CN109406467A

CN109406467A - 用于atp检测的分裂适配体传感器及其应用

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Publication number: CN109406467A
Application number: CN201811202147.3A
Authority: CN
Inventors: 王永祥; 耿凤华; 马雨; 徐茂田; 瞿鹏; 张银堂
Original assignee: Shangqiu Normal University
Current assignee: Shangqiu Normal University
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109406467B

Abstract

本发明公开了用于ATP检测的分裂适配体传感器及其应用，属生物化学技术领域。本发明将富G序列修饰到两个分裂的ATP适配体片段的末端。ThT与两个富G的ATP分裂适配体相互作用，形成比完整的适配体/ThT复合物更高的荧光复合物。由于富G序列可以提高荧光信号，从而提高新方法的灵敏度。在富G序列的帮助下，本发明ATP适配体传感器的检出限为5 nM。该方法对ATP具有100nM到120μM良好线性关系。与之前报道的基于ThT取代的ATP检测的完整适配体相比，本发明适配体传感器更加灵敏，具有更广泛的动态线性范围，并明显提高了对ADP和AMP等的选择性。该适配体传感器可以用于检测复杂生物血清样品中的ATP。

Description

用于ATP检测的分裂适配体传感器及其应用

技术领域

本发明涉及用于ATP检测的分裂适配体传感器及其应用，具体涉及基于荧光传感器的免标记分裂ATP适配体及其应用，属生物化学技术领域。

背景技术

核酸适配体是一种单链RNA或DNA分子，体外通过指数富集(SELEX)配体的系统进化而选择，以特异性地结合具有高亲和力的目标，它们提供了一种实用的替代抗体的方法用于核酸、蛋白质、小分子甚至整个细胞的检测。与抗体相比，核酸适配体有许多优点，例如较高的特异性、合成简单、标记相对容易、尺寸相对较小、非免疫原性、良好的稳定性、相对快速、生产廉价，具有极高的准确性和重现性。同时，在设计具有高检测灵敏度和高选择性的新型生物传感器时，随着目标物的结合适配体的构型变化具有高的灵活性。

在荧光传感领域，当需要一个快速反应和快的回收率时非共价相互作用可能占主要，然而当生物分子需要固定在表面并且是稳定的，弱的超分子力是不利的，因此共价连接是更合适的。免标记法的优点是它不会破坏与目标的亲和力。它设计灵活，价格低廉，但最大的问题是灵敏度低。低灵敏度的原因之一是，适配体与目标物结合的本质是碱基与识别位点的结合，这导致了过量碱基的空间位阻。为了解决这一问题并提高检测灵敏度，分裂核酸适配体近年来受到广泛关注。一个单独的适配体分裂成两个片段，在两个分离的部分和一个折叠的、相关的复合物之间可以达到平衡。与完整的核酸适配体相比，分离的核酸适配体更短且不利于靶向结合的二级结构更少。重要的是，尽管它们被分割成两个或多个片段，但适配体的配体结合能力几乎不受干扰。例如,刘等人将17β-雌二醇的76-碱基的适配体分裂成两个短片段，开发了一个基于AuNP的比色方法，其检出限增加了 10倍。除了用分裂适配体提高灵敏度外，还采用了不同的策略，如目标物取代，用来提高基于适配体检测的灵敏度。

腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate)简称三磷酸腺苷(ATP)，又称腺苷三磷酸，是一种不稳定的高能化合物，是由腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，是生物体内最直接的能量来源。Huizenga and Szostak发现ATP适配体对ATP具有高的亲和力而不是它的类似物：鸟苷三磷酸酯(GTP)、尿苷三磷酸酯(UTP)、腺苷二磷酸酯(ADP)和腺苷单磷酸酯(AMP)。ATP 适配体由于其简单性、特异性强而广泛应用于电化学、荧光、比色、化学发光、场效应晶体管、SPR生物传感器等领域。与其他分析技术相比，基于荧光的ATP 检测更具有吸引力，因为它具有高灵敏度、快速响应、易见性、操作简单、性价比高，并且有可能进行对峙检测。最近，3个研究小组分别报道了以ATP完整适配体为识别单元、以ThT(硫黄素T，又称；碱性黄1；2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓氯化物)为信号报告的指示剂取代法的新型ATP检测。然而，传统的分裂适配体策略不能直接用于改善基于硫磺素T(ThT)取代检测ATP 的免标记核酸适配体，因为分裂后的ATP适配体对ThT的荧光增强效果远不如完整的适配体，主要原因在于分裂ATP适配体和ThT之间的结合非常弱，导致ThT 荧光没有显著增加。目前利用分裂ATP适配体和ThT提高灵敏度的方法还没有被报道。为了给各种生物分子提供简单、灵敏的检测方式，对其进行研究非常必要。

