CN102165071A - 制备均质塑料-粘附适体-磁珠-荧光团和其他夹心分析物的方法 - Google Patents

制备均质塑料-粘附适体-磁珠-荧光团和其他夹心分析物的方法 Download PDF

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Abstract

本申请描述了组装DNA适体-磁珠(“MB”)结合体加适体-量子点(“QD”)适体-荧光纳米粒子或其他适体-荧光团、适体-化学发光报告标记、适体-放射性同位素或其他适体-报告标记结合体夹心分析物的方法，该分析物能粘附到玻璃、聚苯乙烯和其他塑料上。粘附到玻璃或塑料上能无需洗涤步骤，即一步检测到与背景(溶液体)荧光形成对比的表面富集荧光分离物(即便去除用于富集该分析物的外部磁场)。这种分析物形式能实现对各种检测成分的快速、一步(均质)分析，无需洗涤步骤，而且灵敏度不受影响。

Description

制备均质塑料-粘附适体-磁珠-荧光团和其他夹心分析物的方法
相关申请的交叉引用
基于申请号为61/066,506和61/132,147的美国临时申请提出本申请，同时要求上述临时申请的优先权，其全文通过引用并入本说明书。
技术领域
本发明涉及适体基和核酸基诊断试剂相关领域。更具体地说，本发明涉及与适体-量子点(“QD”)结合的自组装DNA适体-磁珠(“MB”)结合体或其他适体-荧光团结合体夹心分析物的制备方法和使用方法，其中，所述分析物天然粘附在玻璃和某些塑料如聚苯乙烯(或其衍生物)上以实现一步(均质)检测，无需洗涤，即便去除外部的磁珠后也无需洗涤。适体与磁珠或量子点和其他荧光团之间的结合通过简单的化学结合反应即可实现，即利用双功能连接剂或核心官能团如醛基、碳二亚胺基、羧基、N-羟基-琥珀酰亚胺(“NHS”)酯基、N-氧-琥珀酰亚胺(“NOS”)酯基、巯基等，或者经由生物素-亲合素、组氨酸-镍等高亲和力连接系统进行结合。这种一步、免洗分析物形式可广泛应用于肉、禽、血清、日用品、水果、蔬菜等食物基质表面或内部食源性致病菌的灵敏检测。该分析物还可用作土样或泥浆样品的环境分析物以及可直接对整个血液、尿液、唾液或其它体液样品进行操作的临床和兽医诊断试剂，样品稀释或不稀释均可，但都不需要洗涤步骤。典型的洗涤步骤涉及去除产生背景荧光的杂质的纯化步骤。
背景技术
所有诊断分析方法中，最希望使用的是那些快速的“结合/检测”或“均质”一步分析法，它们无需洗涤而且不会明显影响灵敏度。成功的一步分析法例如包括荧光偏振(FP)分析法和荧光共振能量转移(“FRET”)分析法。虽然这两种形式的分析方法很受欢迎，但是它们为追求获取试验结果的速度往往使灵敏度大打折扣。所以，FP和FRET分析法常用于血液、尿液或其他体液中某些浓度较高(微摩尔-毫摩尔范围)的检测成分的临床诊断。对于含量很低的检测成分，就需要采用多步分析法来检测纳克、纳摩尔或含量更低的各种目标检测成分，如酶联免疫吸收分析法(“ELISA”)、放射免疫分析法(“RIA”)和其它夹心形式的分析法如磁免疫-电化学发光(“IM-ECL”)分析法。通常来说，这些夹心类分析物都需要一道或多道洗涤步骤，所以操作速度相应减慢。本领域的技术人员都知道，洗涤步骤通常是去除杂质(即待测目标成分之外的物质)、降低背景荧光信号的必要步骤。本发明发现，消除洗涤步骤的必要性大有裨益，因为这能提高许多分析物的检测速度和精确度。
众所周知，DNA可以粘附在某些玻璃表面上，尤其是玻璃表面摩擦带电后粘附会更明显。利用静电作用从细胞裂解物中收集基因组DNA的方法，我们称电玻棒DNA“绕轴(spooling)”法，采用的就是这一原理。Allemand、Bensimon、Buck和Andrew、Dudley、Klein、Labit、Michalet、Moscoso和Torres等人也发表过类似报道，即通过静电引力和疏水力或其它弱作用力使DNA、细菌、生物膜等材料粘附在聚苯乙烯上。但是Allemand、Bensimon和Klein等人强调，DNA的3’或5’游离末端要远远比中间区域更有可能与聚苯乙烯结合，这种结合并非瞬间完成(需要1到几分钟的停留时间，DNA才能结合到塑料上)，有pH依赖性，酸性pH条件下结合最佳(pH约5.5，低于大多数生物分析所需的pH范围)。Bensimon等人(1994)甚至暗示，DNA可能通过其5’或3’磷酸末端(表现为磷酸形式)与苯乙烯环的pi双键或聚苯乙烯纤维中未聚合的游离烯烃端之间的亲电加成作用，与聚苯乙烯共价结合。本发明和Bruno等人(2008)在其空肠弯曲杆菌分析检测中发现并报道，分析材料间结合得非常稳定而持久，是因为DNA适体(aptamer)与聚苯乙烯之间发生共价结合的缘故。
