CN109642234A - 基于适配体的分析物测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含一级和二级适配体的捕获和/或检测分析物的基于适配体的测定法，以及包含此类一级和二级适配体的组合物，其中分析物包含小分子，其为抗体提供有限的相互非竞争性表位，换言之，在使用一级和二级抗体或一级和二级适配体的非竞争性夹心测定中测量的能力有限。
Description
优先权要求
本专利申请要求均在2016年6月3日提交的美国临时申请62/345,641和62/345,697以及在2016年6月6日提交的美国临时申请号62/346,374的优先权，所述申请各自的内容均在此以其整体通过引用并入本文。
拨款信息
本发明在由国立卫生研究院授予的拨款号RGM104960和由国家科学基金会授予的拨款号CCF1518715下的政府支持下进行。政府在本发明中具有某些权利。
1.引言
本发明涉及基于适配体的测定以捕获和/或检测分析物，包括向抗体提供有限的相互非竞争性表位的小分子，且因此难以使用传统的抗体夹心型测定法检测或测量。
2.发明背景
非竞争性夹心测定采用两种不同的结合元件来捕获然后检测分析物1-5。例如，夹心测定形式的典型实例是平板上的酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中针对靶分析物(例如，蛋白质)的一种抗体(捕获抗体)与固体支持物(例如，板)结合，分析物被结合，然后引入携带可检测部分的第二抗体(“检测抗体”)，其与捕获的分析物上的不同位点结合。因为在分析物上通常存在替代结合位点，所以在过量试剂存在的情况下，这些测定可以比竞争性测定更灵敏，检测具有渐增信号的配体，并且具有更低的噪音。夹心原理还允许更严格的洗涤方案，其使非特异性相互作用最小化。与靶分析物相互作用的两种或更多种结合元件的原理(即，“夹心化”)也用于除了ELISA以外的其他测定，诸如侧向流测定或胶乳-珠粒凝集测定。
夹心方法对于小的分析物变得有问题，所述小分析物可能太小而不能一次与两个抗体结合(例如，类固醇或儿茶酚胺或甚至一些小肽诸如血管加压素)或者是非免疫原性(例如，分子诸如苯丙氨酸或葡萄糖)。当可以获得针对小分子的抗体时，几种特殊方法6-9已经产生针对小分子的ELISA样测定。
适配体是基于寡核苷酸的受体，其可以与小分子结合9-15。适配体先前已经用于传统的夹心测定中，然而，传统的夹心测定取决于分析物中多于一个结合位点的可用性。因此，需要用于检测小分子的方法，其克服由于缺乏多个表位而引起的问题。
3.发明概述
本发明涉及基于适配体的测定法，所述方法用于捕获和检测可能不适于基于抗体的测定法的分析物。提供了三种不同的示例性测定法，以及各种包含核心序列和操作序列的适配体，其中所述操作序列可以根据待使用的测定法而不同。
第一组实施方案提供了“抗适配体测定法”，其中使待测试目标分析物的存在和/或量的样品与有效量的以下物质接触：(1)包含与分析物结合的核心序列的一级适配体，和(2)与一级适配体的至少一部分互补的“抗适配体”，其中所述一级适配体和/或抗适配体包含可检测部分，所述可检测部分检测所述一级适配体和抗适配体是否与彼此结合；且其中与所述分析物结合的一级适配体不结合抗适配体。所述分析物与抗适配体竞争结合一级适配体，使得结合(或未结合的)抗适配体的量与存在的分析物的量相关。
第二组实施方案提供了“假夹心测定法”，其中使待测试目标分析物的存在和/或量的样品与有效量的以下物质接触：(1)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列以及与结构转换“传感器寡核苷酸”互补的至少一部分；(2)传感器寡核苷酸，其任选地与固体支持物结合，其任选地进一步包含与“comp”(代表“互补”)寡核苷酸互补的部分；其中所述一级适配体和/或传感器寡核苷酸和/或comp寡核苷酸包含可检测部分，所述可检测部分可以检测所述一级适配体和传感器寡核苷酸是否与彼此结合；且其中所述一级适配体和传感器寡核苷酸形成部分双链螺旋，当所述一级适配体与分析物结合时，所述部分双链螺旋可检测地解离或不形成。例如，可以将测试样品添加至有效量的由一级适配体和传感器寡核苷酸和comp寡核苷酸构成的复合物中；从所述复合物释放的一级适配体的量与所述测试样品中的分析物的量相关(并且所述comp和所述传感器寡核苷酸形成至少部分双链结构)。作为一个进一步实例，且不通过限制的方式，可以将所述复合物连接至固体支持物，应用测试样品，然后可以检测释放的一级适配体。作为一个更具体非限制性实例，所述传感器寡核苷酸可以与固体支持物连接并与一级适配体复合，然后可以使所得复合物与测试样品接触，且检测释放的一级适配体的量，例如，洗掉支持物。
第三组实施方案提供了“夹心测定法”，其中使待测试目标分析物的存在和/或量的样品与有效量的以下物质接触：(1)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列以及当其与分析物结合时结合二级适配体的至少一部分；和(ii)夹心适配体(在本文中也称为“二级适配体”)，其结合一级适配体，条件是所述一级适配体与分析物结合以形成三元复合物(“夹心”)；其中所述一级适配体和/或夹心适配体包含可检测部分，所述可检测部分可以检测所述一级适配体和夹心寡核苷酸是否与彼此结合。例如，可以将测试样品添加至有效量的一级适配体和夹心适配体中，然后可以检测一级适配体/夹心适配体复合物的量，或未结合的一级适配体或夹心适配体的量。
本文还提供了共有核心序列、核心序列和一级适配体，其可以结合目标一级适配体，包括葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵离子、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
进一步提供了相关的抗适配体、传感器、comp和夹心适配体/寡核苷酸。
进一步实施方案提供了包含前述一级适配体和/或寡核苷酸的试剂盒。
4.附图简述
图1A-G.一级适配体(短形式)和相应的靶分析物的结构。(A)一级适配体(SEQ IDNO:62，SEQ ID NO:12的子序列)及其靶分析物，脱氧皮质酮21-葡糖苷(“DOG”)；(B)一级适配体(SEQ ID NO:63)及其靶分析物，醛固酮(“ALDS”)；(C)一级适配体(SEQ ID NO:64，SEQID NO:5的子序列)及其靶分析物，可的松(“CS”)；(D)一级适配体(SEQ ID NO:65，SEQ IDNO:13的子序列)及其靶分析物，睾酮(“TES”)；(E)一级适配体(SEQ ID NO:66)及其靶分析物，Phe-CpRh；(F)一级适配体(SEQ ID NO:67)及其靶分析物，L-苯丙氨酸；(G)一级适配体(SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:1的子序列)及其靶分析物，葡萄糖。
图2A-C.“抗适配体测定”的设计原理。(A)有效量的用荧光标记物(例如，F＝荧光素)标记的一级适配体(”适配体“)及其用猝灭剂(例如，D＝dabcyl猝灭剂)标记的“互补”寡核苷酸(也称为“抗适配体”)可以杂交以形成双链体。在双链体形成后，适配体上的标记物的荧光被猝灭。(B)在靶分析物存在的情况下，一级适配体与分析物、而不是其互补抗适配体结合，并且其标记物的荧光不被猝灭。(C)显示荧光随着未加热样品、但不是加热样品中的靶分析物DOG浓度增加而增加(因为加热干扰分析物/适配体结合)。
