CN108267572A - 一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，涉及材料学、光分析化学、纳米生物传感等技术领域。本发明是基于核酸适配体和目标物(OTA和AFB1)的特异性识别作用并借助荧光光度计来实现信号输出，该方法有特异性高、稳定性强、对周围环境要求不高等特点。本发明运用的磁性纳米微球和二氧化硅纳米球具有较大的比表面积和良好的生物相容性，能够负载更多的信号分子，可以有效提高检测的灵敏度；以同一激发波长下不同发射波长的gQDs和rQDs作为荧光信标构建了磁控荧光适配体传感器，实现了对OTA和AFB1的同时检测。

Description

一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法
技术领域
本发明涉及一种磁控荧光检测的适配体传感器的构建方法，特点在于能够实现对赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)和黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的同时检测，灵敏度高，重现性好，具有较宽的检测范围；涉及材料学、光分析化学、纳米生物传感等技术领域。
背景技术
霉菌毒素主要是指霉菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物，其中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素是谷物及其制品中最常见的霉菌毒素。黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类次级代谢产物，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1(AFB1)最多见，而且其致癌性也最强，毒性最大。AFB1已经被世界卫生组织(WHO)和国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌物，与人类肝癌的发生有密切关系。赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一类结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(OTA)。尽管现代农业技术和食品加工工艺较为先进，却还是难以避免在作物的生长、储存以及加工中霉菌的滋生，并且这些霉菌毒素也可能会由于畜禽食用含有霉菌毒素的食物而进入到其蛋和乳中，进而进入到人类食物链中。因此，构建灵敏的检测方法对两种及以上霉菌毒素进行同时检测，具有十分重要的意义。
纳米材料作为一种最具有广泛应用前景的材料，其潜在的重要性毋庸置疑，由于其独特的表面效应，体积效应以及量子尺寸效应，使得材料的性能产生惊人的变化。纳米材料较大的比表面积可以增加信号分子负载量，有效地提高检测灵敏度；除此之外，有些纳米材料还可以提高传感界面的导电性、电催化活性、化学亲和性等，使得生物传感器具有更优异的稳定性和重现性。在纳米材料中，金纳米粒子，二氧化硅纳米粒子，铁氧化物纳米材料，碳纳米管、石墨烯等纳米材料均被用作优良的载体负载信号分子，用于高灵敏检测蛋白质、DNA和生物小分子等。量子点(QDs)是近几年发展起来的一种新型纳米材料，由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的一种准零维的纳米颗粒。量子点凭借其独特的光谱特征和光化学稳定性等特点，在电磁学、光学、催化和生物传感领域具有极大的应用前景。借助纳米材料独特的性能来构建生物传感器用于霉菌毒素的检测，可以显著增强检测方法的灵敏度。
核酸适配体(aptamer)是一段单链寡核苷酸序列，对靶标具有高亲和性和特异性。作为一种新型识别元件，核酸适配体不仅具有类似抗体的特性，而且具有抗体没有的优势，比如合成简单，化学性质稳定，重现性好，易于储存和运输，方便再生。此外，核酸适配体可利用官能团，荧光团，生物素和酶等进行功能化，简化检测步骤，使得传感平台的构建更加灵活。目前，相关研究人员已设计了多种适配体传感体系，分别利用电化学、化学发光、荧光和比色等研究手段，实现了对OTA、伏马菌毒素B1、黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素B1等典型霉菌毒素的分析检测。然而，能够实现同时检测两种甚至多种霉菌毒素的方法却鲜有报道。鉴于霉菌毒素对农产品的污染并不是单一存在的，一旦温度湿度合适，多种霉菌毒素便会同时滋生，进而产生毒性叠加效应，严重危害人类的身体健康。因此，简化检测步骤，提高检测灵敏度，建立多种毒素同时检测的方法是霉菌毒素检测的发展方向。与单组分霉菌毒素检测相比，同时检测技术具有明显的优势，如：缩短分析时间，减少样本需求量，大幅降低检测成本，提高了食品安全监控的效率。
发明内容
本发明旨在发明一种工艺简单、检测时间短、低成本的可用于两种霉菌毒素同时检测的磁控荧光适配体传感器。所构建的新型传感器，可以有效解决现有检测方法检测程序复杂、成本高、耗时过长、重现性较差、灵敏度较低等难题。
所采用的方案概括为：首先，制备发射绿色荧光的碲化镉量子点(记为gQDs)和发射红色荧光的碲化镉量子点(记为rQDs)，进而利用静电吸附作用分别实现gQDs和rQDs在SiO2纳米球表面的大量均匀负载，得到gQDs包覆的SiO2杂化纳米球(记为SiO2@gQDs)和rQDs包覆的SiO2杂化纳米球(记为SiO2@rQDs)，并将其作为荧光信标与OTA适配体互补链(记为cDNA1)和AFB1适配体互补链(记为cDNA2)藕联；其次，以OTA-Aptamer(记为Apt1)藕联的金包四氧化三铁壳-核磁性纳米球(记为MBs)为捕获探针(记为MBs-Apt1)，以cDNA1藕联的SiO2@gQDs纳米球为信号探针(记为cDNA1-SiO2@gQDs)，通过Apt1与cDNA1之间的杂交反应将信号探针与捕获探针藕连，得到纳米生物复合物1(记为MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs)。