虽然有一些种类的细菌能与塑料和玻璃结合，但并非所有的种类都能形成这种粘附生物膜。在本文所述的分析法中，分析物的组分(DNA适体、磁珠和量子点)在含和不含目标细菌的情况下都发生粘附。相反，免疫磁性(“抗体-磁珠”)夹心分析物在中性或酸性pH下与聚苯乙烯粘附的效果不是很好，这可能是因为蛋白质抗体在中性或酸性pH下与塑料或玻璃材料粘附效果不是很好的缘故。我们都知道，抗体类蛋白质是在广泛应用的ELISA试验模式所使用的碱性pH值条件下粘附在聚苯乙烯微型滴定板孔内。但是，ELISA分析法中适用抗体和蛋白质粘附的pH通常为8.0-9.5，显然不是本文所述的DNA粘附分析法中要求的酸性条件。所以，DNA适体被认为是促成与聚苯乙烯或玻璃或其衍生物粘附进而实现一步免洗分析法的关键组分。虽然某些细菌种类可能有益于器皿内表面的整个粘附，但DNA适体组分却显示出具有足以促成前述分析组分粘附在磁化区内的能力，这是因为分析组分(适体-磁珠结合体)甚至在不含捕获细菌细胞的情况下都会粘附在塑料和玻璃上。
相关文献
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发明内容
本文描述了一种新型适体-磁珠-适体-量子点夹心分析物及其荧光团成分有所不同的衍生形式，这类分析物能一步完成，省却洗涤步骤，即将具强外部磁场的磁珠聚集到玻璃面、聚苯乙烯面、其他塑料面或涂层面如器皿内表面上。由于检测成分被捕获到一较薄的粘附平面区域内，所以将磁珠和所有结合的分析物组分，包括DNA适体、磁珠、荧光团和捕获的检测成分聚集到塑料面上一小块区域内能集中分析物的荧光强度。这样，由于分析物材料和捕获的检测成分被分离并富集到粘附区，所以即便照射食物或血液等基本上不透明的基质内的粘附材料时，仍能极其灵敏地检测到粘附材料发出的荧光，不受整个溶液发出的自体荧光背景的干扰。整个溶液中未捕获的适体-量子点或适体-荧光团结合体发出的荧光构成了背景荧光，但由于这些荧光没有聚集到分析物粘附区内，所以它们对整体荧光信号的影响微乎其微。没有与检测成分和适体-磁珠结合体结合的适体-量子点或适体-荧光团结合体不会被大量地拉到塑料面上也不会粘附到塑料面上，而且不会显著的产生检测信号，但会减弱整个溶液的荧光背景“噪音”。由于适体有高亲和力，磁珠具备富集到限定区的能力，外加红发射量子点的斯托克斯长位移(即高能量的紫外激发态伴随600nm以上的红光谱区发射)，这一组合使本发明的一步免洗分析物形式具备超灵敏特性。不过，使分析物材料和捕获的检测成分粘附到清澈的塑料或玻璃面的小区域内，甚至在去除外部磁场时，是实现一步免洗检测的关键因素。
本发明提供了适体-量子点或其他适体-荧光团结合体与用于捕获目标检测成分的DNA和RNA适体-磁珠结合体的组装体。该目标检测成分例如是以下所想要检测的：致病菌，病毒，寄生虫，白细胞，癌细胞，蛋白质，蛋白质外的其他大分子，毒素，污染物，毒品，爆炸物，病毒衣壳蛋白，病毒聚合酶，生物毒素如细菌毒素、肉毒素、霍乱毒素、破伤风毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素、志贺毒素或vero毒素，藻类毒素如裸藻毒素、雪卡毒素、微囊藻毒素，或石房蛤毒素，蛇毒或蜘蛛毒，临床相关蛋白或蛋白组成部分(肽)如骨标志物(例如：胶原降解肽如CTx、NTx、OCF、组织蛋白酶K或其前体组织蛋白酶K酶原、脱氧吡啶啉、吡啶啉、赖氨酰吡啶啉或羟赖氨酰吡啶啉)，细胞因子和白细胞介素，心肌梗死标志物(肌钙蛋白、肌球蛋白等)，肾病，抗体，自身免疫性疾病，关节炎，或其他临床相关大分子如脂多糖(LPS，内毒素)，以及其他小分子(这里“小分子”是指小于1,000道尔顿的分子)例如具有至少两个不同表位，选自：杀虫剂，天然氨基酸和合成氨基酸及其衍生物：羟赖氨酸、羟脯氨酸、组氨酸、组胺、同型半胱氨酸、DOPA、褪黑素，硝基酪氨酸，短链蛋白水解产物：尸胺、腐胺、聚胺、精胺、亚精胺、脱氧吡啶啉、吡啶啉、赖氨酰基吡啶啉或羟赖氨酰基吡啶啉，DNA或RNA的N碱基，核苷，核苷酸，核酸环形同型异构体，cAMP、cGMP，细胞代谢物：尿素、尿酸，药物：治疗剂、维生素，违禁药品：麻醉药品、致幻剂、γ-羟基丁酸盐(GHB)，细胞介导因子：细胞因子、趋化因子、免疫调节因子、神经调节因子，神经递质如乙酰胆碱，炎性调节因子，前列腺素、前列腺素代谢物、硝基芳烃和硝胺炸药，炸药分解产物(如DNT)或副产物，群体感应分子如AHLs、类固醇、激素，及其衍生物。
