물에 접촉시켜 형광 신호의 변화 여부를 통해 표적 분자의 포함여부를 검출할 수 있도록 함이 특징이다.
본 발명에서 용어, "시료"는 본 발명의 방법을 이용하여 표적 분자의 존재 여부를 확인하고자하는 대상으로서, 생물학적 시료를 포함한다. 표적 분자가 특정 질병에서 과발현 또는 저발현되어 있는 바이오마커일 경우에는 그 질병의 의심개체에서 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물과 반응시켜, 표적 분자의 존재 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 방법에서 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 시료 내의 형광 세기를 측정하는 단계이다. (b) 단계에서 접촉시킨 분리된 시료가 표적 분자를 포함한다면, PNA 앱타머에 결합하여 그라핀 산화물로부터 떨어져나오게 되므로, 시료를 반응시키지 않은 대조군에 비하여 형광 염료의 형광이 증가하는 결과를 나타내게 된다. 반면, 분리된 시료가 표적 분자를 포함하지 않는다면, PNA 앱타머는 그라핀 산화물과 결합하는 상태로 존재하므로, 시료를 반응시키지 않는 대조군과 유의성있는 형광 차이를 나타내지 않게 된다.
형광의 세기 측정은 트라이애드 멀티모드 디텍터(TRIAD Multimode Detector), 왈락/빅터 형광(Wallac/Victor Fluorescence), 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer), Agilent 8453 UV-Visible spectrometer 또는 BioTek Synergy Mx spectrofluophotometer 등을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업자에게 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 측정 장치라면 모두 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 추가로, FAM 표지된 앱타머와 그라핀 산화물을 반응시키고, 표적 분자를 첨가하지 않은 시료와 같은 표적 분자를 포함하지 않은 대조군에 비하여 (c) 단계에서 측정한 형광이 높은 경우 표적 분자가 존재하는 것으로 판정하는 (d) 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 트롬빈에 결합하는 DNA 앱타머의 염기 서열을 가지는 PNA 앱타머가 그라핀 산화물에 결합할 수 있음을 확인하였고(실시예 3), FAM이 표지된 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 접촉시켜 FAM을 소광시킨 다음, 트롬빈을 첨가하여 FAM 형광의 변화 여부를 관찰하였다. 그 결과, 트롬빈의 첨가에 따라 그라핀 산화물에 결합된 PNA 앱타머가 분리되어, FAM 형광이 다시 회복되는 것을 확인하였다(실시예 4). 특히, 상기 PNA 앱타머는 동일한 염기서열을 가지는 DNA 앱타머에 비하여 6배 가량 낮은 해리 상수를 나타내며, FRET 신호 변화 차이를 관찰하기도 용이함을 확인하여, 낮은 농도의 표적 분자 검출에도 유용할 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단일가닥 PNA 앱타머를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 PNA(peptide nucleic acid) 골격에, 염기를 DNA 또는 RNA 앱타머의 염기서열 순으로 도입하는 단계를 포함하는, PNA 앱타머의 제조 방법을 제공한다.
상기 앱타머, PNA 및 PNA 앱타머에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 방법은 DNA 또는 RNA 앱타머의 염기 서열을 이용하여, 상기 앱타머의 각 염기를 메틸렌 카보닐 결합을 통하여 PNA의 골격에 순서대로 결합시킴으로써, PNA 앱타머를 제조하는 방법이다.
상기 DNA 또는 RNA 앱타머의 염기 서열은 공지의 앱타머 데이터베이스, 또는 DNA 또는 RNA 앱타머의 서열을 분석함으로써 얻을 수 있으며, 상기 서열을 바탕으로 염기를 순서대로 PNA 골격에 결합시켜 PNA 앱타머를 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 트롬빈 앱타머의 염기 서열을 PNA에 도입하여, PNA 앱타머를 제조하였다(실시예 2).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단일가닥 PNA 앱타머를 제공한다.
