CN105717285A - 一种用于伏马毒素b1灵敏检测的磁控比率荧光适配体传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，包括如下步骤：发射绿色荧光的CdTe量子点水溶液和发射红色荧光的CdTe量子点水溶液的制备；SiO2纳米球分散液的制备；Fe3O4SiO2磁珠分散液的制备；gQDs包覆的SiO2分散液的制备；rQDs包覆mSiO2纳米球分散液的制备；SiO2gQDs标记的Aptamer荧光探针分散液的制备；mSiO2rQDs标记的cDNA磁性?荧光探针分散液的制备；传感器的构建及样品的检测；对待测样进行检测。本发明研制的磁控比率荧光适配体传感器，加工方法简便、检测成本低，可以提供内部校正以消除环境因素、激发强度变化和探针浓度等因素的干扰，大大减少误差，提高FB1检测的准确性和灵敏性。

Description

一种用于伏马毒素B1灵敏检测的磁控比率荧光适配体传感器的制备 方法
技术领域
本发明涉及材料学、光分析化学、纳米生物传感等领域，特指一种用于伏马毒素B1灵敏检测的磁控比率荧光适配体传感器的制备方法。
背景技术
伏马毒素(Fumonisin)是由串珠镰刀菌、层生镰刀菌、轮枝镰刀菌等产生的次级代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三酸组成的结构类似的双酯化合物。人类迄今为止已发现了28种伏马毒素类似物，分为A、B、C和P族4类，其中在自然界中分布广泛、毒性较强的是伏马毒素B1(Fumonisin B1，FB1)。FB1污染的主要是玉米及其加工产品，此外还有一些如大米、小米、高粱、牛奶、啤酒等食品。FB1可诱发人体食道癌、肝癌、胃癌的发生，并且FB1为水溶性霉菌毒素，对热稳定，在多数食品加工过程中均比较稳定。为此，许多国家制订了相应的限量标准，如欧盟规定婴幼儿玉米制品中FB1和FB2的总含量为0.2mg kg-1，玉米中的限量值为4mg kg-1；美国FDA规定玉米中FB1、FB2和FB3总量的最高限量值为2mg kg-1。玉米是人类赖以生存的主要粮食品种之一，全世界年产近5亿吨，其中我国居第二位，占总产量的20％左右。我国所生产的玉米每年除满足国内需求外，还大量出口到其他国家。因此，建立完善的伏马毒素检测手段和监控机制，及时有效地发现和控制有关伏马毒素的污染，及时采取措施，从而提高中国玉米在国际市场上的质量、信誉和品牌，保证国际贸易的顺利进行。
FB1现行的检测方法主要有薄层色谱法、近红外光谱法、酶联免疫吸附法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。其中薄层色谱法和近红外光谱法灵敏度低且重现性较差，只能用于定性或半定量分析。而酶联免疫吸附法假阳性率高，且对抗体的质量要求高，不能满足实验室分析要求。以气相色谱技术为基础对目标物进行检测是目前公认的、准确检测FB1的仪器分析法。该法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果可靠等优点；但也存在一定的局限，如需要专业的操作人员、分析周期长、设备昂贵且需要特殊的测试环境，而且对样品的前处理要求严苛，常需要对样品进行衍生化，不同操作过程所使用的化学药剂和处理途径差别较大，易对实验结果的精确度造成影响，且谷物中的共提取物干扰严重。
核酸适配体(Aptamer)是通过体外筛选技术，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的、能特异结合蛋白质或其它小分子物质的单链寡聚核苷酸。作为一种新型分子识别元件，适配体一经发现便成为生物传感领域炙手可热的研究对象和分析工具。与抗体和酶等传统的分子识别元件相比，适配体作用的靶分子范围更广，包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫原性的物质；具有更高的特异性和亲和性；热稳定性好、维持活性的pH值和盐浓度范围广。此外，适配体是由人工合成的，因而不依赖于动物或细胞，制备成本低、周期短，可以在合成时定点、随意地连接其他功能基团和分子，具有较高的纯度和加工精确性。鉴于以上诸多优势，近年来关于适配体的基础及应用研究均呈现了快速发展态势，是目前分析化学进展最迅速的学科前沿之一。最近，相关研究人员设计了多个适配体传感体系，分别利用电化学、微悬臂、荧光等研究手段，实现了对FB1的分析检测。比率荧光方法是基于两个不同波长的荧光强度比值来达到分析检测目标物的方法。该方法在提高灵敏度和选择性方面有显著的优势，近年来在生物和化学检测中引起了广泛关注。相比于传统的单波长荧光测量，比率荧光传感器可以提供内部校正以消除环境因素，激发强度变化和探针浓度等因素的干扰，大大减少误差，提高检测的准确性。目前报道的比率荧光传感器多以荧光染料或量子点为探针，用于离子检测和生物分析等方面。
发明内容
本发明旨在发明一种具有工艺简单、成本低廉等优点的磁控比率荧光适配体传感器，提供一种制备高选择性、高精确性，测量范围宽的高灵敏检测FB1的方法，解决现有检测方法成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低、激发强度变化和探针浓度易受干扰等难题。
