CN106596677A - 一种用于ota灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法，步骤如下：步骤1、MPA修饰的纳米胶体金溶液的制备；步骤2、适配体的活化；步骤3、PDDA修饰的丝网印刷电极的制备；步骤4、金纳米粒子修饰的丝网印刷电极的制备；步骤5、适配体修饰的Au NPs‑SPCE的制备。与传统检测方法相比，本发明中所提出的OTA的免标记阻抗检测方法具有操作更简便灵活，仪器设备更简单，试剂用量少，检测成本低廉等特点。

Description

一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法
技术领域
本发明属于电化学检测领域，特指一种用于检测赭曲霉毒素A的基于金纳米粒子修饰的丝网印刷电极的电化学适配体传感器的构建方法及用途。
背景技术
赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一种霉菌肾毒素，属于典型的食源性真菌毒素。在极性有机溶剂中OTA能稳定存在，如OTA的乙醇溶液在冷藏条件下可稳定存在一年以上，但OTA在紫外线照射下很快就会分解。在动物体内OTA非常稳定、不易被代谢降解，而且OTA在多种动物体内存在毒性，研究发现其毒性主要表现肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。1993年，OTA被国际癌症研究机构定为2B类致癌物。OTA的产生主要来源于OTA产生菌，这些霉菌在粮谷类、干果、葡萄及葡萄酒、咖啡、中草药、调味品、罐头食品、油、橄榄、豆制品、啤酒、茶叶等多种农副产品的生产、加工过程中都有可能出现。另一方面，动物在进食受到OTA污染的饲料后，会因OTA的不易代谢降解而在体内蓄积。人在食用这些被OTA污染的动物组织后，对人的生命安全将会产生潜在的危害。
动物食用了含有OTA的饲料会导致体内毒素残留从而使肉制品被污染，这些残留的OTA也可以经由食物链进入人体，从而对人类健康及农业经济发展造成严重威胁。因此，探寻有效检测、控制真菌毒素的措施对于生产效益、动物福利、产品质量和食品安全都是至关重要的。美国、欧洲等发达国家已经初步确立了真菌毒素检测的法规和标准。例如，食品法典委员会规定了小麦、大麦、黑麦等谷物及其产品的OTA限量标准为5.0μg kg-1。欧盟委员会对谷物产品、葡萄酒等食品的OTA限量标准更为严格，要求谷物产品中的OTA≤3.0μg kg-1，葡萄酒中的OTA≤2.0μg kg-1。
用于OTA的传统检测方法主要依靠(1)理化检测方法，如薄层色谱法，微柱层析法，气相色谱法，高效液相色谱法，毛细管电泳法等；(2)生物学检测法，包括皮肤毒性实验，致呕吐实验，种子发芽实验等；(3)免疫化学检测方法，如酶联免疫吸附分析法，荧光免疫分析法，放射免疫分析法等。尽管这些方法一般可以较为灵敏地确定样品中真菌毒素的含量，但往往存在许多不足，例如，(1)需要大型昂贵仪器，如气相/液相色谱仪，质谱仪等；样品前处理步骤麻烦耗时；(2)样品消耗量大，操作步骤繁琐；分析过程中易产生大量废弃的有机溶剂，污染环境；(3)需要相对专业化的实验人员；(4)检测成本较高，不便于广泛推广。现实中粮食往往同时受多种真菌毒素污染，虽然真菌毒素多残留问题已引起重视，但是近年来研究的热点集中于真菌毒素的单一检测，鲜有同时检测多种真菌毒素的研究报道。因此，发展一种简便快捷，高通量，无需大型仪器，检测成本低的方法用于食品中多种真菌毒素的检测，对于人类健康和社会发展都大有益处。
本发明基于金纳米粒子修饰的丝网印刷电极(SPCE)，藉以核酸适配体(aptamer)为识别元件，构建了一种快速、灵敏的电化学适配体传感器用于OTA的电化学阻抗法检测，建立了OTA标准品浓度与电化学阻抗值之间的对应关系，实现了简单、灵敏、快速检测OTA的目的。
发明内容
本发明旨在提供一种集于免标记、高灵敏度、高选择性、广适用性等优点为一体的电化学适配体传感器。该传感器制备工艺简单，成本低，实现了快速定量检测OTA的目的。
所采用的方案概括为：以巯基丙酸(MPA)修饰的纳米胶体金溶液为起始原料，以聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液处理过的丝网印刷电极为载体，利用静电吸附原理在丝网印刷电极表面负载一层金纳米粒子，籍以适配体为识别元件，构建电化学传感平台。首先，制备MPA修饰的纳米胶体金溶液以及PDDA修饰的丝网印刷电极，接着利用静电吸附原理在丝网印刷电极表面负载一层金纳米粒子，利用金纳米粒子优良的导电性能和较大的比表面积等性质，对检测系统起到一个信号放大的作用；然后在金纳米粒子修饰的丝网印刷电极表面利用Au-S的共价键合作用偶联巯基修饰的OTA的适配体；最后构建电化学适配体传感器并通过该传感界面与不同浓度的OTA反应，建立电化学阻抗值与OTA浓度之间的关系，以达到对含OTA的样品进行定量检测的目的。
