CN103344682A

CN103344682A - 一种便携式检测三磷酸腺苷含量的方法

Info

Publication number: CN103344682A
Application number: CN2013102917805A
Authority: CN
Inventors: 林振宇; 周津; 郭隆华; 邱彬; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2033-07-12
Also published as: CN103344682B

Abstract

本发明公开了一种便携式检测三磷酸腺苷含量的方法。将被劈成两段的ATP适配体分别修饰上磁珠和蔗糖转化酶，在ATP存在的条件下，被劈成两段的ATP适配体与目标物ATP发生特异性的识别和结合，从而形成三明治夹心结构，因而将修饰有蔗糖转化酶的适配体固定在磁珠上。通过分离磁珠与溶液，并将清洗后的磁珠溶于蔗糖溶液中进行酶解反应，再使用血糖仪测量酶解后的反应溶液，即可间接检测ATP的浓度。该方法成功地应用于人体血清样品中ATP浓度的检测，本发明具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好等优点。

Description

一种便携式检测三磷酸腺苷含量的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种便携式检测三磷酸腺苷含量的方法。

背景技术

三磷酸腺苷（ATP）是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源和主要来源，它能够储存和传递化学能，参与合成蛋白质、脂肪、糖和核苷酸，而且能够促使机体各种细胞的修复和再生，增强细胞代谢活性，对治疗各种疾病均有较强的针对性。因此，定量检测ATP的含量对于科学研究和临床诊断具有重要的实际意义。

适配体(aptamers)是一类通过指数富集配基的系统进化技术（SELEX）体外筛选得到的能与目标分子高亲和力结合的并且高特异性的识别目标分子的单链DNA或RNA寡核苷酸序列（Ellington A. D., Szostak J.. Nature, 1990, 346:818-822.; Tuerk C., Gold L.. Science, 1990, 249:505-510.）。由于它们具有易于化学修饰、高特异性和稳定性好等优势（Willner I., Zayats M.. Angew. Chem., Int. Ed., 2007, 46:6408-6418.; amulok M., Hartig J. S., Mayer G.. Chem. Rev., 2007,107:3715-3743.），已被广泛应用来构建适配体传感器（Baker B. R., Lai R. Y., Wood M. S., et al. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128:3138-3139.; Xiao Y., Lubin A. A., Heeger A. J., et al. Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44:5456-5459.; Zuo X. L., Song S. P., Zhang J., et al. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129:1042-1043.; Xiao Y., Piorek B. D., Plaxco K. W., et al. J. Am.Chem. Soc., 2005, 127:17990-17991.）。

目前检测ATP的传感器有比色传感器（Jose D. A., Mishra S., Ghosh A., et al. Org. Lett., 2007, 9:1979-1982.），电化学适配体传感器（Du Y., Li B. Y., Wei H., et al. Anal.Chem., 2008, 80:5110-5117.; Zuo X. L., Xiao Y., Plaxco K. W.. J. Am. Chem. Soc., 2009,131:6944-6945.; Yao W., Wang L., H. Wang Y., et al.. Biosens. Bioelectron., 2009, 24:3269-3274.; Liu X. Q., Shi L. H., Niu W. X., et al. Angew. Chem., Int. Ed., 2007, 46:421-424.; Lin Z. Y., Luo F., et al. Chem. Commun., 2011, 47, 8064–8066.）等。但是这些传感器的一个普遍缺点是需要用到实验室里的仪器设备，这类仪器设备操作复杂，而且不方便携带，无法实现现场检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以血糖仪为平台的能够便携的、快速、简单、现场检测ATP的方法。该检测方法对ATP的检测灵敏度高、特异性好。在1×10^-14 M到3.16×10^-12 M的浓度范围内对ATP的检测呈现良好的线性响应，检测限为2.8 fM。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种便携式检测三磷酸腺苷（ATP）含量的方法包括以下步骤：

（1）按照参考文献（Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Elsevier: London, 2008）制备浓度为20 uM的修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物；

（2）将修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1 M NaCl、0.01 M pH=7.3的磷酸盐缓冲液和0.05% 吐温-20组成的混合溶液中，加入100 uM修饰有生物素的DNA，室温振荡30±1分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物；

（3）将修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物混合，加入含有ATP的待测样品，室温培育1.5±0.05小时；

（4）用磁铁分离步骤（3）中的磁珠与混合溶液，用磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠三次后，加入10 uL磷酸盐缓冲溶液，再加入20 uL 1 M蔗糖溶液，于45℃反应20分钟；

（5）用血糖仪测定步骤（4）反应后的溶液，记录数据；

（6）根据ATP浓度和血糖仪读数的线性方程ΔI_G=4.953+3.740lgC，其中ΔI_G为反应前后血糖仪响应变化值，单位为mM；C为其所对应的ATP浓度，单位为fM。

步骤（1）中所述的修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：HS-(CH₂)₆-ACCTGGGGGAGTAT。

步骤（2）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：TGCGGAGGAAGGT-生物素。

步骤（3）中所述的修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物的摩尔比为1:1。

步骤（3）中所述的含ATP的待测样品的加入量为3 uL。

一种便携式检测ATP的适配体传感器包括：

（1）信号探针，所述信号探针为修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物，序列为从左到右5’到3’：HS-(CH₂)₆-ACCTGGGGGAGTAT；

