CN109142710B

CN109142710B - 一种快速灵敏检测河豚毒素ttx的方法

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Publication number: CN109142710B
Application number: CN201811019418.1A
Authority: CN
Inventors: 兰艺凤; 卫艳丽; 宋秀丽; 董川
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2038-09-03
Also published as: CN109142710A

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，为了解决现有测定方法存在的测定时间长、反应灵敏度低、选择性差、以及测定成本高昂等问题，提供了一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，将河豚毒素核酸适配体、小檗碱加入到磷酸缓冲溶液中，以小檗碱为荧光探针，河豚毒素核酸适配体为识别单元，加入待测物河豚毒素后诱导核酸适配体结构改变，核酸适配体与荧光探针小檗碱的结合受到影响，引起体系荧光信号改变，检测体系荧光强度值，计算获得待测物含量。简便、成本低、并且灵敏度高、选择性好，可用于实际生物样品的检测具有潜在的应用价值。

Description

一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，利用小檗碱作为荧光探针检测TTX，在检测物TTX存在时诱导适配体结构的变化与荧光探针结合，实现荧光信号的变化。

背景技术

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种毒性很强的小分子生物碱。其分子式为C₁₁H₁₇O₈N₃，分子量为319，该物质化学性质稳定，对热、日光、酶类、盐类及酸稳定，易溶于稀醋酸中。TTX的化学结构式如图1所示，为氨基全氢喹唑啉型化合物，最早是从河豚鱼中分离得到，近年来还发现河豚毒素不仅存在于河豚属的鱼类，还存在于虾虎鱼、章鱼、海星、蟹类以及腹足类，甚至还有鲎等众多的海洋生物中。河豚毒素毒性极强，食用0.5mg就可致人死亡，TTX通过与钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠通道，从而阻滞动作电位导致与之相关的生理活动障碍，使人感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。目前还没有有效的解毒药。介于河豚毒素的严重危害，且化学性质稳定一般的烹饪手段并不能降解，有必要建立一种简便、快速高效检测河豚毒素的方法。

核酸适配体是指能够通过空间构型互补与配体特异性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列，英文名aptamer（源自于拉丁语 aptus，即适合配对之意）核酸适配体的出现源于1990年美国的Tuerk和Ellington提出的指数富集配体系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，这种通过独立地建立核酸文库，并从核酸文库里筛选出的能与多种靶分子高亲和性、高特异性结合的DNA或RNA寡核苷酸片段即核酸适配体。基于单链核酸适配体空间构象的多样性，当配体存在时，能够通过静电作用、氢键作用、范德华力、碱基配对或者形状匹配等作用形成稳定的三维空间结构，如假结(pseudoknot)、发卡(hairpin)、G-四链体(G- quadruplex)、凸环(bulge)等，进而特异性地结合各类靶分子，如金属离子、药物分子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质、病毒、细胞甚至整块组织等。由于其对应的靶分子范围甚广，大大拓宽了其应用领域，因此，核酸适配体被认为是构建传感器最理想的识别元件之一。

核酸适配体荧光传感器：荧光法是核酸适配体传感体系中应用最为普遍的光学检测方法，荧光法易操作、成本低、反应快且荧光检测技术中核酸适配体与荧光物质的作用方式灵活多样，荧光适配体传感平台是通过监测体系微环境变化所引起的荧光强度或荧光各向异性改变实现检测的，大多数荧光核酸适配体传感平台基于目标分子和核酸适配体亲和作用引起荧光强度的变化来检测目标分子；或者分别将荧光基团和猝灭基团标记于核酸适配体链端，通过将目标分子引入体系中引发荧光强度信号改变来定量分析待测物。

荧光探针小檗碱(Berberine)，亦称黄连素，是重要的异喹啉生物碱，小檗碱平面结构中含有可拓展的π-π体系，自身带部分正电荷，在水介质中几乎没有荧光，而保护性介质DNA加入后，由于DNA分子的碱基堆积作用以及互补碱基之间的氢键作用，为小檗碱分子提供了良好的疏水环境，另一方面，由于双螺旋DNA分子存在沟槽空间，加上小檗碱分子结构的空间效应，使得小檗碱更容易嵌入DNA中。同时，从静电作用看，小檗碱分子自身所带正电荷与DNA的磷酸骨架的负电荷也对二者的键合有贡献。因此，小檗碱分子嵌入易于嵌入DNA双螺旋结构中，从而使其荧光信号显著增强，基于它们较强的相互作用引起体系荧光强度的变化可进一步构建探针/核酸适配体荧光传感体系并用于靶分子检测。

