CN110118761A - 一种信号增强型人血清atp荧光传感器 - Google Patents

一种信号增强型人血清atp荧光传感器 Download PDF

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Abstract

本发明属生物化学领域，涉及一种荧光增强型传感器，尤其涉及一种基于富G的DNA功能化分裂适配体构建的检测ATP荧光增强型传感器。该传感器利用两条分裂ATP适配体与富含鸟嘌呤（G）的DNA序列连接，通过形成G‑四链体/AMT复合物有效猝灭AMT的荧光，并同时保持分裂ATP适配体对其靶标的识别能力。在最佳条件下，所开发的适体传感器在0.1μM~1.5mM的ATP浓度范围内检测具有高选择性和良好的准确度，通过3σ/K公式计算出检测限（LOD）为8 nM。将其应用于分析人血清中加标检测ATP，其灵敏度、选择性和准确度高，是一种新型传感器。

Description

一种信号增强型人血清ATP荧光传感器
技术领域
本发明属生物化学领域，涉及一种荧光增强型传感器，尤其涉及一种基于富 G的DNA功能化分裂适配体检测ATP荧光增强型传感器。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)是带三个负电荷的磷酸盐，是生物体中最关键和必不 可少的生物分子之一。ATP是生物体中最直接的能量源，它在水解过程中释放出 大量的能量。ATP在细胞的各种生理和病理过程中起重要作用。此外，异常的ATP 含量与许多疾病有关，如心血管疾病，帕金森病，阿尔茨海默病等。然而，ATP 和二磷酸腺苷(ADP)可以快速转化，细胞中的ATP含量低且处于动态平衡状态。 因此，准确测定ATP具有重要意义。特别是建立用于检测生物液体中目标物的临 床应用新方法是具有挑战且有吸引力的。迄今为止，已经提出了许多方法来检测 ATP，例如毛细管电泳(CE)，荧光探针，高效液相色谱(HPLC)，比色法等。然而大多数这些已经报道的检测技术具有一定限制，例如灵敏度不足，耗时的构 造方法，检测需要复杂的仪器。其中以荧光为基础的检测方法最受欢迎，主要是 由于其高灵敏度，反应快速，能够体内或体外成像(Bhowmik,S.；Ghosh,B.N.； V.；Rissanen,K.,Nanomolar pyrophosphate detection in water and in a self-assembled hydrogelof a simple terpyridine-Zn2+complex.J.Am.Chem.Soc.2014, 136,5543-5546)。建立可用于ATP检测的荧光检测方法用于实际临床是有价值的。 适体是从核酸分子文库中获得的DNA或RNA序列，通常通过指数富集(SELEX) 系统进化获得配体。适体对各种目标物质具有高度特异性，因此被广泛使用在生 物传感器领域。适体易于合成，更稳定，成本更低，并且具有与抗原-抗体相似 反应的特异性和灵敏度，这些优点使适体成为检测各种目标物质的有力工具。已 经报道的完整或分裂的ATP适体，并且基于结合ATP后的构象变化广泛用于构建 荧光适体传感器。(1.Huizenga,D.E.；Szostak,J.W.,A DNA aptamer that bindsadenosine and ATP.Biochemistry 1995,34,656-665；2.Wu,C.；Yang,S.Y.；Wu,Z. Y.；Shen,G.L.；Yu,R.Q.,Split aptamer-based liquid crystal biosensor for ATPassay.Acta Chim.Sin.2013,71,367-370；3.Zuo,X.；Song,S.；Zhang,J.；Pan, D.；Wang,L.；Fan,C.,A target-responsive electrochemical aptamer switch(TREAS) forreagentless detection of nanomolar ATP.J.Am.Chem.Soc.2007,129,1042-3； 4.Yu,P.；He,X.L.；Zhang,L.；Mao,L.Q.,Dual recognition unit strategy improves thespecificity of the adenosine triphosphate(ATP)aptamer biosensor for cerebralATP assay.Anal.Chem.2015,87,1373-1380；5.Ye,S.J.；Xiao,J.；Guo,Y.Y.； Zhang,S.S.,Aptamer-based sers assay of ATP and lysozyme by using primer self-generation.Chem.-Eur.J.2013,19,8111-8116；6.Wang,J.；Jiang,Y.；Zhou, C.；Fang,X.,Aptamer-based ATP assay using a luminescent light switching complex.Anal.Chem.2005,77,3542-3546；7.Cai,L.；Chen,Z.Z.；Dong,X.M.；Tang,H.W.； Pang,D.W.,Silica nanoparticles based label-free aptamer hybridization for ATPdetection using hoechst33258as the signal reporter.Biosens.Bioelectron.2011,29,46-52；8.Fedotova,T.A.；Kolpashchikov,D.M.,Liquid-to-gel transition forvisual and tactile detection of biological analytes.Chem.Commun.2017,53,12622-12625)。
