KR101437492B1 - 살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독균에 특이적으로 단일가닥 DNA에 관한 것으로서, 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) KCCM 12021 검출용 단일가닥 DNA 앱타머를 제공한다. 본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 구조적으로 안정하고 인공적인 합성이 용이하며 각 염기서열 위치에 화학적으로 용이한 변형이 가능하여, 식중독균인 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 대한 신규한 차세대 진단 탐침으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 이의 용도{DNA aptamer specifically binding to Salmonella Enteritidis and uses thereof}
본 발명은 식중독균인 살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 결합하는 살모넬라 엔테리티디스 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 및 이를 포함하는 식중독균 검출용 키트에 관한 것이다.
식중독은 병원성 세균, 병원성 세균에서 발현되는 독소, 바이러스 및 자연계에 존재하는 독소에 의해 발병하는 질병으로서, 식중독의 원인균으로서 알려진 병원균도 많지만 불명의 원인도 다수 존재하는 질병이다. 국내의 식중독균에 의한 발병 통계에 의하면, 특히 병원성 대장균 및 살모넬라균에 의한 발병 건수 및 환자수가 각각 나란히 1위 및 2위를 차지하고 있다(표 1 참조).
원인균별 식중독 발병 통계
원인균 환자수 발병건수
병원성 대장균 1,096 10
살모넬라 497 16
황색포도상구균 302 10
캠필로박터 제주니 287 9
클로스트리디움 퍼프리젠스 104 3
바실러스 세레우스 70 7
장염비브리오균 12 2
합계 2,368 57
한편, 현재 대부분의 살모넬라 및 병원성 대장균 등의 식중독균을 검출하는 방법으로, 전통적인 세포 배양법과 이외에 유전자분석법(PCR) 및 면역분석법(ELISA) 등이 사용되고 있다. 또한 일부 회사에서는 항체를 이용한 진단 키트 등을 개발하여 시판하고 있다. 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법은 PCR로써 진단 대상체의 고유한 유전자를 인지 후, 이를 시험관 내(in vitro)에서 증폭함으로써 소량의 대상체를 분석하는 방법이다. 유전자가 지니는 고유한 염기서열을 이용하여 진단 대상체만의 고유한 염기서열을 대상으로 하고, 또한 근래의 인간 게놈 프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스 확보를 통하여 그 활용 범위를 확대시켜나가고 있다. 또한, 식중독균 진단에 사용되는 기술은 위의 PCR 방법 외에 ELISA 분석을 토대로 이루어진다. ELISA 기술은 특정 단백질에 대한 특이적 결합을 하는 항체를 인식용 지표물질로 사용하며 농수산식품 등의 검체로부터 진단 대상체를 분리하고 이를 효소 결합 항체를 이용하여 검출함으로써 다양한 검체를 처리할 수 있으며 항체가 갖는 특이적 결합을 보이는 장점이 있다. 그러나 ELISA의 경우 PCR 진단법에 비해 비교적 낮은 수준의 민감도를 가지므로 이를 극복하기 위한 많은 연구가 진행중이다.
이러한 종래의 방법들은 자체적으로 높은 민감도와 특이성을 제안하는 방법들이지만 검출시간이 길고 목표 분자의 분리 정제가 필요하며, 때로는 고가의 검출 장비가 필요하다는 단점이 있다. 이러한 종래의 진단 방법으로는 보다 편리하게 식중독균을 조기 검출할 수 없는 실정이므로, 초정밀 검역을 위하여 높은 감도와 신속성을 지닌 검출 방법의 개발이 필수적이다. 따라서 현재 식중독 발병 원인균 1, 2위를 차지하는 살모넬라 및 병원성 대장균들 검체 대상으로 하여 식중독을 조기에 진단하여 검출할 수 있는 기술 개발이 무엇보다 필요하다.
