CN105424777B - 一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，包括如下步骤：金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液的制备；水溶性碲化镉量子点溶液和水溶性硫化铅量子点溶液的制备；单分散硅烷化SiO2纳米粒子水分散液的制备；碲化镉量子点包覆的SiO2纳米球分散液和硫化铅量子点包覆的SiO2纳米球分散液的制备；MB‑aptamer1和MB‑aptamer2捕获探针的制备；适配体1的互补链与SiO2@PbS偶联得到cDNA1‑SiO2@PbS以及适配体2的互补链与SiO2@CdTe偶联得到cDNA2‑SiO2@CdTe纳米生物探针的制备；MB‑aptamer1/DNA1‑SiO2@PbS和MB‑aptamer2/DNA2‑SiO2@CdTe纳米生物复合材料的制备；传感器的构建及样品的检测。本发明使用的丝网印刷电极结构简单，加工方法简便、成本低，具有检测方法操作方便、检测灵敏度高等特点。

Description

一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的 方法
技术领域
本发明属于电化学检测领域，特指一种同时检测两种霉菌毒素的磁控电化学适配体传感器的构建方法及用途。
背景技术
赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是由赭曲霉(Aspergillusochraceus)和纯绿青霉(Penicilliumviridicatum)产生的一种霉菌肾毒素，属于典型的食源性真菌毒素。在极性有机溶剂中OTA能稳定存在，如OTA的乙醇溶液在冷藏条件下可稳定存在一年以上，但OTA在紫外线照射下很快就会分解。在动物体内OTA非常稳定、不易被代谢降解，而且OTA在多种动物体内存在毒性，研究发现其毒性主要表现肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。1993年，OTA被国际癌症研究机构定为2B类致癌物。OTA的产生主要来源于OTA产生菌，这些霉菌在粮谷类、干果、葡萄及葡萄酒、咖啡、中草药、调味品、罐头食品、油、橄榄、豆制品、啤酒、茶叶等多种农副产品的生产、加工过程中都有可能出现。另一方面，动物在进食受到OTA污染的饲料后，会因OTA的不易代谢降解而在体内蓄积。人在食用这些被OTA污染的动物组织后，对人的生命安全将会产生潜在的危害。
伏马毒素(Fumonisin，FB)是由镰刀菌属在一定的温度和湿度下产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。1988年，Gelderblom等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。随后，Laurent等又从伏马毒素中分离出伏马毒素B1(FB1)和伏马毒素B2(FB2)。到目前为止，发现的伏马毒素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11种，其中60％以上是FB1，其毒性也最强。伏马毒素在人畜体内的作用比较复杂，它与神经鞘氨醇(Sphinngosine，SO)和二氢神经鞘氨醇(Shpinganine，SA)的结构极为相似，而后两者均为神经鞘脂类的长链骨架。伏马毒素通过抑制N-脂酰基神经鞘氨醇合成酶，阻断SO合成，破坏鞘脂类的代谢或影响鞘脂类的功能，这一抑制可引起SA升高，从而导致组织、血、尿中SA/SO比值升高。细胞内自由SA的聚集是有毒性的，而内源神经酰胺和1-磷酸-鞘氨醇之间是否平衡也决定了细胞能否存活。现在认为SA浓度和SA/SO比值是我们调查研究过的所有动物是否存在FB1接触感染最敏感的生物标记，两者之间存在着剂量依赖性。伏马毒素可以引起人畜急性中毒和慢性毒性，并具有种属特异性和器官特异性，不同的动物产生的疾病不同，相应的耐受限量也有很大差别。研究发现高浓度的FB1可导致各种家畜和试验动物出现种属特异性的急毒症状，如马脑白质软化综合征、猪肺水肿和羊肝肾病变等，现在还发现FB1可能与人的食管癌和肝癌发生有关，但低剂量的FB1对小鼠和猪均无明显影响。
动物食用了含有OTA和FB1等真菌毒素的饲料会导致体内毒素残留从而使肉制品被污染，这些残留的OTA和FB1真菌毒素也可以经由食物链进入人体，从而对人类健康及农业经济发展造成严重威胁。因此，探寻有效检测、控制真菌毒素的措施对于生产效益、动物福利、产品质量和食品安全都是至关重要的。美国、欧洲等发达国家已经初步确立了真菌毒素检测的法规和标准。例如，食品法典委员会规定了小麦、大麦、黑麦等谷物及其产品的OTA限量标准为5.0μg/kg。欧盟委员会对谷物产品、葡萄酒等食品的OTA限量标准更为严格，要求谷物产品中的OTA≤3.0μg/kg，葡萄酒中的OTA≤2.0μg/kg。对于伏马毒素的研究很多,但对其制定限量标准的很少。2001年6月美国食品与药物管理局(FDA)规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为2mg/kg。
用于OTA和FB1等真菌毒素的传统检测方法主要依靠(1)理化检测方法，如薄层色谱法(TLC)，微柱层析法，气相色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC)，毛细管电泳法(CE)等；(2)生物学检测法，包括皮肤毒性实验，致呕吐实验，种子发芽实验等；(3)免疫化学检测方法，如酶联免疫吸附分析法，荧光免疫分析法，放射免疫分析法等。尽管这些方法一般可以较为灵敏地确定样品中真菌毒素的含量，但往往存在许多不足，例如，(1)需要大型昂贵仪器，如气相/液相色谱仪，质谱仪等；样品前处理步骤麻烦耗时；(2)样品消耗量大，操作步骤繁琐；分析过程中易产生大量废弃的有机溶剂，污染环境；(3)需要相对专业化的实验人员；(4)检测成本较高，不便于广泛推广。现实中粮食往往同时受多种真菌毒素污染，虽然真菌毒素多残留问题已引起重视，但是近年来研究的热点集中于真菌毒素的单一检测，鲜有同时检测多种真菌毒素的研究报道。因此，发展一种简便快捷，高通量，无需大型仪器，检测成本低的方法用于食品中多种真菌毒素的检测，对于人类健康和社会发展都大有益处。
