CN109358027A - 一种测定赭曲霉毒素a的适配体生物传感器的构建方法 - Google Patents

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Abstract

一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，属于生物传感器检测技术领域。本发明提供了一种用FAM标记的与赭曲霉毒素A高特异性高亲和力结合的单链DNA适配体，当体系中不含有赭曲霉毒素A时，荧光素标记的适配体被吸附到金纳米粒子@PVP表面，金纳米粒子通过荧光共振能量转移效应对荧光素标记的赭曲霉毒素A适配体产生的荧光信号进行淬灭；当体系中含有赭曲霉毒素A时，荧光标记的适配体与赭曲霉毒素A识别结合并形成折叠结构，该折叠结构能抵抗金纳米粒子的吸附，使得荧光信号得以保留。本发明方法能实现对赭曲霉毒素A超灵敏检测，检测限低、检测灵敏度高、特异性好，为痕量赭曲霉毒素A以及其他有害物质的检测提供了一种有效的方法。

Description

一种测定赭曲霉毒素A的适配体生物传感器的构建方法
技术领域
本发明涉及一种一种测定赭曲霉毒素A的适配体生物传感器的构建方法，属于生物传感器检测技术领域。
背景技术
赭曲霉毒素(Ochratoxins)是曲霉属和青霉属的几个种产生的一组结构类似的有毒代谢产物，有A、B、C、D四种化合物，包括7种化学结构相似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农作物的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。主要产生菌是赭曲霉(Asperillus ochraceus)、纯绿霉(Penicillium verrucosum)，对食品污染的范围较广，广泛存在于谷物、咖啡豆、豆类、葡萄干、啤酒、葡萄汁等各类食物和饲料中，谷物及其副产品是OTA的主要来源。赭曲霉毒素A具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。因此世界各国均重视对赭曲霉毒素A的检测和控制，并制定了相关限量标准，以便于确保食品安全和消除国际贸易中的技术壁垒。
目前，赭曲霉毒素A的残留分析方法主要有化学分析法和免疫化学分析法。薄层层析法(TLC)的优点是方法简单，使用的试剂价格便宜，但是存在灵敏度较差，所需试剂繁多，检测周期长，重现性不好和无法实现自动化等缺点，已不能满足现代检测的要求。而液相质谱联用法(LC-MS)具有灵敏度高、检出率高等特点，其设备昂贵，操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查的要求。免疫分析技术具有较高的灵敏度和特异性，但是高质量抗体的制备过程需要较长的周期，交叉反应率的存在会大大影响检测结果的准确度。
适配体是一类在体外筛选的能与相应目标物专一并紧密结合的一类单链寡核苷酸序列，具有热稳定性、可重用性和易于化学合成等优点，与抗体相比具有更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗所不能区分的靶标分子单个取代基修饰的极细微差别。以赭曲霉毒素A的适配体代替抗体作为赭曲霉毒素A识别探针，其体外筛选、体外制备的特点能够有效克服抗体制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存的缺点。
FAM标记适配体构建各种荧光传感器可以实现对重金属离子、生物毒素含量的检测。因此，基于PVP包被的金纳米粒子对FAM的荧光的淬灭作用，以FAM作为检测的标记信号分子对待测物进行检测，可以带来更多的优势，如：检测限低、灵敏度高、特异性好、操作简单等。
适配体高特异性高亲和性结合目标物的特征结合，当体系中不含有赭曲霉毒素A时，荧光素标记的适配体被吸附到金纳米粒子@PVP表面，金纳米粒子通过荧光共振能量转移效应对荧光素标记的赭曲霉毒素A适配体产生的荧光信号进行淬灭；当体系中含有赭曲霉毒素A时，荧光标记的适配体与赭曲霉毒素A识别结合并形成折叠结构，该折叠结构能抵抗金纳米粒子的吸附，使得荧光信号得以保留。通过检测FAM的荧光信号的强度，间接测定待检目标物的含量。本方法的最大优点在于可以实现赭曲霉毒素A快速、准确、便捷的检测。
发明内容
一种测定赭曲霉毒素A的适配体生物传感器的构建方法，所述构件方法如下：
(1)PVP包被金纳米粒子制备：利用经典的柠檬酸钠还原氯金酸法制备金纳米粒子，在搅拌、沸腾条件下，向50mL浓度为1mM的氯金酸溶液中迅速注入5mL1％的柠檬酸钠溶液，持续煮沸，搅拌15min，至溶液呈酒红色，移除热源，搅拌冷却至室温，在转速10000r/min的条件下，离心20min，弃上清液，将沉淀重悬于超纯水中，将100nMPVP与4nM金纳米粒子等体积混合，混合均匀后，室温下静置5h，备用；
(2)所用FAM标记的适配体序列：5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG-CATCGG ACA-FAM-3’；
(3)适配体传感器的构件：分别向试管中加入400μL的浓度为0-10000nM的不同浓度梯度的OTA溶液(均用pH8.0的10mM的Tris-HCL缓冲溶液(含20mMCaCl2，5mMKCL)配制)，随后分别加入200μL、200nM适配体溶液(用上述pH8.0的Trls-HCL配制)，室温静置30min，再分别引入200μL、2nM的PVP包被的金纳米粒子，室温放置2h，所有操作均需在避光条件下进行，随后进行荧光测试，荧光光谱仪器条件为：发波长：492nm，发射波长范围：500-630nm，入射狭缝：10nm，出射狭缝：10nm。根据其在520nm处的荧光强度可以定量检测OTA。