发明内容

为了提高荧光适配体传感器对ATP的灵敏度，构建了一个基于ThT取代的用于ATP检测且灵敏度高的分裂适配体传感器；同时提供其应用方法。

为了实现本发明目的，本发明采用了两种策略:分裂适配体和指示剂取代法。本发明将富G序列修饰到两个分裂的ATP适配体片段的末端。ThT可以与两个富 G的ATP分裂适配体相互作用，形成比完整的适配体/ThT复合物更高的荧光复合物。富G序列可以提高荧光信号，从而提高新方法的灵敏度。

具体技术方案如下：

所述用于ATP检测的分裂适配体传感器，以硫黄素T(ThT)作为指示剂和媒介体，免标记分裂ATP结合适配体作为识别元素，连接在两条分裂适配体片末端的富G序列作为信号放大器；所述富GDNA序列为GGGTTGGG或GGGTAGGG；分裂ATP结合适配体连接富G的DNA序列为序列表中序列1和2。

优选：ThT浓度为5μM；

优选：序列表中序列1DNA和2DNA两个分裂适配体的比值为1:2，浓度分别为0.1μM和0.2μM。

所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法1，采用荧光法：在含有序列表中序列1DNA和序列2DNA以及硫黄素T的Tris-HCl缓冲溶液中，加入经过处理的人血清，在激发波长450nm条件下，对其进行荧光测定：当溶液颜色由亮绿色逐渐变浅至接近无色，说明该传感体系对ATP响应良好；

所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法2，采用圆二色谱法：在含有序列表中序列1DNA和序列2DNA以及硫黄素T的Tris-HCl缓冲溶液中进行圆二色谱测定：268nm的正峰和240nm的负峰消失，即含有ATP；

所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法3，采用可视检测：在含有序列表中序列1DNA和序列2DNA以及硫黄素T的Tris-HCl缓冲溶液中，在254nm的紫外灯激发下，看到溶液由亮绿色变为接近无色，即含有ATP；

以上所述Tris-HCl缓冲溶液选pH 6.0,含Mg²⁺。优选：pH 6.0,30mM Mg²⁺。

本发明优点：构建了一个基于ThT取代的用于ATP检测的灵敏的分裂适配体传感器，其中ThT作为指示剂和媒介体，免标记分裂ATP结合适配体作为识别元素，连接在两条分裂适配体片末端的富G序列作为信号放大器。上述分裂适配体策略和指示剂取代法提高了灵敏度,而本发明方法的主要优势之一是提出的 G-rich split ATP aptamer/ThT比完整的ATP aptamer/ThT要亮得多,因为更多的ThT 分子与DNA结合。而G-rich序列可以实现显著的信号放大和提高灵敏度，为其他物种提供了一种构建基于荧光传感器的免标记分裂适配体的途径。

在富G序列的帮助下，本发明ATP适配体传感器的检出限为5nM。该方法对ATP具有100nM到120μM良好线性关系。与之前报道的基于ThT取代的ATP 检测的完整适配体相比，本发明适配体传感器更加灵敏，具有更广泛的动态线性范围。所提出的适配体传感器可以用于检测复杂生物血清样品中的ATP，灵敏、选择性好、方便、快速，并且具有宽的线性范围。更重要的是，目前的研究不仅为ATP分析提供了一种新方法，而且为各种生物分子的简单、灵敏检测提供了新的机会。

本发明涉及的DNA序列(从5’到3’)见序列表。DNA1和DNA2是两条富G 的ATP分裂型适配体,通过三甘醇(isp9)将富G序列与分裂型ATP适配体连接, 其DNA序列为序列表中序列1和2。(其对ATP传感的效果，见图2中d曲线)； DNA3和DNA4是两条ATP分裂型适配体,其DNA序列为序列表中序列3和4(其对ATP传感的效果，见图2中a曲线)；DNA5和DNA6是两条富T的ATP分裂型适配体,其DNA序列为序列表中序列5和6(其对ATP传感的效果，见图2中b 曲线)；DNA7是不分裂的ATP适配体，也即完整的适配体,其DNA序列为序列表中序列7(其对ATP传感的效果，见图2中c曲线)。