鸟嘌呤(G)-四链体DNA是通过富含G的DNA序列折叠形成的非典型DNA 二级结构。近年来，基于G-四链体DNA和靶标物的不同构造以及静电密度分布 和空穴尺寸的差异所导致的不同亲和力已经开发出各种生物传感器。设计基于 G-四链体的荧光生物传感器主要有三种策略：第一种策略是用荧光G-四链体结 合物诱导G-四链体结构，然后添加目标物(1.Huo,Y.F.；Zhu,L.N.；Li,X.Y.； Han,G.M.；Kong,D.M.,Water soluble cationicporphyrin showing pH-dependent optical responses to G-quadruplexes:Applications in pH-sensing and DNA logic gate. Sens.Actuator B-Chem.2016,237,179-189；2.Tong,L.-l.；Li,L.；Chen,Z.；Wang, Q.；Tang,B.,Stable label-freefluorescent sensing of biothiols based on ThT direct inducing conformation-specific G-quadruplex.Biosens.Bioelectron.2013,49, 420-425；3.Ge,J.；Li,X.-P.；Jiang,J.-H.；Yu,R.-Q.,A highly sensitive label-free sensor for Mercury ion(Hg2 +)by inhibiting thioflavin T as DNA G-quadruplexes fluorescentinducer.Talanta 2014,122,85-90；4.Xu,L.；Shen, X.；Hong,S.；Wang,J.；Zhang,Y.；Wang,H.；Zhang,J.；Pei,R.,Turn-on and label-free fluorescence detection of leadions based on target-induced G-quadruplex formation.Chem.Commun.2015,51,8165-8168.)。许多常用的G-四链体配体染料 (如NMM，TMPyP，ThT等)的荧光通过与G-四链体DNA结合而大大增强。这对 开发荧光增强型传感器具有很大挑战，首先，基于该策略的传感器通常很复杂； 另外，当分析物诱导G-四链体时，G-四链体结合物和分析物之间存在竞争性相 互作用，此竞争作用使G-四联体中目标物被取代，导致灵敏度降低。第二种策 略，首先，使用一小段部分互补序列锁定富G序列，使其在粘合剂存在下不能够 形成G-四链体，处于双链DNA(dsDNA)或发夹结构DNA。此时，粘合剂未嵌入 dsDNA中，系统无荧光。然而，在添加目标物后，由于目标物和G-四链体结合的 稳定性大于dsDNA的稳定性，因此形成G-四链体，并且目标物和粘合剂同时嵌 入G-四链体中，因此系统的荧光增强(1、Li,T.；Dong,S.；Wang,E.,A Lead(II)-driven DNA molecular device for turn-on fluorescencedetection of Lead(II) Ion with high selectivity andsensitivity.J.Am.Chem.Soc.2010,132,13156-13157； 2.He,H.-Z.；Pui-Yan Ma,V.；Leung,K.-H.；Shiu-Hin Chan,D.；Yang,H.；Cheng,Z.； Leung,C.-H.；Ma,D.-L.,A label-free G-quadruplex-based switch-on fluorescence assay for the selectivedetection of ATP.Analyst 2012,137,1538-1540；3.Leung, K.-H.；He,H.-Z.；He,B.；Zhong,H.-J.；Lin,S.；Wang,Y.-T.；Ma,D.-L.；Leung,C.-H., Label-free luminescenceswitch-on detection of hepatitis C virus NS3helicase activity using a G-quadruplex-selective probe.Chem.Sci.2015,6,2166-2171；4.