상기 표적 분자, PNA 및 앱타머에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
PNA는 중성 골격으로 인하여 상보적인 핵산에 대한 결합력은 뛰어나지만, 반대로 단백질과 같은 표적 분자에 대한 선택적인 결합은 저해시키는 효과를 나타낼 수 있어, 종래에는 DNA 또는 RNA 유래 앱타머와 달리 앱타머의 한 종류로 사용되지 않았다. 이에 본 발명에서는 트롬빈의 DNA 앱타머의 염기서열을 PNA에 도입한 다음, 상기 PNA가 표적 분자인 트롬빈에 특이성 및 친화성을 모두 가지는지 확인하였고, 그 결과 동일한 염기서열을 가지는 DNA 앱타머에 비하여 현저히 높은 친화성을 지니며, 표적 분자 특이성 역시 가져, PNA가 앱타머로서 기능함을 규명하였다. 이로부터 본 발명에서는 PNA의 앱타머로서의 기능에는 염기 서열이 중요하게 작용할 수 있음을 규명하고, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 다양한 PNA 앱타머를 개발하였다.
특히, PNA는 인공적으로 합성한 DNA 또는 RNA의 유사체로서, 셀렉스(SELEX)라는 과정을 통하여 선별되는 핵산 앱타머와 달리 합성으로만 제조될 수 있는 특징이 있다. 따라서, PNA가 앱타머로서 기능할 수 있는지 여부는 특정 PNA를 합성한 다음, 이의 앱타머로서의 기능 여부를 개별적으로 확인함으로써 규명될 수 있는 것으로, 특정 표적 분자에 대한 PNA 앱타머를 규명하기 위해서는 많은 노력 및 시간이 필요하다. 본 발명에서는, 대표적인 표적 분자로서 트롬빈을 이용하여 트롬빈에 결합하는 DNA 앱타머의 서열을 PNA에 도입하여 트롬빈에 대한 PNA를 제조하였으며, 상기 PNA가 앱타머로서 기능하는지 여부를 확인하였다. 그 결과, PNA가 표적분자에 특이적으로 결합하여 앱타머로서 기능할 수 있음을 확인하였으며, 이러한 PNA 앱타머는 동일한 염기 서열을 가지는 DNA 또는 핵산 앱타머에 비해 표적 분자에 선택적이며 강하게 결합할 수 있음을 확인하여, 표적 분자 검출 등에 대한 적용가능성을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 트롬빈에 결합하는 DNA 앱타머의 염기서열을 이용하여 PNA를 제조하였으며(실시예 2), 상기 PNA가 트롬빈에 특이성 및 친화성을 가져 앱타머로서 기능할 수 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, FAM이 표지된 PNA 및 그라핀 산화물을 이용하여 그라핀 산화물에 의한 소광이, 트롬빈의 첨가에 의해 회복될 수 있는지를 통하여 친화성을 확인하였고, 그 결과, 같은 조건에서 반응시킨 DNA 앱타머가 30nM 내지 1.7μM 농도의 트롬빈에 대하여 10 내지 25% 가량의 FRET 신호 변화를 나타낸 반면, 상기 PNA는 8nM 내지 210nM의 트롬빈 농도 범위에서 FRET 신호가 25 내지 50% 가량 증가하는 결과를 나타내었으며, 해리상수 역시 6배 가량 차이를 나타내어, 같은 조건에서 반응시킨 DNA 앱타머에 비하여 현저히 높은 친화도를 나타내는 결과를 보였다(도 2). 또한, 상기 FAM이 표지된 PNA 및 그라핀 산화물을 서로 반응시킨 다음, BSA(Bovine serum albumine)를 첨가하여도 FAM 형광 신호가 회복되지 않는 결과를 나타내어, 표적분자인 트롬빈에 특이적으로 결합하는 것임을 시사하였다(도 3).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 PNA 앱타머 및 그라핀 산화물을 포함하는, 표적 분자 검출용 키트를 제공한다.