所采用的方案概括为：首先，在SiO2表面静电吸附发射绿色荧光的CdTe量子点(gQDs)制备SiO2@gQDs，并将其作为荧光探针与FB1的Aptamer偶联；其次，以改进的法合成Fe3O4@SiO2磁性纳米微球(mSiO2)，在mSiO2表面静电吸附发射红色荧光的CdTe量子点(rQDs)制得mSiO2@rQDs，并将其作为磁性-荧光探针与aptamer的互补DNA(cDNA)偶联；最后，利用Aptamer与cDNA之间的杂交反应将SiO2@gQDs捕获在mSiO2@rQDs制得mSiO2@rQDs-cDNA/aptamer-gQDs@SiO2磁控-荧光-分子靶向纳米生物复合物。该探针与目标物FB1作用后，对其施加外源磁场分离富集未脱附的荧光信标，形成比率荧光适配体传感体系，实现对FB1的灵敏检测。该比率荧光适配体传感方法可以提供内部校正，消除环境因素、激发强度变化和探针浓度等因素的干扰，相比于单波长荧光检测，在提高灵敏度和精确度方面具有非常显著的优势。
本发明是通过如下具体技术方案实现的：
一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1(FB1)的方法，包括如下步骤：
步骤1、发射绿色荧光的水溶性CdTe量子点(简称为gQDs)水溶液和发射红色荧光的水溶性CdTe量子点(简称为rQDs)水溶液的制备；
步骤2、单分散SiO2纳米球分散液的制备；
步骤3、Fe3O4@SiO2磁珠(mSiO2)分散液的制备；
步骤4、gQDs包覆的SiO2(简称为SiO2@gQDs)分散液纳米球的制备：取步骤2制备的SiO2纳米球分散液和0.02M NaCl溶液溶解的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应；产物经离心分离、洗涤后，再加入步骤1中制备的gQDs水溶液，于避光条件下磁力搅拌反应，经离心分离、洗涤后，避光自然干燥，将干燥后的产物分散到蒸馏水中，得到SiO2@gQDs分散液，备用；
步骤5、rQDs包覆mSiO2纳米球(简称为mSiO2@rQDs)分散液的制备：取用步骤3中制备的mSiO2分散液，向其中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，机械搅拌反应；将产物磁性分离，二次水洗3次后，加入二次水将其重新分散，制得聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的mSiO2(简称为mSiO2-PDDA)；最后，加入rQDs水溶液机械搅拌，经磁性分离，二次水洗后，避光自然干燥，将干燥后的mSiO2@rQDs分散在二次水中，得到mSiO2@rQDs分散液，备用；
步骤6、SiO2@gQDs标记的Aptamer(简称为SiO2@gQDs-Aptamer)荧光探针分散液的制备：取步骤4制备的SiO2@gQDs分散液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)水溶液，振荡反应，随后加入Aptamer储备液，振荡孵育过夜，反应完毕后，离心洗涤产物，将产物重新分散在Tris-HCl溶液中，得到SiO2@gQDs-Aptamer分散液，备用；
步骤7、mSiO2@rQDs标记的Aptamer的互补链cDNA(简称为mSiO2@rQDs-cDNA)磁性-荧光探针分散液的制备：取步骤5制备的mSiO2@rQDs的分散液，加入EDC水溶液和NHS水溶液，振荡反应，加入cDNA，振荡孵育过夜，振荡孵育过夜，反应完毕后，离心洗涤产物，将产物重新分散在Tris-HCl溶液中，得到mSiO2@rQDs-cDNA分散液，备用；
步骤8、传感器的构建及样品的检测，包括：磁控-比率荧光-靶向纳米生物复合物的制备：取步骤6制备的SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液和步骤7制备的mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液混合，进行第一次恒温振荡孵育，制得mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物，对产物mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物磁性分离、洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液A中，备用；
对FB1标准品进行检测，建立标准曲线：取所制备的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物与FB1溶液混合，进行第二次恒温振荡孵育；经磁性分离后，弃去已脱附的SiO2@gQDs，将收集得到的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液B中，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图，通过荧光强度比(Ig/Ir)/(Ig/Ir)0与FB1标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线，其中，(Ig/Ir)和(Ig/Ir)0分别为存在与不存在FB1时，磁性收集的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物所测得的gQDs荧光强度(Ig)和rQDs荧光强度(Ir)的比值；