所述富G的DNA序列为：GGGTTGGG或GGGTAGGG。

附图说明

图1为基于ATP分裂适配体-富G序列的DNA适配体传感体系用于检测的原理示意图；

图2为不同类型的DNA序列对ATP的响应，(a)分裂ATP适配体，(b)富T-分裂ATP适配体，(c)不分裂ATP适配体，(d)富G-分裂ATP适配体；从图可以看出，分裂型ATP对ATP几乎没有响应，但在两条分裂型ATP的一端接上富G 序列后，其传感性能明显优于不分裂型ATP适配体，同时，为了验证富G的作用，用了富T序列作为对照，发现富T序列也基本没有传感性能。

图3为荧光比色图，从左至右依次是ThT、ThT+DNA1+DNA2、ThT+DNA1+DNA2+ATP；

图4为加入不同DNA的圆二色谱图，1-buffer+1μMDNA1；2-buffer+2μMDNA2； 3-buffer+1μMDNA1+2μMDNA2；4-buffer+1μMDNA1+2μMDNA2+25μMThT；5-bu ffer+1μMDNA1+2μMDNA2+25μMThT+0.8mMATP； 7-buffer+1μMDNA1+2μMDNA2+25μMThT 1.0mM ATP；

图5为本发明传感体系对不同浓度DNA的荧光-时间图；

图6为本发明传感体系对不同浓度ATP的荧光-时间图；

图7为本发明传感体系对不同浓度Mg²⁺的荧光响应；

图8为本发明传感体系对不同浓度K⁺的荧光响应；

图9为本发明传感体系对不同浓度ThT的荧光响应；

图10为本发明传感体系对不同DNA比例的荧光响应；

图11为本发明传感体系对不同DNA浓度的荧光响应；

图12为本发明传感体系对不同pH的荧光响应；

图13为本发明传感体系对ATP的荧光光谱响应；

图14为以ATP浓度为函数对荧光响应比值F0/F作图；内插图：F0/F与ATP浓度的线性关系图；

图15为在含有ThT+DNA1+DNA2的缓冲溶液中加入不同浓度ATP的体系在紫外灯下(254nm)激发下的荧光图片，1-6标号ATP浓度依次为 0,0.01,0.03,0.05,0.1,0.2mM；

图16为本发明传感体系加入不同干扰类似物的荧光响应；

图17为加入不同干扰类似物的比色图片，1-6标号依次为ATP，GTP，UTP，ADP， AMP及其混合物。

具体实施方案

为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：

实施例1

1实验部分

1.1仪器与试剂

日立F-7000型荧光分光光度计；Chirascan圆二色谱仪；超纯水(Mill-Q纯水仪，电导率＞18MΩ.cm)；KS-300D超声波清洗器(宁波科生仪器厂)；雷磁 PHS-3C酸度计；McAry(SQ)Eq-001离心机。

本发明用到的DNA序列购于上海生工生物工程股份有限公司，见序列表。用超纯水溶解DNA固体并配置成浓度为100μM的母液。硫磺素T(ThT)购于 Sigma-Aldrich公司，用超纯水溶解，母液浓度为1mM，4℃避光保存。氯化镁及氯化钾为市售品。实验中所用的缓冲溶液是10mMTris-HCl(30mM MgCl₂,pH ＝6.0)。用于样品测定的人血清从商丘第一人民医院获得。所用试剂均为分析纯，无需进一步处理，实验用水均为超纯水(Milli-QAdvantage A10,18.2MΩ)，无特殊说明，实验均在室温下进行。

1.2荧光测定

在含有0.1μMDNA1和0.2μΜ DNA2以及5μΜ ThT的10mMTris-HCl(pH6.0,30mM Mg² ⁺)缓冲溶液中分别加入不同浓度的ATP，对其进行荧光测定。测定条件为激发波长450nm，荧光激发和发射狭缝宽度为5和5，扫描速度为 240nm/min，测量范围为460-600nm。

1.3圆二色谱法

含有不同物质的六种10mM Tris-HCl缓冲混合液(30mM MgCl₂,pH＝6.0) 分别是buffer+1μMDNA1；buffer+2μMDNA2；buffer+1μMDNA1+2μM DNA2；buffer+1μMDNA1+2μMDNA2+25μMThT；buffer+1μMDNA1+2μMDNA2+ 25μMThT+0.8mMATP和buffer+1μMDNA1+2μMDNA2+25μMThT 1.0mM ATP，在220-330nm范围内测定圆二色谱，光谱扫描速度为100nm/min，响应时间为 0.5s，扫描所得光谱为三次扫描的平均值。