图3A-L.使用“短形式”一级适配体的各种靶分析物的抗适配体测定的结果的实例。(A)与荧光标记物(例如，F＝荧光素)连接的针对脱氧皮质酮21-葡糖苷(“DOG”)的一级适配体(SEQ ID NO:62)及其用猝灭剂(例如D＝dabcyl猝灭剂)标记的互补抗适配体(SEQID NO:69)可以杂交以形成双链体(由SEQ ID NO:70示意性表示)；在DOG存在的情况下形成更少的双链体，并且荧光信号增加。(B)将1:1比率的(A)的一级适配体和抗适配体与0至100μM的递增浓度的DOG合并。该图显示随着时间的荧光。(C)与荧光标记物(例如，F＝荧光素)连接的针对醛固酮(“ALDS”)的一级适配体(SEQ ID NO:63)及其用猝灭剂(例如D＝dabcyl猝灭剂)标记的互补抗适配体可以杂交以形成双链体(由SEQ ID NO:71示意性表示)；在ALDS存在的情况下形成更少的双链体，并且荧光信号增加。(D)将1:1比率的(C)的一级适配体和抗适配体与0至100μM的递增浓度的ALDS合并。该图显示随着时间的荧光。(E)与荧光标记物(例如，F＝荧光素)连接的针对皮质醇(“CS”)的一级适配体(SEQ ID NO:64)及其用猝灭剂(例如D＝dabcyl猝灭剂)标记的互补抗适配体可以杂交以形成双链体(由SEQ ID NO:72示意性表示)；在CS存在的情况下形成更少的双链体，并且荧光信号增加。(F)将1:10比率的(E)的一级适配体和抗适配体与0至125μM的递增浓度的CS合并。该图显示随着时间的荧光。(G)与荧光标记物(例如，F＝荧光素)连接的针对睾酮(“TES”)的一级适配体(SEQ IDNO:65)及其用猝灭剂(例如D＝dabcyl猝灭剂)标记的互补抗适配体可以杂交以形成双链体(由SEQ ID NO:73示意性表示)；在TES存在的情况下形成更少的双链体，并且荧光信号增加。(H)将1:1比率的(G)的一级适配体和抗适配体与0至100μM的递增浓度的TES合并。该图显示随着时间的荧光。(I)与荧光标记物(例如，F＝荧光素)连接的针对Phe-CpRh的一级适配体(SEQ ID NO:66)及其用猝灭剂(例如D＝dabcyl猝灭剂)标记的互补抗适配体可以杂交以形成双链体(由SEQ ID NO:74示意性表示)；在DOG存在的情况下形成更少的双链体，并且荧光信号增加。(J)将1:1比率的(I)的一级适配体和抗适配体与0至100μM的递增浓度的Phe-CpRh合并。该图显示随着时间的荧光。(K)与荧光标记物(例如，F＝荧光素)连接的针对苯丙氨酸(“Phe”)的一级适配体(SEQ ID NO:67)及其用猝灭剂(例如D＝dabcyl猝灭剂)标记的互补抗适配体可以杂交以形成双链体(由SEQ ID NO:75示意性表示)；在Phe存在的情况下形成更少的双链体，并且荧光信号增加。(L)将1:1比率的(K)的一级适配体和抗适配体与0至2mM的递增浓度的Phe合并。该图显示随着时间的荧光。这些结果表明对适配体和抗适配体链的杂交的靶分析物-浓度依赖性影响。
图4A-C.适配体/抗适配体(短形式)产生基于板的测定形式。信号来自TMB和HRP标记的抗适配体互补序列之间的反应。(A)DOG:抗适配体包被的板暴露于1μM DOG-适配体和DOG靶标的溶液30分钟。(B)葡萄糖：将2μM葡萄糖-适配体和葡萄糖靶标的溶液暴露于0.2μM抗适配体10分钟，然后“下拉”至链霉抗生物素蛋白包被的板上。(C)苯丙氨酸：将1μM Phe-适配体和苯丙氨酸靶标的溶液暴露于0.2μM抗适配体5分钟，然后“下拉”至链霉抗生物素蛋白包被的板上。
图5A-F.使用“长形式”一级适配体的各种靶分析物的抗适配体测定的结果的实例。(A)与荧光标记物(例如，FAM＝荧光素)连接的针对脱氧皮质酮21-葡糖苷(“DOG”)的一级适配体的长形式(SEQ ID NO:66，其包含SEQ ID NO:62和12)及其用猝灭剂(例如，QFBkA13猝灭剂)标记的互补抗适配体(SEQ ID NO:69)可以杂交以形成双链体(B；SEQ IDNO:78)。(C)在各种浓度的靶标存在的情况下混合适配体和抗适配体之后随着时间的荧光信号。这些结果表明对适配体和抗适配体链的杂交的靶标-浓度依赖性影响。(D)与荧光标记物(例如，FAM＝荧光素)连接的针对醛固酮(“ALDS”)的一级适配体的长形式(SEQ ID NO:79，其包含SEQ ID NO:63)及其用猝灭剂(例如，QFBkA13(“Iowa Black”；Integrated DNATechnologies)猝灭剂)标记的互补抗适配体(SEQ ID NO:80)可以杂交以形成双链体(E；SEQ ID NO:81)。(F)在各种浓度的靶标存在的情况下混合适配体和抗适配体之后随着时间的荧光信号。这些结果表明对适配体和抗适配体链的杂交的靶标-浓度依赖性影响。
图6A-C.假夹心测定的设计原则。(A)与其配体(L)复合的一级适配体(AP)。(B)延长AP(AP ext)并添加互补寡核苷酸(CD)以获得结构转换传感器(此处显示于设置中以实现荧光信号传导；F＝荧光素和D＝dabcyl猝灭剂)。这是平衡过程，并且系统，如果附接至表面以实现ELISA样形式，则不能在不除去组分的情况下洗涤。(C)假夹心测定法克服了这些问题并将平衡反应转化为稳定的双螺旋结构。为了实现这一点，将CD扩展为CDext，然后CDext comp用于建立不同的平衡。如果将CDext附接至表面(一种可能的实施方式，在另一种实施方式中，CDext comp附接至表面)，在配体结合后，CDext和CDext comp形成稳定的双螺旋复合物，如果在表面形成，则可以将稳定的双螺旋复合物充分洗涤。
图7.一级适配体的选择。在描绘的溶液相选择的图示性表示中，寡核苷酸文库(NM，其中随机化区域M具有8至100个核苷酸，其侧接恒定区，即用于PCR扩增的引物，其中N可以是A、T、G或C中任一个)经由生物素化的互补寡核苷酸(CB)与琼脂糖-链霉抗生物素蛋白柱附接。暴露于靶标(蓝色形状；红色形状是通过消除交叉反应性确保特异性的反靶标，导致其中稳定茎(S)的受体的洗脱，然后扩增这些序列。
图8A-C.小分子的夹心测定的设计原则和二级“夹心”适配体的概念。(A)与其L复合的AP。(B)仅当AP与L复合时，二级“夹心”适配体(AS)与AP结合以形成三元复合物。(C)如果AP附接至表面，AS将其自身附接至AP与其L的复合物，因此形成夹心。
图9A-B.二级“夹心”适配体的选择。(A)固态选择：将靶适配体(Ap)附接至基质(例如，珠粒)，在L存在的情况下与文库(例如，结构化N40，其中部分自互补引物形成茎；替代物是非结构化的NM)一起孵育以对AP*L复合物具有亲和力的适配体候选物。将这些寡核苷酸PCR-扩增，再生单链种类，然后用于下一选择循环中。重复该过程，直至达到收敛，将合并物克隆和测序，得到AS候选物。通过在L不存在的情况下消除针对AP的结合剂来进行反选择。(B)溶液相中的过程使用经由互补寡核苷酸附接至基质的预结构化的文库，并且选择AS候选物，因为它们的环通过与AP的结合而闭合并且它们从固体表面释放。在该情况下，反选择是针对没有配体的AP和配体本身。
图10A-C.如用于假夹心测定法中的针对葡萄糖的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:82)结合的一级适配体(SEQ ID NO:1)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:83)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图11A-C.如用于假夹心测定法中的针对苯丙氨酸的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:84)结合的一级适配体(SEQ ID NO:2)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:85)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图12A-C.