本发明是通过如下具体技术方案实现的：
一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法，步骤如下：
步骤1、MPA修饰的纳米胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.01％的HAuCl4溶液100mL，加热至沸腾，搅拌条件下迅速加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液3mL，并继续煮沸15分钟；结束反应后将溶液冷却至室温，得到胶体金；在振荡的条件下，向10mL胶体金中逐滴加入60μL MPA，滴加完毕后持续振荡5小时；反应结束后离心得到紫黑色沉淀，水洗3次后向紫黑色沉淀物中加入5mL 50mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液，沉淀物立刻均匀分散为紫红色胶体溶液，即为MPA修饰的纳米胶体金溶液；
步骤2、适配体的活化：首先，将20μL 100μM的OTA适配体标准液加入到5μL 50mMpH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，该Tris-HCl缓冲溶液中含有100mM的磷酸三氯乙酯(TCEP)；然后在室温条件下，放置在往复震荡仪上振荡1小时；最后，利用离心超滤装置移去多余的磷酸三氯乙酯，4℃密封保存备用；
步骤3、PDDA修饰的丝网印刷电极的制备：首先，将清洗过的丝网印刷电极浸入5mL含有0.5M H2SO4和0.1M KCl的混合溶液中进行循环伏安扫描，直至扫描得到稳定的循环伏安图，二次水淋洗，氮气吹干，得到处理过的丝网印刷电极；然后将10μL体积浓度为1％的PDDA溶液滴涂在处理过的丝网印刷电极表面，室温下反应2小时，二次水淋洗，氮气吹干，密封保存备用；
步骤4、金纳米粒子修饰的丝网印刷电极的制备：将10μL步骤1制备的MPA修饰的金纳米粒子溶液滴涂在步骤3制备的丝网印刷电极表面，室温下反应2小时，得到金纳米粒子修饰的丝网印刷电极，记为Au NPs-SPCE，4℃密封保存备用；
步骤5、适配体修饰的Au NPs-SPCE的制备：首先取10μL 100μM的OTA适配体标准液滴涂在步骤4中制备的工作电极表面，室温条件下反应12小时，用50mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液淋洗，氮气吹干；然后将电极浸没在5mL 1mM 6-巯基己醇(MCH)中，室温条件下反应1小时，封闭电极后分别用Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，得到适配体修饰的Au NPs-SPCE，即所述适配体传感器，4℃密封保存备用。
步骤3中，在进行所述循环伏安扫描时，扫描电压范围为-0.2～1.5V，扫描速率为100mVs-1。
所述OTA适配体序列为：5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGGACA–SH-3′。
所述OTA标准溶液浓度为0～100ng mL-1。
所述适配体传感器用于对赭曲霉毒素检测的用途。
对OTA标准品进行检测的步骤如下：
对OTA标准品进行检测，建立标准曲线：将OTA标准溶液分别滴涂在步骤5制备的电化学传感界面上，在37℃条件下孵化30分钟，之后用50mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液淋洗，氮气吹干；最后将电极置于阻抗溶液中，扫描电化学阻抗图谱(EIS)，根据阻抗值与对应的OTA标准品浓度建立标准曲线。所述阻抗液为0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)含5mM[Fe(CN)6]3-/4-。
有益效果：
本发明采用自组装法构建了基于Au NPs修饰SPCE的可抛式一次性适配体传感器，运用核酸适配体序列对OTA的特异性识别，构建了一种免标记阻抗检测OTA的方法，其特色和优点表述如下：