1.4可视检测

在含有0.1μMDNA1，0.2μΜ DNA2，5μΜ ΤhΤ的10mM Tris-HCl缓冲混合液(30mMMgCl₂,pH＝6.0)中，分别加入不同浓度的ATP，在紫外灯(254nm) 激发下，用手机拍照。

1.5样品处理

参照文献对人血清进行处理。把人血清与乙醇以1:1的体积比例混合震荡，放于冰箱冷藏(0-4℃)过夜，第二天取出，15,000r/min离心10min，取上清液于超滤离心管，分子截留量(Amicon Ultra-0.5mL，Millipore)3kDa，13,000r /min 4℃冷冻离心20min后取过滤液，并冷冻于冰箱中待用。

2结果与讨论

2.1基于指示剂取代法的分裂适配体用于ATP检测的原理

图1显示了ATP检测的传感策略。提出的基于分裂适配体指示剂取代方法用于ATP检测的关键是ThT与分裂适配体之间的结合亲和力适中。强的结合力可以形成具有强荧光的稳定复合物，而弱的结合力在目标物存在的情况下可以快速指示取代。ATP结合适配体对ATP(6μM)比对ThT(89μM)具有更高的结合力，因此，ThT被选为指示剂和媒介体。本发明把完整的ATP适配体序列(Apt 15，5′ -GGTTGGTGTGGTTGG-3′)分裂为两个片段。通常，自由的ThT在溶液中几乎没有荧光，然而，一旦ThT嵌入到双链DNA和G四链体中，它的荧光显著增加。两个分裂的适配体片段的存在并不会导致ThT的荧光显著增加(图2中的曲线a，这与文献报道一致。这一结果清楚的表明尽管完整的ATP适配体对ThT具有强的结合力，而分裂的适配体几乎完全失去了它与ThT结合的能力。本发明找到了一个新方法来增加分裂ATP适配体和ThT之间的结合力。在ThT存在的情况下，富G 序列可以形成G四链体，因此，本发明假设连接在两条分裂ATP适配体末端的富G序列可以提高它与ThT的结合力。为了验证这一观点，两条分裂适配体都连接上了富G DNA序列。虽然两条分裂适配体片段不能与ThT结合，但在末端连接有富G序列的两条分裂适配体片段与ThT产生的荧光信号(图2中的曲线d)比完整的适配体(图2中的曲线c)要高。这些数据表明，分裂适配体末端连接的富G序列可以提高ThT的荧光强度，从而提高该方法的灵敏度。为了验证富G序列的具有增强该结合的功能(而不是碱基长度增加带来的功能)，本发明合成了两条含同样碱基个数的富T序列的分裂Aptamer，但其也不与ThT结合(图2中的曲线 b)。如预期的那样，在ATP存在的情况下，ATP可以有效地从ThT/DNA复合体中置换出ThT，荧光显著降低。因此，ThT/DNA复合物对ATP的荧光检测是很敏感的。同时，明显的荧光变化(在254nm激发)可以被很容易的看到。

2.2圆二色谱表征

圆二色谱可以用来表征DNA不同的二级结构，例如ssDNA、dsDNA和G- 四链体。如图4所示，在10mM Tris-HCl缓冲溶液(30mM MgCl₂,pH＝6.0)中，当只有DNA1时，在254nm有一个正峰，表明DNA1以单链形式存在；只有DNA2 存在时，在268nm有一个正峰，240nm处有一个负峰，此峰表明了平行G-四链体的形成；当DNA1和DNA2同时存在时，峰位置几乎不变，其值增大；向含两种 DNA的缓冲溶液中加入25u MThT后，峰位置不变，峰值增加，表明形成了更多更稳定的G-四链体；加入不同浓度的ATP后，268nm的正峰和240nm的负峰消失，此现象表明了平行G-四链体的消失，同时也证明了ATP可以有效地从ThT/DNA 复合体中置换出ThT。

2.3DNA1/DNA2结合引起ThT荧光增强以及ATP诱导DNA1/DNA2/ThT荧光猝灭的荧光动力学

本发明研究了荧光生物传感器对ATP的实时检测。如图5A所示，随着不同浓度DNA1/DNA2的加入，ThT的荧光快速显著增加，这很可能是由于 DNA1/DNA2/ThT的形成。在DNA1/DNA2存在的情况下，ThT荧光强度的轻微降低可能是由于光漂白作用。如图5B,随着ATP的进一步加入，荧光强度在半分钟内急剧并且显著降低。这一结果清楚地表明ATP有效地结合到分裂适配体上， ThT被取代并从DNA1/DNA2/ThT组合体中移走。