荧光团是指与一分子结合的荧光成分或官能团。荧光团可以是染料、发光珠、发光脂质体、量子点(“QD”)、荧光或磷光纳米粒子(“NP”)、荧光乳胶粒子或微珠、荧光染料分子如荧光素、羧基荧光素及其他荧光素衍生物，荧光共振能量转移(“FRET”)复合物如链内或竞争性FRET-适体，或任何其他能与适体形成共价键的发光体。本文中，“其他适体-荧光团结合体”包括那些结合有荧光团的适体，例如，除本文另外罗列的适体外，还包括适体-荧光染料结合体、适体-荧光微珠结合体或含有荧光染料的适体-脂质体结合体。本发明中，荧光团在快速、免洗的一步操作中起到“报告”检测目标检测成分的作用。对目标物的唯一要求是，目标物得含有两个可靠近的组成和构象相同或不同的表位以使具有捕获适体和报告适体组分的夹心分析物发挥作用。
本发明采用一步分析物形式，其可在夹心分析法中使用，以定量检测所述溶液中的所述目标检测成分，还可在荧光强度法、时间分辨荧光分析法、化学发光检测法、电子检测法、电化学检测法、电化学发光检测法、磷光检测法或放射性同位素检测法中使用。该分析物的一步特性由以下特征所决定，即该分析物的组分捕获检测成分，然后粘附或粘连在分析物基质的内表面，在高度磁化区停留短暂时间(5-10分钟)。上述分析物基质一般是聚苯乙烯塑料管、玻璃管或其他类型的能透过荧光的透明或半透明器皿。
更具体地说，所述分析物具有一步特性，是因为施加外部磁场后，该磁场能通过磁力作用将分析物材料(适体-磁珠和适体-量子点或其他适体-荧光团结合体)从溶液体中分离或隔离出来，使这些材料通过DNA和某些塑料或玻璃之间的吸引力或共价结合力，结合或粘附到一个面如聚苯乙烯管或玻璃管的内表面上，从而增加磁性物质所在位置的那个表面的信噪比(即便将磁性物质或磁场撤离后，该比例也不受影响)，以进行荧光检测。由于发出强荧光的检测成分粘附在器皿内表面上，所以，能够分辨样品荧光与背景荧光，或目标荧光与整个溶液或者“信号与噪音”，从而使得一步均质分析检测成为可能。分析物材料与器皿的粘附技术成为一项甚至能用于检测浓稠食品(如牛奶、鸡汁和牛肉汁、蛋黄样品)的技术。
典型的一步适体-磁珠加适体-量子点器皿分析或检测物包括以下两种按任何顺序合成和添加的组分：(1)100μg对目标检测成分上的一个表位有特异性的5’氨基修饰DNA适体，10mM BS3(双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯)或其他合适的胺反应性双功能连接剂如EDC[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]、磺基-EGS[乙二醇双磺基琥珀酰亚胺丁二酸酯]、磺基-SMCC[磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯]、戊二醛等，外加8μM量子点655ITK试剂(Invitrogen公司)。将这些组分加到1ml1×结合缓冲液中(“1×BB”；0.5M NaCl、10mM Tris-HCl、1mM MgCl2、pH7.5-7.6)混合，室温放置30分钟。用Sephadex G-25或其他合适的尺寸排除色谱基质纯化这种适体-量子点组分。(2)100μg对目标检测成分上的第二个表位有特异性的第二种5’氨基修饰DNA适体，加10μl甲苯磺酰基-活化磁珠(约1×106个磁珠，直径1-5微米)。将这种组分在37℃温育2小时或2小时以上，然后强磁性物质如强磁铁收集，1×BB洗涤3次。将这两种主要组分(适体-量子点和适体-MB结合体)加到聚苯乙烯或其他塑料管内，加入1×BB至总体积2ml。将器皿冻干，用氮气回吹并密封供长期保存。
上面描述了本发明的用于食品安全检测，测定微量致病菌所用分析物组分含量的典型实施例。但是，需要有很宽的检测范围用于其他类型检测成分的分析测定。所以，考虑到适体亲和力范围和可测荧光范围，可基于两种主要分析物组分的以下比例范围，对一步器皿分析物进行描述。
(1)适体-量子点试剂：0.5-50纳摩尔5’氨基-DNA适体(或10-1,000μg 60-100个碱基的DNA)加10-20毫摩尔双功能连接剂(BS3等，连接剂过量)加0.8-80微摩尔量子点。