상기 PNA 앱타머 및 그라핀 산화물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 키트에는 추가로 검출에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액, 또는 장치를 더 포함하여 구성할 수 있다. 또한, 표적 분자 검출 반응이 일어날 수 있는 구획이 나눠진 투명용기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 PNA 앱타머는 형광 염료가 표지된 형태일 수 있으며, 형광 염료가 표지되지 않은 형태의 PNA 앱타머의 경우에는 형광 염료를 포함하는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 표적 분자 검출용 키트는 표적분자가 표지된 PNA 앱타머 및 그라핀 산화물을 서로 반응시킨 다음, 이를 검출하고자 하는 시료에 첨가하고, 형광 세기를 측정함으로써 표적 분자 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 PNA 앱타머를 사용하여 표적 분자를 검출할 경우, DNA 등을 기반으로 하는 앱타머에 비하여 분해효소 등으로부터 안정하므로 의약개발 또는 진단기법 개발 등에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 PNA 앱타머 및 그라핀 산화물을 기반으로 하여 본 발명의 대표적인 표적 분자인 트롬빈을 검출하는 원리에 대한 모식도이다. PNA, DNA 또는 RNA를 그라핀 산화물 표면에 흡수시킬 경우, 형광 염료과 그라핀 산화물 간에 FRET 현상이 일어나 FAM이 표지된 PNA, DNA 또는 RNA의 형광이 소광된다. 상기 시스템에 트롬빈을 첨가한 경우, 그라핀 산화물에 대한 훨씬 약한 친화도를 가진 것으로 알려진 4중 나선(quadruplex)-트롬빈 복합체의 형성에 의해 소광되었던 형광이 되살아난다. 그 결과, 형광 염료는 그라핀 산화물 표면으로부터 떨어져 나갈 수 있게 된다.
도 2는 앱타머와 트롬빈의 결합에 따른 형광 세기의 변화를 도시한 그래프이다. (a) FAM 표지된 PNA의 서로 다른 세 가지 조건(그라핀 산화물과의 접촉 전의 FAM이 표지된 PNA 앱타머의 형광 세기, 그라핀 산화물과의 접촉 후의 형광 세기, 트롬빈 접촉 후의 형광 세기) 하에서의 형광 스펙트럼 그래프이다. 130mM NaCl, 2.56mM KCl, 9.5mM NaHCO3을 포함하는 10mM PBS 완충용액(pH 8.3)에서, 26.7nM FAM-표지된 실시예 2의 PNA와 3.3㎍/mL GO를 15분간 함께 배양하였을 때, 형광 세기가 상당히 감소하였고(약 50%까지 감소), 감소된 형광은 잠재적인 결합 상대인 트롬빈의 존재에 의하여 다시 회복되었다. (b) 트롬빈을 첨가하였을 때와 트롬빈을 첨가하지 않았을 때의 형광 세기의 차이를 첨가한 트롬빈의 농도에 따라 도시화한 그래프이다. FAM 표지된 PNA는 8nM 내지 210nM의 트롬빈과 반응하여 20% 내지 50%의 FRET 신호변화를 보임으로써, 상기 FAM 표지된 PNA와 트롬빈간의 겉보기 해리상수(apparent dissociation constant, Kd app)가 약 6.85nM임을 나타내었다. 상기 실험 결과는 잘 알려진 안티-트롬빈(anti-thrombin) DNA 앱타머와 동일한 염기 서열을 갖는 PNA 또한 트롬빈과 강하게 결합할 수 있음을 시사하였다. (c) 상기 (a)에서와의 동일한 조건 하에서 수행된 FAM 표지된 DNA의 형광 스펙트럼 그래프이다. 상기 (a)와 동일한 양상으로, 형광 세기가 감소하였다가 트롬빈의 첨가에 의하여 다시 증가하였다. (d) 트롬빈을 첨가하였을 때와 트롬빈을 첨가하지 않았을 때의 형광 세기의 차이를 첨가한 트롬빈의 농도에 따라 도시화한 그래프이다. FMA 표지된 DNA는 30nM 내지 1.7μM의 트롬빈과 반응하여 10% 내지 25%의 FRET 신호변화를 보임으로써, 상기 FAM 표지된 PNA와 트롬빈간의 겉보기 해리상수(apparent dissociation constant, Kd app)가 약 39.2nM임을 나타내었다.