He,H.-Z.；Leung,K.-H.；Wang,W.；Chan,D.S.-H.；Leung,C.-H.；Ma,D.-L.,Label-free luminescence switch-on detection of T4polynucleotide kinaseactivity using a G-quadruplex-selective probe.Chem.Commun.2014,50,5313-5315)。第三 种策略使用两条富G序列连接识别序列作为构建模块。与识别序列完全互补的靶 序列的存在使富G序列接近，这使其形成分子间G-四链体，然后将粘合剂插入 G-四联体中荧光增强(1.Zhu,J.；Zhang,L.；Wang,E.,Measurement of the base number of DNA usinga special calliper made of a split G-quadruplex.Chem.Commun.2012, 48,11990-11992；2.Zhu,J.；Zhang,L.；Dong,S.；Wang,E.,How to split a G-quadruplex for DNAdetection:new insight into the formation of DNA split G-quadruplex.Chem.Sci.2015,6,4822-4827；3.Ma,D.-L.；Lin,S.；Leung,K.-H.；Zhong,H.-J.；Liu, L.-J.；Chan,D.S.-H.；Bourdoncle,A.；Mergny,J.-L.；Wang,H.-M.D.；Leung,C.-H., Anoligonucleotide-based label-free luminescent switch-on probe for RNAdetection utilizing a G-quadruplex-selective iridium(iii)complex.Nanoscale2014,6, 8489-8494)。尽管这些策略已被广泛使用，但基于G-四链体的荧光增强型传感器的开发背景信号高，选择性差。近年来，本发明人小组设计了基于G-quadruplex 的荧光传感器，并成功应用于检测DNA，有毒汞离子。与常规策略相比，通过简 单地改变识别部分来构建用于检测目标物的荧光增强型传感器的策略仍未被探 索。主要因为缺乏在G-四链体中相互作用荧光猝灭的配体。因此，本发明人小 组提出了一种构建荧光增强型传感器的新策略。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种利用G-四链体作为良好猝灭剂的新型荧光 增强型适体传感器，提高检测ATP的灵敏度。
基于该研究目的，本发明选择用富G序列连接两个分裂的ATP适配体片段 作为分子识别单元，AMT作为荧光指示剂，利用猝灭原理构建新型检测ATP的荧 光增强型传感器。
本发明原理：4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素(AMT)是一种补骨脂 素衍生物，在缓冲溶中发出明亮荧光的平面分子。此外，AMT水溶性良好，低或 无毒，并且广泛用于商业补骨脂素药物及紫外疗法。更重要的是，AMT和G-四链 体(Kb～105M-1)之间存在强烈的相互作用，当AMT与G-四链体DNA结合时，AMT 荧光几乎完全淬灭。无荧光的G-quadruplex/AMT复合物为基于G-quadruplex 的荧光增强型传感器的设计提供了可能性。
AMT结构式
AMT自身可诱导22AG形成G-四链体，并使AMT荧光猝灭。ATP适配体(表1 所示)为富G序列(GC含量为59.3％)。本发明研究了ATP适配体对AMT荧光的 影响，在ATP适配体中，AMT荧光不能被有效猝灭(图4A)，而ATP适配体单链 DNA(ssDNA)在不存在ATP的情况下以不规则的卷曲形式存在。因此，在加入ATP时AMT的荧光恢复不能应用于ATP检测(图2，曲线a)。适配体被分割成 两个或三个片段可作为使用完整适配体的替换方案。分裂适体也被广泛用作传感 器设计中的识别部分。本发明研究了分裂ATP适配体对AMT荧光的影响(图4B)， 分裂ATP适配体对AMT的荧光猝灭效率((F0-Fmin)/F0＝64％)高于完整的 ATP适配体((F0-Fmin)/F0＝54％)。