相同方法以AFB1-Aptamer(记为Apt2)藕联的MBs为捕获探针(记为MBs-Apt1)，以cDNA2藕联的SiO2@rQDs纳米球为信号探针(记为cDNA2-SiO2@rQDs)制备得到纳米生物复合物2(记为MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs)。上述两种纳米生物复合物与目标物OTA和AFB1作用后，Apt1与OTA以及Apt2与AFB1的特异性结合会使部分的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs从MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物上脱附,通过外加磁场对混合物进行分离并收集脱附的信号探针，构建磁控荧光适配体传感体系，实现对OTA和AFB1的同时检测。该磁控荧光适配体传感方法可以大大缩短检测时间，减少样品需求量，从而显著提高检测效率，该方法也为农产品中其他霉菌毒素的同时检测，甚至霉菌毒素以外其它小分子物质的同时检测提供了借鉴。
本发明是通过如下具体技术方案实现的：
一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1、发射绿色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为gQDs)和发射红色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为rQDs)的制备；
步骤2、单分散SiO2纳米球的制备；
步骤3、金包四氧化三铁壳-核磁性纳米球(记为MBs)的制备；
步骤4、gQDs包覆的SiO2(记为SiO2@gQDs)和rQDs包覆的SiO2(记为SiO2@rQDs)杂化纳米球的制备：取步骤2制备的SiO2纳米球和含0.02M NaCl的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应3h；产物经离心分离、洗涤后，制得PDDA修饰的SiO2(记为PDDA-SiO2)；然后，加入步骤1中制备的gQDs或rQDs水溶液，于避光条件下磁力搅拌反应3h，经离心分离、洗涤后，将产物分散到蒸馏水中，备用；
步骤5、SiO2@gQDs标记的cDNA1(记为cDNA1-SiO2@gQDs)和SiO2@rQDs标记的cDNA2(记为cDNA2-SiO2@rQDs)信号探针的制备：取步骤4制备的SiO2@gQDs和SiO2@rQDs分别分散于离心管中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化交联溶液，振荡反应1h，随后分别加入cDNA1和cDNA2储备液，振荡孵育过夜，通过酰胺键将cDNA1和cDNA2分别藕联到SiO2@gQDs和SiO2@rQDs表面制备cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，备用。
步骤6、MBs标记的Apt1(记为MBs-Apt1)和MBs标记的Apt2(记为MBs-Apt2)磁性捕获探针的制备：取步骤3制备的MBs的分散液于离心管中，加入aptamer，振荡孵育过夜，通过Au-S键将Apt1和Apt2分别藕联到MBs表面制备MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，备用。
步骤7、传感器的构建及样品的检测，包括：纳米生物复合物的制备：取步骤5制备的cDNA1-SiO2@gQDs信号探针和步骤6制备的MBs-Apt1磁性捕获探针于离心管中混合，同样，取步骤5制备的cDNA2-SiO2@rQDs信号探针和步骤6制备的MBs-Apt2磁性捕获探针于另外一支离心管中，混合37℃振荡孵育2h，基于Aptamer和cDNA之间的杂交反应分别制得纳米生物复合物1(记为MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs)和纳米生物复合物2(记为MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs)，磁控分离、洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM，含120mMNaCl，20mM CaCl2，20mM MgCl2和5mM KCl)中，备用。
对OTA和AFB1标准品进行同时检测，建立标准曲线：取所制备的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物各400μL进行等量混合，然后，加入100μL包含不同浓度OTA和AFB1的混合溶液于离心管中，37℃振荡孵育40min。由于OTA与Apt1之间以及AFB1与Apt2之间的特异性结合，使得部分cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针分别从MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物上脱附。经磁分离后，收集已脱附的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图。通过荧光强度与OTA和AFB1标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线。
步骤1中，gQDs的制备方法为：称取碲粉和硼氢化钠置入10mL比色管中，加入超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液。将氯化镉水合物(CdCl2·2.5H2O)和巯基丙酸加入到含二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1M NaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液，继续搅拌30min，100℃下回流0.5h，得到gQDs。停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的gQDs水溶液，4℃避光保存。