(1)本发明采用一次性的SPCE作为基底来构建传感器，避免了电极表面繁琐的预处理程序；SPCE表面的多孔结构也为纳米粒子提供了更多的负载空间。
(2)本发明采用金纳米粒子对电极表面进行修饰，一方面，大量的金纳米粒子负载在电极表面为免标记阻抗法检测起到信号放大的作用；另一方面，利用Au-S键固定更多的巯基化的适配体在电极表面。
(3)本发明利用核酸适配体作为信号指示剂，通过适配体与目标分子的特异性识别来检测OTA。
(4)本发明所提出的信号放大方法和检测模式实现了对OTA的超灵敏检测，在10pg·mL-1～50ng·mL-1的浓度区间内，OTA浓度的对数值(log cOTA)与Ret呈现良好的线性关系，检出限可达5pg·mL-1。
(5)与传统检测方法相比，本发明中所提出的OTA的免标记阻抗检测方法具有操作更简便灵活，仪器设备更简单，试剂用量少，检测成本低廉等特点。
附图说明
图1中，图A为不同OTA浓度下的阻抗图谱，图B为OTA浓度与阻抗值的对应关系图，插图为标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
MPA修饰的纳米胶体金溶液的制备
(1)取质量浓度为0.01％的HAuCl4溶液100mL，加热至沸腾，搅拌条件下迅速加入质量浓度为1％柠檬酸三钠溶液3mL，并继续煮沸约15分钟。结束反应后将溶液冷却至室温，取10mL上述制备的胶体金，在振荡的同时用移液器逐滴加入60μL的MPA，滴加完毕后持续振荡5小时。反应结束后将上述胶体以13000rpm转速离心10min，得到紫黑色沉淀，水洗3次后向紫黑色沉淀物中加入5mL 50mM Tris-HCl缓冲溶(pH 7.4)，沉淀物立刻均匀分散为紫红色胶体溶液，即为MPA保护的AuNPs。
PDDA修饰的丝网印刷电极的制备
(2)首先，将清洗过的丝网印刷电极浸入包含5mL 0.5M H2SO4和0.1M KCl的混合溶液并进行循环伏安扫描，扫描电压范围设定为-0.2～1.5V，扫描速率为100mV s-1，扫描时间60秒，二次水淋洗，氮气吹干。然后将10μL体积浓度为1％的PDDA溶液滴涂在上述处理过的丝网印刷电极表面，室温下反应2小时，二次水淋洗，氮气吹干，密封保存备用。
适配体的活化
(3)首先，将20μL 100μM的OTA适配体标准液加入到5μL 50mM Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.4，包含100mM磷酸三氯乙酯(TCEP))；然后在室温条件下，混合溶液放置在往复震荡仪上振荡1小时；最后，利用离心超滤装置移去多余的TCEP，4℃保存备用。
实施例2：
电化学适配体传感器的构建
(4)金纳米粒子修饰的丝网印刷电极(Au NPs-SPCE)的制备：将10μL步骤(1)制备的MPA修饰的胶体金溶液滴涂在步骤(3)制备的丝网印刷电极表面，室温下反应2小时，4℃密封保存备用。
(5)适配体修饰的Au NPs-SPCE电极的制备：首先取10μL 100μM的OTA适配体标准液滴涂在步骤(4)中制备的工作电极表面，室温条件下反应12小时，分别用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)淋洗，氮气吹干；然后将电极浸没在5mL 1mM 6-巯基己醇(MCH)中，室温条件下反应1小时，封闭电极后分别用Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，4℃密封保存备用。
实施例4：
建立赭曲霉毒素(OTA)检测的标准曲线
(6)对OTA标准品进行检测，建立标准曲线：将OTA标准品分别滴涂在步骤(5)制备的电化学传感界面上，在37℃条件下孵化30分钟，之后用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)淋洗，氮气吹干；最后将电极置于阻抗溶液中，扫描电化学阻抗图谱(EIS)，根据阻抗值与对应的OTA标准品浓度建立标准曲线。图1中，图A为在不同OTA浓度(从a到i依次为：0，0.01，0.05，0.1，0.05，0.1，5，10，50，100ng mL-1)下的阻抗图谱，从图中可以看出，随着浓度的增大阻抗图谱中所呈现的半圆弧也逐渐增大，表明OTA的加入对传感体系中的电荷传递存在明显的阻碍作用；图B为FB1浓度与EIS值的对应关系图，插图为标准曲线图，可以看出，0.01～50ng mL-1的浓度范围内阻抗值与FB1浓度的对数呈现一个很好的线性关系。