2.4实验条件优化

为提高传感性能，进一步对该传感体系的实验条件进行优化，如缓冲溶液中 Mg²⁺浓度和K⁺浓度，ThT的浓度，DNA1与DNA2的比例和浓度以及pH。

Mg²⁺浓度是影响体系中DNA1/DNA2/ThT复合体的一个关键因素，本发明对缓冲溶液中的Mg²⁺浓度进行了优化,结果如图6(A)所示。当缓冲溶液中不含Mg²⁺时，加入ATP后，发现该体系对ATP响应比较差，荧光淬灭不明显，说明只有少量的ThT被ATP置换出来，随着Mg²⁺浓度的增加，猝灭效果进一步增强，当缓冲溶液中Mg²⁺浓度达到30mM时淬灭效果最佳，更高浓度时荧光猝灭能力下降。因此,缓冲溶液中Mg²⁺的适宜浓度为30mM。

一价阳离子(如K⁺，Na⁺)在G-四链体的稳定性中起着重要的作用。我们进一步研究了K⁺对荧光强度的影响。如图6(B)所示，在没有K⁺的情况下，荧光猝灭效率最高。在50-250mM K⁺的情况下，加入ATP后，适配体传感器的荧光强度没有显著降低。这些数据强烈表明ThT不能被ATP取代，主要原因可能是ThT/G– 四链体在K⁺存在下的高稳定性。综上所述，当体系中不含K⁺时，传感体系灵敏度最佳。

作为指示剂和媒介体，ThT的浓度对传感性能有显著的影响。从图6(C)可以看出,在5μM ThT存在下，荧光猝灭效率最高。当ThT的浓度低于5μM时,系统的初始荧光较低,当ThT的浓度高于5μM时，ATP可能无法取代所有的ThT。

作为捕获探针，两个分裂适配体的浓度和比例也至关重要。图6(D)表明DNA1 和DNA2的最佳比值为1:2。图6(E)DNA1和DNA2的浓度分别为0.1μM和0.2μM。

为了进一步探究该传感器的实际应用性能，对缓冲溶液的pH值也进行了优化。缓冲溶液的pH值直接影响着DNA的带电性和聚集状态，因此，考察pH的影响非常有必要。在含有相同浓度的DNA1/DNA2/ThT不同pH值的10 mMTris-HCl，30mM缓冲溶液中加入相同浓度的ATP(0.5mM)后，荧光信号响应如图6F。从图中可以看出，当缓冲溶液的pH值为6.0时，该传感体系具有最佳的灵敏度。

2.5基于ThT取代法的分裂适配体用于ATP检测的性能，探讨了所提出的方法用于ATP定量检测的能力。

图7(A)显示了随着ATP的增加，DNA/ThT组合体在滴定过程中荧光光谱的变化。正如预期的那样,当ATP浓度在50nM-5mM范围内增加时，荧光信号出现明显的降低。这种猝灭效应是由于ATP和硫磺素T对分裂适配体的竞争而导致的。当目标浓度进一步增加超过5mM,发射光谱没有明显的变化并且达到了一个平台，如图7(B)。通过公式(F₀-F)/F₀计算淬火效率为88％，其中F₀和F 分别为不存在和存在ATP时486nm处的荧光强度。F₀/F与[ATP]的曲线显示了良好的线性关系，为0.05到120μM。回归方程为y＝2.59c+1.06，相关系数R²＝0.9958，如图7(B)插图。检出限(LOD)基于3σ/k规则(σ是空白溶液的标准偏差,n＝11,k是线性方程的斜率)被测定为5nM。如此低的LOD和3个数量级宽的动态范围比现有的完整的ATP aptamer-ThT方法要好得多。此外，荧光光谱的变化也可以通过荧光颜色看到。如图7(C),随着ATP浓度从0增加到150u M， 486nm的荧光从亮绿色变成了接近无色。