本发明首先成功合成了含有两种不同金属元素的量子点(CdTe QDs和PbS QDs)并将其包覆在SiO2微球表面，以金(Au)壳包覆的磁性纳米粒子为载体，基于核酸适配体与其互补链碱基互补配对技术组装了磁性纳米复合材料作为生物探针，藉以核酸适配体为识别元件用于OTA和FB1的电化学方波伏安法(SWV)检测，构建了一种快速、灵敏可同时检测OTA和FB1的电化学磁控适配体传感器，建立了OTA和FB1标准品浓度与两种金属离子之间的对应关系，实现了简单、灵敏、同时快速检测OTA和FB1两种典型真菌毒素的目的。
发明内容
本发明旨在发明一种高通量、高选择性、简单易操作、成本低廉等优点为一体的磁控电化学适配体传感器，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的同时定量检测两种真菌毒素OTA和FB1的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低、易干扰、检测单一的难题。
所采用的方案概括为：以金纳米粒子包覆的Fe3O4磁性微球(MB)为载体分别负载经巯基修饰的伏马毒素B1(FB1)的适配体1(aptamer1)和赭曲霉毒素A(OTA)的适配体2(aptamer2)，得到MB-aptamer1和MB-aptamer2。以硅烷化的SiO2纳米微球为载体分别负载上巯基丙酸(MPA)保护的PbS量子点(QDs)和CdTe QDs，得到SiO2@PbS和SiO2@CdTe纳米粒子，进而将氨基末端修饰的aptamer1和aptamer2的互补链cDNA1和cDNA2分别偶联到SiO2@PbS和SiO2@CdTe纳米粒子表面，得到cDNA1-SiO2@PbS和cDNA2-SiO2@CdTe两种纳米粒子标记的纳米生物探针，通过碱基互补配对反应分别将cDNA1-SiO2@PbS、cDNA2-SiO2@CdTe和MB-aptamer1、MB-aptamer2进行杂交，得到MB-aptamer1/cDNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/cDNA2-SiO2@CdTe两种生物复合物。将一定量的MB-aptamer1/cDNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/cDNA2-SiO2@CdTe混合后，将其与不同浓度的OTA和FB1标准品进行同时温育。经磁分离后，将收集得到的磁性纳米复合物用一定量的稀硝酸溶解得到含Pb2+和Cd2+的待测液。最后，借助铋膜修饰的丝网印刷三电极体系，利用电化学工作站的SWV检测方法，分别在铋膜修饰的丝网印刷电极上沉积Pb和Cd，然后检测Pb2+和Cd2+的溶出峰。通过对不同浓度的OTA和FB1标准品进行电化学SWV检测，建立Pb2+和Cd2+的溶出峰与FB1和OTA浓度之间的关系，以达到对含FB1和OTA的样品进行同时定量检测的目的。
本发明是通过如下具体技术方案实现的：
一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，包括如下步骤：
步骤1、金纳米粒子包覆的Fe3O4微球(MB)的水分散液的制备；
步骤2、水溶性碲化镉量子点(CdTe QDs)溶液和水溶性硫化铅量子点(PbS QDs)溶液的制备；
步骤3、单分散硅烷化SiO2纳米粒子水分散液的制备；
步骤4、CdTe QDs包覆的SiO2纳米球(简称为SiO2@CdTe)分散液和PbS QDs包覆的SiO2纳米球(简称为SiO2@/PbS)分散液的制备：取步骤2制备的CdTe QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、步骤3制备的SiO2纳米粒子水分散液混合均匀，在冰水浴中搅拌反应，反应结束后，将产物离心分离、洗涤，再将产物分散到蒸馏水中，备用；取步骤2制备的PbS QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、步骤3制备的SiO2纳米粒子水分散液混合均匀，在冰水浴中搅拌反应，反应结束后，将产物离心分离、洗涤，再将产物分散到蒸馏水中，备用；
步骤5、MB-aptamer1和MB-aptamer2捕获探针的制备：包括用MB为载体负载经巯基修饰的伏马毒素B1(FB1)的适配体1(aptamer1)，简称为MB-aptamer1；用MB为载体负载经巯基修饰的赭曲霉毒素A(OTA)的适配体2(aptamer2)，简称为MB-aptamer2；具体如下：将aptamer1的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯(Trichloroethyl phosphate，TCEP)的Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液混合，振荡反应，反应完毕后，离心后得到即时活化的aptamer1溶液A，将所述活化的aptamer1溶液A与步骤1得到的金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液混合，得到混合液B，向混合液B中加入6-巯基己醇溶液得到混合液C，将混合液C进行振荡反应，反应完毕后，对产物进行磁性分离并洗涤，最后将产物重新分散到水中，备用；将aptamer2的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯(Trichloroethyl phosphate，TCEP)的Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液混合，振荡反应，反应完毕后，离心后得到即时活化的aptamer2溶液D，将所述即时活化的aptamer2溶液D与步骤1得到的金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液混合，得到混合液E，向混合液E中加入6-巯基己醇溶液得到混合液F，将混合液F进行振荡反应，反应完毕后，对产物进行磁性分离并洗涤，最后将产物重新分散到水中，备用；