아울러, 최근 정부의 다양한 국가와의 FTA 협상이 진행됨에 따라 세계 각국의 농수산물들이 대규모로 수입되고 있으며 수입될 전망이다. 농수산식품을 대규모로 수입하고 관리하면 관리 소홀로 인한 식중독의 발생 가능성이 높아진다. 살모넬라 엔테리티디스균이 식품의 표면에 존재하게 되면 식품 섭취에 의해 체내로 유입되고 균은 수일(72시간) 내로 많은 양의 개체수가 증폭되어 식중독을 유발한다. 따라서, 식품에 존재하는 살모넬라 엔테리티디스균을 조기에 진단하는 것이 식중독 예방에 매우 중요하므로, 상기와 같은 전통적인 진단방법을 대체할 차세대 진단기술개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 목적은 살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 단일가닥 DNA 앱타머를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 검출용 조성물을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 단일가닥 DNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 구조적으로 안정하고 인공적이 합성이 용이하며, 각 염기서열 위치에 화학적으로 용이한 변형이 가능하여 신규한 차세대 진단 탐침으로서 가능성을 제시한다. 또한, 본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 기존이 진단 시스템이 갖는 안정성 및 민감도를 크게 향상시킬 수 있는 바, 살모넬라 엔테리티디스 식중독균의 조기 진단에 효과적으로 활용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 서열번호 4의 단일가닥 DNA 앱타머(a) 및 서열번호 5의 단일가닥 DNA 앱타머(b)의 해리상수(KD)를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 4의 단일가닥 DNA 앱타머(a) 및 서열번호 5의 단일가닥 DNA 앱타머(b)의 살모넬라 엔테리티디스균에 대한 결합 특이성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "DNA 앱타머(aptamer)"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미하는 것으로서, 단일 가닥인 DNA 핵산 분자를 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 살모넬라 엔테리티디스( Salmonella Enteritidis ) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머
본 발명의 일 측면은 살모넬라 엔테리티디스 검출용 단일가닥 DNA 앱타머를 제공한다.
본 발명의 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함한다.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 보다 바람직하게는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 특이적 및 선택적으로 결합한다. 특히, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021 이외에 다른 비살모넬라 박테리아에는 결합하지 않으므로 환경에 존재하는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021을 선택적으로 검출할 수 있다.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 특히, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열이, 이들 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 화학적 또는 물리적으로 변형(modification)된 형태로 포함될 수도 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 또는 디아미노퓨린 등으로 구성될 수 있다.
또한, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는 상기 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열들과 서열은 상이하지만, 상기 염기서열들과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열로서, 상기 서열번호 4 내지 서열번호 10의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성(homology)을 가지는 염기서열일 수 있다.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 검출 가능한 검출체로 표지될 수 있다. 상기 검출체는 살모넬라 엔테리티디스에 상기 단일가닥 DNA 앱타머가 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위한 것으로서, 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 상기 단일가닥 DNA 앱타머에 태깅되는 경우, 상기 검출체는 상기 단일가닥 DNA 앱타머에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 단일가닥 DNA 앱타머에 링크(공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있고, 특히 상기 검출체의 태깅 위치는 상기 단일가닥 DNA 앱타머의 5'-말단일 수 있다.
상기 단일가닥 DNA 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 30 내지 200 뉴클레오티드일 수 있으며, 약 100 뉴클레오티드 이하인 것이 바람직하고, 약 80 뉴클레오티드 이하인 것이 더욱 바람직하며, 보다 효율적인 30 내지 40 뉴클레오티드 길이인 것이 가장 바람직하다. 상기 단일가닥 DNA 앱타머를 이루는 총 뉴클레오티드수가 적을수록 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고 경제적이며, 생체내 안정성도 높고 독성이 낮을 수 있다.