2.6基于ThT取代法的分裂适配体的选择性

对于复杂生物基质中具有潜在应用价值的生物传感器，对目标物的特异性识别是非常必要的。所提出的荧光适配体传感器理论上应该表现出对ATP的良好选择性，因为ATP aptamer作为识别单元，如图8A，100μM ATP可能诱发适配体传感器的明显降低，而ATP类似物如ADP、AMP等不能引起荧光显著的变化。为了进一步研究选择性，还进行了竞争实验。类似物分别添加到100μM ATP。所测试的适配体传感器在加入ATP类似物后，对ATP的响应几乎没有改变。结果表明，所提出的适配体传感器能够满足血清等复杂生物样品的选择要求。荧光颜色的变化进一步证实了所提出的荧光aptasensor具有良好的选择性。如图8B所示，只有在ATP存在的情况下，以486nm为中心的荧光的亮绿色被淬灭。在ATP类似物存在的情况下，荧光颜色并没有明显的变化。

2.7实际样品测定

为了评估这种基于分裂适配体的ThT置换检测方法在实际样品中检测ATP 的应用可行性，本发明在稀释的人血清等复杂生物样品中进行了加标回收实验，结果如下表所示。5,50,100uM三个样品的回收率均是在99％-104％,相对标准偏差(rsd)小于4％,表示该传感体系在人血清中检测ATP是可应用的。这些结果有力地证明了基于分裂适配体的ThT置换检测方法用于实际复杂生物样品中ATP 的检测是非常可靠的。

3结论

综上所述，传统的分裂适配体策略不能直接用于改善ATP的基于ThT指示剂取代的免标记适配体。为了解决这个问题，我们将G-rich序列修饰到两个分裂的ATP适配体片段的末端。ThT可以与两个G-rich分裂ATP适配体片段相互作用，形成比完整的适配体/ThT复合物更高的荧光复合物。高荧光富G-分裂 ATP适配体片段/ThT复合物可作为ATP检测传感器，有效、灵敏和高选择性。在本实验中，G-rich序列可以提高荧光强度，从而提高该ATP生物传感器的灵敏度。人血清中的ATP浓度已被成功测定，进一步证明了该新体系的潜在效用。该设计为能引起相应适配体结构转换的其他目标物的简单、灵敏检测提供了新的机会。

Claims

1.用于ATP检测的分裂适配体传感器，其特征在于，以硫黄素T （ThT）作为指示剂和媒介体，免标记分裂ATP结合适配体作为识别元素，连接在两条分裂适配体片末端的富G序列作为信号放大器；所述富GDNA序列为GGGTTGGG 或GGGTAGGG；分裂ATP结合适配体通过三甘醇（isp9）将富G序列与分裂型ATP适配体连接,其DNA序列为序列表中序列1和2。

2.如权利要求1所述的分裂适配体传感器检测ATP，其特征在于，ThT浓度为5μM。

3.如权利要求1或2所述的分裂适配体传感器检测ATP，其特征在于，序列表中序列1DNA和2DNA两个分裂适配体的比值为1:2，浓度分别为 0.1μM和0.2μM。

4.如权利要求1所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法，其特征在于，采用荧光法：在含有序列表中序列1DNA和序列2DNA以及硫黄素T的Tris-HCl缓冲溶液中，加入经过处理的人血清，在激发波长450 nm条件下，对其进行荧光测定：当溶液颜色由亮绿色逐渐变浅至接近无色，则该传感体系对ATP响应良好；

所述Tris-HCl缓冲溶液选pH 6.0，含 Mg²⁺。

5.如权利要求1所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法，其特征在于，采用圆二色谱法：在含有序列表中序列1DNA和序列2 DNA以及硫黄素T的Tris-HCl缓冲溶液中，进行圆二色谱测定：268nm的正峰和240nm的负峰消失，即含有ATP；

所述Tris-HCl缓冲溶液选pH 6.0，含 Mg²⁺。

6.如权利要求1所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法，其特征在于，采用可视检测：在含有序列表中序列1DNA和序列2 DNA以及硫黄素T的Tris-HCl缓冲溶液中，在激发波长为254nm的紫外灯激发下，看到溶液由亮绿色逐渐变浅至无色，则该传感体系对ATP响应良好；

所述Tris-HCl缓冲溶液选pH 6.0，含 Mg²⁺。

7.如权利要求4-6其中之一所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液选pH 6.0，30 mM Mg²⁺。

8.如权利要求4-6其中之一所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法，其特征在于，硫黄素T的浓度选5μM。

9.如权利要求4-6其中之一所述的分裂适配体传感器检测ATP的方法，其特征在于，序列表中序列1 DNA和2 DNA两个分裂适配体的比值为1:2，浓度分别为 0.1μM和0.2μM。