rQDs的制备方法为：称取碲粉和硼氢化钠置入10mL比色管中，加入超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液。将CdCl2·2.5H2O和巯基丙酸加入到含二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1MNaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液，继续搅拌30min，100℃下回流12h，得到rQDs。停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的rQDs水溶液，4℃避光保存。
步骤1中，在gQDs的制备过程中，所述碲粉、硼氢化钠和超纯水的质量比为1.5:1:89；反应混合溶液中Cd:Te:MPA的摩尔比为1:1:2.5。在rQDs的制备过程中，所述碲粉、硼氢化钠和超纯水的质量比为1.5:1:89；反应混合溶液中Cd:Te:MPA的摩尔比为1:1:2.5。
步骤2中，单分散SiO2纳米球的制备方法为：取一个经过严格清洗的250mL单口烧瓶，分别加入无水乙醇，二次水和的氨水(28wt％)，55℃下搅拌反应10min；然后将正硅酸四乙酯(TEOS)与乙醇的混合溶液a迅速加入，55℃下搅拌反应5h后，制得小粒径的SiO2晶种。然后，取20mL上述制备的SiO2晶种于另一只250mL圆底烧瓶中，再将无水乙醇，二次水和氨水(28wt％)依次加入250mL圆底烧瓶中；搅拌均匀后，将TEOS与无水乙醇混合液b逐滴加入烧瓶中。搅拌反应5h后，烧瓶放入烘箱，50℃下将溶剂挥发至得到干燥的SiO2纳米粒子，4℃保存备用。
步骤2中，所述无水乙醇、二次水、氨水和TEOS的总体积比为28.4:1.6:1.2:1；混合溶液a中TEOS与乙醇的体积比为1:2.6；所述SiO2晶种、无水乙醇、二次水、氨水和TEOS的总体积比为20:80:13:7.5:1；混合溶液b中TEOS与乙醇的体积比为1:10；所述SiO2晶种的浓度为0.8g mL-1。
步骤3中，MBs的制备方法为：将乙二醇，一缩乙二醇和FeCl3·6H2O加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入醋酸钠和聚乙二醇并使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200℃下反应2h。冷却后，将混合物移至小烧杯中，磁分离、乙醇洗涤5次，重新分散于50mL乙醇中，4℃保存备用。
取上述Fe3O4纳米球分散液超声处理30min，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，室温下搅拌反应7h，磁分离并醇洗数次，将产物重新分散于40mL水中；将HAuCl4溶液逐滴加入到上述分散液中，于100℃温度下回流反应30min，后逐滴加入柠檬酸钠溶液，再于100℃温度下继续回流反应3h后，经磁分离水洗数次，得到MBs，重新分散于40mL水中备用。
步骤3中，所述乙二醇、一缩乙二醇、FeCl3·6H2O、醋酸钠和聚乙二醇的质量比为22.31:22.36:1:3:2。所述Fe3O4纳米球分散液和APTS的体积比为100:1；所用HAuCl4溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为1:2；HAuCl4溶液的浓度为1wt％，柠檬酸钠溶液的浓度为1wt％。
步骤4中，制备SiO2@gQDs杂化纳米球时，所述的SiO2纳米球为0.12g；所述的PDDA溶液和gQDs水分散液的体积比为10:1。制备SiO2@rQDs杂化纳米球时，所述的SiO2纳米球为0.12g；所述的PDDA溶液和rQDs水分散液的体积比为10:1。所述的PDDA溶液的浓度为0.4wt％，含0.02M NaCl。
步骤5中，制备cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针时，所用的SiO2@gQDs或SiO2@rQDs分散液、EDC/NHS溶液、cDNA1或cDNA2储备液的体积比为200:100:1；所用的活化交联溶液中EDC和NHS的浓度分别为10mM和5mM，所用的cDNA储备液的浓度均为20μM，所制得的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针分散液的体积比为1:1。
步骤6中，制备MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针时，所用的MBs、TCEP、cDNA储备液的体积比为200:1:1；所用的TCEP溶液的浓度分别为50mM，所用的aptamer储备液的浓度为20μM，所制得的MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针分散液的体积比为1:1。
步骤7中，制备磁控荧光传感器时，所用的cDNA1-SiO2@gQDs信号探针和MBs-Apt1磁性捕获探针以及cDNA2-SiO2@rQDs信号探针和MBs-Apt2磁性捕获探针的体积比均为1:1，所制得的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物分散液的体积比为1:1。
在样品检测过程中，所用的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs纳米生物复合物、MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物、OTA标准品溶液、AFB1标准品溶液的体积比为8:8:1:1，515nm和633nm分别为gQDs和rQDs荧光发射波长。所用的OTA标准品溶液的浓度依次为0、0.002、0.003、0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5ng mL-1，所用的AFB1标准品溶液的浓度依次为0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.1、0.5、1、2、5、10ng mL-1。