如用于假夹心测定法中的针对苯丙氨酸的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:86)结合的一级适配体(SEQ ID NO:3)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:87)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图13A-C.如用于假夹心测定法中的针对苯丙氨酸的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:88)结合的一级适配体(SEQ ID NO:4)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:89)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图14A-C.如用于假夹心测定法中的针对氢化可的松的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:90)结合的一级适配体(SEQ ID NO:5)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:91)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图15A-C.如用于假夹心测定法中的针对氢化可的松的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:92)结合的一级适配体(SEQ ID NO:6)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:93)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图16A-C.如用于假夹心测定法中的针对氢化可的松的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:94)结合的一级适配体(SEQ ID NO:7)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:95)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图17A-C.如用于假夹心测定法中的针对脱氢异雄甾酮和脱氧皮质酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:96)结合的一级适配体(SEQ ID NO:8)；发夹的最左边链是5’末端。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:97)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图18A-C.如用于假夹心测定法中的针对脱氢异雄甾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:98)结合的一级适配体(SEQ ID NO:9)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:99)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图19A-C.如用于假夹心测定法中的针对脱氢异雄甾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:100)结合的一级适配体(SEQ ID NO:10)。(B)核心/口袋(SEQ IDNO:101)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图20A-C.如用于假夹心测定法中的针对脱氢异雄甾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:102)结合的一级适配体(SEQ ID NO:11)。(B)核心/口袋(SEQ IDNO:103)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图21A-C.如用于假夹心测定法中的针对脱氧皮质酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:104)结合的一级适配体(SEQ ID NO:12)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:105)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图22A-C.如用于假夹心测定法中的针对睾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:106)结合的一级适配体(SEQ ID NO:13)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:107)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图23A-C.如用于假夹心测定法中的针对睾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:108)结合的一级适配体(SEQ ID NO:14)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:109)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图24A-C.如用于假夹心测定法中的针对睾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:110)结合的一级适配体(SEQ ID NO:15)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:111)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图25A-C.如用于假夹心测定法中的针对睾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:112)结合的一级适配体(SEQ ID NO:16)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:113)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图26A-C.如用于假夹心测定法中的针对睾酮的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:114)结合的一级适配体(SEQ ID NO:17)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:115)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图27A-C.