전형적으로, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 표적인 살모넬라 엔테리티디스의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 수득될 수 있으며, 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 공지되어 있다. 특히, 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment) 방법으로 공지된 시험관내 또는 생체내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 상기 SELEX 방법에서, 반복 회수를 늘리거나 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 앱타머를 농축 및 선별할 수 있다. 따라서, 상기 SELEX 빙밥에서 반복 회수를 조절하거나 경합 상태를 변화시킴으로써 결합력이 상이한 앱타머, 결합 형태가 상이한 앱타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 앱타머를 얻을 수 있다. 또한, 상기 SELEX 방법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.
특히, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 1) PCR 및 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 단일가닥 앱타머를 선별하는 단계; 및 2) SELEX 기법을 통해 살모넬라 엔테리티디스에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 선별될 수 있다.
상기 단계 1)의 단일가닥 DNA 앱타머 선별에 있어서, PCR을 이용하여 증폭한 이중가닥 DNA 중 단일가닥 DNA만을 증폭하기 위해 비대칭 PCR을 수행할 수 있다. 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 중 하나의 프라이머, 예를 들면, 정방향 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA를 수득할 수 있게 된다.
상기 단계 2)는 최적 친화성을 갖는 SELEX 라운드에서 살모넬라 엔테리티디스 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝 단계; 및 선별된 살모넬라 엔테리티디스 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열 결정 단계로 이루어지질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 식중독균에 대한 신규한 진단 탐침을 발굴하기 위하여, 식중독균인 살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하였다. 먼저, 화학적으로 합성된 단일가닥 DNA 라이브러리로부터 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 대해 CELL-SELEX 방법을 이용하여 앱타머 후보 단일가닥 DNA를 선별하였다. 상기 CELL-SELEX 방법은 배양된 세포를 목표 분자로 이용하기 때문에 특정 분자의 분리, 정제 단계가 생략되며 세포표면의 분자의 구조가 원형으로 보존이 되기 때문에 차후 임상에 적용시 진단이 가능한 장점이 있다. 이와 같이 선별된 앱타머 후보 단일가닥 DNA의 염기서열을 분석한 후, 살모넬라 엔테리티디스에 대해 특이적으로 결합하고 서열 유사성을 갖는 7 종류의 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하였다(표 4 참조).
또한 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기와 같이 선별된 단일가닥 DNA 앱타머의 결합 능력을 확인하기 위하여, FAM 형광물질로 태깅된 단일가닥 DNA 앱타머를 이용하여 살모넬라 엔테리티디스에 대한 결합력을 측정한 결과, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 단일가닥 DNA 앱타머의 결합 정도가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 또한, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 살모넬라균, 특히 살모넬라 엔테리티디스균, 보다 바람직하게는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 대한 결합에 있어서 특이성을 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
따라서, 상기 서열번호 4 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 단일가닥 DNA 앱타머는 식중독균 특히 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 대한 신규 탐침으로서 유용하다.
2. 살모넬라 엔테리티디스 검출용 조성물
본 발명의 다른 측면은 살모넬라 엔테리티디스 검출용 조성물 및 이를 이용한 살모넬라 엔테리티디스의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 단일가닥 DNA 앱타머를 포함한다.
본 발명의 상기 검출 방법은 1) 살모넬라 엔테리티디스가 존재하는 것으로 의심되는 시료와 상기 조성물을 접촉시키는 단계; 및 2) 살모넬라 엔테리티디스와 상기 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스의 검출 방법을 제공한다.
상기 단일가닥 DNA 앱타머에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 검출용 조성물 또는 검출 방법에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.
상기 단계 1)의 시료는 관심 있는 표적 물질 즉, 식중독균인 살모넬라 엔테리티디스가 존재하거나 또는 존재하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 대상으로서, 액체, 토양, 공기, 식품, 사료, 폐기물 및 동식물 중 어느 하나 이상에서 채취된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등일 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 상기 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물은 식품이나 동식물의 사료 등으로 이용될 수 있는 조직을 제공하는 것이면 특별히 제한되지 아니한다.