正如预期的一样，AMT的荧光恢复在加 入目标物时也不能应用于检测ATP(图2，曲线b)。为了有效猝灭AMT荧光， 本发明分别在两个分裂的ATP适配体片段上连接富含G的DNA序列。富含G的分 裂ATP适配体DNA可以有效地淬灭AMT的荧光(图3)，经过检测最大猝灭效率 可达76％。有效荧光猝灭可能是由于AMT和富含G的DNA序列之间的强相互作用 使两个富含G的DNA序列形成分子间G-四链体。荧光被猝灭的AMT/G-rich DNA 复合物为构建荧光增强型传感器提供了可能性。当ATP存在时，AMT游离于溶液 中，使AMT荧光恢复(图2曲线d)。AMT荧光恢复的原因是ATP与其分裂适配 体结合破坏了AMT/G-四链体复合物，并使AMT游离于溶液中。为了证实，发 明人在两条分裂的ATP适体片段的一端分别连接了富T的DNA序列。研究了富含 T的分裂ATP适体对AMT荧光的影响(图4C)。富含T序列的分裂ATP适配体(猝 灭率69％)和分裂ATP适配体(猝灭率64％)变化较小。相应地，富含T序列 的分裂ATP适配体和分裂ATP适配体在ATP存在下，AMT的荧光恢复不如富含G 序列的分裂ATP适配体的荧光恢复效果(图2，曲线c)。因此，富含G的分裂 ATP适体可以强烈猝灭AMT的荧光，这是由于G-四链体/AMT复合物引起的。图 4A验证了本发明所构建的荧光增强型传感器检测ATP的反应机理。
本发明用到的DNA序列见序列表。
由于G-四链体具有特征圆二色(CD)光谱信号，图5给出了在10mM Tirs-HCl (pH＝9)中用于该工作的不同DNA序列的CD光谱。DNA1特征CD光谱(图5A， 曲线a)与DNA2特征CD光谱(图5A，曲线b)在238nm有一负峰，在258nm左 右有一正峰，其特征峰为平行G-四链体(240nm左右正峰，260nm左右负峰)， 这可能是由于DNA1或DNA2自身分子间形成G-四链体。通过DNA1+DNA2圆二色 谱(图5A，曲线c)信号可看出其特征同样为平行G-四链体特征峰，信号较DNA1、 DNA2略有增强。当向DNA1/DNA2中加入10uM AMT时(图5B，曲线2)，体系的 CD信号未明显变化，说明AMT嵌入G-四链体中荧光猝灭未影响体系二级结构的 构型。当再向体系中逐渐加入10uM、30uM、50uM ATP(图5B，曲线3、4、5) 时CD谱图中258nm正峰强度逐渐减弱，原因是在体系中加入ATP后，ATP与富 G-ATP分裂适配体中的ATP适配体碱基部分强结合，阻碍了富G序列形成G-四链 体，使得平行G-四链体信号减弱。
通过以上探讨，本发明所述检测ATP荧光增强型传感器通过如下方式构建： 传感体系为Tris-HCl缓冲溶液，AMT，DNA 1与DNA 2由超纯水配制后加热缓 慢冷却至室温做退火处理，保存做储备液。将AMT、DNA 1、DNA 2溶解在 pH＝9.0Tris-HCl缓冲溶液中均匀混合，检测时取构建好的体系溶液，再向其中 加入不同浓度ATP溶液，充分混匀后室温下进行荧光检测。
优选条件：选择1.2μM AMT用于传感体系。DNA 1、DNA 2两条分裂的适配 体比例为3：1。分裂适配体浓度为12μMDNA1和4μMDNA2。在构建的传感系统 中加入ATP后，选择30分钟作为系统测试的反应时间。
本发明基于G-四链体诱导4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素(AMT)荧 光猝灭，补骨脂素，三磷酸腺苷(ATP)和ATP功能化适配体富G-DNA之间相互 竞争作用构建了一种荧光增强型传感器。优点：1、与其他ATP适配体的荧光传 感器相比，所提出的适配体传感器对ATP具有较高选择性，高灵敏度，检测限为 8nM。2、不需要ATP适体任何荧光标记，无标记的荧光适体传感器具有良好的 成本效益，可以避免影响ATP结合适体的亲和力或选择性。其次，利用G-四链 体的猝灭特性和ATP诱导的荧光恢复，荧光增强型传感器优于荧光猝灭型传感 器，可以降低信号误报的可能性。3、在1％血清样品中检测ATP时显示出优异 的重现性，增强了实际临床样品中ATP测定可靠性，在实际临床复杂样品中检测 ATP具有实际应用价值。4、构建传感器所用材料都是商业上可获取且经济的， 对开发此类新型荧光增强传感器的十分有利。