도 3은 FMA 표지된 15-mer PNA 앱타머와 BSA(Bovine serum albumine)를 접촉시켰을 때의 형광 세기의 변화를 도시한 그래프이다. (a) FAM 표지된 PNA의 서로 다른 세 가지 조건(그라핀 산화물과의 접촉 전의 FAM이 표지된 PNA 앱타머의 형광 세기, 그라핀 산화물과의 접촉 후의 형광 세기, 트롬빈 접촉 후의 형광 세기) 하에서의 형광 스펙트럼 그래프이다. 130mM NaCl, 2.56mM KCl, 9.5mM NaHCO3을 포함하는 10mM PBS 완충용액(pH 8.3)에서, 26.7nM FAM 표지된 실시예 2의 PNA와 3.3㎍/mL GO를 15분간 함께 배양하였을 때, 형광 세기가 상당히 감소하였고(약 50%까지 감소), 감소된 형광은 BSA의 첨가 이후에도 다시 증가하지 않음을 보였다. (b) BSA을 첨가하였을 때와 BSA를 첨가하지 않았을 때의 형광 세기의 차이를 첨가한 BSA의 농도에 따라 도시화한 그래프이다. FMA 표지된 PNA는 60nM 내지 270nM의 BSA과 반응하여도 신호변화를 보이지 않거나 무시할 만한 변화를 보이며, 상기 실험 결과는 FAM 표지된 PNA가 BSA가 아닌 트롬빈에 특이적으로 결합하는 것임을 시사하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 시약 및 기기의 준비
본 발명에서 사용된 화학 물질들은 공급회사로부터 구입하였고, 다른 정제과정 없이 사용하였다. 구체적으로 15-mer PNA 및 15-mer DNA는 파나진(Panagene), FAM(fluorescein amidite)-NHS ester는 바이오니어(Bioneer), 그라핀 산화물(GO, ~60% 1-atomic layer)은 그라핀 스퀘어(Graphene Square), 트롬빈은 Enzyme Research Laboratories에서 구입하였다. 그리고 전 실험과정에서 2차증류된 탈이온수(double-distilled deionized water)를 사용하였다. FAM이 부착된(FAM-labeled) 핵산은 FAM-NHS 공급업체로부터 제공된 조건 하에서 구입하였다. UV 흡광도는 Agilent 8453 UV-Visible spectrometer를 사용하여 측정하였고, 형광도(fluorescence)는 BioTek Synergy Mx spectrofluophotometer를 사용하여 520nm에서 측정하였다. 모든 실험은 3배수 이상으로 수행하였다.
실시예 2: 트롬빈에 대한 PNA 의 제조
PNA가 앱타머로서 기능하는지 여부를 확인하기 위하여, 대표적인 표적분자로서 트롬빈을 선별하고, 트롬빈에 결합하는 DNA 앱타머의 서열을 PNA에 도입하여 트롬빈에 대한 PNA를 제조하였다.
구체적으로, 트롬빈에 결합하는 뉴클레오티드 서열인 5’-GGTTG GTGTG GTTGG-3’ (서열번호 1)을 이용하여 PNA를 합성하였고, 그 서열은 하기와 같았다.
트롬빈에 대한 PNA: (N-말단) Cys-Gly-GGTTG GTGTG GTTGG (C-말단)
실시예 3: PNA 의 그라핀에 대한 결합력 확인
음전하 골격을 가지는 DNA와 달리, 골격(backbone)이 중성인 PNA가 표적분자에 특이적이면서도 높은 친화도로 결합하여 앱타머로 기능할 수 있는지 여부를 하기와 같이 확인하기 위하여, 그라핀 산화물을 이용하였다.
그라핀 산화물은 DNA와 같은 핵산과 결합할 수 있으며, 인접한 형광물질을 FRET으로 소광시킬 수 있는 능력을 가진다. 염기를 구성성분으로 하는 PNA 역시 그라핀 산화물에 결합할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, PNA에 형광물질을 표지하고, 이를 그라핀 산화물과 반응시킨 다음, 형광을 측정하였다. 이때, 형광물질로서는 그라핀 산화물에 거의 결합하지 않는 FAM을 사용하여, 소광능력이 PNA에 의한 것인지를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2의 PNA의 N-말단에 형광 염료인 FAM(emission maxima at 520nm)을 표지하였고, 26.7nM의 농도의 FAM이 표지된 실시예 2의 PNA를 130mM NaCl, 2.56mM KCl, 9.5mM NaHCO3 를 포함하는 10mM PBS 완충용액(pH 8.3)과 함께 15분간 배양하여, PNA의 그라핀 산화물에 대한 결합여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, FAM의 형광세기(fluorescence intensity)가 약 50%까지 감소됨을 나타내어, PNA가 그라핀 산화물에 결합하는 결과를 나타내었다. 특히, 그라핀 산화물에 의한 PNA에 표지된 형광 물질의 소광이 반응한지 약 15분동안 50%까지 감소되는 결과를 보여, PNA가 그라핀 산화물에 강한 결합력을 나타냄을 시사하였다.