(2)适体-磁珠试剂：0.5-50纳摩尔5’氨基-DNA/105-107个甲苯磺酰基-磁珠或其他用于结合DNA的合适的磁珠衍生物。
总的来说，分析物各组分的用于抗体和适体的亲和力在10倍范围内(即上下10倍)是在本发明的预期范围内。由于本发明涵盖不同灵敏度的分析物，所以分析物组分的量是可变动的。所以同一个基础分析物所含的组分有可能变动以适应要求极高灵敏度的情形和其他可以接受较低灵敏度的应用情形。
使用前，用可能含有目标检测成分的待测溶液将所述一步器皿分析物还原。该溶液预计大约2ml，可以是任意数量的不同样品液基质，其中可能含有目标待测成分，其包括但不限于：天然水、缓冲液、或者稀释或未稀释的食品(如牛奶、酸奶、尚未固化的乳酪、肉汁、果汁、鸡蛋、浸泡了水果和蔬菜的水、稀释的花生酱等)、稀释的全血、血清、尿液、痰液或其他体液样品。
往适体-磁珠结合体(“适体-磁珠”)和适体-荧光团结合体中加入所述整个溶液，或者在加入目标检测成分前可将适体-磁珠结合体(“适体-磁珠”)和适体-荧光团结合体一起原位冻干(在器皿内)。适体结合体是依照能在目标检测成分的第一结合位点与其结合的适体-磁珠结合体标准和能在目标检测成分的第二结合位点与其结合的适体-荧光团结合体标准来选择的。所以，如果待测溶液中存在目标检测成分，两种适体-磁珠和适体-荧光团结合体均与目标检测成分结合，形成检测成分-适体-荧光团复合物。确保溶液中的适体-磁珠不与适体-荧光团结合、形成碱基对或杂交也是很有必要的。如果它们以一定方式彼此结合，与目标检测成分发生竞争，那么分析物会产生假阳性，这是因为磁珠会把适体-磁珠-荧光团(不含检测成分)拉向器皿透明面区域以备分析检测。
每隔15-20分钟将器皿重新密封，摇晃、混合，让适体-磁珠结合到目标检测成分的第一结合位点上，让适体-荧光团结合体结合到目标检测成分的第二结合位点上，形成检测成分-适体-荧光团复合物。然后，把器皿放到在合适高度处有一组外部磁铁的架子或其他装置内，通过外部磁场对磁珠的吸引力，检测成分-适体-荧光团复合物被吸附到器皿的透明壁区域。受磁场引力作用，磁珠将剩余的收集任何捕获的检测成分的检测成分-适体-荧光团复合物拉到与荧光光度计的光路径齐平的位置，呈带状(矩形或正方形)或圆形的样式。收集带有捕获的分析物和目标检测成分的磁珠5分钟或5分钟以上，然后去除外部磁铁，留下粘附在塑料器皿内表面上的粘附荧光磁珠、分析物和目标检测成分，如图1所示。正是通过这种将分析物组分和捕获的检测成分分离并富集到器皿内表面上形成粘附薄膜的方式，使分析物强荧光与粘附材料背后的溶液体的微弱荧光形成对比而得以区分。这样，分析物-适体-荧光团复合物就有效的从剩余的溶液体中分离出来，使检测性增强。这种分离方式满足了把粘附的一步、均质分析物置于荧光光度计内，用合适的激发和发射波长进行定量测定时的高信噪比要求。
虽然上面描述的是一个器皿，但本发明对任意数量的容器或管形式都是有效的。所以，本发明的方法可以在试管、样品瓶、盘、流通池、匣、盒、微流控芯片和其他任何类似的容器类型内操作。而且，该容器可以由任何形式和任何类型的过量材料组成，只要在观察“窗”内粘附了呈平面的分析物材料区而且核酸适体能结合在该材料上即可。所以，本发明的夹心形式也可以应用于平面型塑料或玻璃匣或盒，其中，分析物组分可以分析物组分在磁力作用下，被外部磁铁拉到沿一个槽或通道排列的位置。一旦到达透明的塑料或玻璃检测窗位置，外部磁铁会让分析物组分停留在该位置，它们在那能粘附在检测窗壁上，离开溶液体富集于此。因此，分析物器皿的一些具体实施形式或几何形状均可适用，只要所用器皿具有透明平面区域能够进行荧光分析即可。例如，具有供所述检测成分-适体-荧光团复合物粘附其上的器皿透明表面区域可以形成为正方形、矩形、圆形、椭圆形或平面形的容器、样品瓶、管、柱形筒、匣或盒。
预期所用容器可以由聚苯乙烯、透明塑料或玻璃制成。但除此之外，DNA与玻璃或塑料的结合并不限于天然玻璃或简单的聚苯乙烯。相反，也可以使用合适的塑料和涂层衍生物(如硅烷等)和疏水涂层，前者包括用于DNA亲电加成的烯烃，后者有助于弱力(范德华力或偶极-偶极)相互作用并加强DNA与带有涂层的玻璃或塑料间的结合。
附图说明
图1是表示一步粘附夹心分析物如何形成并在外部磁铁作用下如何被拉到塑料或玻璃器皿内表面的示意图。