如用于假夹心测定法中的针对鞘氨醇-1-磷酸(d18:1)的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:116)结合的一级适配体(SEQ ID NO:18)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:117)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图28A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:118)结合的一级适配体(SEQ ID NO:19)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:119)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图29A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:120)结合的一级适配体(SEQ ID NO:20)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:121)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图30A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:122)结合的一级适配体(SEQ ID NO:21)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:123)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图30A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:122)结合的一级适配体(SEQ ID NO:21)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:123)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图31A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:124)结合的一级适配体(SEQ ID NO:22)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:125)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图32A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:126)结合的一级适配体(SEQ ID NO:23)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:127)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图33A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:128)结合的一级适配体(SEQ ID NO:24)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:129)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图34A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:130)结合的一级适配体(SEQ ID NO:25)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:131)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图35A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:132)结合的一级适配体(SEQ ID NO:26)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:133)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图36A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:134)结合的一级适配体(SEQ ID NO:27)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:135)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图37A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:136)结合的一级适配体(SEQ IDNO:28)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:137)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图38A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:138)结合的一级适配体(SEQ ID NO:29)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:139)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图39A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:140)结合的一级适配体(SEQ ID NO:30)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:141)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图40A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:142)结合的一级适配体(SEQ ID NO:31)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:143)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图41A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:144)结合的一级适配体(SEQ ID NO:32)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:145)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图42A-C.如用于假夹心测定法中的针对多巴胺的一级适配体。(A)与传感器寡核苷酸(SEQ ID NO:146)结合的一级适配体(SEQ ID NO:33)。(B)核心/口袋(SEQ ID NO:147)；发夹的最左边链是5’末端。(C)剂量/荧光响应曲线。
图43A-B.如用于假夹心测定法中的针对脱氧皮质酮的一级适配体。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体对于脱氧皮质酮具有约30nM的结合亲和力(解离常数，Kd)(在室温或25℃下在水溶液中)。
图44A-B.如用于假夹心测定法中的针对皮质醇的一级适配体。在某些非限制性实施方案中，结合皮质醇的一级适配体对于皮质醇具有约30nM的结合亲和力(解离常数，Kd)(在室温或25℃下在水溶液中)。
图45A-B.如用于假夹心测定法中的针对血清素的一级适配体。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体对于血清素具有约25nM的结合亲和力(解离常数，Kd)(在室温或25℃下在水溶液中)。
图46A-B.如用于假夹心测定法中的针对葡萄糖的一级适配体。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体对于葡萄糖具有约8nM的结合亲和力(解离常数，Kd)(在室温或25℃下在水溶液中)且与葡萄糖(相比于半乳糖)选择性结合。