上述实验所涉及的：
1.适配体序列：5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA–SH-3′；
2.OTA检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的OTA进行反应后，扫描得到其交流阻抗图谱，根据不同浓度下阻抗值制得的标准曲线。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法
<130> 一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

Claims (5)

1.一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1、MPA修饰的纳米胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.01％的HAuCl4溶液100mL，加热至沸腾，搅拌条件下迅速加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液3mL，并继续煮沸15分钟；结束反应后将溶液冷却至室温，得到胶体金；在振荡的条件下，向10mL胶体金中逐滴加入60μL MPA，滴加完毕后持续振荡5小时；反应结束后离心得到紫黑色沉淀，水洗3次后向紫黑色沉淀物中加入5mL 50mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液，沉淀物立刻均匀分散为紫红色胶体溶液，即为MPA修饰的纳米胶体金溶液；
步骤2、适配体的活化：首先，将20μL 100μM的OTA适配体标准液加入到5μL 50mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，该Tris-HCl缓冲溶液中含有100mM的磷酸三氯乙酯(TCEP)；然后在室温条件下，放置在往复震荡仪上振荡1小时；最后，利用离心超滤装置移去多余的磷酸三氯乙酯，4℃密封保存备用；
步骤3、PDDA修饰的丝网印刷电极的制备：首先，将清洗过的丝网印刷电极浸入5mL含有0.5M H2SO4和0.1M KCl的混合溶液中进行循环伏安扫描，直至扫描得到稳定的循环伏安图，二次水淋洗，氮气吹干，得到处理过的丝网印刷电极；然后将10μL体积浓度为1％的PDDA溶液滴涂在处理过的丝网印刷电极表面，室温下反应2小时，二次水淋洗，氮气吹干，密封保存备用；
步骤4、金纳米粒子修饰的丝网印刷电极的制备：将10μL步骤1制备的MPA修饰的金纳米粒子溶液滴涂在步骤3制备的丝网印刷电极表面，室温下反应2小时，得到金纳米粒子修饰的丝网印刷电极，记为Au NPs-SPCE，4℃密封保存备用；
步骤5、适配体修饰的Au NPs-SPCE的制备：首先取10μL 100μM的OTA适配体标准液滴涂在步骤4中制备的工作电极表面，室温条件下反应12小时，用50mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液淋洗，氮气吹干；然后将电极浸没在5mL 1mM 6-巯基己醇(MCH)中，室温条件下反应1小时，封闭电极后分别用Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，得到适配体修饰的Au NPs-SPCE，即所述适配体传感器，4℃密封保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤3中，在进行所述循环伏安扫描时，扫描电压范围为-0.2～1.5V，扫描速率为100mV s-1。
3.根据权利要求1所述的一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述OTA适配体序列为：5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAGCAT CGG ACA–SH-3′。
4.根据权利要求1所述的一种用于OTA灵敏检测的可抛式适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述OTA标准溶液浓度为0.01～100ng mL-1。
5.权利要求1～4任意一项所述的方法制备的适配体传感器用于对赭曲霉毒素检测的用途。
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