步骤9、对待测样按照步骤8同样的方法进行检测，依据步骤8得到的标准曲线得出检测数据。
步骤1中，发射绿色荧光的gQDs水溶液和发射红色荧光的rQDs水溶液的制备方法为：称取0.0638g碲粉和0.0449g硼氢化钠置入10mL比色管中，加入4mL超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液；将0.1142gCdCl2·2.5H2O和75μL巯基丙酸加入到含50mL二次水的三颈瓶中，氮气氛下磁力搅拌5min，用用2M NaOH调节溶液pH至8.5，迅速加入上述制备的NaHTe溶液2mL，继续搅拌30min，100℃下回流0.5h和12h，回流0.5h后得到gQDs，回流12h后得到rQDs；停止反应恢复至室温，加入100mL乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物避光自然干燥，再重新分散得到10mg mL-1的gQDs水溶液和10mg mL-1的rQDs水溶液，4℃避光保存，备用。
步骤2中，单分散SiO2纳米球分散液的制备方法为：取一个经过严格清洗的250mL单口烧瓶，分别加入80mL乙醇，4.85mL二次水和3.6mL的氨水(28wt％)，55℃下搅拌反应10min，然后将3.1mL正硅酸四乙酯(TEOS)与8mL乙醇的混合溶液迅速加入，55℃下搅拌反应4h后，停止反应；产物离心水洗后，干燥，将干燥的产物转移至水中，制得浓度为10mgmL-1的SiO2纳米球分散液。
步骤3中，Fe3O4@SiO2磁珠(mSiO2)分散液的制备方法为：将10mL乙二醇，10mL一缩乙二醇，和0.5536g FeCl3·6H2O加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入1.5g醋酸钠和1g聚乙二醇并使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200℃下反应2h；冷却后，将混合物移至小烧杯中，磁分离、乙醇洗涤5次，避光干燥后，将干燥后的产物转移至水中，制得浓度为20mg mL-1的Fe3O4纳米球分散液；
取5mL Fe3O4纳米球分散液加入到100mL的柠檬酸钠溶液(1M)中，室温下搅拌反应3h，随后70℃下回流2h，磁分离去除清液，得到柠檬酸根修饰的Fe3O4(C-Fe3O4)；向制得的C-Fe3O4加入0.5mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，搅拌反应3h，磁分离去除清液后，加入0.15mL TEOS，10mL氨水(28wt％)和80mL乙醇，机械搅拌12h，磁分离、水洗多次，将制得的mSiO2重新分散在二次水中，得到mSiO2的分散液，其质量浓度为10mg mL-1。
步骤4中，制备SiO2@gQDs纳米球分散液时，所用的SiO2纳米球分散液、聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液、gQDs水分散液的体积比为5:30:3；所用的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液的浓度为0.4wt％，所制得的SiO2@gQDs纳米球水分散液的浓度为10mg mL-1；所述的搅拌反应均为3h。
步骤5中，制备mSiO2@rQDs分散液时，所用的mSiO2、聚二烯丙基二甲基氯化铵、rQDs水溶液的体积比为5:50:2；所用的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液的浓度为0.4wt％，所制得的mSiO2@rQDs分散液的浓度为10mg mL-1；加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液后的机械搅拌反应为1h，加入rQDs水溶液后的机械搅拌反应为3h。
步骤6中，制备SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液时，所用的SiO2@gQDs分散液、EDC水溶液、NHS水溶液、Aptamer储备液的体积比为250:2:1:1；所用的EDC溶液的浓度为400mM，NHS溶液的浓度为200mM，所用的Aptamer储备液的浓度为100μM，所制得的SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液的浓度为10mg mL-1，所述的振荡反应时间为2h；Tris-HCl溶液pH＝7.4，浓度为10mM。
步骤7中，制备mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液时，所用的mSiO2@rQDs的水分散液、EDC水溶液、NHS水溶液、cDNA储备液的体积比为250:2:1:1；所用的EDC溶液的浓度为400mM，NHS溶液的浓度为200mM，所用的cDNA储备液的浓度为100μM，所制得的mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液的浓度为10mg mL-1，所述的振荡反应时间为2h；Tris-HCl溶液pH＝7.4，浓度为10mM。