本发明所述富含G序列的分裂ATP适配体选DNA 1、DNA 2，其DNA序列见 序列表中序列1和2。
附图说明
图1为本发明基于无标记适体的ATP检测原理图。
图2为在10mM Tris-HCl(pH＝9)的缓冲溶液、1.2μM AMT中不同适配体时，对ATP的荧光传感响应，其中(a)Non-split aptamer DNA为4μM；(b)Split aptamer DNA5为12μM、DNA6为4μM；(c)T-rich split aptamer DNA3为12μM、DNA4为4μM； (d)G-rich splitaptamer DNA1为12μM、DNA2为4μM。
图3为在10mM Tris-HCl(pH＝7.2 30mM K+)缓冲溶液、1μM AMT中加入不同浓度DNA1、DNA2(DNA1：DNA2＝1:2)的荧光光谱图。内插图：以DNA浓度为函数对荧 光响应F的关系图。
图4为在10mM Tris-HCl(pH＝9)的缓冲溶液中(A)Non-split aptamer；(B)Splitaptamer；(C)T-rich split aptamer对1.2μM AMT荧光猝灭响应。
图5为10mM Tris-HCl(pH＝9)缓冲溶液中(A)(a)0.5μM DNA1，(b)0.5μM DNA2，(c)0.5μM DNA1+0.5μM DNA2；(B)(1)0.5μM DNA 1+0.5μM DNA 2，(2)DNA 1/DNA2+10μMAMT，(3)DNA 1/DNA 2/AMT+10μM ATP，(4)DNA 1/DNA 2/AMT+30μM ATP，(5)DNA 1/DNA 2/AMT+50μM ATP，(6)5mM ATP。
图6为在10mM Tris-HCl的缓冲溶液中对传感体系pH的优化。
图7为在10mM Tris-HCl(pH＝9)的缓冲溶液中(A)传感体系中K+浓度的优化； (B)传感体系中AMT浓度的优化；(C)传感体系中DNA1/DNA2比例的优化；(D) 传感体系中DNA浓度的优化。
图8为在10mM Tris-HCl(pH＝9)的缓冲溶液中最优条件下加入16.6mM ATP的动力学响应图。
图9为(A)传感体系对ATP的荧光光谱响应图，内插图：以ATP浓度为函数对 荧光响应F/F0的关系图；(B)F/F0与ATP浓度的线性关系图。
图10为加入ATP类似物的荧光响应图，检测物浓度均为50μM。
图11(A)传感体系在1％人血清中对ATP的荧光光谱响应图，内插图：以ATP 浓度为函数对荧光响应F/F0的关系图；(B)F/F0与ATP浓度在1％血清中的的线 性关系图，检测限：27nM线性范围：0.2mM-1.2mM。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实验药品及仪器：
4'-Aminomethyltrioxsalen hydrochloride(AMT)，购于Sigma(中国，上海) 公司；Tris(hydroxymethyl)-aminomethane，分析纯，购于Serva(中国，上海)公 司；KCl，MgCl2、HCl，Tris-HCl缓冲溶液：10mM Tris溶液滴加HCl调节pH。ATP(adenosine-5’-triphosphate disodium trihydrate)；AMP (Adenosine-5’-monophosphate disodium)；UTP(Uridine-5’-triphosphoric acid trisodium salt)；CTP(cytidine-5’-triphosphate(CTP),disodium salt)；GTP (GTP,guanosine-5’-triphosphate)；ADP(Adenosine-5’-dlphosphate disodium salt)，均购于生工生物工程(上海)公司。溶液均由超纯水配制(电阻率： 18.2Ω)。pH的测量采用雷磁(上海)pHS-3C酸度计。PxD1(DNA1)，PxD2(DNA2)， DNA，DNA3，DNA4，DNA5，DNA6，为HPLC纯化，均购于生工生物工程(上海)公 司，DNA储备液由超纯水配制后做退火处理，在95℃水域保持加热10分钟后自 然冷却至室温，置于4℃环境保存做储备液，DNA序列如表1。