图47A-F.如在溶液中和在板上所实施的假夹心测定法的实例。(A)溶液中的假夹心测定法的实例。参与假夹心测定法的序列，AP是针对脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)的一级适配体(显示用荧光素标记)(SEQ ID NO:12；(SEQ ID NO:150)。Cext是延伸的竞争剂(用猝灭剂Q标记)，而Cext comp是形成稳定双螺旋的互补寡核苷酸。剂量-荧光响应曲线显示Cext和Cext comp之间双螺旋的形成和荧光标记的适配体的释放(图6B；在这种情况下，Cext用猝灭剂Q标记，且AP用荧光素F标记)。(B)溶液中的假夹心测定法的实例。参与假夹心测定法的序列，Ap是针对L-苯丙氨酸的一级适配体(显示用荧光素标记)(SEQ ID NO:2；(SEQ ID NO:151)。Cext是延伸的竞争剂(用猝灭剂Q标记)，而Cext comp是形成稳定双螺旋的互补寡核苷酸。剂量-荧光响应曲线显示Cext和Cext comp之间双螺旋的形成和荧光标记的适配体的释放(图6B；在这种情况下，Cext用猝灭剂Q标记，且AP用荧光素F标记)。(C)溶液中的假夹心测定法的实例。参与假夹心测定法的序列，Ap是针对D-葡萄糖的一级适配体(显示用荧光素标记)(SEQ IDNO:1；(SEQ ID NO:152)。Cext是延伸的竞争剂(用猝灭剂Q标记)，而Cext comp是形成稳定双螺旋的互补寡核苷酸。剂量-荧光响应曲线显示Cext和Cext comp之间双螺旋的形成和荧光标记的适配体的释放(图6B；在这种情况下，Cext用猝灭剂Q标记，且AP用荧光素F标记)。(D)溶液中的假夹心测定法的实例。参与假夹心测定法的序列，Ap是针对L-酪氨酸的一级适配体(显示用荧光素标记)(SEQ ID NO:33；(SEQ ID NO:153)。Cext是延伸的竞争剂(用猝灭剂Q标记)，而Cext comp是形成稳定双螺旋的互补寡核苷酸。剂量-荧光响应曲线显示Cext和Cext comp之间双螺旋的形成和荧光标记的适配体的释放(图6B；在这种情况下，Cext用猝灭剂Q标记，且AP用荧光素F标记)。(E)假夹心测定板的实例。如板上的测定中所用的序列(SEQ ID NO:12；(SEQID NO:154)；序列与图47A中相同，但夹心适于在板上形成(辣根过氧化物酶-链霉抗生物素蛋白缀合物(HRP-STV)用于放大夹心)。剂量-颜色强度响应表明在板表面上配体-剂量-依赖性夹心形成。(F)假夹心测定板的实例。如板上的测定中所用的序列(SEQ ID NO:2；(SEQID NO:155)；序列与图47B中相同，但夹心适于在板上形成(辣根过氧化物酶-链霉抗生物素蛋白缀合物(HRP-STV)用于放大夹心)。剂量-颜色强度响应表明在板表面上配体-剂量-依赖性夹心形成。
图48A-E.二级适配体的实例和在溶液中和在板上的夹心测定的实例。(A)二级适配体和溶液中的测定法的实例。脱氧皮质酮作为靶向的分子，其用于与一级适配体形成复合物。如用于选择二级适配体(SEQ ID NO:62；衍生自SEQ ID NO:12)的一级适配体(AP)的假定的二级结构。结合所述结构(SEQ ID NO:34)的二级适配体(AS)的假定的二级结构。对渐增量的靶标的剂量-荧光响应曲线显示为红色曲线，而蓝色是其中消除一级适配体的对照。为了该测定的目的，二级适配体用荧光素标记，并向其中添加具有猝灭剂的Cext。(B)二级适配体和溶液中的测定法的实例。脱氧皮质酮作为靶向的分子，其用于与一级适配体形成复合物。如用于选择二级适配体(SEQ ID NO:62；衍生自SEQ ID NO:12)的一级适配体(AP)的假定的二级结构。结合所述结构(SEQ ID NO:35)的二级适配体(AS)的假定的二级结构。对渐增量的靶标的剂量-荧光响应曲线显示为红色曲线，而蓝色是其中消除一级适配体的对照。为了该测定的目的，二级适配体用荧光素标记，并向其中添加具有猝灭剂的Cext。(C)二级适配体和溶液中的测定法的实例。血清素作为靶向的分子，其用于与一级适配体形成复合物。如用于选择二级适配体(SEQ ID NO:58；衍生自SEQ ID NO:25)的一级适配体(AP)的假定的二级结构。结合所述结构(SEQ ID NO:59)的二级适配体(AS)的假定的二级结构。针对渐增量的靶标的剂量-荧光响应曲线显示为红色曲线，而蓝色是其中消除一级适配体的对照。为了该测定的目的，二级适配体用荧光素标记，并向其中添加具有猝灭剂的Cext。(D)板上的夹心测定的实例。血清素作为靶向的分子，其用于与一级适配体形成复合物。如用于选择二级适配体(SEQ ID NO:58；衍生自SEQ ID NO:25)的一级适配体(AP)的假定的二级结构。结合所述结构(SEQ ID NO:59；衍生自SEQ ID NO:36)的二级适配体(AS)的假定的二级结构。针对配体的剂量-颜色强度响应曲线；通过HRP-STV反应显色。
图49A-Q.示例性夹心测定法。
图50A-B.(A)结合葡萄糖的一级适配体(SEQ ID NO:68)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:68的一级适配体和与类似于图10A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与葡萄糖(顶部曲线)相比于半乳糖(中间曲线)或果糖(底部曲线)的选择性结合。
图51A-B.(A)结合苯丙氨酸的一级适配体(SEQ ID NO:167)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:167的一级适配体和与类似于图11A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与苯丙氨酸的结合。
图52A-B.(A)结合苯丙氨酸的一级适配体(SEQ ID NO:67)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:67的一级适配体和与类似于图12A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与苯丙氨酸的结合。
图53A-B.(A)结合苯丙氨酸的一级适配体(SEQ ID NO:174)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:174的一级适配体和与类似于图13A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与苯丙氨酸(顶部曲线)相对于酪氨酸、甘氨酸和色氨酸的结合。