실시예 4: 그라핀 산화물을 통한 PNA 앱타머로서의 기능 확인
지금까지 앱타머와 표적분자의 결합에 대한 메커니즘으로서, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용 또는 п-스택킹(stacking) 등이 제시되었으므로(C. Tuerk and L. Gold, Science 1990, 249, 505-510; S. M. Nimjee, C. P. Rusconi and B. A. Sullenger, Annu. Rev. Med. 2005, 56, 555-583.), 앱타머와 표적분자의 결합에 앱타머의 전하를 띤 골격 등이 중요한 역할을 하는지를 확인하였다. 이를 위하여, 트롬빈에 결합하는 15-mer DNA 앱타머와 동일한 염기 서열을 포함하는 실시예 2의 앱타머를 이용하였다.
또한, 상기 실시예 3을 통하여 PNA가 그라핀 산화물과 결합함을 확인하였으므로, 그라핀 산화물을 이용하여 하기와 같이 PNA의 앱타머로서의 기능을 확인하였으며, 특히 DNA 앱타머의 음전하를 띤 골격이 앱타머의 기능에 중요한 역할을 수행하는지, DNA 앱타머의 염기 서열을 도입한 PNA가 앱타머로서 기능할 수 있는지 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 130mM NaCl, 2.56mM KCl, 9.5mM NaHCO3을 포함하는 10mM PBS 완충용액(pH 8.3)에서, 26.7nM FAM 표지된 실시예 2의 PNA와 3.3㎍/mL GO를 15분간 함께 배양하였다. 그 다음, 서로 다른 농도의 트롬빈을 상기 용액에 첨가하였고, 14시간 배양한 다음 형광을 측정하였다.
그라핀 산화물을 이용한 본 발명의 방법은, 상기 PNA가 PNA 앱타머로 기능하여 표적 분자와 특이성 및 친화성을 가지고 결합하는 경우, 구조가 변화하게 되면서 그라핀 산화물과 멀어지게 되므로, FRET이 일어나지 않게 되면서 상기 형광물질의 형광을 다시 검출할 수 있음을 이용한 것이다.
그 결과, 도2a에 나타낸 바와 같이, 그라핀 산화물과 FAM이 표지된 PNA의 결합으로 현저하게 감소된 FAM의 형광이 트롬빈의 존재하에 회복되는 결과를 나타내어, 트롬빈에 결합하는 DNA 앱타머의 염기서열을 도입한 PNA가 앱타머로서 기능할 수 있음을 시사하였다. 또한, 그라핀 산화물 및 FAM 표지된 PNA의 농도를 고정시키고, 트롬빈의 첨가 농도를 달리했을 때, FAM의 방출 파장인 520nm에서 형광 강도의 변화를 그래프로 나타낸 도 2b의 결과에서, 트롬빈의 농도에 따른 형광 변화 그래프는 전형적인 포화 곡선을 나타내어, FAM이 표지된 PNA에 대해 그라핀 산화물 및 트롬빈 간에 경쟁적인 결합하는 것을 나타내었다(도 2b). 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, 8nM 내지 210nM의 트롬빈 농도 범위에서 FRET 신호가 25 내지 50% 가량 증가하는 결과를 나타내었으며, FAM 표지된 상기 PNA와 트롬빈 간의 겉보기 해리 상수(Kd app)는 약 6.85nM를 나타내어, 우수한 친화도를 나타내고 있음을 시사하였다.
비교군으로서, 본 발명의 PNA 앱타머와 동일한 염기 서열(서열번호 1)을 가지는, 트롬빈에 결합하는 DNA 앱타머 5'-H2N-(CH2)6-GGTTG GTGTG GTTGG-3'을 이용하여, 상기와 같은 조건으로 반응을 진행한 다음 FAM의 형광을 측정하였고, 그 결과를 도 2c 및 2d에 나타내었다.