步骤8中，制备磁控比率荧光传感器时，所用的SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液和mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液的体积比为1:1，所制得mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物分散液的浓度为10mg mL-1；第一次恒温振荡孵育的温度为37℃，时间为2h；第二次恒温振荡孵育的温度为37℃，时间为60min；Tris-HCl缓冲溶液A pH＝7.4，浓度为10mM，Tris-HCl缓冲溶液A中含有120mM NaCl，20mMCaCl2，20mM MgCl2和5mM KCl；Tris-HCl缓冲溶液A pH＝7.4，浓度为10mM；
在样品检测过程中，所用的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物、FB1标准品溶液、磁性分离后重新分散的纳米生物复合物的体积比为1:1:40，所用的FB1标准品溶液浓度为0～20000pg mL-1。
所用的Aptamer序列为:5'-NH2-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTATAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAAGTG CAA TCT-3'；cDNA序列为:5'-NH2-AGA TTG CAC TTA CTA TCT AAT TGA ATA AGCTGG TAT GTG CAG ACG TAA TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGAATA AGC TGG TAT-3'。
四、有益效果：
(1)本发明结合磁性微球、CdTe量子点(QDs)荧光信标以及适配体分子识别技术，构建比率荧光适配体传感器，对FB1快速识别、富集、分离及高灵敏检测等优势。
(2)本发明构建的比率荧光传感器可以提供内部校正以消除环境因素，激发强度变化和探针浓度等因素的干扰，大大减少误差，提高检测的准确性。
(3)本发明构建的磁控比率荧光传感器为FB1的高灵敏靶向富集检测提供简便、快捷、可靠的新手段，为公共卫生安全提供一种快速侦检的锐利工具，具有快速、灵敏和操作简便、检测灵敏度高等特点。
(4)本发明所提出检测方法实现了FB1的比率检测，在50pg mL-1～11ng mL-1的浓度区间内，log((Ig/Ir)/(Ig/Ir)0)与FB1浓度呈现良好的线性关系，线性相关系数R2＝0.9983，检出限为16.7pg mL-1。
附图说明
图1为实施例1中所制得的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物的荧光光谱图；
图2为实施例1中对FB1的检测数据图，其中(A)与为不同浓度FB1(自下而上：0(曲线a)，50(曲线b)，100(曲线c)，500(曲线d)，1000(曲线e)，2000(曲线f)，4000(曲线g)，7000(曲线h)，11000(曲线i)，15000(曲线j)，20000(曲线k)pg mL-1)对应的适配体传感体系的荧光光谱；(B)为(Ig/Ir)/(Ig/Ir)0与FB1浓度之间的对应关系，插图为FB1标准品检测的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
(1)gQDs水溶液和rQDs水溶液的制备：
按照现有的方法制备gQDs和rQDs，具体如下：称取0.0638g碲粉和0.0449g硼氢化钠置入10mL比色管中，加入4mL超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到碲氢化钠(NaHTe)溶液。将0.1142g CdCl2·2.5H2O和75μL巯基丙酸加入到含50mL二次水的三颈烧瓶，氮气保护下磁力搅拌5min，用2M NaOH调节溶液pH至8.5，迅速加入上述制备的NaHTe溶液2mL，继续搅拌30min，100℃下回流0.5h和12h，回流0.5h后得到gQDs，回流12h后得到rQDs。停止反应恢复至室温，加入100mL乙醇搅拌然后静置15min。离心后，将沉淀物避光自然干燥，再重新分散得到10mg mL-1的gQDs水溶液和10mg mL-1的rQDs水溶液，4℃避光保存，备用。
(2)SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液的制备:
按照现有的方法制备SiO2纳米球，具体如下：单分散SiO2纳米球水分散液的制备方法为：取一个经过严格清洗的的250mL单口烧瓶，分别加入80mL乙醇，4.85mL二次水和3.6mL的氨水(28wt％)，55℃下搅拌反应10min，然后将3.1mL TEOS与8mL乙醇的混合溶液迅速加入，55℃下搅拌反应4h后，停止反应。离心、水洗，将产物干燥后，重新分散制得浓度为10mg mL-1的SiO2纳米球分散液。
取5mL上述SiO2纳米球分散液和30mL含0.02M NaCl的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液(0.4wt％)于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应3h；产物经离心分离、洗涤后，再加入3mLgQDs，于避光条件下磁力搅拌反应3h，经离心分离、洗涤后，避光自然干燥，将干燥后的产物分散到蒸馏水中，制得浓度为10mg mL-1的SiO2@gQDs的水分散液，备用。