（2）捕获探针，所述捕获探针为修饰在磁珠上的DNA化合物，序列为从左到右5’到3’：TGCGGAGGAAGGT-生物素；

（3）检测仪器，所述检测仪器为便携式的罗氏血糖仪。

步骤（1）中所述的信号探针与步骤（2）中所述的捕获探针的摩尔比为1:1。

所述的传感器应用于人体血清样品中ATP浓度的检测。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明的两种修饰DNA合成方法简单、快速、反应条件温和、容易控制，得到的DNA化合物具有良好的活性和稳定性。

（2）本发明的操作步骤简单、便捷、灵敏、成本低而且无毒害，实用性强。

（3）本发明的传感器在识别ATP的过程中，能快速读取数值，有利于对ATP的检测。

（4）上述所提到的检测仪器为血糖仪，仪器小巧方便携带，操作简单快速，特别适用于现场检测。

附图说明

图1是本发明的传感器在不同干扰物质中所示的血糖仪响应变化值ΔI_G。

具体实施方式

实施例1

以下实施例结合附图来说明应用本发明所述方法应用于人血清样品中ATP浓度的检测的操作过程：

1、修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物的合成。参考文献（Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Elsevier: London, 2008）。具体步骤如下：

A、将30 μM修饰有巯基的DNA与60 μM TCEP于PBS缓冲溶液中混合均匀，室温培育1小时；

B、将10.0 mg/mL蔗糖转化酶与1 mg Sulfo-SMCC于缓冲溶液（0.01 M PBS，pH=7.3，0.1 M NaCl）中混合5 min，室温下置于摇床上振动1小时，再将混合物离心分离，取上清液；

C、将A与B制备的物质混合，室温下反应48小时。

2、修饰有蔗糖转化酶的磁珠的制备与ATP的检测，具体步骤如下：

（1）将修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1 M NaCl、0.01 M PH=7.3的PBS、0.05% 吐温-20组成的缓冲溶液中，加入100 uM修饰有生物素的DNA，室温振荡（30±1）分钟。

（2）将制备的20 uM修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物与20 uM修饰在磁珠上的DNA化合物以摩尔比1：1混合均匀，加入含ATP的待测样品（ATP浓度从低到高分别为1×10^-14 M、3.16×10^-14 M、1×10^-13 M、3.16×10^-13 M、1×10^-12 M和3.16×10^-12 M），室温培育(1.5±0.05)小时，发生适配体和ATP的特异性结合反应，生成三明治夹心结构。

（3）用磁铁分离步骤（2）中的磁珠与混合溶液，用由0.1 M NaCl、0.01 M PH=7.3的PBS、0.05% 吐温-20组成的缓冲溶液洗涤磁珠三次并向磁珠中加入该缓冲溶液，再加入1 M蔗糖溶液，于45℃反应20分钟。

（4）用罗氏血糖仪测定步骤（3）反应后的溶液，记录血糖仪读数。血糖仪响应变化值ΔI_G随着ATP浓度的增加而增大，在1×10^-14 M到3.16×10^-12 M范围内呈线性响应，其血糖仪响应变化值和ATP浓度的对数值的线性响应方程为：ΔI_G=4.953+3.740lgC，相关系数为R=0.9965，检测限为2.8 fM。

实施例2

1、人血清中ATP浓度的检测，具体步骤如下：向4.0 uM两种修饰的DNA混合物中加入稀释10³倍的人血清样品，室温培育(1.5±0.05)小时，然后用磁铁分离混合物，用50 uL缓冲溶液洗涤磁珠三次并加入10 uL缓冲溶液，再加入20 uL 1 M蔗糖溶液，于45℃反应20分钟，移取2.5 μL用血糖仪测量，记录数据。检测结果显示人血清样品中ATP浓度大约为1.81×10^-10 M。

2、本发明所述方法对ATP检测的特异性，具体步骤如下：为了检测本发明所述的方法的特异性，将实施例1-2中所使用的ATP换成其他干扰物质，分别为UTP、GTP和CTP，ATP的浓度为1×10^-12 M，和三种干扰物质UTP、GTP和CTP的浓度均为1×10^-10 M。如图1所示，从左到右为该传感器在不同干扰物质中所示的血糖仪响应变化值ΔI_G，从左到右分别为ATP（17.3 mM）、UTP（2.1 mM）、GTP（2.8 mM）和CTP（2.0 mM）。结果说明本发明所述方法对ATP检测有较好的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种便携式检测三磷酸腺苷含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）制备浓度为20 uM的修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物；

（2）将修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1 M NaCl、0.01 M pH=7.3的磷酸盐缓冲溶液和0.05% 吐温-20组成的混合溶液中，加入100 uM修饰有生物素的DNA，室温振荡30±1分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物；

（5）用血糖仪测定步骤（4）反应后的溶液，记录数据；

2.根据权利要求1所述的便携式检测三磷酸腺苷含量的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：HS-(CH₂)₆-ACCTGGGGGAGTAT。

3.根据权利要求1所述的便携式检测三磷酸腺苷含量的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：TGCGGAGGAAGGT-生物素。

4.根据权利要求1所述的便携式检测三磷酸腺苷含量的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的修饰有蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求1所述的便携式检测三磷酸腺苷含量的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的含ATP的待测样品的加入量为3 uL。