所用的OTA的核酸适配体(Apt1)序列为5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-(CH2)6-SH-3'，AFB1的核酸适配体(Apt2)序列为5'-GTT GGG CAC GTGTTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-(CH2)6-SH-3'，相应的互补序列cDNA1为5'-CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-(CH2)6-NH2-3'，cDNA2为5'-CAC AGA GAGACA ACA CGT GCC CAA C-(CH2)6-NH2-3'。
有益效果
(1)本发明是基于核酸适配体和目标物(OTA和AFB1)的特异性识别作用并借助荧光光度计来实现信号输出，该方法有特异性高、稳定性强、对周围环境要求不高等特点。
(2)本发明运用的磁性纳米微球和二氧化硅纳米球具有较大的比表面积和良好的生物相容性，能够负载更多的信号分子，可以有效提高检测的灵敏度；以同一激发波长下不同发射波长的gQDs和rQDs作为荧光信标构建了磁控荧光适配体传感器，实现了对OTA和AFB1的同时检测。
(3)传感器制备过程所用试剂量极小，检测仪器为荧光分光光度计，相对于传统的检测手段而言，该传感器具操作简便灵活、分析速度快、检测成本低、灵敏度高等特点。
附图说明
图1为实施例4中所制得的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物的荧光光谱图；
图2为实施例5中对OTA和AFB1的检测数据图，其中(A)与为不同浓度OTA和AFB1混合标准液对应的适配体传感体系的荧光光谱；(B)荧光强度与OTA浓度的对数值之间的对应关系；(C)荧光强度与AFB1浓度的对数值之间的对应关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
(1)gQDs和rQDs的制备:
按照现有的方法制备gQDs，具体如下：称取0.065g碲粉和0.045g硼氢化钠置入10mL比色管中，加入4mL超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液。将0.1142g CdCl2·2.5H2O和75μL巯基丙酸加入到含50mL二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1M NaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液2mL，继续搅拌30min，100℃下回流0.5h，可得到gQDs。停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的gQDs水溶液，4℃避光保存。
按照现有的方法制备rQDs，具体如下称取0.065g碲粉和0.045g硼氢化钠置入10mL比色管中，加入4mL超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液。将0.1142g CdCl2·2.5H2O和75μL巯基丙酸加入到含50mL二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1M NaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液2mL，继续搅拌30min，100℃下回流12h，可得到rQDs。停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的rQDs水溶液，4℃避光保存。
实施例2
(2)cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针的制备:
按照现有的方法制备SiO2纳米球，具体如下：单分散SiO2纳米球水分散液的制备方法为：取一个经过严格清洗的的250mL单口烧瓶，依次加入80mL乙醇，4.85mL二次水和3.6mL的氨水(28wt％)，下搅拌条件下逐渐升温至55℃，然后迅速加入3.1mL TEOS与8mL乙醇的混合溶液，55℃下搅拌反应5h后，停止反应，制得小粒径的SiO2晶种。然后，取20mL上述制备的SiO2晶种于另一只250mL圆底烧瓶中，再将70mL无水乙醇，13mL H2O和7.5mL NH3·H2O依次加入250mL圆底烧瓶中，搅拌均匀后，将1mL TEOS与10mL无水乙醇混合液逐滴加入烧瓶中。搅拌反应5h后，烧瓶放入烘箱，50℃下将溶剂挥发得到干燥的SiO2纳米粒子，4℃保存备用。
取0.12g上述SiO2纳米球和60mL含0.02M NaCl的PDDA水溶液(0.4wt％)于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应3h；产物经离心分离、洗涤后，再加入6mL gQDs水分散液，于避光条件下磁力搅拌反应3h，经离心分离、洗涤后，将产物分散到30mL水中，制得SiO2@gQDs的水分散液，同样方法得到SiO2@rQDs的水分散液，备用。
取20mL SiO2@gQDs分散液于离心管中，加入10mL EDC/NHS活化交联溶液，振荡反应1h，随后加入100μL 20μM cDNA1储备液，振荡孵育过夜，通过酰胺键将cDNA1偶联到SiO2@gQDs表面制备cDNA1-SiO2@gQDs信号探针，离心洗涤后，将其重新分散在30mL Tris-HCl(pH7.4，10mM)溶液中，制得cDNA1-SiO2@gQDs信号探针分散液。同样方法制得cDNA2-SiO2@rQDs信号探针分散液。
实施例3
(3)MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针的制备:
按照现有的方法制备MBs：将10mL乙二醇，10mL一缩乙二醇，和0.5g FeCl3·6H2O加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入1.5g醋酸钠和1g聚乙二醇并使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200℃下反应2h。冷却后，将混合物移至小烧杯中，磁分离、乙醇洗涤5次，重新分散于50mL乙醇中，4℃保存备用。