本发明的有益效果：本发明提供了一种适配体生物传感器，通过适配体高亲和结合目标物，然后通过PVP包被的金纳米粒子对为结合目标物的适配体上的FAM的荧光淬灭，实现目标物的定量检测。
附图说明
图1为赭曲霉毒素A标准曲线；
图2为金纳米粒子电镜图；
图3为特异性对比图。
具体实施方式
以下实施例所用材料、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、方法和仪器，本领域普通技术人员均可通过商业渠道获得。
在本发明以下的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”和“竖着”等指示方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此，不能理解为对本发明的限制。
在本发明以下的描述中，需要说明的是，除非另有明确规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接连接，也可以是通过中间介质间接连接，可以是两个部件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以是具体情况理解上书术语在本发明中的具体含义。
此外，在本发明以下的描述中，除非另有说明，“多个”、“多组”、“多根”的含义是两个或两个以上。
下面结合附图对本发明做进一步详细说明，但以下详细说明不视为对本发明的限定。
(1)PVP包被金纳米粒子制备
利用经典的柠檬酸钠还原氯金酸法制备金纳米粒子。在搅拌、沸腾条件下，向50mL浓度为1mM的氟金酸溶液中迅速注入5mL 1％的柠檬酸钠溶液，持续煮沸，搅拌15min。溶液最终呈酒红色。移除热源，搅拌冷却至室温，在转速10000r/min的条件下，离心20min，弃上清液，将沉淀重悬于超纯水中。
将100nM PVP与4nM金纳米粒子等体积混合，混合均匀后，室温下静置5h，备用。
(2)适配体传感器的构建
分别向试管中加入400μL的浓度为0-10000nM的不同浓度梯度的OTA溶液(均用pH8.0的10mM的Tris-HCl缓冲溶液(含20mM CaCl2，5mM KCI)配制)随后分别加入200μL，200nM适配体溶液(用上述Ph 8.0的Tris-HCl配制)，室温静置30min，再分别引入200μL、2nM的PVP包被的金纳米粒子。室温放置2h，所有操作均需在避光条件下进行。随后进行荧光测试。荧光光谱仪器条件为：发波长：492nm，发射波长范围：500-630nm，入射狭缝：10nm，出射狭缝：10nm。根据其在520nm处的荧光强度可以定量检测OTA。
(3)检测灵敏度研究
根据多次平行试验，其检测限为最低能够对空白荧光信号产生影响的OTA浓度，为5nM。
(4)特异性研究
以玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、黄曲霉毒素B1、N-乙酰-L-苯丙氨酸、华法林代替赭曲霉毒素A作为检测目标物进行特异性研究，加入的六种毒素的浓度和上述赭曲霉毒素A的加入浓度相同，均为1000nM，操作方法同赭曲霉毒素A检测的操作方法一致，获得检测六种毒素的荧光光谱；所得每种毒素浓度下的荧光光谱与空白实验荧光光谱分别取波长520nm处的荧光强度值按照F-FO/FO(F为在520nm处的各个样品的荧光强度，FO为空白在520nm处的荧光强度)作图，除OTA外的其它样品在波长520nm处的荧光强度与空白在误差允许范围内相同。所以此方法的特异性良好。
(5)样品添加回收研究
首先将1％的红酒引入到缓冲体系，然后用此包含1％红酒的缓冲将OTA标准溶液稀释成浓度为10、50、100、500nM的样品溶液(相当于1％的红酒溶液中分别含有上述浓度的标准OTA溶液)，用此方法测定标准品的添加回收率，最终得到的回收率范围在89.0％-117.8％，可以用于实际样品的测定。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种测定赭曲霉毒素A的适配体生物传感器的构建方法，其特征在于，所述构件方法如下：
(1)PVP包被金纳米粒子制备：利用经典的柠檬酸钠还原氯金酸法制备金纳米粒子，在搅拌、沸腾条件下，向50mL浓度为1mM的氯金酸溶液中迅速注入5mL1％的柠檬酸钠溶液，持续煮沸，搅拌15min，至溶液呈酒红色，移除热源，搅拌冷却至室温，在转速10000r/min的条件下，离心20min，弃上清液，将沉淀重悬于超纯水中，将100nMPVP与4nM金纳米粒子等体积混合，混合均匀后，室温下静置5h，备用；
(2)所用FAM标记的适配体序列：5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAGCAT CGGACA-FAM-3’；
(3)适配体传感器的构件：分别向试管中加入400μL的浓度为0-10000nM的不同浓度梯度的OTA溶液(均用pH8.0的10mM的Tris-HCL缓冲溶液(含20mMCaCl 2，5mMKCL)配制)，随后分别加入200μL、200nM适配体溶液(用上述pH8.0的Tris-HCL配制)，室温静置30min，再分别引入200μL、2nM的PVP包被的金纳米粒子，室温放置2h，所有操作均需在避光条件下进行，随后进行荧光测试，荧光光谱仪器条件为：发波长：492nm，发射波长范围：500-630nm，入射狭缝：10nm，出射狭缝：10nm。根据其在520nm处的荧光强度可以定量检测OTA。
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