注：粗体部分为富G的DNA碱基序列，斜体部分为分裂式ATP核酸适体序列
实施例1
1.1、传感体系构建
传感体系使用10mM pH＝9.0Tris-HCl缓冲溶液，所有DNA储备液由超纯水 配制后在95℃水域保持加热10分钟后缓慢冷却至室温做退火处理，置于4℃环 境保存做储备液。在条件优化后选择使用1.2μM AMT，12μM DNA 1与4μM DNA 2。 将AMT、DNA 1、DNA 2溶解在Tris-HCl缓冲溶液中均匀混合，检测时取构建好 的体系溶液500μL，再向其中加入不同浓度ATP溶液，充分混匀后室温下进行荧 光检测。
1.2、荧光光谱分析
荧光光谱采用日立F-7000荧光光谱仪测量。对于ATP的荧光检测，将不浓 度的ATP加入含有12μM DNA1,4μM DNA2,1.2μM AMT的10mM Tris-HCl(pH＝9) 缓冲溶液中，并将溶液在室温下充分搅拌。然后立即测定荧光发射光谱。激发 和发射的狭缝均设定为5nm，扫描速度为中等(240nm/min)。传感体系的荧 光发射波长为360nm至660nm，激发波长为340nm。
1.3、圆二色性(CD)光谱分析
CD光谱实验采集自Bio-Logic MOS-450圆二色谱仪，测试时光源始终保持 在稳定的高纯氮(99.99％)气流中。光谱采集的波长范围是220-320nm，选用 光路为1cm的石英比色皿池，仪器的扫描速率设为100nm/min，响应时间为2s。 缓冲溶液的背景信号已经从CD数据中扣除。
为达到传感体系最佳状态，进行了一系列实验探索最佳实验条件。首先在 6-10的pH范围内探索pH对ATP检测的影响。数据显示pH对传感性能影响不大。 如图6中所示，与pH6.0,7.0,8.0和10.0相比，pH 9.0时显示出16.6mM ATP 测定的最高荧光增强约3倍(F/F0)。F和F0分别为在存在与不存在ATP时 在450nm处的荧光强度。因此，pH 9.0用于以下实验中。
一价阳离子(K+，Na+等)可影响G-四链体的空间结构和稳定性。因此， 检测了体系中K+浓度对传感体系的影响。结果如图7A所示，在传感体系中加入 不同浓度的K+，结果表明，F/F0随着K+浓度从0mM增加到100mM而降低。体 系在不含有K+时传感效果最佳，这可能是由于加入K+后G-四链体太稳定，ATP 和分裂适配体的结合不能打开G-四链体并释放AMT。
当AMT浓度高于1μM时传感体系性能达到最佳(图7B)，选择1.2μM AMT 用于传感体系。两条分裂的适配体的比例也影响它们与ATP的结合，从图7C中 可以看出，当两条DNA比例为3：1时，传感性能最佳。分裂适配体浓度对传感 性能也有影响，从图7D可以看出，F/F0随着分裂适体浓度的增加而增加，并 且在12μMDNA1和4μMDNA2时达到最大值。
1.4动力学检测缓冲溶液中的ATP
传感系统的荧光强度与添加ATP的反应时间之间的关系如图8所示。在构 建的传感系统中加入16.6mM ATP后，系统的荧光强度随时间逐渐增加，反应30 分钟后荧光强度逐渐趋于稳定，因此，选择30分钟作为系统测试的反应时间。
1.5、传感体系对ATP的荧光响应
在最佳实验条件下加入不同浓度的目标物ATP，结果如图9A所示，随着从 0-8mMATP浓度的逐渐增加，荧光强度逐步增加。当ATP浓度超过8mM时，荧光 强度达到饱和。如图9A内插图所示，当ATP浓度超过8mM时，F/F0对ATP浓 度(F和F0是存在和不存在ATP时的荧光强度)显示出荧光约增强3倍。F/F0对ATP浓度的线性图(图9B)显示检测ATP的线性范围为0.1μM至1.5mM。线 性方程为F/F0＝0.62c+1.02，相关系数(r)为0.9987。根据3σ/k方程 计算检测限(LOD)为8nM(其中σ是空白溶液的标准偏差(n＝11)，k表示 校准曲线的斜率)。
1.6、传感体系对检测物选择性的考察
为了评估开发的传感系统辨别能力，在相同条件下添加了四种常见的ATP 类似物，包括CTP，GTP，ADP，AMP。结果显示在图10中，与ATP相比，在相同 浓度下其类似物的荧光增强很弱。体系对ATP的高选择性可归因于适配体与其靶 标之间的高亲和力。此外，将相同浓度的ATP及其类似物混合进行实验，结果显 示相同浓度的类似物不干扰ATP检测。
实施例2