取上述40mL Fe3O4纳米球分散液超声处理30min，然后加入400μL APTS，室温下搅拌反应7h，磁分离并醇洗数次，将产物重新分散于40mL水中；将4mL的HAuCl4溶液(1wt％)逐滴加入到上述分散液中，于100℃温度下回流反应30min，后逐滴加入8mL柠檬酸钠溶液(1wt％)，再于100℃温度下继续回流反应3h后，经磁分离水洗数次，得到MBs，重新分散于40mL水中备用。
取上述制备的20mL MBs的分散液于离心管中，加入100μL 20μM Apt1或Apt2储备液，振荡孵育过夜离心洗涤后，分别将其分散在30mL Tris-HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，制得MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针。
实施例4
(4)磁控荧光传感器的构建:
取30mL cDNA1-SiO2@gQDs信号探针和30mL的MBs-Apt1磁性捕获探针于离心管中混合，同样，取30mL cDNA2-SiO2@rQDs信号探针和30mL MBs-Apt2磁性捕获探针于另外一支离心管中，混合37℃振荡孵育1h，基于Aptamer和cDNA之间的杂交反应分别制得MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物，磁控分离、洗涤后，分别将其分散在30mL Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM，含120mM NaCl，20mM CaCl2，20mM MgCl2和5mM KCl)中，备用。
从图1中可以看出，MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物在515nm和633nm处有一个特征发射峰，分别归属于gQDs和rQDs，证明了纳米生物复合物的成功制备。
实施例5
(5)对FB1标准品进行检测，建立标准曲线:
分别取400μL MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs纳米生物复合物和400μL MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物于离心管混合，然后，分别加入50μL不同浓度的OTA和50μL不同浓度的AFB1，37℃振荡孵育40min。由于OTA与Apt1以及AFB1与Apt2之间的特异性结合，使得部分cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针分别从MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物上脱附。经磁分离洗涤后，收集已脱附的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs，重新分散在600μL Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM)中，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图，通过荧光强度与OTA和AFB1标准品浓度的对数值之间的对应关系建立标准曲线。
上述实验所涉及的：
1.Apt1序列：5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-(CH2)6-SH-3'；
2.Apt2序列：5'-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTAGGC CCA CA-(CH2)6-SH-3'；
3.cDNA1序列：5'-CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-(CH2)6-NH2-3'；
4.cDNA2序列：5'-CAC AGA GAG ACA ACA CGT GCC CAA C-(CH2)6-NH2-3'。
从图2中可以看出，检测OTA和AFB1标准品浓度的线性范围分别为：0.002ng mL-1～5ng mL-1和0.005ng mL-1～10ng mL-1，且在此范围内均呈现良好的线性关系，线性相关系数分别为R2＝0.9916和R2＝0.9929，对OTA的检出限达到了0.67pg mL-1，对AFB1的检出限达到了1.70pg mL-1。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法
<140> 2017112692806
<141> 2017-12-05
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
cctttacgcc acccacaccc gatc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
cacagagaga caacacgtgc ccaac 25

Claims (10)

1.一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
步骤1、发射绿色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为gQDs)和发射红色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为rQDs)的制备；
步骤2、单分散SiO2纳米球的制备；
步骤3、金包四氧化三铁壳-核磁性纳米球(记为MBs)的制备；