图54A-B.(A)结合氢化可的松的一级适配体(SEQ ID NO:178)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:178的一级适配体和与类似于图14A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与氢化可的松(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图55A-B.(A)结合氢化可的松的一级适配体(SEQ ID NO:181)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:181的一级适配体和与类似于图15A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与氢化可的松(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图56A-B.(A)结合氢化可的松的一级适配体(SEQ ID NO:182)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:182的一级适配体和与类似于图16A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与氢化可的松(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图57A-B.(A)结合脱氢异雄甾酮的一级适配体(SEQ ID NO:183)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:183的一级适配体和与类似于图18A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与脱氢异雄甾酮(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图58A-B.(A)结合脱氢异雄甾酮的一级适配体(SEQ ID NO:184)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:184的一级适配体和与类似于图19A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与脱氢异雄甾酮(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图59A-B.(A)结合脱氢异雄甾酮的一级适配体(SEQ ID NO:185)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:185的一级适配体和与类似于图20A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与脱氢异雄甾酮(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图60A-B.(A)结合脱氧皮质酮的一级适配体(SEQ ID NO:188)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:188的一级适配体和与类似于图21A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与脱氧皮质酮(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图61A-B.(A)结合脱氧皮质酮的一级适配体(SEQ ID NO:189和190)，其显示茎和环结构。(B)显示选择性结合的凝胶分析。
图62A-B.(A)结合睾酮的一级适配体(SEQ ID NO:191)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:191的一级适配体和与类似于图22A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与睾酮(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图63A-B.(A)结合睾酮的一级适配体(SEQ ID NO:192)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:192的一级适配体和与类似于图26A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与睾酮(顶部曲线)相对于其它类固醇的结合。
图64A-B.(A)结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体(SEQ ID NO:193)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:13的一级适配体和与类似于图27A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与鞘氨醇-1-磷酸的选择性结合。
图65A-B.(A)结合多巴胺的一级适配体(SEQ ID NO:196)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:196的一级适配体和与类似于图30A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与多巴胺(顶部曲线)相对于(降序曲线)去甲肾上腺素、血清素和5-HIAA的结合。
图66A-B.(A)结合多巴胺的一级适配体(SEQ ID NO:197)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:197的一级适配体和与类似于图31A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与多巴胺(顶部曲线)相对于(降序曲线)左旋多巴、血清素和酪氨酸的结合。
图67A-B.(A)结合多巴胺的一级适配体(SEQ ID NO:200)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:200的一级适配体和与类似于图32A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与多巴胺(顶部曲线)相对于(降序曲线)血清素和酪氨酸的结合。
图68A-B.(A)结合多巴胺的一级适配体(SEQ ID NO:201)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:201的一级适配体和与类似于图29A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与多巴胺(顶部曲线)相对于(降序曲线)左旋多巴、血清素和然后各种其它(包括酪氨酸和褪黑激素)的结合。
图69A-B.(A)结合多巴胺的一级适配体(SEQ ID NO:202)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:202的一级适配体和与类似于图28A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与多巴胺(顶部曲线)相对于(降序曲线)血清素和然后各种其它(包括酪氨酸)的结合。
图70A-B.(A)结合血清素的一级适配体(SEQ ID NO:203)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:203的一级适配体和与类似于图34A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血清素(顶部曲线)相对于(降序曲线)H-IAA、去甲肾上腺素和多巴胺的结合。
图71A-B.(A)结合血清素的一级适配体(SEQ ID NO:204)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:204的一级适配体和与类似于图37A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血清素(顶部曲线)相对于(降序曲线)多巴胺和各种其它化合物的结合。
图72A-B.(A)结合血清素的一级适配体(SEQ ID NO:205)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:205的一级适配体和与类似于图33A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血清素(顶部曲线)相对于例如褪黑激素、5-HIAA和色氨酸的结合。
