CN103045602B - 一种能特异结合河豚毒素的dna适配子及其应用 - Google Patents

Abstract

为了提供一种分子生物学快速筛选检测河豚毒素的方法，本发明提供了一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子，并建立一种简便、快速筛选检测河豚毒素的DNA适配子-染料直接法。所述适配子是应用SELEX技术，从人工合成的全长为78个碱基的ssDNA文库中筛选获得的单链DNA（ssDNA），能特异结合河豚毒素。所述DNA适配子的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示；本发明将制备的DNA适配子应用于河豚毒素的分子生物学检测，检测限低。本发明的DNA适配子可通过PCR扩增或人工合成的方式制备，易于获得、长期保存。建立的河豚毒素DNA适配子-染料直接检测法，无需昂贵的仪器和复杂的操作，具有操作简便、成本低廉、快速、灵敏等优点。

Description

一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子及其应用

技术领域

 本发明具体涉及一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子及其应用。

背景技术

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是毒性最强的非蛋白类神经毒素之一，存在于河豚等多种海洋生物以及蝾螈、火晰蜴、青蛙、蟾蜍等动物体内，某些细菌（如弧菌属、假单胞菌属等）也可分泌TTX。TTX的分子式为C₁₁H₁₇N₃O₈，相对分子量为319.271，是一种小分子物质。TTX是钠离子通道阻断剂，直接影响神经肌肉兴奋性的传导，使得神经肌肉呈麻痹状态，甚至引起死亡。河豚毒素性质稳定，可使水源和食物等长期染毒，易经消化道吸收中毒，分散呈气溶胶状态的河豚毒素，亦可通过呼吸道吸入中毒。河豚毒素是一种强神经毒素，毒性大大超过包括有机磷毒剂在内的所有合成毒剂，它比氰化钠的毒性大1000多倍，国内外因食用河豚或织纹螺而导致河豚毒素中毒死亡的案例时有发生。此外，由于TTX已可人工化学合成，存在可能被恐怖分子利用的潜在威胁。这些使得对TTX的检测越来越被人们所重视。

河豚毒素检测方法有很多，包括生物法、酶免疫分析法、气相色谱法、液相色谱法、液相-质谱联用法等，但目前还未见分子生物学快速筛选检测方法。

适配子（aptamer）是通过指数富集配基的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术从人工合成的DNA或RNA随机库中筛选出来的，与非核酸靶物质特异结合的高亲和性单链寡核苷酸序列。SELEX技术是利用分子生物学技术，人工合成单链随机寡核苷酸文库（20－60个碱基），将随机寡核苷酸文库与靶物质相互作用，保留结合的寡核苷酸序列，经反复扩增、筛选，即可使与该靶物质特异结合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX技术发展非常迅速，已成功应用于许多靶物质如蛋白质、肽、病毒、细菌、有机物，甚至金属离子等的适配子的筛选。适配子包括DNA适配子和RNA适配子，DNA适配子的稳定性较好。适配子与靶物质的结合是由适配子的三维结构通过氢键、范德华力等与靶物质的特定区域结合的。适配子具有亲和力高、特异性强、靶物质范围广、制备及修饰容易、稳定性好、与靶物质的结合条件可调控、应用灵活等特点，在分子生物学、环境检测、食品卫生检验、生物毒素检测、毒理学等研究领域都有广阔的应用前景，凡是涉及抗体的诊断领域几乎都可以用适配子代替，且优于抗体。

因此，本发明以河豚毒素为靶物质，采用SELEX技术，结合克隆、测序、亲和力测定等方法制备了能特异结合河豚毒素的DNA适配子，并建立了河豚毒素的DNA适配子-染料直接检测法，将制备的DNA适配子应用于河豚毒素的分子生物学检测，达到简便、快递筛选河豚毒素的目的。

发明内容

为了提供一种分子生物学快速筛选检测河豚毒素的方法，本发明提供了一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子，并建立一种简便、快速筛选检测河豚毒素的DNA适配子-染料直接法。

本发明提供了一种DNA适配子，所述适配子是应用SELEX技术，从人工合成的全长为78个碱基的ssDNA文库中筛选获得的单链DNA（ssDNA），能特异结合河豚毒素。