步骤4、gQDs包覆的SiO2(记为SiO2@gQDs)和rQDs包覆的SiO2(记为SiO2@rQDs)杂化纳米球的制备：取步骤2制备的SiO2纳米球和含0.02M NaCl的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应3h；产物经离心分离、洗涤后，制得PDDA修饰的SiO2(简称为PDDA-SiO2)；然后，加入步骤1中制备的gQDs或rQDs水溶液，于避光条件下磁力搅拌反应3h，经离心分离、洗涤后，将产物分散到蒸馏水中，备用；
步骤5、SiO2@gQDs标记的cDNA1(记为cDNA1-SiO2@gQDs)和SiO2@rQDs标记的cDNA2(简称为cDNA2-SiO2@rQDs)信号探针的制备：取步骤4制备的SiO2@gQDs和SiO2@rQDs分别分散于离心管中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化交联溶液，振荡反应1h，随后分别加入cDNA1和cDNA2储备液，振荡孵育过夜，通过酰胺键将cDNA1和cDNA2分别藕联到SiO2@gQDs和SiO2@rQDs表面制备cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，备用；
步骤6、MBs标记的Apt1(记为MBs-Apt1)和MBs标记的Apt2(记为MBs-Apt2)磁性捕获探针的制备：取步骤3制备的MBs的分散液于离心管中，加入aptamer，振荡孵育过夜，通过Au-S键将Apt1和Apt2分别藕联到MBs表面制备MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，备用；
步骤7、传感器的构建及样品的检测，包括：纳米生物复合物的制备：取步骤5制备的cDNA1-SiO2@gQDs信号探针和步骤6制备的MBs-Apt1磁性捕获探针于离心管中混合，同样，取步骤5制备的cDNA2-SiO2@rQDs信号探针和步骤6制备的MBs-Apt2磁性捕获探针于另外一支离心管中，混合37℃振荡孵育2h，基于Aptamer和cDNA之间的杂交反应分别制得纳米生物复合物1(记为MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs)和纳米生物复合物2(记为MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs)，磁控分离、洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM，含120mMNaCl，20mM CaCl2，20mM MgCl2和5mM KCl)中，备用；
对OTA和AFB1标准品进行同时检测，建立标准曲线：取所制备的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物各400μL进行等量混合，然后，加入100μL包含不同浓度OTA和AFB1的混合溶液于离心管中，37℃振荡孵育40min；由于OTA与Apt1之间以及AFB1与Apt2之间的特异性结合，使得部分cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针分别从MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物上脱附；经磁分离后，收集已脱附的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图；通过荧光强度与OTA和AFB1标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤1中，gQDs的制备方法为：称取碲粉和硼氢化钠置入10mL比色管中，加入超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液；将氯化镉水合物(CdCl2·2.5H2O)和巯基丙酸加入到含二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1M NaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液，继续搅拌30min，100℃下回流0.5h，得到gQDs；停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的gQDs水溶液，4℃避光保存；
rQDs的制备方法为：称取碲粉和硼氢化钠置入10mL比色管中，加入超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液；将CdCl2·2.5H2O和巯基丙酸加入到含二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1M NaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液，继续搅拌30min，100℃下回流12h，得到rQDs；停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的rQDs水溶液，4℃避光保存；
步骤1中，在gQDs的制备过程中，所述碲粉、硼氢化钠和超纯水的质量比为1.5:1:89；反应混合溶液中Cd:Te:MPA的摩尔比为1:1:2.5；在rQDs的制备过程中，所述碲粉、硼氢化钠和超纯水的质量比为1.5:1:89；反应混合溶液中Cd:Te:MPA的摩尔比为1:1:2.5。
3.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤2中，单分散SiO2纳米球的制备方法为：取一个经过严格清洗的250mL单口烧瓶，分别加入无水乙醇，二次水和的氨水(28wt％)，55℃下搅拌反应10min；然后将正硅酸四乙酯(TEOS)与乙醇的混合溶液a迅速加入，55℃下搅拌反应5h后，制得小粒径的SiO2晶种；然后，取20mL上述制备的SiO2晶种于另一只250mL圆底烧瓶中，再将无水乙醇，二次水和氨水(28wt％)依次加入250mL圆底烧瓶中；搅拌均匀后，将TEOS与无水乙醇混合液b逐滴加入烧瓶中；搅拌反应5h后，烧瓶放入烘箱，50℃下将溶剂挥发至得到干燥的SiO2纳米粒子，4℃保存备用；