步骤6、适配体1的互补链(简称为cDNA1)与SiO2@PbS偶联得到cDNA1-SiO2@PbS以及适配体2的互补链(简称为cDNA2)与SiO2@CdTe偶联得到cDNA2-SiO2@CdTe纳米生物探针的制备：取步骤4制备的CdTe QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液混合，得到混合液G，将混合液G在室温下搅拌反应a，加入溶有适配体1的互补链的Tris-HCl缓冲溶液，得到混合液H，室温下进行搅拌反应b，反应完毕后离心得到产物，并将产物重新用Tris-HCl缓冲溶液分散，备用；取步骤4制备的PbS QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液混合，得到混合液I，将混合液I在室温下搅拌反应c，加入溶有适配体2的互补链的Tris-HCl缓冲溶液，得到混合液J，对混合液J进行室温下搅拌反应d，反应完毕后离心得到产物，并将产物重新用Tris-HCl缓冲溶液分散，备用；
步骤7、MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe纳米生物复合材料的制备：取步骤6制得的cDNA1-SiO2@PbS分散液与步骤5制得的MB-aptamer1分散液混合，得到混合液K，室温下振荡反应，反应完毕后磁性分离产物并洗涤，最后将产物重新分散于Tris-HCl缓冲液中，备用；取步骤6制得的cDNA2-SiO2@CdTe分散液与步骤5制得的MB-aptamer2分散液混合，得到混合液L，室温下振荡反应，反应完毕后磁性分离产物并洗涤，最后将产物重新分散于Tris-HCl缓冲液中，备用；
步骤8、传感器的构建及样品的检测，包括：
铋膜修饰的丝网印刷电极的制备：将与电化学工作站连接的丝网印刷电极浸入硝酸铋溶液中，通过外加电压e沉积Bi3+，沉积完毕后，洗涤并干燥，铋膜修饰的丝网印刷电极；
对OTA和FB1标准品进行检测，建立标准曲线：将FB1和OTA标准品溶液分别与含有MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe的混合液反应，室温下温育，反应完毕后用磁铁收集反应后的磁性复合材料，用PBS冲洗后用含有PBS和HNO3的混合溶液稀释得到底液；将工作站相联的铋膜修饰的丝网印刷电极浸入含底液和HAc-NaAc缓冲溶液的混合溶液中，在外加电压f下沉积Cd和Pb金属单质，然后利用方波伏安法检测Cd2+和Pb2+的溶出峰，通过Cd2+和Pb2+的溶出峰高与对应OTA和FB1标准品浓度建立标准曲线。
步骤1中，金纳米粒子包覆的Fe3O4微球(MB)分散液的浓度为5mg mL-1。步骤2中，水溶性碲化镉量子点(CdTe QDs)溶液和水溶性硫化铅量子点(PbS QDs)溶液的浓度均为10mgmL-1。
步骤2中，水溶性碲化镉量子点(CdTe QDs)的制备方法为：将0.065g的Te粉和0.05g的NaBH4加入到10mL水中，通氮气在冰水浴中反应至Te粉溶解完全，得到NaHTe溶液，保存；将0.1142g CdCl2·2.5H2O和210μL的巯基丙酸(MPA)与50mL水混合，用1mol L-1NaOH调节pH值为8～9，得到混合液M，通氮气除氧30min；在强磁力搅拌条件下，移取2mL的NaHTe溶液快速注入混合液M中，然后移到水热釜中保持80℃反应70min。停止反应恢复至室温后加入过量乙醇搅拌然后静置15min，将所得溶液以离心，取沉淀重新分散得到10mg mL-1水溶性CdTe QDs溶液，4℃避光保存。
步骤3中，单分散硅烷化SiO2纳米粒子水分散液的浓度为10mg mL-1。
步骤4中，制备CdTe QDs包覆的SiO2纳米球时，所用的CdTe QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、SiO2纳米粒子水分散液的体积比为10:1:20；制备PbS QDs包覆的SiO2纳米球时，PbS QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、SiO2纳米粒子水分散液的体积比均为10:1:20；所用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的浓度为20mg mL-1。
步骤5中，制备活化的aptamer1溶液A时，所用的aptamer1的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1:1，aptamer1的浓度为0.1mmol L-1；制备混合液B时，所用的活化的aptamer1与MB分散液的体积比为1:30；制备混合液C时，所用的混合液B与6-巯基己醇溶液的体积比为31:30；制备活化的aptamer2溶液D时，所用的aptamer2的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1:1，aptamer2的浓度为0.1mmol L-1；制备混合液E时，所用的活化的aptamer2与MB分散液的体积比为1:30；制备混合液F时，所用的混合液E与6-巯基己醇溶液的体积比为31:30；步骤5中，所用的磷酸三氯乙酯的浓度均为0.1mol L-1，6-巯基己醇溶液的浓度均为2μmol L-1，所有的振荡反应均在37℃下进行，反应时间均为12h。
步骤5中，在得到混合液B或混合液E后，向混合液B或混合液E中分四次加入2molL-1NaCl溶液，所加入的NaCl溶液体积依次为0.8mL、0.8mL、1.8mL、7mL。