图2示出了相对荧光强度随空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni，C.jejuni)浓度变化的线图。
图3示出了一系列与空肠弯曲杆菌经纯缓冲液(1×BB)稀释的十倍系列稀释液的检测和各种如图所示的稀释食物基质有关的荧光发光谱。激发态为380nm，光电倍增管设定为900伏。
图4中显示了能从未稀释鸡汁(从待烹饪的鸡腿上采集血清液)中检测到10个C.jejuni活菌的典型一步分析物。
具体实施方式
附图中，图1给出了一步粘附夹心分析物概念的代表性示意图。这个概念中，将DNA或可能的RNA适体与磁珠结合，用于捕获目标分析物(本例中为细菌细胞)。特异性适体通过与细菌表面的表位结合将其捕获。同理，利用适体-量子点结合体或其他的适体-荧光团报告试剂来结合另一表位，同时进行荧光检测。因为该夹心分析物含有DNA或RNA，所以它通过静电引力或其他弱作用力如偶极-偶极相互作用力或范德华力以及烯烃或苯乙烯环之间的可能为共价形式的亲电加成作用(Bensimon等，1994)，容易粘附在某些带电玻璃或带电/不带电塑料如聚苯乙烯及其衍生物。外部的磁性引力，如磁性较强的钴、钕或其他稀土磁性材料，更促进了它们之间的粘附。将外部的磁性物质脱离后，由于DNA与苯乙烯或其他塑料或玻璃材料之间的相互作用，分析材料仍旧粘附在器皿内表面上。这样，分析物连同捕获并标记的细菌或其它检测成分通过这种粘附作用从溶液体中分离出来。如果将分析物材料粘附的那侧管壁靠近探测器，同时用激发源从相对侧照射溶液，即可实现快速、灵敏、一步到位的检测。一旦所有的适体-磁珠-细菌-适体-量子点复合体都粘附在管壁上，该粘附材料会发出比含有游离的适体-量子点或适体-荧光结合体的整个溶液亮得多的荧光信号。
图2中绘制的折线表示使用一步粘附DNA适体-磁珠-适体红量子点(量子点655nm)夹心分析物(无洗涤步骤)得到的纯缓冲液(1×结合缓冲液；1×BB)中检测的空肠弯曲杆菌(C.jejuni)细菌浓度降到每毫升约2个细菌细胞水平所对应的相对荧光度。使用Turner Biosystems公司的手持荧光光度计的绿通道测定，每个数据点取5个独立的读数。误差棒表示这5个读数的标准偏差，由于它们的数值非常小，所以肉眼不可见。粘附一步免洗适体-磁珠/适体-量子点或适体-荧光团分析物的优选形式是，在塑料聚乙烯管内使用冻干的夹心分析物材料，其保质期长，可根据需要再复水。使用台式荧光分光光度计或手提式荧光光度计如Turner Biosystems公司生产的PicofluorTM荧光光度计或Invitrogen公司生产的Q-BitTM荧光光度计或者使用其他荧光读取设备，经过15-20分钟的捕获和5分钟的磁性收集时间，就能测出分析物的荧光度。图2和图4中看到的主要呈线性的光电响应/细菌浓度对数变化的关系图可能与荧光光度计中的光电二极管探测器有关，例如PicofluorTM荧光光度计中发现这种情况，这与图3形成反差，图3中的荧光分光光度计使用更灵敏和呈指数关系响应的光电倍增管(PMT)收集数据。
图3中显示了将加热致死的C.jejuni细菌从25×106个细菌/ml(最高峰)按十倍系列稀释到2.5个细菌/ml，然后再到0个细菌/ml(最低峰)后各稀释样品发出的一系列荧光发射谱，其中使用Cary-Varian荧光分光光度计测定并使用直接置于图中所示的各种食物基质中的未经洗涤步骤的一步塑料-粘附适体-磁珠-红量子点(Q-点655nm)夹心分析物。图中箭头表示细菌浓度降低的方向。本文中一般是使用荧光度报告法来描述本发明的分析物，这种方法是一种测定荧光亮度的简单方法，用于检测和定量分析检测成分-适体结合体。不过，这种荧光度报告法也可以用时间分辨荧光分析法、化学发光法、电子检测法、电化学检测法、电化学发光法、磷光分析法或发射性同位素检测法替代。
图4中显示了能检测到鸡汁(从新鲜的杂货店鸡制品上收集的血液和脂肪液滴)中10个C.jejuni活细菌的典型一步分析物。使用Turner Biosystems公司的手持荧光光度计的绿通道测定，每个数据点取5个独立的读数。误差棒表示这5个读数的标准偏差，由于它们的数值非常小，所以肉眼几乎不可见。
如图3和图4所示，不需洗涤步骤，即可直接对各种食物、环境或体液基质进行检测。
实施例1
各种食物基质中空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的一步免洗超灵敏检测