TTX的检测技术研究始自20世纪60年代，传统的检测技术主要有生物检法；液相色谱法、色谱-质谱联用法、荧光光度法、以及以酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫层析法(LFIA)等。

（1）小鼠检测法是测定TTX的传统方法，具有直观、快速、症状典型易于判断、易于操作、费用低等优点，且不需要特殊设备，其检测精度能满足水产品安全监测要求等特点，但是该方法与小鼠的个体差异显著相关，重复性差且易受到共存氨基酸和无机离子的影响而导致结果偏低等缺点，因此该方法未被普及。

（2）色谱法，HPLC为常用的色谱法测定TTX，该该方法灵敏度较高(0.2～9.6 μg/ml)，但样品前处理复杂，且所用仪器昂贵、检测费用相对较高。

液质联用和气质联用也用于测定TTX的含量，检测限能达到10ng/ml，检测过程简单、快速，同时配有高灵敏度的检测器，比较灵敏，是常用的检测方法之一，但对样品纯度要求较高。其缺点在于样品处理比较麻烦，所用仪器设备昂贵，检测成本高。

（3）免疫分析法，具有快速、灵敏，操作相对简单且专一性好等优点，在现代检测领域得到了快速发展，但该方法需要制备TTX抗体，而TTX是小分子物质，其抗体尤其是单克隆抗体很难制备，且操作步骤较为繁琐，所需检测时间较长一般需3小时左右。

（4）荧光分光光度法是最早建立起来的定量检测TTX的仪器方法，其原理是通过检测荧光化合物C9碱来测定TTX的量。检出限为0.3 mg/ml。TTX在碱性条件下生成C9碱的同时，也定量生成草酸钠，后者在230 nm处有明显的吸收峰，根据此建立的紫外分光光度法检出限为0.02～0.1 mg/ml。

荧光适配体传感技术是通过目标分子诱导适配体构型的变化与荧光探针结合引起荧光信号的变化建立的一种分析方法。具有操作简便、反应迅速、选择性好灵敏度高等优势，本发明构建了一种、无毒、生物相容性好的荧光探针、并构建了免标记的核酸适配体荧光传感平台检测TTX，操作简便快速、选择性好、灵敏度高，具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明为了解决现有测定方法存在的测定时间长、反应灵敏度低、选择性差、以及测定成本高昂等问题，提供了一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，利用小檗碱作为荧光探针检测TTX，在检测物TTX存在时诱导适配体结构的变化与荧光探针结合，实现荧光信号的变化。

本发明由如下技术方案实现的：一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，将河豚毒素核酸适配体、小檗碱加入到磷酸缓冲溶液中，以小檗碱为荧光探针，河豚毒素核酸适配体为识别单元，加入待测物河豚毒素后诱导核酸适配体结构改变，核酸适配体与荧光探针小檗碱的结合受到影响，引起体系荧光信号改变，检测体系荧光强度值，计算获得待测物含量。河豚毒素核酸适配体为：TTX-aptamer：5’-ttt tta aag tgt gcc cac gga gcc gacagg-3’。

具体步骤如下：

（1）制作标准曲线：将氯化镁溶液、核酸适配体、荧光探针小檗碱分别加入磷酸盐缓冲溶液中，控制体系pH值为7.5，氯化镁浓度为2.0～2.5 mM，磷酸缓冲液浓度为1 mM～10mM，荧光探针小檗碱浓度为20-40μM；核酸适配体浓度为0.3-0.6μM；然后加入若干浓度梯度的TTX，室温静置5-10min后测定溶液在激发波长为365 nm，发射波长为530 nm下的荧光强度F，以不加TTX的溶液的荧光强度为F₀，以TTX的浓度为横坐标，荧光强度变化值(F-F₀)/F₀为纵坐标，建立标准曲线及线性回归方程；

（2）测定实际待测生物样品中TTX的含量：待测生物样品中加入含有不同浓度的TTX，具体操作同步骤（1），测定溶液的荧光强度值，将得到的荧光强度值代入步骤一中所得到的线性回归方程中，计算得到实际待测生物样品中的TTX含量。