步骤6中，制备混合液G时，CdTe QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为15:8；制备混合液H时，所用的溶有aptamer1的互补链的Tris-HCl缓冲溶液与混合液G的体积比为1:46；制备混合液I时，PbS QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为15:8；制备混合液H时，所用的溶有aptamer2的互补链的Tris-HCl缓冲溶液与混合液G的体积比为1:46；所述的搅拌反应a、b、c、d均在室温下进行，所述搅拌反应a、c反应时间均为1h，所述搅拌反应b、d反应时间均为12h；步骤6中，所用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为1mmol L-1。
步骤7中，制备混合液K时，所用的cDNA1-SiO2@PbS分散液与MB-aptamer1分散液的体积比为2:3，cDNA1-SiO2@PbS分散液的浓度为10mg mL-1，MB-aptamer1分散液的浓度为5mgmL-1；制备混合液L时，所用的cDNA2-SiO2@CdTe分散液与MB-aptamer2分散液的体积比为2:3，cDNA2-SiO2@CdTe分散液的浓度为10mg mL-1，MB-aptamer2分散液的浓度为5mg mL-1。
步骤8中，所述的硝酸铋溶液浓度为1.25mg mL-1，所述外加电压e为-1.2V，外加电压e的沉积时间为120秒；所述FB1标准品的浓度为0～10ng mL-1，所述OTA标准品的浓度为0～50ng mL-1，所用的MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe的混合液体积为1mL，MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe的浓度均为15mg mL-1，所述温育时间为60分钟；含有PBS和200μL 0.1M HNO3的混合溶液中，所用的PBS溶液与HNO3溶液的体积比为5:1，HNO3溶液的浓度为0.1mol L-1；在含底液和HAc-NaAc缓冲溶液的混合溶液中，底液与HAc-NaAc缓冲溶液的体积比为1:3，所用的HAc-NaAc缓冲溶液浓度为10mmol L-1；所述外加电压f为-1.0V，外加电压f沉积时间为300秒；所述方波伏安法(SWV)的电压为-1.2～-0.3V；步骤8中，所用的PBS溶液浓度均为0.1moll-1，pH均为7.0。
所用的适配体1序列为5’–ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TACCAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTG CAATCT–SH–3’；适配体2序列为5’–GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA–SH–3’；适配体1的互补链序列为5’–TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGAATA AGC TGG TAT–NH2–3’；适配体2的互补链序列为5’–CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCGATC–NH2–3’。
有益效果：
(1)本发明通过先对磁性表面进行金壳包覆制备了金纳米粒子包覆的磁性复合材料；大量巯基修饰的适配体通过Au-S键与磁性复合材料一步键合，实现了简单易操作的特点；
(2)本发明基于适配体对目标分子的特异性识别检测真菌毒素，因此不需要对样品进行分离纯化，并以电化学方波伏安法作为检测手段，大大降低了小分子毒素检测的成本；
(3)本发明使用的丝网印刷电极结构简单，加工方法简便、成本低，具有检测方法操作方便、检测灵敏度高等特点。
(4)本发明所提出的双通道检测模式实现了对FB1和OTA的同时检测，线性范围分别在0.005～50ng mL-1和0.005～10ng mL-1的浓度区间内，FB1和OTA分别与SWV呈现良好的线性关系，检出限分别可达0.5pg mL-1和1.1pg mL-1。
附图说明
图1为本发明实施例制备的材料的透射电镜图，其中(A)为SiO2@CdTe的透射电镜图，(B)为SiO2@PbS的透射电镜图；
图2为实施例1中对赭曲霉毒素A和伏马毒素B1的检测数据图，其中(A)为检测不同浓度伏马毒素B1和赭曲霉毒素A与所得到的SWV值的对应关系的数据图：a为0ng mL-1浓度伏马毒素B1和0ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，b为0.005ng mL-1浓度伏马毒素B1和0.005ngmL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，c为0.05ng mL-1浓度伏马毒素B1和0.01ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，d为0.1ng mL-1浓度伏马毒素B1和0.05ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，e为0.5ng mL-1浓度伏马毒素B1和0.1ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，f为1ng mL-1浓度伏马毒素B1和0.5ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，g为5ng mL-1浓度伏马毒素B1和1ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，h为10ng mL-1浓度伏马毒素B1和5ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线，i为50ng mL-1浓度伏马毒素B1和10ng mL-1赭曲霉毒素A的检测曲线；(B)和(C)分别为(A)中FB1浓度和OTA浓度与SWV值的标准曲线，插图为(A)中FB1和OTA浓度的对数取值与SWV值的线性关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