그 결과, FAM이 표지된 DNA 앱타머는 GO 표면에 효과적으로 흡수되어, 50% 가량의 형광 감소를 나타내었으며, 표적 분자의 트롬빈의 존재하에서 FAM의 형광이 회복되는 결과를 나타내었다(도 2c).
그러나, 도 2d에 나타낸 바와 같이, GO 표면에 흡수된 FAM 표지된 DNA 앱타머의 백그라운드 형광 수준과 구별되는 형광 신호를 검출하기 위해서는 거의 동량인 FAM 표지된 DNA 앱타머가 요구되었으며, 30nM 내지 1.7μM 농도의 트롬빈에 대하여 10 내지 25% 가량의 FRET 신호 변화를 나타내었다.
즉, 본 발명의 PNA 앱타머는 동일한 염기서열을 가지는 DNA 앱타머에 비하여 더 낮은 트롬빈의 농도에서 더 높은 FRET 변화를 나타내어, 표적 분자에 높은 친화도를 가지고 있음을 시사하였으며, 또한 상기 방법으로 효과적으로 표적 분자인 트롬빈을 검출할 수 있음을 나타내었다.
또한, 겉보기 해리 상수(Kd app) 역시 상기 DNA 앱타머는 대략 39.2nM 값을 나타내어, 본 발명의 PNA 앱타머에 비하여 6배 가량 높은 결과를 나타내어, 본 발명의 PNA 앱타머는 표적 분자에 매우 높은 친화도를 지니며, 상기 PNA 앱타머를 이용하여 상기 방법으로 표적 분자를 검출하는 경우 높은 효율을 가지고 올 수 있음을 시사하였다. 상기 동일한 염기서열을 가지는, 트롬빈에 대한 DNA 앱타머와 PNA 앱타머의 해리 상수를 하기 표에 나타내었다.
Figure pat00001
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 동일한 염기서열을 가지는 DNA 앱타머에 비하여 본 발명의 PNA 앱타머는 현저히 낮은 해리 상수를 나타내어, 표적 분자에 대하여 높은 친화도를 가지고 있음을 시사하였다. 상기와 같은 결과는, 트롬빈에 안정적인 4중 나선(quadruplex) 구조를 형성함으로써 도출된 것으로 해석하였다.
실시예 5: 트롬빈에 결합하는 PNA 의 특이성 확인
상기 실시예 4에서 확인한 실시예 2의 PNA가 트롬빈에 특이성을 가지고 결합하는지를 하기와 같이 확인하여, 앱타머로서 기능함을 보다 확실히 검토하였다.
이를 위하여, 130mM NaCl, 2.56mM KCl, 9.5mM NaHCO3을 포함하는 10mM PBS 완충용액(pH 8.3)에서, 26.7nM FAM 표지된 실시예 2의 PNA와 GO를 15분간 함께 배양하였다. 그 다음, BSA를 농도별로 첨가한 다음, 형광 변화를 관찰하였다.
그 결과, FAM 표지된 PNA와 GO의 결합에 의하여 감소한 FAM의 형광은 BSA 첨가로 회복되지 않는 결과를 나타냈으며(도 3a), 특히 60 내지 270nM의 BSA 농도에서도 FRET 신호가 나타나지 않거나 무시할만한 정도의 신호를 나타내어, 상기 PNA가 표적 분자인 트롬빈에 특이적으로 결합함을 시사하였다.
상기 실시예 5의 결과와 실시예 4의 결과와 종합하면, 실시예 2의 PNA는 트롬빈에 높은 친화도를 가지고 있을 뿐만 아니라, 특이도도 가지고 있음을 시사하는 결과로서, 이는 상기 PNA가 앱타머로서 기능함을 나타내는 결과이다. 뿐만 아니라, 형광물질이 표지된 PNA 앱타머 및 그라핀 산화물을 이용하여 형광 신호를 검출하는 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 동일한 염기서열을 가지는 DNA 앱타머를 이용하는 경우에 비하여 현저히 높은 표적 분자 검출 효과를 나타낼 수 있음을 시사하였다.