图73A-B.(A)结合血清素的一级适配体(SEQ ID NO:206)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:206的一级适配体和与类似于图35A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血清素(顶部曲线)相对于例如褪黑激素、5-HIAA和色氨酸的结合。
图74A-B.(A)结合血清素的一级适配体(SEQ ID NO:207)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:207的一级适配体和与类似于图36A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血清素(顶部曲线)相对于其它化合物的结合。
图75A-B.(A)结合血清素的一级适配体(SEQ ID NO:208)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:208的一级适配体和与类似于图38A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血清素(顶部曲线)相对于其它化合物的结合。
图76A-B.(A)结合血清素的一级适配体(SEQ ID NO:209)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:209的一级适配体和与类似于图39A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血清素(顶部曲线)相对于其它化合物的结合。
图77A-B.(A)结合褪黑激素的一级适配体(SEQ ID NO:210)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:210的一级适配体和与类似于图42A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与褪黑激素(顶部曲线)相对于其它化合物的结合。
图78A-B.(A)结合褪黑激素的一级适配体(SEQ ID NO:211)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:211的一级适配体和与类似于图40A-C的传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与褪黑激素(顶部曲线)相对于其它化合物的结合。
图79A-B.结合醛固酮的一级适配体(SEQ ID NO:214)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:214的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与醛固酮(顶部曲线)相对于其它类固醇化合物的结合。
图80A-B.结合醛固酮的一级适配体(SEQ ID NO:215)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:215的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与醛固酮(顶部曲线)相对于其它类固醇化合物的结合。
图81A-B.结合妥布霉素的一级适配体(SEQ ID NO:218)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:218的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与妥布霉素(顶部曲线)相对于阿米卡星和卡那霉素的结合。
图82A-B.结合妥布霉素的一级适配体(SEQ ID NO:221)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:221的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与妥布霉素(顶部曲线)相对于阿米卡星和卡那霉素的结合。
图83A-B.结合阿米卡星的一级适配体(SEQ ID NO:225)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:225的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与阿米卡星(顶部曲线)相对于妥布霉素和卡那霉素的结合。
图84A-B.结合阿米卡星的一级适配体(SEQ ID NO:228)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:228的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与阿米卡星(顶部曲线)相对于妥布霉素和卡那霉素的结合。
图85A-B.结合阿米卡星的一级适配体(SEQ ID NO:230)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:230的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与阿米卡星(顶部曲线)相对于妥布霉素和卡那霉素的结合。
图86A-B.结合亚甲基蓝的一级适配体(SEQ ID NO:231)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:231的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与亚甲基蓝的结合。
图87A-B.结合亚甲基蓝的一级适配体(SEQ ID NO:232)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:232的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与亚甲基蓝的结合。
图88A-B.结合亚甲基蓝的一级适配体(SEQ ID NO:233)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:233的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与亚甲基蓝的结合。
图89A-B.结合亚甲基蓝的一级适配体(SEQ ID NO:234)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:234的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与亚甲基蓝的结合。
图90A-B.结合亚甲基蓝的一级适配体(SEQ ID NO:235)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:235的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与亚甲基蓝的结合。
图91A-B.结合亚甲基蓝的一级适配体(SEQ ID NO:236)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:236的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与亚甲基蓝的结合。
图92A-B.结合铵的一级适配体(SEQ ID NO:239)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:239的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子的选择性结合。