(1)MB-aptamer1和MB-aptamer2捕获探针的制备：
按照现有的方法制备Fe3O4微球，具体如下：0.5536g FeCl3·6H2O溶解于10mL乙二醇(EG)和10mL一缩二乙二醇(DEG)的混合液中，然后加入1.5g醋酸钠和1.0g聚乙二醇，室温下搅拌30min，移入水热反应釜中200℃反应2.5h，冷却至室温。将混合物磁分离，并用水和乙醇多次洗涤，得到Fe3O4微球，放入烘箱，50℃下将溶剂挥发得到干燥的Fe3O4微球，备用。
按照现有的方法制备金纳米粒子包覆的Fe3O4微球(MB)，具体如下：0.14g上述制得Fe3O4微球溶于40mL乙醇，又将400μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)原液加入其中，机械搅拌7h，然后磁分离水洗数次重分散于40mL水中。4mL 1％HAuCl4溶液逐滴加入到上述溶液中，100℃回流30min，后逐滴加入8mL 1％柠檬酸钠溶液，100℃回流3h，冷却后得到MB微球。最后，经磁分离水洗数次，粉末重新用蒸馏水分散得到5mg mL-1MB分散液备用。
活化aptamer1和aptamer2：将500μL 100μM的aptamer1(或aptamer2)加入到500μL包含100mM磷酸三氯乙酯(Trichloroethyl phosphate，TCEP)的Tris-HCl(10mmol L-1，pH＝7.4)缓冲溶液中，在37℃下震荡1h，然后离心纯化去除多余的TCEP。将1mL上述即时活化的aptamer1(或aptamer2)加入到30mL上述制得的MB分散液中，为了保证aptamer1(或aptamer2)与MB的高效键接，在上述溶液中分四次分别加入0.8mL、0.8mL、1.8mL、7mL的2molL-1NaCl溶液，使得溶液中钠离子的浓度为0.05M、0.1M、0.2M、0.5M，每次加入NaCl溶液都将混合液超声10秒并震荡20分钟。最后将上述含钠离子的混合液在37℃下震荡12h后与30mL2μM 6-巯基己醇(MCH)37℃下震荡1h后溶液经过缓冲溶液磁洗涤去除多余的aptamer1(或aptamer2)，纯化处理并重新分散得到5mg mL-1MB-aptamer1(或MB-aptamer2)4℃保存。
(2)cDNA1-SiO2@PbS和cDNA2-SiO2@CdTe纳米生物探针的制备：
可以根据现有方法中的回流法制备CdTe QDs，本发明通过下述低温溶剂热法制备：将0.065g的Te粉和0.05g的NaBH4加入试管中，加入10mL水，通氮气4℃下反应至Te粉溶解完全，得到淡紫色的NaHTe溶液，4℃保存。将0.1142g CdCl2·2.5H2O和210μL的MPA与50mL水混合于烧杯中，用1M NaOH调节pH值为8～9，通氮气除氧30min。在强磁力搅拌条件下，移取2mL的NaHTe溶液快速注入烧杯中，然后移到100mL水热釜中保持80℃反应70min。停止反应净至室温后加入过量乙醇搅拌然后静置15min，将所得溶液以13000rpm离心10min，取沉淀重新分散得到10mg mL-1水溶性CdTe QDs溶液，4℃避光保存。
合成水溶性PbS QDs，具体如下：称取0.008g的S粉置于三颈烧瓶(Ⅰ)中，加入3mL油胺OLA，抽真空，氮气置换3次，90℃加热至S粉完全溶解，冷却至室温得到溶液(A)。取0.14gPbCl2置于三颈烧瓶(Ⅱ)中，加入5mL OLA，通氮除氧15min，氮气氛下90℃加热至PbCl2完全溶解，得到溶液(B)。将溶液(A)注入溶液(B)中，90℃下反应10min后，用10mL预冷(4℃)的正己烷终止反应。3000rmp离心10min除去过量的PbCl2，弃去沉淀后加入无水乙醇(体积比1:1)使粒子沉淀，3000rmp离心10min，弃去上清液将沉淀重新分散在正己烷中，再加无水乙醇使粒子沉淀析出，离心，如此重复四次。最后将PbS QDs分散在10mL正己烷中，4℃保存备用。取上述10mL油溶性PbS QDs，向其中加入1mL MPA原液，振荡1h，超声20min，将含有PbS QDs的部分用乙醇洗三次，饱和NaHCO3溶液洗一次，最后将其分散饱和NaHCO3水溶液中，得到10mg mL-1水溶性的PbS QDs。
从图1(A)和(B)可以观察到SiO2颗粒呈现规则的球形，粒径约100nm。CdTe和PbS量子点均匀分布在SiO2小球表面。
制备单分散硅烷化SiO2纳米粒子，具体如下：首先将80mL无水乙醇，4.85mL H2O和3.6mL NH3·H2O依次加入250mL圆底烧瓶中，在剧烈搅拌下加热到55℃。再将3.1mL TEOS与8mL无水乙醇混合后迅速加入烧瓶中，在55℃下搅拌反应5h。反应结束后将所得到的SiO2纳米粒子作为种子用于进一步生长成较大粒径的SiO2纳米粒子，具体操作是：将70mL无水乙醇，13mL H2O和7.5mL NH3·H2O依次加入250mL圆底烧瓶后，再将20mL 10mg mL-1上述种子加入其中，搅拌均匀后，将1mL TEOS与10mL无水乙醇混合液逐滴加入烧瓶中，搅拌反应5h。反应结束后将烧瓶放入烘箱，50℃下将溶剂挥发至得到干燥的SiO2纳米粒子，备用。最后将20mL 10mg mL-1较大颗粒的SiO2小球加入乙醇溶液，超声至完全分散。然后将1mL APTS原液滴加到以上混合溶液中，搅拌6小时，得到氨基修饰的SiO2纳米粒子。混合物离心分离，沉淀用乙醇溶液清洗3次，二次水清洗2次，用二次水中分散得到10mg mL-1SiO2小球，备用。