실시예 6: PSMA , HER2 , Muc1 , His 태그 또는 ATP 에 결합하는 PNA 앱타머의 제조
서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는, 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, PSMA에 결합하는 앱타머; 서열번호 4 또는 5의 염기서열을 포함하는, HER2에 결합하는 앱타머; 서열번호 6의 염기서열을 포함하는, Muc1에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 His 태그에 결합하는 PNA 앱타머; 또는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 ATP에 결합하는 PNA 앱타머를 합성한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Method for Dectecting of Target Molecules Using PNA Aptamers <130> PA130081KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrombin aptamer <400> 1 ggttggtgtg gttgg 15 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrombin aptamer <400> 2 agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29 <210> 3 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMA aptamer <400> 3 gggaggacga ugcggaucag ccauguuuac gucacuccuu gucaauccuc aucggcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 4 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 aptamer <400> 4 agccgcgagg ggagggauag gguagggcgc ggcu 34 <210> 5 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 aptamer <400> 5 gggacgcgug guaccaaaag uugugagggg agggauaggg uagggcacga cuagucaaga 60 aaaugaagcu uccgcgggga uc 82 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Muc1 aptamer <400> 6 gcgagcgcag ttgatccttt ggataccctg ggctcgc 37 <210> 7 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His tag aptamer <400> 7 gcuaugggug gucugguugg gauuggcccc gggagcuggc 40 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP aptamer <400> 8 acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27

Claims (10)

  1. (a) 표적 분자에 결합하며 형광 염료가 표지된 PNA(peptide nucleic acid) 앱타머(aptamer)에, 그라핀 산화물(Graphene oxide, GO)을 접촉시켜 상기 PNA 앱타머와 그라핀 산화물을 연결시키는 단계;
    (b) 상기 PNA 앱타머가 연결된 그라핀 산화물에 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 시료 내의 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 형광 염료는 FAM(fluorescein amidite), HEX(Hexachloro-fluorescein), NEDTM, ROXTM(6-Carboxyl-X-Rhodamine) 및 텍사스 레드(Texas RedTM)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PNA 앱타머는 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; PSMA(Prostate-specific membrane antigen)에 결합하는 PNA 앱타머; HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)에 결합하는 PNA 앱타머; Muc1(Mucin 1)에 결합하는 PNA 앱타머; His 태그에 결합하는 PNA 앱타머; 및 ATP(Adenosine triphosphate)에 결합하는 PNA 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 PNA 앱타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, PSMA에 결합하는 앱타머; 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, HER2에 결합하는 앱타머; 서열번호 5의 염기서열을 포함하는, HER2에 결합하는 앱타머; 서열번호 6의 염기서열을 포함하는, Muc1에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는, His 태그에 결합하는 앱타머; 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는, ATP에 결합하는 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 (c) 단계에서 측정한 형광이 표적 분자가 존재하지 않는 대조군에 비하여 높으면 표적 분자가 존재하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. PNA(peptide nucleic acid) 골격에, 염기를 DNA 또는 RNA 앱타머의 염기 서열 순으로 도입하는 단계를 포함하는, PNA 앱타머의 제조 방법.
  7. 표적 분자에 결합하는 단일가닥 PNA 앱타머.
  8. 제7항에 있어서, 상기 PNA 앱타머는 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; PSMA(Prostate-specific membrane antigen)에 결합하는 PNA 앱타머; HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)에 결합하는 PNA 앱타머; Muc1(Mucin 1)에 결합하는 PNA 앱타머; His 태그(tag)에 결합하는 PNA 앱타머; 및 ATP에 결합하는 PNA 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 앱타머.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PNA 앱타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 트롬빈에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, PSMA에 결합하는 앱타머; 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, HER2에 결합하는 앱타머; 서열번호 5의 염기서열을 포함하는, HER2에 결합하는 앱타머; 서열번호 6의 염기서열을 포함하는, Muc1에 결합하는 PNA 앱타머; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는, His 태그에 결합하는 앱타머; 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는, ATP(Adenosine triphosphate)에 결합하는 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 앱타머.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 PNA 앱타머; 및 그라핀 산화물을 포함하는, 표적 분자 검출용 키트.


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