本发明用于检测如图2-4所示的纯缓冲液和各种食物基质中所含的像2个那么少的C.jejuni活菌或死菌细胞(常见的食源性致病菌)。这些分析物中，有两个不同的C.jejuni序列(用C2和C3或SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3表示)，在固相DNA合成时，这些序列的2’-氨基被修饰，然后与每个试验的结合量即1,000个甲苯磺酰基-M280(直径2.8μm)Dynal(Invitrogen公司)磁珠或0.24pL Q-点655ITK试剂(Invitrogen公司)结合。C2适体(SEQ ID 2)在甲苯磺酰基-磁珠表面上用于捕获，C3适体(SEQ ID NO.3)通过BS3(从Pierce Chemical公司得到的双-辛二酸盐双功能连接剂)与Q-点655ITK试剂结合后，用作报告试剂。这些试剂经纯化、混合后，在塑料管内冻干。粉末状分析物再用氮气回吹，盖上盖密封。这些粘附的一步夹心分析物经复水后用于检测活的或死的(加热致死)C.jejuni细胞，得到图2-4所示的高度灵敏的检测结果。空肠弯曲杆菌分析物中，从SEQ ID NOs.1-6中选择的用于捕获和报告功能的其他适体能被替换，但检测灵敏度多少有些降低。
实施例2
各种食物基质中大肠杆菌O157:H7(Escherichia Coli O157:H7)和其他产毒素(志贺毒素或vero毒素)E.Coli的一步免洗超灵敏检测
通过适体与O157脂多糖(LPS)的外糖和H7鞭毛抗原结合，本发明能用于检测各种食物内或食物表面的肠出血性E.coli O157:H7。可以选用来自SEQ ID NOs.7-20的适体序列，用于捕获(适体-磁珠结合体)或报告(适体-荧光团结合体)功能，并用于检测食物内或食物上的E.coli O157:H7。或者，许多E.coli共有的外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)也可用于E.coli细菌细胞的适体-磁珠捕获(或鉴定)，然后再用LPS-特异性适体-量子点报告试剂对E.coli菌株或血清型进行特异性鉴定。适体SEQ ID NOs.279-322可用作E.coli OMP识别和捕获。在另一实施例中，通过分泌的志贺毒素或vero毒素(1型和2型或Stx-1和Stx-2)，可以灵敏的鉴定出非O157:H7产毒素E.coli细菌。包括O126在内的许多其他E.coli菌株能引发使人致命的疾病，这些致死菌都有一共同点，那就是它们都分泌Stx。所以，本发明的一个很有用的实施例就是使用由SEQ ID NOs.323-352鉴定出的任一DNA适体序列检测Stx-1和/或Stx-2。
实施例3
各种食物基质中单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogens)的一步免洗超灵敏检测
通过与李斯特菌素(listerolysin，LO)表面蛋白结合，本发明能用于检测各种食物内或食物表面的致命菌L.monocytogens。可以选用来自SEQ ID NOs.21-52的适体序列，用于捕获(适体-磁珠结合体)或报告(适体-荧光团结合体)功能，并用于检测食物内或食物上的LO和L.monocytogens。
实施例4
各种食物基质中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的一步免洗超灵敏检测
本发明能用于检测各种食物内和食物上的S.typhimurium和沙门氏菌的其他菌种(S.typhi等)。虽然S.typhimurium已重新命名为Salmonell enterica servovar Typhimurium，但许多生物学家仍然称这种微生物为S.typhimurium。可以选用来自SEQ ID NOs.53-68的适体序列，用于捕获(适体-磁珠结合体)或报告(适体-荧光团结合体)功能，并用于检测食物内或食物上的S.typhimurium LPS菌。另外，适体SEQ ID NOs.353-392可用于S.typhimurium的OMPs的捕获或鉴别。这些S.typhimurium的DNA适体序列有其独特性，与Joshi等人(2008)最近报道的序列不相似。
实施例5
水中粪便污染物的检测