将人血清(商丘市第一人民医院，正常人血清)与乙醇以1:1的比例混合震 荡，混合均匀后放置于冰箱(0-4℃)冷藏过夜，第二天取出，15000r/min离 心10min，取上清液于超滤离心管，分子截留量(Amicon Ultra-0.5ml,Millipore)3kpa 1300r/min 4℃冷冻离心20min后取过滤液， 并冷冻于冰箱中待用。将12μM DNA1，4μM DNA2和1.2μM AMT及不同浓度的 ATP加入含有稀释至1％人血清的Tris-HCl(pH＝9)缓冲液中，然后立即记录荧 光发射光谱，检测稀释的人血清中的ATP。结果如表2所示，所提出方法的回收 率为97％-107％，在可接受的范围内。结果表明，该传感器可用于检测实际临 床样品中的ATP。
表2在1％人血清中ATP的加标回收实验
a:本方法检测人血清中ATP的含量与文献(王正昌,黄健,吴自娟,人血ATP的生物发光测定,生物化学 与生物物理进展，1989，16(4)，316-317)报道的结果一致。
b:未测项目。
序 列 表
< 110> 中国矿业大学
<120>一种信号增强型人血清ATP荧光传感器
<160> 7
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>富G的ATP分裂型适配体
<223>isp9为三甘醇，将富G序列与分裂型ATP适配体连接
<400> 1
gggttggg isp9 acctggggga gta 21
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>富G的ATP分裂型适配体
<223>isp9为三甘醇，将富G序列与分裂型ATP适配体连接
<400>2
ccctgcggag gaaggt isp9 gggtaggg 24
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>ATP适配体
<400>3
acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27
<210>4
<211>21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>富T的ATP分裂型适配体
<223>isp9为三甘醇，与分裂型ATP适配体连接
<400>4
tttttttt isp9 acctggggga gta 21
<210>5
<211> 24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>富T的ATP分裂型适配体
<400>5
ccctgcggag gaaggt isp9 tttttttt 24
<210>6
<211>13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>ATP分裂适配体
<400>6
acctggggga gta 13
<210>7
<211>16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> ATP分裂适配体
<400>7
ccctgcggag gaaggt 16

Claims (3)

1.一种检测ATP的荧光增强型传感器，其特征在于，通过将AMT、DNA 1和DNA 2溶解在pH=9.0Tris-HCl缓冲溶液中均匀混合构建而成；
所述DNA 1、DNA 2 为富含G的DNA分裂适配体，其DNA序列见序列表中序列1和2。
2.如权利要求1所述的检测ATP的荧光增强型传感器，其特征在于，AMT浓度为1.2μM；DNA 1、DNA 2两条分裂的适配体比例为3：1，DNA 1、DNA 2两条分裂适配体浓度为12μMDNA1和4μMDNA2。
3.如权利要求1或2所述的检测ATP的荧光增强型传感器，其特征在于，在构建的传感系统中加入ATP后，选择30分钟反应时间作为系统测试时间。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111474147A (zh) * 2020-03-20 2020-07-31 商丘师范学院 一种测定人血清Hg2+含量的荧光传感器
CN111487227A (zh) * 2020-01-17 2020-08-04 商丘师范学院 一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器