所述TTX的浓度梯度指TTX浓度至少包括3、30、150、300、400、500 nM。

本发明与现有测定方法相比，操作简便，样品不需要复杂的前处理且检测所需时间短，相比于免疫分析法需要3小时的反应时间，本发明构建的免标记核酸适配体荧光传感体系反应时间短，检测一份样品仅需5～10 min。

核酸适配体是一种人工体外合成的DNA或RNA,合成过程简单，具有稳定的二级结构，对靶分子具有高特异性和高亲和性，易于化学修饰和功能化，靶分子范围及其广泛，无机离子、有机小分子、生物大分子、蛋白质、酶甚至细胞均可能存在与之对应的高特异性亲和适配体。

小檗碱(Berberine)平面结构中含有可拓展的π-π体系，自身带部分正电荷，而DNA具有磷酸骨架带负电荷，小檗碱与DNA由于静电作用易于键合。

DNA分子的碱基堆积作用以及互补碱基之间的氢键作用，为小檗碱分子提供了良好的疏水环境。双螺旋DNA分子存在沟槽空间，加上小檗碱分子结构的空间效应，使得小檗碱更容易嵌入DNA中。

小檗碱分子嵌入易于嵌入DNA双螺旋结构中，从而使其荧光信号显著增强，基于它们较强的相互作用引起体系荧光强度的变化可进一步构建小檗碱/核酸适配体荧光传感体系并用于靶分子检测，小檗碱与适配体荧光传感分析法集合了各自的优点，具有荧光背景信号低、与适配体特异性结合等特点。

本发明构建了一种免标记的核酸适配体传感器用于TTX的检测,不仅简便、成本低、并且灵敏度高、选择性好，可用于实际生物样品的检测具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为TTX的化学结构式；图2为体系pH值考察折线图；图3为体系氯化镁浓度考察折线图；图4为小檗碱在PBS缓冲溶液中的荧光光谱随浓度变化图，插图为小檗碱（6.65～67.0 μM）的荧光散点图；图5为小檗碱的荧光强度在适配体存在情况下随TTX浓度增加的变化图；图6为核酸适配体浓度考察折线图；图7为TTX标准曲线图；图8为传感体系选择性考察图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本方法做进一步说明。

实施例1：一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，将河豚毒素核酸适配体、小檗碱加入到磷酸缓冲溶液中，以小檗碱为荧光探针，河豚毒素核酸适配体为识别单元，加入待测物河豚毒素后诱导核酸适配体结构改变，核酸适配体与荧光探针小檗碱的结合受到影响，引起体系荧光信号改变，检测体系荧光强度值，计算获得待测物含量。河豚毒素核酸适配体为：TTX-aptamer：5’-ttt tta aag tgt gcc cac gga gcc gac agg-3’。

具体步骤如下：

（1）制作标准曲线：将浓度为1.0 M的氯化镁，浓度为100 μM的核酸适配体和浓度为2.0 mM的荧光探针加入到浓度为1 mM的磷酸盐缓冲溶液中，作为空白溶液，测定溶液在特定波长下的荧光强度记为F₀；

（2）取不同浓度的TTX标准溶液，参照步骤（1）的方法加入到磷酸缓冲溶液中，作为对照溶液，室温静置5～10 min后，测定溶液在激发波长为365 nm，发射波长为530 nm下的荧光强度记为F；TTX的浓度梯度指TTX浓度至少包括3、30、150、300、400、500 nM；

（3）以TTX浓度为横坐标，(F-F₀)/F₀为纵坐标，建立标准曲线及线性回归方程。

实验例1：考察体系的最佳pH。选取五份不同pH溶液的缓冲溶液，（pH为6.5～8.5）分别加入氯化镁，核酸适配体、TTX，最后加入荧光探针，混匀静置5～10 min，测定530 nm波长处的荧光强度。同法配制空白溶液。结果见图2。由图2可知,体系的pH值为7.5时，(F-F₀)/F₀值变化最大，拟将体系的pH定为7.5。

实验例2：盐溶液浓度的考察。选取不同盐浓度（0.5 mM～3.0 mM）的缓冲溶液，加入核酸适配体、TTX，最后加入荧光探针，混匀静置5～10 min，测定体系的荧光强度。同法配制空白溶液。结果见图3。由图3可知,溶液的氯化镁浓度为2.0～2.5 mM时，(F-F₀)/F₀值变化最大，拟将体系的氯化镁浓度定为2.0～2.5 mM。