取5mL SiO2@gQDs分散液于离心管中，加入40μL EDC(400mM)和20μL NHS(200mM)水溶液，振荡反应2h，随后加入20μL100μM Aptamer储备液，振荡孵育过夜，通过酰胺键将Aptamer偶联到SiO2@gQDs表面制备SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH7.4，10mM)溶液中，制得浓度为10mg mL-1的SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液。
(3)mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针的制备:
按照现有的方法制备mSiO2：将10mL乙二醇，10mL一缩乙二醇，和0.5536g FeCl3·6H2O加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入1.5g醋酸钠和1g聚乙二醇并使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200℃下反应2h。冷却后，将混合物移至烧杯中，磁分离、乙醇洗涤5次，制得浓度为20mg mL-1的Fe3O4纳米球分散液。
取上述5mL Fe3O4纳米球分散液加入到100mL的柠檬酸钠溶液(1M)中，室温下搅拌反应3h，随后70℃下回流2h，磁分离去除清液，得到柠檬酸根修饰的Fe3O4(C-Fe3O4)；向制得的C-Fe3O4加入0.5mL APTS，搅拌反应3h，磁分离去除清液后，加入0.15mL TEOS，10mL氨水(28wt％)和80mL乙醇，机械搅拌12h，磁分离、水洗多次，干燥后，将制得的Fe3O4@SiO2(mSiO2)重新分散至二次水中，得到mSiO2分散液，其质量浓度为10mgmL-1。
向5mL mSiO2中加入50mL聚二烯丙基二甲基氯化铵(0.4wt％)，机械搅拌反应1h；将产物磁性分离，二次水洗3次后，加入二次水将其重新分散，制得聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的mSiO2(简称为mSiO2-PDDA)；最后，加入2mL rQDs水溶液机械搅拌3h，经磁性分离，二次水洗，避光自然干燥，重新分散制得10mg mL-1mSiO2@rQDs分散液备用。
取上述制备的5mL mSiO2@rQDs的分散液于离心管中，加入40μL EDC(400mM)水溶液和20μL NHS(200mM)水溶液，振荡反应2h，随后加入20μL 100μM Aptamer储备液，振荡孵育过夜离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，制得浓度为10mg mL-1的mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液。
(4)mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2磁控比率荧光传感器的构建:
将所制备的10mL SiO2@gQDs-Aptamer分散液和10mL mSiO2@rQDs-cDNA分散液于离心管中混合，37℃振荡孵育2h，基于Aptamer和cDNA之间的杂交反应制得mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物，磁控分离、洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM，含120mM NaCl，20mM CaCl2，20mM MgCl2和5mM KCl)中，得到mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物分散液，浓度为10mg mL-1。
从图1中可以看出，mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物在520和670nm处有两个特征发射峰，分别归属于gQDs和rQDs，证明了比率荧光探针的成功制备。
(5)对FB1标准品进行检测，建立标准曲线:
取50μL mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物分散液和不同浓度FB1溶液50μL于离心管混合，37℃振荡孵育60min。由于FB1与Aptamer之间的特异性结合，使得部分SiO2@gQDs荧光探针从mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物上脱附。经磁分离后，弃去已脱附的SiO2@gQDs，将磁性收集的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物洗涤后，重新分散在2mL Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM)中，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图，通过荧光强度比(Ig/Ir)/(Ig/Ir)0的对数值与FB1标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线。