CN111504966A (zh) * 2020-04-24 2020-08-07 济南大学 一种检测并降解氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法与应用
CN113109305A (zh) * 2021-03-26 2021-07-13 南京邮电大学 基于拆分型核酸适配体和硫代黄素t检测atp的方法
CN114621958A (zh) * 2022-02-16 2022-06-14 江南大学 特异性识别atp的单链dna适配体序列及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106706575A (zh) * 2016-11-11 2017-05-24 商丘师范学院 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
CN109406467A (zh) * 2018-10-16 2019-03-01 商丘师范学院 用于atp检测的分裂适配体传感器及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106706575A (zh) * 2016-11-11 2017-05-24 商丘师范学院 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
CN109406467A (zh) * 2018-10-16 2019-03-01 商丘师范学院 用于atp检测的分裂适配体传感器及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAISHENG LIU: "A facile label-free G-quadruplex based fluorescent aptasensormethod for rapid detection of ATP", 《SPECTROCHIMICA ACTA PART A: MOLECULAR AND BIOMOLECULAR SPECTROSCOPY》 *
HUIHUI WANG: "Thioflavin T behaves as an efficient fluorescent ligand for label-free ATP aptasensor", 《ANAL BIOANAL CHEM》 *
SNEHA PAUL AND ANUNAY SAMANTA: "Ground- and Excited-State Interactions of a Psoralen Derivative with Human Telomeric G‑Quadruplex DNA", 《J. PHYS. CHEM. B》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111487227A (zh) * 2020-01-17 2020-08-04 商丘师范学院 一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器
CN111474147A (zh) * 2020-03-20 2020-07-31 商丘师范学院 一种测定人血清Hg2+含量的荧光传感器
CN111504966A (zh) * 2020-04-24 2020-08-07 济南大学 一种检测并降解氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法与应用
CN113109305A (zh) * 2021-03-26 2021-07-13 南京邮电大学 基于拆分型核酸适配体和硫代黄素t检测atp的方法
CN114621958A (zh) * 2022-02-16 2022-06-14 江南大学 特异性识别atp的单链dna适配体序列及其应用
CN114621958B (zh) * 2022-02-16 2023-09-22 江南大学 特异性识别atp的单链dna适配体序列及其应用

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