实验例3：荧光探针浓度考察。考察了小檗碱在1 mM PBS (pH=7.5，2.0～2.5 mMMgCl₂) 缓冲液中体系的荧光强度随小檗碱浓度变化的线性范围。小檗碱浓度（6.65 mM～67.0 mM）。结果见图4。同时，考察了小檗碱的浓度对适配体传感体系荧光强度的影响，结果见图5。从图中可知，小檗碱浓度为20μM、40μM时，随着TTX浓度的增加，荧光信号强度变化较大，因此该体系中选择的小檗碱浓度为20～40μM。

实验例4：适配体浓度考察。对TTX-aptamer浓度(0～1.5 μM)进行了考察，结果见图6，从图6中可见，随TTX-aptamer浓度的增加，体系的荧光信号增强。并且TTX-aptamer在0～1.5μM的浓度范围内与荧光强度成良好的线性关系（R²=0.9996,图6中插图)。为了减小背景干扰，故将体系中核酸适配体的浓度定为0.3～0.6 μM。

TTX标准曲线见图7。TTX在3～500 nM范围内呈良好的线性，检出限为0.21 nM。

实验例5：传感体系选择性考察。通过考察K⁺、 Cl^-、CO₃ ^2- 、PO₄ ^3-、半胱氨酸、抗坏血酸、谷胱甘肽、天冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸及葡萄糖等干扰物的荧光响应,测试了传感体系的选择性。如图8所示，仅TTX引起显著的信号增强，而其它物质即使浓度是TTX 的10倍，也几乎没有引起荧光变化。源于TTX适配体对其目标分子特异性的识别能力，实验结果表明本文构建的适配体传感体系对TTX具有较高的选择性。

实施例2：测定实际待测生物样品血清中TTX的含量：将血液离心后取上清液血清，结果显示血清中不含TTX。同时采用标准加入法将不同浓度的TTX标准溶液加入到血清中，进行回收率试验，数据为六次实验结果的平均值，结果见表1，回收率为99.18%～102.03%，结果进一步证实了本发明方法应用于人血清中TTX浓度准确检测的可行性。

表1.血清中TTX检测及回收率表

样品	加入［TTX］/nM	检测［TTX］/nM	回收率/%	RSD/%
					血清	0	0	-	-
	30	30.61	102.03	5.74
						150	152.59	101.73	1.35
	250	247.96	99.18	3.45
						300	303.83	101.28	0.99
	400	402.06	100.52	1.76

该方法与报道的方法在线性范围和检出限比较，结果见表2。

表2.测定TTX含量的方法比较表

方法	检测范围 /ng mL<sup>-1</sup>	检出限/ng mL<sup>-1</sup>
			ECL	0.5~5000	0.1
ELISA	5~500	4.44
			ECS	0.23~1.07	0.199
Immunoassay	5~5000	0.1
			SPR sensor	0.01~10000	0.3
UCF sensor	0.1~100000	0.06
			Berberine/TTX-aptamer	0.957~159.5	0.066

Claims

1.一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，其特征在于：将河豚毒素核酸适配体、小檗碱加入到磷酸缓冲溶液中，以小檗碱为荧光探针，河豚毒素核酸适配体为识别单元，加入待测物河豚毒素后诱导核酸适配体结构改变，核酸适配体与荧光探针小檗碱的结合受到影响，引起体系荧光信号改变，检测体系荧光强度值，计算获得待测物含量；

所述河豚毒素核酸适配体为：TTX-aptamer：5’-ttt tta aag tgt gcc cac gga gccgac agg-3’；

具体步骤如下：

（1）制作标准曲线：将氯化镁溶液、核酸适配体、荧光探针小檗碱分别加入磷酸盐缓冲溶液中，控制体系pH值为7.5，氯化镁浓度为2.0～2.5 mM，磷酸缓冲液浓度为1 mM～10 mM，荧光探针小檗碱浓度为20-40μM；核酸适配体浓度为0.3-0.6μM；然后加入若干浓度梯度的TTX，室温静置5-10min后测定溶液在激发波长为365 nm，发射波长为530 nm下的荧光强度F，以不加TTX的溶液的荧光强度为F₀，以TTX的浓度为横坐标，荧光强度变化值(F-F₀)/F₀为纵坐标，建立标准曲线及线性回归方程；

2.根据权利要求1所述的一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，其特征在于：所述TTX的浓度梯度指TTX浓度至少包括3、30、150、300、400、500 nM。