上述实验所涉及的：
1.Aptamer序列:5'-NH2-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TACCAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTGCAA TCT-3'；
2.cDNA序列:5'-NH2-AGA TTG CAC TTA CTA TCT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTGCAG ACG TAA TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGA ATA AGC TGGTAT-3'。
3.FB1检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的FB1标准品进行反应后，经磁分离后，弃去已脱附的SiO2@gQDs，将收集得到的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM)中，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图，根据荧光强度比(Ig/Ir)/(Ig/Ir)0的对数值与FB1标准品浓度之间的对应关系制得标准曲线。
从图2中可以看出，检测FB1标准品浓度的线性范围为：50pg mL-1～11ng mL-1，均呈现良好的线性关系，线性相关系数R2＝0.9983，对FB1的检出限达到了16.7pg mL- 1。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种用于伏马毒素B1灵敏检测的磁控比率荧光适配体传感器的制备方法
<130> 一种用于伏马毒素B1灵敏检测的磁控比率荧光适配体传感器的制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ataccagctt attcaattaa tcgcattacc ttataccagc ttattcaatt acgtctgcac 60
ataccagctt attcaattag atagtaagtg caatct 96
<210> 2
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agattgcact tactatctaa ttgaataagc tggtatgtgc agacgtaatt gaataagctg 60
gtataaggta atgcgattaa ttgaataagc tggtat 96

Claims (10)

1.一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、发射绿色荧光的水溶性CdTe量子点gQDs水溶液和发射红色荧光的水溶性CdTe量子点rQDs水溶液的制备；
步骤2、单分散SiO2纳米球分散液的制备；
步骤3、Fe3O4@SiO2磁珠mSiO2分散液的制备；
步骤4、gQDs包覆的SiO2SiO2@gQDs分散液纳米球的制备：取步骤2制备的SiO2纳米球分散液和0.02M NaCl溶液溶解的聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA溶液于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应；产物经离心分离、洗涤后，再加入步骤1中制备的gQDs水溶液，于避光条件下磁力搅拌反应，经离心分离、洗涤后，避光自然干燥，将干燥后的产物分散到蒸馏水中，得到SiO2@gQDs分散液，备用；
步骤5、rQDs包覆mSiO2纳米球mSiO2@rQDs分散液的制备：取用步骤3中制备的mSiO2分散液，向其中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，机械搅拌反应；将产物磁性分离，二次水洗3次后，加入二次水将其重新分散，制得聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的mSiO2(简称为mSiO2-PDDA)；最后，加入rQDs水溶液机械搅拌，经磁性分离，二次水洗后，避光自然干燥，将干燥后的mSiO2@rQDs分散在二次水中，得到mSiO2@rQDs分散液，备用；
步骤6、SiO2@gQDs标记的Aptamer SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液的制备：取步骤4制备的SiO2@gQDs分散液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC水溶液和N-羟基丁二酰亚胺NHS水溶液，振荡反应，随后加入Aptamer储备液，振荡孵育过夜，反应完毕后，离心洗涤产物，将产物重新分散在Tris-HCl溶液中，得到SiO2@gQDs-Aptamer分散液，备用；