상기 단계 2)의 결합은 상기 DNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 검출할 수 있으며, 상기 DNA 앱타머에 부착된 검출체의 반응을 통해 검출할 수도 있다. 이때, 검출체의 분석은 일반적으로 알려진 검출체 분석방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 형광 물질을 상기 검출체로서 사용한 경우, 시료 내에 존재하는 살모넬라 엔테리티디스가 상기 형광 물질에 의하여 표지되므로, 상기 형광 물질의 발광 또는 색변화를 측정함으로써 살모넬라 엔테리티디스를 검출할 수 있다.
3. 식중독균 검출용 키트
본 발명의 또 다른 측면은 식중독균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 식중독균 검출용 키트는 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 단일가닥 DNA 앱타머를 포함한다.
상기 단일가닥 DNA 앱타머에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 식중독균 검출용 키트에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.
상기 식중독균 검출용 키트의 검출대상이 되는 식중독균은 살모넬라일 수 있고, 상기 식중독균은 살모넬라 엔테리티디스인 것이 더욱 바람직하고, 상기 식중독균은 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 식중독균 검출용 키트에 포함되는 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 상기 살모넬라 엔테리티디스와 같은 식중독균 이외에 다른 비살모넬라 박테리아에는 결합하지 않으므로 식품, 환경 시료 또는 생체 시료 중에 오염된 식중독균을 선택적으로 검출할 수 있다.
상기 식중독균 검출용 키트는 혼성화 반응에 필요한 시약을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 혼성화 반응에 필요한 시약은 본 기술분야에 통상적으로 이용되는 것들을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 추가로 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 포함할 수 있다.
상기 식중독균 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
살모넬라 엔테리티디스( Salmonella enteritidis ) KCCM 12021에 특이적인 앱타머의 선별
<1-1> PCR을 통한 단일가닥 DNA 라이브러리의 합성
먼저, 하기 서열번호 1의 염기서열로 표현되는 60 mer 길이의 단일가닥 DNA들의 라이브러리를 준비하였다. 상기 단일가닥 DNA 라이브러리는 (주)바이오니아(한국)에서 주문 제작하였다.
[서열번호 1]
5'-GCGCGGATCCCGCGC-(N)30-CGCGCGAAGCTTGCG-3'
상기 서열번호 1에서 밑줄 친 부분은 PCR 수행시 프라이머가 결합하는 부분으로서 고정된 서열이며, 상기 (N)30 부분은 A, G, C, T 염기가 임의로 배열되는 부분이다. 염기가 임의로 배열되는 부분에 의해, 분리되는 앱타머 분자의 서열이 결정된다.
상기와 같이 주문 제작한 단일가닥 DNA 라이브러리를 주형으로, 비대칭 PCR을 수행하여 상기 DNA 라이브러리를 증폭하였다.
상기 PCR 수행시 사용된 프라이머의 서열은 하기와 표 2와 같다. 여기에서 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 서열의 밑줄 친 부분은 차후 유전자 재조합을 위하여 제한효소자리(BamH1 및 HindⅢ)를 삽입하여 이용하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
정방향 프라이머 5'-GCGCGGATCCCGCGC-3' (Bam HI G/GATCC) 2
역방향 프라이머 5'-GCGCAAGCTTCGCGC-3' (Hind Ⅲ A/AGCTT) 3
상기 비대칭 PCR은, 사용한 프라이머의 농도를 달리하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA의 생성을 유도하는 것으로서, 정방향 프라이머를 역방향 프라이머 보다 10배 더 많이 첨가하여 상기 비대칭 PCR을 수행하였다.
상기와 같이 증폭시킨 PCR 산물은 2.5% 아가로즈 겔에 전기영동 하여 육안으로 확인하였다.