CdTe(或PbS)QDs包覆SiO2纳米球的制备：将10mL上述制得10mg mL-1MPA保护的CdTe(或PbS)QDs、1mL 20mg mL-11-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶液与上述20mL 10mg mL-1氨基修饰的SiO2纳米小球混合均匀，在4℃下搅拌反应6h。混合物离心分离，沉淀用水清洗4次，得到由CdTe(或PbS)QDs修饰的SiO2纳米小球(SiO2@CdTe或SiO2@PbS)，并用0.01M PBS分散得10mg mL-1SiO2@CdTe或SiO2@PbS，备用。
cDNA1-SiO2@PbS和cDNA2-SiO2@CdTe纳米生物探针的制备：
将15mL上述制得的10mg mL-1SiO2@CdTe(或SiO2@PbS)纳米小球与8mL包含1mmol L-1EDC和1mM NHS的10mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液混合，室温下搅拌反应1h。500μL 100μM的cDNA1(或cDNA2)加入到上述溶液中室温下搅拌过夜，离心去除多余互补链，所得沉淀重新用Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液分散得到10mg mL-1cDNA1-SiO2@PbS(或cDNA2-SiO2@CdTe)纳米生物探针，4℃避光保存，备用。
(3)MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe纳米生物复合物的制备：
将20mL步骤(2)制得的10mg mL-1cDNA1-SiO2@PbS(或cDNA2-SiO2@CdTe)溶液加入到30mL步骤(1)制得的5mg mL-1MB-aptamer1(或MB-aptamer2)溶液中，室温下震荡反应2h后得到MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS(或MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe)，磁分离再用Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液冲洗，最后重分散于10mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液中得到15mg mL-1的磁控生物复合材料，备用。
(4)对OTA和FB1标准品进行检测，建立标准曲线。
铋膜修饰的丝网印刷电极的制备：将与电化学工作站连接的丝网印刷电极浸入4mL pH＝2，Bi3+浓度为1.25mg mL-1的硝酸铋溶液中，外加电压-1.2V条件下，沉积120s，水洗并氮气吹干。
对OTA和FB1标准品进行检测，建立标准曲线：0，0.005，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50ng mL-1的FB1和0，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10ng mL-1的OTA标准品分别与1mL15mg mL-1包含MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe的混合液反应，室温下温育60分钟后，用磁铁收集反应后的磁性复合材料，用0.1mol L-1PBS(pH 7.0)溶液冲洗后用包含1mL 0.1mol L-1pH7.0 PBS和200μL 0.1mol L-1HNO3的混合溶液稀释得到底液。最后将工作站相联的铋膜修饰的丝网印刷电极浸入4mL含1mL底液和3mL 10mM HAc-NaAc缓冲溶液中，外加电压-1.0V下沉积Cd和Pb金属单质300s，然后改变外加电压范围从-1.2到-0.3V，利用方波伏安法检测Cd2+和Pb2+的溶出峰，通过Cd2+和Pb2+的溶出峰高与对应OTA和FB1标准品浓度建立标准曲线。
上述实验所涉及的：
1.适配体aptamer1序列：5’–ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTATAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTGCAA TCT–SH–3’；
2.适配体aptamer2序列：5’–GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGGACA–SH–3’；
3.单链cDNA1序列：5’–TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGAATA AGC TGG TAT–NH2–3’；
4.单链cDNA2序列：5’–CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC–NH2–3’；
5.OTA检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的OTA和FB1标准品进行反应后，再将反应后的磁性复合材料磁收集并溶解在过量的稀硝酸中，并用电化学工作站方波伏安法沉积两种金属单质并检测Pb2+和Cd2+的溶出峰，根据不同浓度下Pb2+和Cd2+的溶出峰值与对应的OTA和FB1标准品浓度制得的标准曲线。
从图2中可以看出，检测FB1和OTA标准品浓度的线性范围分别为：5pg mL-1～10ngmL-1和5pg mL-1～5ng mL-1，均呈现良好的线性关系，对FB1的检出限达到了0.5pg mL-1，对OTA的检出限达到了1.1pg mL-1。

Claims (10)

1.一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液的制备；
步骤2、水溶性碲化镉量子点溶液和水溶性硫化铅量子点溶液的制备；
步骤3、单分散硅烷化SiO2纳米粒子水分散液的制备；