通过使用靶向LPS共有核心成分的DNA SEQ ID NOs.69-122发挥捕获和报告功能，本发明能用于检测各种再生的污水处理水和饮用水中所有种类的E.coli细菌。通过使用靶向共同的磷壁酸部分的DNA SEQ ID NOs.123-130发挥捕获和报告功能，本发明能用于检测各种再生的污水处理水和饮用水中所有的肠球菌(另一种常见的粪便指示生物)。
实施例6
皮肤伤口或内脏液中利什曼原虫的检测
通过使用靶向利什曼原虫共有的表面蛋白的DNA SEQ IDNOs.131-134发挥捕获和报告功能，本发明能用于检测皮肤伤口或体液和其他样品中的杜氏利什曼原虫和热带利什曼原虫。
实施例7
血液和体液中形成荚膜的炭疽杆菌营养体的检测
通过使用靶向表面的聚-D-谷氨酸荚膜材料的DNA SEQ IDNOs.135-138发挥捕获和报告功能，本发明能用于检测血液和体液中形成荚膜的炭疽杆菌营养体。
实施例8
环境和临床样品中小分子(小于1,000道尔顿)的检测
如果小于1,000道尔顿的目标小分子具有两个不同且可靠近的表位供构成夹心分析物形式的捕获和报告适体结合，则本发明具有检测这类小分子的前景。这类小分子目标物包括环境水、土壤或泥样以及血液和体液及其他样品中的有机磷杀虫剂(如二嗪磷和马拉硫磷)。使用靶向杀虫剂分子不同末端的选自DNA SEQ ID NOs.139-154的适体DNA序列发挥捕获和报告功能。另外，维生素如25-羟基维生素D3(骨化二醇；SEQ ID NOs.243-274)、神经递质乙酰胆碱(ACh；SEQ ID NOs.393-416)可能成为本发明这一新型粘附分析物形式的可行目标物。
实施例9
口足病(FMD)及相关病毒的检测
通过使用靶向FMD的几种O血清型的16个氨基酸保守肽的选自SEQ ID NOs.155-164的适体DNA发挥捕获和报告功能，本发明能用于检测口足病(FMD)及相关病毒。
实施例10
血液和体液中骨吸收或合成标志物的检测
通过使用靶向每种骨标志物上独特表位的选自DNA SEQ IDNOs.165-242的适体DNA序列来发挥捕获和报告功能，本发明能用于检测血液、尿液和其他体液和其他样品中因长期太空飞行期间低重力效应或骨质疏松和衰老导致的骨丢失标记物，如组织蛋白酶K、胶原C末端肽(CTx)和胶原N末端肽(NTx)、羟基赖氨酸(HL)、骨钙素片段(OCF)。通过选自DNA SEQ ID NOs.243-274来发挥捕获和报告功能，本发明还能用于检测和区分与骨形成有关的各种维生素D异构体。
实施例11
肉毒素A及相关生物毒素的检测
通过使用粘附夹心形式的适体DNA序列，本发明能用于检测血液和体液和其他样品中影响人和动物健康的肉毒梭菌(血清型A-F)毒素及相关的细菌毒素、赤潮(有害藻华)(HAB，沟鞭藻类)毒素、海洋生物(贝类)毒素或植物毒素，如破伤风毒素、霍乱毒素和白喉毒素、志贺毒素和vero毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素、微囊藻毒素、裸藻毒、雪卡毒素、膝沟藻毒素、软骨藻酸异构体、刺尾鱼毒素、岩沙海葵毒素、扇贝毒素、石房蛤毒素、蓖麻毒素、截短型细胞毒素、相思豆毒素、蜘蛛毒和蛇毒等。尤其是选自DNA SEQ ID NOs.275-278的适体序列能用于A型肉毒素轻链或海参毒素。
实施例12
细菌感染物中群体感应分子的检测
已经发现，许多细菌通过分泌小分子进行交流。许多革兰氏阴性致病菌在细胞或“群体”达到能有效感染宿主生物的关键浓度时，常使用酰基高丝氨酸内酯(AHLs)小分子家族在细菌细胞间交流感应。AHLs控制对疾病发生和毒力因子的诱导，如控制粘附蛋白和毒素的表达。所以，AHLs的早期感应行为说明可能即将出现革兰氏阴性细菌感染，有可能提示医生使用合适的抗生素加以治疗，防止出现感染或更严重的败血症。AHLs都含有两个不同末端或潜在的表位，所以是颇具潜力的用作本文所述的一步塑料-粘附DNA适体-磁珠-适体-量子点或其他适体-报告物夹心分析物的候选分子。DNA SEQ ID NOs.417-426表示了可能的靶向革兰氏阳性菌AHLs分子家族并与其反应以用于诊断的适体DNA。
虽然这里结合具体实施例对本发明做了介绍，但是本说明书不是要对本发明作出限制。文本所述实施例的各种改动以及备选实施例对看完本发明说明后的所述领域的技术人员来说都是显而易见的。所以，所附权利要求欲涵盖落在本发明范围内的这些改动形式。备选实施例可能包括但不限于：改变报告方法，包括不使用荧光检测，而改用化学发光检测、电子检测、电化学检测、电化学发光检测、磷光检测和放射性同位素检测。