步骤7、mSiO2@rQDs标记的Aptamer的互补链cDNA mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液的制备：取步骤5制备的mSiO2@rQDs的分散液，加入EDC水溶液和NHS水溶液，振荡反应，加入cDNA，振荡孵育过夜，振荡孵育过夜，反应完毕后，离心洗涤产物，将产物重新分散在Tris-HCl溶液中，得到mSiO2@rQDs-cDNA分散液，备用；
步骤8、传感器的构建及样品的检测，包括磁控-比率荧光-靶向纳米生物复合物的制备：取步骤6制备的SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液和步骤7制备的mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液混合，进行第一次恒温振荡孵育，制得mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物，对产物mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物磁性分离、洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液A中，备用；
对FB1标准品进行检测，建立标准曲线：取所制备的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物与FB1溶液混合，进行第二次恒温振荡孵育；经磁性分离后，弃去已脱附的SiO2@gQDs，将收集得到的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液B中，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图，通过荧光强度比(Ig/Ir)/(Ig/Ir)0与FB1标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线，其中，(Ig/Ir)和(Ig/Ir)0分别为存在与不存在FB1时，磁性收集的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物所测得的gQDs荧光强度和rQDs荧光强度的比值；
步骤9、对待测样按照步骤8同样的方法进行检测，依据步骤8得到的标准曲线得出检测数据。
2.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤1中，发射绿色荧光的gQDs水溶液和发射红色荧光的rQDs水溶液的制备方法为：称取0.0638g碲粉和0.0449g硼氢化钠置入10mL比色管中，加入4mL超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈紫色透明的碲氢化钠溶液；将0.1142gCdCl2·2.5H2O和75μL巯基丙酸加入到含50mL二次水的三颈瓶中，氮气氛下磁力搅拌5min，用用2M NaOH调节溶液pH至8.5，迅速加入上述制备的NaHTe溶液2mL，继续搅拌30min，100℃下回流0.5h和12h，回流0.5h后得到gQDs，回流12h后得到rQDs；停止反应恢复至室温，加入100mL乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物避光自然干燥，再重新分散得到10mg mL-1的gQDs水溶液和10mg mL-1的rQDs水溶液，4℃避光保存，备用。
3.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤2中，单分散SiO2纳米球分散液的制备方法为：取一个经过严格清洗的250mL单口烧瓶，分别加入80mL乙醇，4.85mL二次水和3.6mL 28wt％的氨水，55℃下搅拌反应10min，然后将3.1mL正硅酸四乙酯TEOS与8mL乙醇的混合溶液迅速加入，55℃下搅拌反应4h后，停止反应；产物离心水洗后，干燥，将干燥的产物转移至水中，制得浓度为10mg mL-1的SiO2纳米球分散液。
4.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤3中，mSiO2分散液的制备方法为：将10mL乙二醇，10mL一缩乙二醇，和0.5536g FeCl3·6H2O加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入1.5g醋酸钠和1g聚乙二醇并使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200℃下反应2h；冷却后，将混合物移至小烧杯中，磁分离、乙醇洗涤5次，避光干燥后，将干燥后的产物转移至水中，制得浓度为20mg mL-1的Fe3O4纳米球分散液；
取5mL Fe3O4纳米球分散液加入到100mL 1M的柠檬酸钠溶液中，室温下搅拌反应3h，随后70℃下回流2h，磁分离去除清液，得到柠檬酸根修饰的Fe3O4C-Fe3O4；向制得的C-Fe3O4加入0.5mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTS，搅拌反应3h，磁分离去除清液后，加入0.15mLTEOS，10mL 28wt％的氨水和80mL乙醇，机械搅拌12h，磁分离、水洗多次，将制得的mSiO2重新分散在二次水中，得到mSiO2的分散液，其质量浓度为10mg mL-1。