所述DNA适配子的核苷酸序列为（SEQ ID NO.1）：

5‘-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCCTGCCGGGGGCTTCTCCTTGCTGCTCTGCTCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3‘。

本发明另外还提供了上述DNA适配子的应用，是将所述DNA适配子用于筛选检测河豚毒素。

所述DNA适配子用于筛选检测河豚毒素是采用DNA适配子-染料法，其能在2小时内快速筛选检测河豚毒素。

所述DNA适配子-染料法的具体步骤如下：

    取5μL浓度为10pmol/L的DNA适配子的dsDNA于1.5mL离心管中，加入589μL pH7.5的0.01mol/L磷酸缓冲液，再加入6μL河豚毒素待测样品，同时以1%乙酸溶液代替河豚毒素待测样品作为空白对照，室温下孵育lh。孵育结束后，取孵育后的溶液198μL于酶标微孔中，同时以0.01mol/L磷酸缓冲液作为背景信号对照，各加入2μL染料Eva Green，充分结合10min后，用多功能酶标仪于激发波长为485nm、发射波长为533nm处测定荧光强度值，当对照溶液与待测样品的荧光差值大于背景信号时，可判定为河豚毒素初筛阳性。

DNA适配子-染料直接法筛选检测河豚毒素的检出限为10^-6mo1/L，即为3.19×10^-4mg/mL。

本发明的显著优点：

目前，河豚毒素检测方法有生物法、酶免疫分析法、色谱法、液相-质谱联用法等。鼠生物法是测定TTX的传统方法，但该法与小鼠个体差异显著相关，且操作复杂。用酶免疫分析法测定河豚毒素，需要制备河豚毒素的抗体，而河豚毒素是小分子物质，其抗体尤其是单克隆抗体很难制备。色谱法、液相-质谱联用法等虽然特异性强、灵敏度高，但都需要昂贵的仪器。

本发明以河豚毒素为靶物质，采用SELEX技术，制备了能特异结合河豚毒素的DNA适配子，并建立了河豚毒素的DNA适配子-染料直接检测法，将制备的DNA适配子应用于河豚毒素的分子生物学检测，检测限低。本发明的DNA适配子可通过PCR扩增或人工合成的方式制备，易于获得、长期保存。建立的河豚毒素DNA适配子-染料直接检测法，无需昂贵的仪器和复杂的操作，具有操作简便、成本低廉、快速、灵敏等优点。

附图说明

图1为适配子的二级结构；

图2为应用DNA适配子检测TTX的原理示意图；

图3 为反应体系的pH值对荧光强度检测的影响；

图4为染料结合时间对荧光强度检测的影响；

图5 为TTX检出限的测定结果。

具体实施方式

实施例所需的试验材料：

河豚毒素：购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥99%（HPLC），用1%乙酸溶液将河豚毒素稀释至浓度为1mol/L，4℃保存备用。

根据体外人工合成的ssDNA文库的两端固定序列，设计并合成以下引物：

引物Ⅰ（SEQ ID NO.2）：5’-GGG AGC TCA TAA ACG CTC AA-3’，

引物Ⅱ（SEQ ID NO.3）：5’-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3’，

引物Ⅲ（SEQ ID NO.4）：5’-地高辛- GGG AGC TCA TAA ACG CTC AA-3’，

引物Ⅳ（SEQ ID NO.5）：5’-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3’。

引物用TE溶液（pH8.0）稀释至浓度为10μmol/L，-20℃保存备用。

染料EvaGreen购自北京美莱博医学有限公司(Biotium，美国)。

实施例1：能特异结合河豚毒素的DNA适配子

 1、DNA适配子的核苷酸序列

从体外人工合成的两端为固定序列、中间为35个随机序列、全长为78个碱基的ssDNA文库，采用SELEX技术、结合诱变PCR技术，通过克隆、测序、亲和力测定等手段，筛选获得与河豚毒素（TTX）特异结合的单克隆DNA适配子。DNA适配子的核苷酸序列为：

5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCCTGCCGGGGGCTTCTCCTTGCTGCTCTGCTCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。