<1-2> 단일가닥 DNA 라이브러리의 추출
상기 실시예 <1-1>에서 증폭시킨 단일가닥 DNA 라이브러리를 Crush and Soak 방법으로 분리하였다. 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 PCR 산물을 12 % 아크릴아마이드젤에 전기영동하여 이중가닥과 단일가닥 DNA를 분리하였다. 전기영동 후 EtBr로 핵산을 염색한 후 단일가닥 DNA 밴드를 절단하였다. 절단된 겔을 Crush and Soak 버퍼(500 mM NH4OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA)에 분쇄하여 단일가닥 DNA를 추출하였다. 추출물을 원심분리하여 고형젤을 분리한 후, 에탄올 침전 등을 통하여 단일가닥 DNA를 정제함으로써, 단일가닥 DNA 라이브러리를 추출하였다.
상기와 같이 추출된 단일가닥 DNA 라이브러리는 UV/Vis 분광광도계를 사용하여 정량하여 Cell-SELEX에 이용하였다.
<1-3> 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 결합하는 앱타머의 선별
상기 실시예 <1-2>에서 추출한 단일가닥 DNA 라이브러리를 하기 표 3에 기재된 조건으로 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021과 반응시키는 Cell-SELEX를 10회 수행하였다. 상기 Cell-SELEX의 매회 마지막 단계에서 원심분리를 수행하고, 세척버퍼(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM KCl, 1 mM MgCl2)로 3회 세척함으로써 상기 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 결합되지 않은 DNA 앱타머를 제거하고, 상기 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 결합된 DNA 앱타머만을 분리하였다.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
염(NaCl) 농도(mM) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
세포수(개) 108 108 108 108 104 104 104 104 104 104
라이브러리 농도(㎍) 2 2 2 2 1 1 1 1 0.5 0.5
라이브러리 결합시간(분) 60 60 60 60 60 30 30 30 30 30
선별된 단일가닥 DNA 앱타머 서열 분석 및 특이적 결합 분석
<2-1> 앱타머의 서열 분석
유전자 재조합을 실시하여 상기 실시예 1에서 선별된 단일가닥 DNA 앱타머들의 핵산 서열을 분석하였다. 먼저, 상기 실시예 <1-3>과 같이 총 10회의 선별 실험에서 선별된 핵산 앱타머에 미리 지정한 제한효소를 처리하여 대장균용 플라스미드 벡터인 T-벡터에 삽입하여 접합을 유도하였다. 접합이 완료된 플라스미드 벡터를 대장균에 형질전환시켜 증폭시켰고, 상기 증폭된 플라스미드 벡터를 멤브레인으로 분리정제한 후, 삽입된 DNA 앱타머들의 서열을 분석하였다.
그 결과, 하기 표 4와 같이, 최종적으로 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 특이적으로 결합하는 7개의 신규 앱타머 서열이 확인되었으며, 상기 7개의 앱타머 서열 중에서 5개의 앱타머에서 AAAC 서열이 공통적으로 확인되었다.
서열번호 서열 빈출도
서열번호 4 CACACCGGAAGGGATGCCACCTAAACCCC 5
서열번호 5 CACAGATGACGTCTGGCACATAATTAACAC 4
서열번호 6 CCGATGTCCGTTAGGGCTCCTCCATAGATC 1
서열번호 7 CAGACAGTAAGGGATGCCGCCTAAACACC 2
서열번호 8 CGCACTGAAGTGGGATACCGCCTAAACGG 2
서열번호 9 CGCACTGAAGTGGGATACCGCCTAAACGG 3
서열번호 10 CAGACCGTAAGGGATGCCGCCTAAACACC 3
<2-2> 앱타머의 결합력 측정
상기 실시예 <2-1>에서 확인한 신규 앱타머 서열 7개 중에서, 공통 서열을 가지는 서열번호4의 앱타머와 그렇지 않은 서열번호5의 앱타머에 FITC 계열의 형형광표지 물질인 FAM(carboxyfluorescein)을 5'-말단에 연결하고, 결합버퍼(50 nM HEPES, 50 mM NaCl)에 농도 별(0 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM 및 20 μM)로 첨가하였다. 상기와 같이 서로 다른 농도의 앱타머들이 첨가된 결합버퍼에 1.0x108개의 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021을 현탁시키고, 1시간 동안 배양한 다음, 각 농도에서의 상기 두 앱타머들(서열번호 4 및 서열번호 5)의 형광발산 신호를 수집하여 해리상수(KD)를 분석함으로써, 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 대한 두 앱타머들의 결합력을 확인하였다.