5.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤4中，制备SiO2@gQDs纳米球分散液时，所用的SiO2纳米球分散液、聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液、gQDs水分散液的体积比为5:30:3；所用的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液的浓度为0.4wt％，所制得的SiO2@gQDs纳米球水分散液的浓度为10mg mL-1；所述的搅拌反应均为3h。
6.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤5中，制备mSiO2@rQDs分散液时，所用的mSiO2、聚二烯丙基二甲基氯化铵、rQDs水溶液的体积比为5:50:2；所用的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液的浓度为0.4wt％，所制得的mSiO2@rQDs分散液的浓度为10mg mL-1；加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液后的机械搅拌反应为1h，加入rQDs水溶液后的机械搅拌反应为3h。
7.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤6中，制备SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液时，所用的SiO2@gQDs分散液、EDC水溶液、NHS水溶液、Aptamer储备液的体积比为250:2:1:1；所用的EDC溶液的浓度为400mM，NHS溶液的浓度为200mM，所用的Aptamer储备液的浓度为100μM，所制得的SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液的浓度为10mg mL-1，所述的振荡反应时间为2h；Tris-HCl溶液pH＝7.4，浓度为10mM。
8.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤7中，制备mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液时，所用的mSiO2@rQDs的水分散液、EDC水溶液、NHS水溶液、cDNA储备液的体积比为250:2:1:1；所用的EDC溶液的浓度为400mM，NHS溶液的浓度为200mM，所用的cDNA储备液的浓度为100μM，所制得的mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液的浓度为10mg mL-1，所述的振荡反应时间为2h；Tris-HCl溶液pH＝7.4，浓度为10mM。
9.根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤8中，制备磁控比率荧光传感器时，所用的SiO2@gQDs-Aptamer荧光探针分散液和mSiO2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液的体积比为1:1，所制得mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物分散液的浓度为10mg mL-1；第一次恒温振荡孵育的温度为37℃，时间为2h；第二次恒温振荡孵育的温度为37℃，时间为60min；Tris-HCl缓冲溶液A pH＝7.4，浓度为10mM，Tris-HCl缓冲溶液A中含有120mM NaCl，20mMCaCl2，20mM MgCl2和5mM KCl；Tris-HCl缓冲溶液A pH＝7.4，浓度为10mM；
在样品检测过程中，所用的mSiO2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@SiO2纳米生物复合物、FB1标准品溶液、磁性分离后重新分散的纳米生物复合物的体积比为1:1:40，所用的FB1标准品溶液浓度为0～20000pg mL-1。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，所用的Aptamer序列为：5'-NH2-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AATCGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCAATT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3'；cDNA序列为：5'-NH2-AGA TTG CAC TTA CTA TCTAAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG CAG ACG TAA TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AATGCG ATT AAT TGA ATA AGC TGG TAT-3'。
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