2、 DNA适配子的二级结构

用DNAMAN软件分析，得到河豚毒素DNA适配子的二级结构（图1）。

、DNA适配子与河豚毒素的亲和力

以DNA适配子为模板，用引物Ⅲ、引物Ⅳ进行PCR扩增。将PCR产物用链酶亲和素磁珠吸附，得到含地高辛标记的ssDNA。利用地高辛-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统，通过测定吸光值来反映适配子与河豚毒素的亲和力。结果显示，DNA适配子与河豚毒素的亲和力为1.254。

实施例2 ：检测河豚毒素的DNA适配子-染料直接法的建立

、检测原理

检测原理如图2所示，利用荧光嵌入染料EvaGreen在单双链DNA溶液中产生不同的荧光的特点建立了基于核酸适配子的TTX检测体系。由于绿色荧光染料EvaGreen本身没有荧光，与dsDNA作用时，EvaGreen嵌合到dsDNA中，产生较强的荧光信号。当dsDNA与TTX孵育后，TTX能识别与其特异性结合的适配子，并形成核酸适配子-TTX复合物，使dsDNA的双链解开，dsDNA变成ssDNA，嵌合的荧光染料EvaGreen从dsDNA中得以释放，从而导致系统荧光信号骤然减弱，通过检测系统中荧光信号的变化强度就可定性或定量TTX。

2、实验步骤

取DNA适配子的dsDNA，加入0.01mol/L磷酸缓冲液，再加入河豚毒素待测样品，室温下孵育lh。孵育结束后，加入2μL染料Eva Green，充分结合一段时间后，用多功能酶标仪于激发波长为485nm、发射波长为533nm处测定荧光强度值，通过荧光信号的变化来筛选检测待测样品中的河豚毒素。

3、 检测方法的建立

    以DNA适配子为模板，用引物Ⅰ、引物Ⅱ进行PCR扩增。纯化PCR产物，得到DNA适配子的dsDNA，用于以下研究。

3.1、PBS缓冲液pH值的确定

分别取稀释好的浓度为10pmol/L的dsDNA 5μL于5个编号为1～5的l.5mL 离心管中，并向各管中分别加入570μL的pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.01mol/L PBS，再分别加入1mmol/L的TTX溶液6μL，最后加入0.01 mol/L 的PBS至600μL，置于室温下孵育lh。孵育结束后，取198μL TTX与dsDNA反应后的混合液，向每管中加入2μL染料EvaGreen，充分结合10min后，用多功能酶标仪测定其荧光强度值，设置仪器激发波长为485nm，发射波长为533nm，重复试验三次，取其平均值。

结果如图3所示，可看出：不同pH值的PBS缓冲液对荧光强度的检测具有显著的影响。当pH值为7.5时，反应检测所得的荧光强度值最小，即荧光变化值最大，说明在pH7.5时，缓冲液对反应体系的影响最小。这是因为荧光强度的变化由染料EvaGreen的释放量来决定，而染料EvaGreen的释放量又受适配子-TTX结合程度的影响，而pH值能够影响适配子-TTX复合物的解离，在pH7.5时，适配子-TTX复合物的解离程度最小，因此该pH7.5是本反应体系的最适pH值。

3.2、染料结合时间的确定

取稀释好的浓度为10pmol/L的dsDNA 10μL，加入pH7.5、0.01mol/L的PBS 570μL，再加入1mmol/L的TTX 6μL，然后置于室温下孵育lh，孵育结束后，取198μL TTX与dsDNA反应后的混合液，加入2μL染料EvaGreen，间隔一定时间（lmin）测定反应后溶液的荧光强度值。

结果如图4所示，在加入染料后，前10min内荧光强度呈现明显的上升趋势，在10min时达到最大值，之后荧光强度值逐渐下降。结果表明绿色荧光核酸染料EvaGreen与DNA适配子的最佳孵育时间为10min，此时二者结合最稳定，解离程度也最小。出现此现象的原因可能是：染料与核酸适配子的结合处于一个动态的变化过程，在不断的结合同时又不断的解离，所以它们需要反应一段时间才能达到平衡，而只有当它们处于结合的最佳状态时，体系才会产生最大荧光，所以在10min之前荧光值伴随着二者的结合而逐渐上升；染料与核酸适配子结合后也会出现缓慢淬灭，所以在达到最大荧光强度后又开始逐渐减弱。