步骤4、CdTe QDs包覆的SiO2纳米球分散液和PbS QDs包覆的SiO2纳米球分散液的制备：取步骤2制备的CdTe QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、步骤3制备的SiO2纳米粒子水分散液混合均匀，在冰水浴中搅拌反应，反应结束后，将产物离心分离、洗涤，再将产物分散到蒸馏水中，备用；取步骤2制备的PbS QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、步骤3制备的SiO2纳米粒子水分散液混合均匀，在冰水浴中搅拌反应，反应结束后，将产物离心分离、洗涤，再将产物分散到蒸馏水中，备用；
步骤5、MB-aptamer1和MB-aptamer2捕获探针的制备：包括用MB为载体负载经巯基修饰的伏马毒素B1的适配体1，简称为MB-aptamer1；用MB为载体负载经巯基修饰的赭曲霉毒素A的适配体2，简称为MB-aptamer2；具体如下：将aptamer1的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris-HCl缓冲溶液混合，振荡反应，反应完毕后，离心后得到即时活化的aptamer1溶液A，将所述活化的aptamer1溶液A与步骤1得到的金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液混合，得到混合液B，向混合液B中加入6-巯基己醇溶液得到混合液C，将混合液C进行振荡反应，反应完毕后，对产物进行磁性分离并洗涤，最后将产物重新分散到水中，备用；将aptamer2的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris-HCl缓冲溶液混合，振荡反应，反应完毕后，离心后得到即时活化的aptamer2溶液D，将所述即时活化的aptamer2溶液D与步骤1得到的金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液混合，得到混合液E，向混合液E中加入6-巯基己醇溶液得到混合液F，将混合液F进行振荡反应，反应完毕后，对产物进行磁性分离并洗涤，最后将产物重新分散到水中，备用；
步骤6、适配体1的互补链与SiO2@PbS偶联得到cDNA1-SiO2@PbS以及适配体2的互补链与SiO2@CdTe偶联得到cDNA2-SiO2@CdTe纳米生物探针的制备：取步骤4制备的CdTe QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液混合，得到混合液G，将混合液G在室温下搅拌反应a，加入溶有适配体1的互补链的Tris-HCl缓冲溶液，得到混合液H，室温下进行搅拌反应b，反应完毕后离心得到产物，并将产物重新用Tris-HCl缓冲溶液分散，备用；取步骤4制备的PbS QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液混合，得到混合液I，将混合液I在室温下搅拌反应c，加入溶有适配体2的互补链的Tris-HCl缓冲溶液，得到混合液J，对混合液J进行室温下搅拌反应d，反应完毕后离心得到产物，并将产物重新用Tris-HCl缓冲溶液分散，备用；
步骤7、MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe纳米生物复合材料的制备：取步骤6制得的cDNA1-SiO2@PbS分散液与步骤5制得的MB-aptamer1分散液混合，得到混合液K，室温下振荡反应，反应完毕后磁性分离产物并洗涤，最后将产物重新分散于Tris-HCl缓冲液中，备用；取步骤6制得的cDNA2-SiO2@CdTe分散液与步骤5制得的MB-aptamer2分散液混合，得到混合液L，室温下振荡反应，反应完毕后磁性分离产物并洗涤，最后将产物重新分散于Tris-HCl缓冲液中，备用；
步骤8、传感器的构建及样品的检测，包括：
铋膜修饰的丝网印刷电极的制备：将与电化学工作站连接的丝网印刷电极浸入硝酸铋溶液中，通过外加电压e沉积Bi3+，沉积完毕后，洗涤并干燥，铋膜修饰的丝网印刷电极；
对OTA和FB1标准品进行检测，建立标准曲线：将FB1和OTA标准品溶液分别与含有MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe的混合液反应，室温下温育，反应完毕后用磁铁收集反应后的磁性复合材料，用PBS冲洗后用含有PBS和HNO3的混合溶液稀释得到底液；将工作站相联的铋膜修饰的丝网印刷电极浸入含底液和HAc-NaAc缓冲溶液的混合溶液中，在外加电压f下沉积Cd和Pb金属单质，然后利用方波伏安法检测Cd2+和Pb2+的溶出峰，通过Cd2+和Pb2+的溶出峰高与对应OTA和FB1标准品浓度建立标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤1中，金纳米粒子包覆的Fe3O4微球分散液的浓度为5mg mL-1；步骤2中，水溶性碲化镉量子点溶液和水溶性硫化铅量子点溶液的浓度均为10mg mL-1。
3.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤2中，水溶性碲化镉量子点的制备方法为：将0.065g的Te粉和0.05g的NaBH4加入到10mL水中，通氮气在冰水浴中反应至Te粉溶解完全，得到NaHTe溶液，保存；将0.1142g CdCl2·2.5H2O和210μL的巯基丙酸与50mL水混合，用1mol L-1NaOH调节pH值为8～9，得到混合液M，通氮气除氧30min；在强磁力搅拌条件下，移取2mL的NaHTe溶液快速注入混合液M中，然后移到水热釜中保持80℃反应70min；停止反应恢复至室温后加入过量乙醇搅拌然后静置15min，将所得溶液以离心，取沉淀重新分散得到10mg mL-1水溶性CdTe QDs溶液，4℃避光保存。