그 결과, 서열번호 4의 앱타머와 서열번호 5의 앱타머는 KD 값이 각각 7±0.51 μM 및 5.1±1.08 μM으로 측정되어, 상기 두 서열 모두 마이크로몰 농도(μM) 수준의 결합력을 갖는 것을 확인하였다(도 1).
<2-3> 앱타머의 특이적 결합력 확인
상기 서열번호 4의 앱타머와 서열번호 5의 앱타머의 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 대한 특이적 결합(specificity)을 확인하기 위하여, 같은 그램음성 세균인 대장균(Escherichia coli DH5α) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonsa aeruginosa)와의 교차반응을 통하여 앱타머의 결합 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 서열번호4의 앱타머 및 서열번호5의 앱타머에 FITC 계열의 형형광표지 물질인 FAM(carboxyfluorescein)을 5'-말단에 연결하고, 결합버퍼(50 nM HEPES, 50 mM NaCl)에 농도 별(0 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM 및 6 μM)로 첨가하였다. 상기와 같이 서로 다른 농도의 앱타머들이 첨가된 결합버퍼에 각각 1.0x108개의 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021, E.coli DH5a 및 슈도모나스 애루지노사를 현탁시키고, 1시간 동안 배양한 다음, 각 농도에서의 상기 두 앱타머들(서열번호 4 및 서열번호 5)의 형광발산 신호를 수집하여 해리상수(KD)를 분석함으로써, 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에 대한 두 앱타머들의 결합특이성을 확인하였다.
그 결과, 동일 농도를 처리한 실험군에서 서열번호 4 및 서열번소 5의 두 앱타머 모두 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021에서 가장 높은 형광발산 신호가 수집되었다(도 2).
상기와 같은 결과로부터, Cell-SELEX에 의해 선별된 본 발명의 서열번호 4 내지 서열번호 10의 DNA 앱타머들은 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021 균의 표면에 특이적으로 결합함을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> DNA aptamer specifically binding to Salmonella Enteritidis and uses thereof <130> HY120085N <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library template sequence <400> 1 gcgcggatcc cgcgcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnncgcgc gaagcttgcg 60 60 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the library amplification <400> 2 gcgcggatcc cgcgc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the library amplification <400> 3 gcgcaagctt cgcgc 15 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 1 <400> 4 cacaccggaa gggatgccac ctaaacccc 29 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 2 <400> 5 cacagatgac gtctggcaca taattaacac 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 3 <400> 6 ccgatgtccg ttagggctcc tccatagatc 30 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 4 <400> 7 cagacagtaa gggatgccgc ctaaacacc 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 5 <400> 8 cgcactgaag tgggataccg cctaaacgg 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 6 <400> 9 cgcactgaag tgggataccg cctaaacgg 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 7 <400> 10 cagaccgtaa gggatgccgc ctaaacacc 29

Claims (9)

  1. 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) KCCM 12021 검출용 단일가닥 DNA 앱타머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021 검출용 단일가닥 DNA 앱타머.
  3. 제1항에 있어서, 상기 앱타머는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 검출체로 태깅(tagging)된 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021 검출용 단일가닥 DNA 앱타머.
  4. 삭제
  5. 제1항의 단일가닥 DNA 앱타머를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021 검출용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021 검출용 조성물.
  7. 제1항의 단일가닥 DNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 키트.
  9. 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021이 존재하는 것으로 의심되는 시료와 제1항의 단일가닥 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
    상기 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021과 상기 단일가닥 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021의 검출 방법.
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