3.3、DNA适配子-染料直接法的具体步骤

根据3.1、3.2的试验结果，确定河豚毒素的DNA适配子-染料直接法的具体步骤为：取5μL浓度为10pmol/L的DNA适配子的dsDNA于1.5mL离心管中，加入589μL pH7.5的0.01mol/L磷酸缓冲液，再加入6μL河豚毒素待测样品，同时以1%乙酸溶液代替河豚毒素待测样品作为空白对照，室温下孵育lh。孵育结束后，取孵育后的溶液198μL于酶标微孔中，同时以0.01mol/L磷酸缓冲液作为背景信号对照，各加入2μL染料Eva Green，充分结合10min后，用多功能酶标仪于激发波长为485nm、发射波长为533nm处测定荧光强度值，当对照溶液与待测样品的荧光差值大于背景信号时，可判定为河豚毒素初筛阳性。

3.4、DNA适配子-染料直接法对TTX的检出限

用1%乙酸溶液将TTX进行10倍系列稀释，取浓度为10^-1mol/L、10^-2mol/L、10^-3mol/L、10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L各6μL，按照3.3的方法，进行检测。

DNA适配子-染料直接法是根据检测待测样品与对照溶液的荧光信号的差值来判定待测样品中是否含有河豚毒素的，差值大表明河豚毒素含量高，差值小则表明河豚毒素含量低。结果显示背景信号对照的荧光强度（吸收值）很低，仅为19.57。由图5可知，空白对照（1%乙酸溶液）的荧光强度为324.5， 随着TTX浓度的减小，所测得的荧光信号与空白对照的差值越来越小。当TTX浓度为10^-7mo1/L时，所测得的荧光信号与空白对照差值很小，接近于背景信号值，表明建立的方法对浓度为10^-7mo1/L的TTX的检测效果不理想。因此，建立的方法检测TTX的保守检测限可低至10^-6mo1/L 。

TTX的分子式为C₁₁H₁₇N₃O₈，相对分子量为319.271。当TTX浓度为10^-6mo1/L时，换算成质量浓度时约为3.19×10^-4mg/mL。而现行采用的用于测定河豚毒素的GB/T23217-2008《水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测法》中对河豚毒素标准品的检出限为5×10^-2mg/mL。由此可见，本发明建立的河豚毒素DNA适配子-染料直接法的检出限低于现行标准，已经能满足日常检测的需求。

实施例3：河豚毒素DNA适配子-染料直接检测法的初步应用

河豚毒素主要存在于河豚的性腺、肝脏、脾脏、肾脏、眼睛、皮肤、血液等部位，肉多为弱毒或无毒，因此我们选取鱼的内脏（肝脏、脾脏、肾脏）进行河豚毒素测定的试验。

从送检样品中收集河豚鱼、非洲鲫鱼、草鱼、带鱼、菇鱼、大黄鱼6种试验材料，分别取其内脏（肝脏、脾脏、肾脏），匀浆，称取5.00g匀浆试样，按照GB/T23217-2008的7.1 提供的方法，提取河豚毒素。

按照3.3建立的DNA适配子-染料直接法对以上各样品的提取液进行河豚毒素的测定，以1%乙酸溶液为对照溶液。结果如表1所示，仅河豚鱼的荧光差值很多，且大于背景信号，即表明其河豚毒素初筛结果为阳性，其他鱼样品为阴性。

表1  鱼样品中河豚毒素的筛选检测结果

<110>福建出入境检验检疫局检验检疫中心

<120>一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子及其应用

<160>5

<210> 1

<211>78

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gggagctcag aataaacgct caaccctgcc gggggcttct ccttgctgct ctgctctgtt cgacatgagg 60

cccggatc 78

 

<210> 2

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

gggagctcat aaacgctcaa 20

 

 

<210> 3

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

gatccgggcc tcatgtcgaa 20

 

<210> 4

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

gggagctcat aaacgctcaa 20

 

<210> 5

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

gatccgggcc tcatgtcgaa 20

Claims (1)

1.一种DNA适配子，其特征在于：所述适配子是应用SELEX技术，从人工合成的全长为78个碱基的ssDNA文库中筛选获得的单链DNA，能特异结合河豚毒素；所述DNA适配子的核苷酸序列为：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCCTGCCGGGGGC TTCTCCTTGCTGCTCTGCTCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。