步骤2中，所述无水乙醇、二次水、氨水和TEOS的总体积比为28.4:1.6:1.2:1；混合溶液a中TEOS与乙醇的体积比为1:2.6；所述SiO2晶种、无水乙醇、二次水、氨水和TEOS的总体积比为20:80:13:7.5:1；混合溶液b中TEOS与乙醇的体积比为1:10；所述SiO2晶种的浓度为0.8g mL-1。
4.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤3中，MBs的制备方法为：将乙二醇，一缩乙二醇和FeCl3·6H2O加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入醋酸钠和聚乙二醇并使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200℃下反应2h；冷却后，将混合物移至小烧杯中，磁分离、乙醇洗涤5次，重新分散于50mL乙醇中，4℃保存备用；
取上述Fe3O4纳米球分散液超声处理30min，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，室温下搅拌反应7h，磁分离并醇洗数次，将产物重新分散于40mL水中；将HAuCl4溶液(1wt％)逐滴加入到上述分散液中，于100℃温度下回流反应30min，后逐滴加入柠檬酸钠溶液(1wt％)，再于100℃温度下继续回流反应3h后，经磁分离水洗数次，得到MBs，重新分散于40mL水中备用；
步骤3中，所述乙二醇、一缩乙二醇、FeCl3·6H2O、醋酸钠和聚乙二醇的质量比为22.31:22.36:1:3:2；所述Fe3O4纳米球分散液和APTS的体积比为100:1；所用HAuCl4溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为1:2；HAuCl4溶液的浓度为1wt％，柠檬酸钠溶液的浓度为1wt％。
5.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤4中，制备SiO2@gQDs杂化纳米球时，所述的SiO2纳米球为0.12g；所述的PDDA溶液和gQDs水分散液的体积比为10:1；制备SiO2@rQDs杂化纳米球时，所述的SiO2纳米球为0.12g；所述的PDDA溶液和rQDs水分散液的体积比为10:1；所述的PDDA溶液的浓度为0.4wt％，含0.02M NaCl。
6.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤5中，制备cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针时，所用的SiO2@gQDs或SiO2@rQDs分散液、EDC/NHS溶液、cDNA1或cDNA2储备液的体积比为200:100:1；所用的活化交联溶液中EDC和NHS的浓度分别为10mM和5mM，所用的cDNA储备液的浓度均为20μM，所制得的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针分散液的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤6中，制备MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针时，所用的MBs、TCEP、cDNA储备液的体积比为200:1:1；所用的TCEP溶液的浓度分别为50mM，所用的aptamer储备液的浓度为20μM，所制得的MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针分散液的体积比为1:1。
8.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤7中，制备磁控荧光传感器时，所用的cDNA1-SiO2@gQDs信号探针和MBs-Apt1磁性捕获探针以及cDNA2-SiO2@rQDs信号探针和MBs-Apt2磁性捕获探针的体积比均为1:1，所制得的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物分散液的体积比为1:1。
9.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于在样品检测过程中，所用的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs纳米生物复合物、MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物、OTA标准品溶液、AFB1标准品溶液的体积比为8:8:1:1，515nm和633nm分别为gQDs和rQDs荧光发射波长；所用的OTA标准品溶液的浓度依次为0、0.002、0.003、0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5ng mL-1，所用的AFB1标准品溶液的浓度依次为0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.1、0.5、1、2、5、10ng mL-1。
10.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于所用的OTA的核酸适配体(Apt1)序列为5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-(CH2)6-SH-3'，AFB1的核酸适配体(Apt2)序列为5'-GTT GGG CAC GTGTTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-(CH2)6-SH-3'，相应的互补序列cDNA1为5'-CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-(CH2)6-NH2-3'，cDNA2为5'-CAC AGA GAGACA ACA CGT GCC CAA C-(CH2)6-NH2-3'。
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