4.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤4中，制备CdTe QDs包覆的SiO2纳米球时，所用的CdTe QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、SiO2纳米粒子水分散液的体积比为10:1:20；制备PbS QDs包覆的SiO2纳米球时，PbS QDs溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、SiO2纳米粒子水分散液的体积比均为10:1:20；所用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的浓度为20mg mL-1，所用的SiO2纳米粒子水分散液的浓度为10mg mL-1。
5.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤5中，制备活化的aptamer1溶液A时，所用的aptamer1的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1:1，aptamer1的浓度为0.1mmol L-1；制备混合液B时，所用的活化的aptamer1与MB分散液的体积比为1:30；制备混合液C时，所用的混合液B与6-巯基己醇溶液的体积比为31:30；制备活化的aptamer2溶液D时，所用的aptamer2的Tris-HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1:1，aptamer2的浓度为0.1mmol L-1；制备混合液E时，所用的活化的aptamer2与MB分散液的体积比为1:30；制备混合液F时，所用的混合液E与6-巯基己醇溶液的体积比为31:30；步骤5中，所用的磷酸三氯乙酯的浓度均为0.1mol L-1，6-巯基己醇溶液的浓度均为2μmolL-1，所有的振荡反应均在37℃下进行，反应时间均为12h。
6.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤5中，在得到混合液B或混合液E后，向混合液B或混合液E中分四次加入2mol L-1NaCl溶液，所加入的NaCl溶液体积依次为0.8mL、0.8mL、1.8mL、7mL。
7.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤6中，制备混合液G时，CdTe QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为15:8；制备混合液H时，所用的溶有aptamer1的互补链的Tris-HCl缓冲溶液与混合液G的体积比为1:46；制备混合液I时，PbS QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的Tris-HCl缓冲溶液的体积比为15:8；制备混合液H时，所用的溶有aptamer2的互补链的Tris-HCl缓冲溶液与混合液G的体积比为1:46；所述的搅拌反应a、b、c、d均在室温下进行，所述搅拌反应a、c反应时间均为1h，所述搅拌反应b、d反应时间均为12h；步骤6中，所用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为1mmol L-1。
8.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤7中，制备混合液K时，所用的cDNA1-SiO2@PbS分散液与MB-aptamer1分散液的体积比为2:3，cDNA1-SiO2@PbS分散液的浓度为10mg mL-1，MB-aptamer1分散液的浓度为5mg mL-1；制备混合液L时，所用的cDNA2-SiO2@CdTe分散液与MB-aptamer2分散液的体积比为2:3，cDNA2-SiO2@CdTe分散液的浓度为10mg mL-1，MB-aptamer2分散液的浓度为5mg mL-1。
9.根据权利要求1所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，步骤8中，所述的硝酸铋溶液浓度为1.25mg mL-1，所述外加电压e为-1.2V，外加电压e的沉积时间为120秒；所述FB1标准品的浓度为0～10ng mL-1，所述OTA标准品的浓度为0～50ng mL-1，所用的MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe的混合液体积为1mL，MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe的浓度均为15mg mL-1，所述温育时间为60分钟；含有PBS和200μL 0.1M HNO3的混合溶液中，所用的PBS溶液与HNO3溶液的体积比为5:1，HNO3溶液的浓度为0.1mol L-1；在含底液和HAc-NaAc缓冲溶液的混合溶液中，底液与HAc-NaAc缓冲溶液的体积比为1:3，所用的HAc-NaAc缓冲溶液浓度为10mmol L-1；所述外加电压f为-1.0V，外加电压f沉积时间为300秒；所述方波伏安法的电压为-1.2～-0.3V；步骤8中，所用的PBS溶液浓度均为0.1mol l-1，pH均为7.0。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，所用的适配体1序列为5’–ATA CCA GCT TAT TCA ATT AATCGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATTAGA TAG TAA GTG CAA TCT–SH–3’；适配体2序列为5’–GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA–SH–3’；适配体1的互补链序列为5’–TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AATGCG ATT AAT TGA ATA AGC TGG TAT–NH2–3’；适配体2的互补链序列为5’–CCT TTA CGCCAC CCA CAC CCG ATC–NH2–3’。
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