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Claims (13)

1.一种夹心分析方法，该方法通过制备和组装用于捕获和检测溶液体中目标检测成分的DNA或RNA适体-磁珠结合体来进行，其包括：
将所述溶液体与装在一器皿内的适体-磁珠结合体和适体-荧光团结合体混合，其中，所述适体-MB能与所述目标检测成分的第一结合位点结合，所述适体-荧光团结合体能与所述目标检测成分的第二结合位点结合，从而形成检测成分-适体-荧光团复合物，其中，所述器皿具有透明的表面区域以便进行荧光分析；
让所述适体-MB与所述目标检测成分的第一结合位点结合，让所述适体-荧光团结合体与所述目标检测成分的第二结合位点结合，以形成所述检测成分-适体-荧光团复合物；
通过施加一外部磁场以吸引所述磁珠的方式使所述检测成分-荧光团复合物粘附到所述器皿的透明表面区域上；以及
对粘附到所述器皿透明表面区域上的所述检测成分-适体-荧光团复合物进行分析。
2.权利要求1的方法，其中，所述方法不包括洗涤步骤。
3.权利要求1的方法，其中，所述检测成分-适体-荧光团复合物从所述溶液体中被有效隔离出来以增强检测性。
4.权利要求1的方法，其中，所述器皿由聚苯乙烯、透明塑料或玻璃制成。
5.权利要求4的方法，其中，供所述检测成分-适体-荧光团复合物粘附其上的所述器皿透明表面区域形成为正方形、矩形、圆形、椭圆形或平面形的容器、样品瓶、管、柱形筒、匣或盒。
6.权利要求1的方法，其中，在所述溶液体中所述适体-磁珠和所述适体-荧光团彼此间不发生结合、不形成碱基对或不发生杂交。
7.权利要求1的方法，其中，所述适体-荧光团结合体中的荧光团是量子点、荧光或磷光纳米粒子、荧光乳胶粒子或微珠、荧光染料分子包括荧光素、羧基荧光素和荧光素衍生物，或罗丹明或其衍生物。
8.权利要求1的方法，其中，所述荧光团是荧光共振能量转移复合物如链内或竞争性荧光共振能量转移复合物-适体。
9.权利要求1的方法，其中，所述分析步骤是要检测并定量分析所述溶液体中的目标检测成分的夹心分析方法。
10.权利要求1的方法，其中，所述目标检测成分是完整细胞如细菌、寄生虫、白细胞或癌细胞。
11.权利要求1的方法，其中，所述目标检测成分是病毒衣壳蛋白，病毒聚合酶，生物毒素如细菌毒素，如肉毒素、霍乱毒素、破伤风毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素、志贺毒素或vero毒素，藻类毒素如裸藻毒素、雪卡毒素、微囊藻毒素，或石房蛤毒素，蛇毒或蜘蛛毒，临床相关蛋白或蛋白组成部分(肽)如骨标志物(例如：胶原降解肽如CTx、NTx、OCF、组织蛋白酶K或其前体组织蛋白酶K酶原、脱氧吡啶啉、吡啶啉、赖氨酰吡啶啉或羟赖氨酰吡啶啉)，细胞因子和白细胞介素，心肌梗死标志物(肌钙蛋白、肌球蛋白等)，肾病，抗体，自身免疫性疾病，关节炎，或其他临床相关大分子如脂多糖(LPS，内毒素)。
12.权利要求1的方法，其中，所述目标检测成分包括具有至少两个不同表位的小分子(小于1,000道尔顿的分子)，其选自：杀虫剂，天然氨基酸和合成氨基酸及其衍生物，羟赖氨酸、羟脯氨酸、组氨酸、组胺、同型半胱氨酸、DOPA、褪黑素，硝基酪氨酸，短链蛋白水解产物，尸胺、腐胺、聚胺、精胺、亚精胺、脱氧吡啶啉、吡啶啉、赖氨酰基吡啶啉或羟赖氨酰基吡啶啉，DNA或RNA的N碱基，核苷，核苷酸，核酸环形同型异构体，cAMP、cGMP，细胞代谢物：尿素、尿酸，药物：治疗剂、维生素，违禁药品，麻醉药品、致幻剂、γ-羟基丁酸盐，细胞介导因子，细胞因子、趋化因子、免疫调节因子、神经调节因子，神经递质如乙酰胆碱，炎性调节因子，前列腺素、前列腺素代谢物、硝基芳烃和硝胺炸药，炸药分解产物(如DNT)或副产物，群体感应分子如AHLs、类固醇、激素，及其衍生物。
13.权利要求1的方法，其中，所述目标检测成分的分析步骤按以下一种方式操作：荧光强度法、时间分辨荧光分析法、化学发光检测法、电子检测法、电化学检测法、电化学发光检测法、磷光检测法或放射性同位素检测法。
CN200980113138XA 2008-02-21 2009-02-18 制备均质塑料-粘附适体-磁珠-荧光团和其他夹心分析物的方法 Pending CN102165071A (zh)

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