图93A-B.结合铵的一级适配体(SEQ ID NO:240)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:240的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子的选择性结合。
图94A-B.结合铵的一级适配体(SEQ ID NO:241)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:241的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子的选择性结合。
图95A-B.结合铵的一级适配体(SEQ ID NO:242)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:242的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子的选择性结合。
图96A-B.结合铵的一级适配体(SEQ ID NO:243)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:243的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子的选择性结合。
图97A-B.结合铵的一级适配体(SEQ ID NO:244)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:244的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子的选择性结合。
图98A-B.结合铵的一级适配体(SEQ ID NO:245)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:245的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子的选择性结合。
图99A-B.结合硼酸的一级适配体(SEQ ID NO:247)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:247的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与硼酸相比于双硼酸(例如，与葡萄糖络合的双硼酸)的选择性结合。
图100A-B.结合硼酸的一级适配体(SEQ ID NO:248)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:248的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与硼酸相比于双硼酸(例如，与葡萄糖络合的双硼酸)的选择性结合。
图101A-B.结合肾上腺素的一级适配体(SEQ ID NO:249)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:249的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与肾上腺素和以降序血清素、去甲肾上腺素和多巴胺的选择性结合。
图102A-B.结合肾上腺素的一级适配体(SEQ ID NO:250)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:250的一级适配体和与传感器寡核苷酸互补的额外操作序列产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与肾上腺素和以降序血清素、多巴胺和去甲肾上腺素的选择性结合。
图103A-B.结合肌酸酐的一级适配体(SEQ ID NO:256)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:256的一级适配体产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与肌酸酐的结合。图104A-B.结合肌酸酐的一级适配体(SEQ ID NO:257)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ IDNO:257的一级适配体产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与肌酸酐的结合。
图105A-B.结合肌酸酐的一级适配体(SEQ ID NO:258)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:258的一级适配体产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与肌酸酐的结合。
图106A-B.结合肌酸酐的一级适配体(SEQ ID NO:259)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:259的一级适配体产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与肌酸酐的结合。
图107A-B.结合血管加压素的一级适配体(SEQ ID NO:261)，其显示茎和环结构。(B)由包含SEQ ID NO:261的一级适配体产生的剂量/荧光响应曲线，其显示与血管加压素的结合。
5.发明详述
本发明涉及用于捕获和检测分析物的基于适配体的测定。除了本文所述的一级适配体、相关寡核苷酸和测定方法以外，该方法可以应用于设计其他适配体、相关寡核苷酸和用适配体或适配体对的类似测定，其中调整与分子类型、可用试剂和定量目标相关，例如通过实际临床样品中的浓度和/或分离的试剂的亲和力确定。此外，利用各种核酸混合物的测定可以与其他核酸组分(诸如形成链置换级联的那些)组合。
为了清楚地公开且不通过限制的方式，本发明的改详述分为以下部分：
5.1.一级适配体；
5.2.抗适配体测定
5.3.假夹心测定；和
5.4.夹心测定。
当本文提供的序列是指核苷酸“N”时，序列中的该位置可以被任何天然或非天然核苷酸填充，除非相反说明。
术语“表位”在本文中用于指一级适配体在靶分析物上的结合位点，或者在夹心测定的情况下，可以是靶分析物和二级适配体上的结合位点。
在某些实施方案中，在本发明提供具有末端CTCTC(SEQ ID NO:237)5’序列的序列的情况下，本发明还提供了缺乏初始CTCTC(SEQ ID NO:237)序列的该序列的替代形式。
在某些实施方案中，在本发明提供具有CTCTC GGG(SEQ ID NO:238)5’末端序列的序列的情况下，本发明还提供了缺乏初始CTCTCGGG(SEQ ID NO:238)序列的该序列的替代形式。在某些实施方案中，在本发明提供具有TCCC(SEQ ID NO:246)3’末端序列的序列的情况下，本发明还提供了缺乏最终TCCC(SEQ ID NO:246)序列的该序列的替代形式。在某些实施方案中，当本发明提供具有CTCTC GGG(SEQ ID NO:238)5’末端序列和TCCC(SEQ ID NO:246)3’末端序列的序列的情况下，本发明还提供缺乏这两个序列的替代形式。
在本文所述的测定中，使用可检测的标记物。在某些实施方案中，荧光部分包含在结合对的一个配偶体中，并且猝灭剂部分包含在结合对的另一个成员中。可以设计测定，使得可检测部分-例如荧光部分–在该对的任一成员上。荧光/猝灭剂化合物是本领域已知的，且参见Mary Katherine Johansson,Methods in Molecular Biol.335:FluorescentEnergy Transfer Nucleic Acid Probes:Designs and Protocols,2006,Didenko,编,Humana Press,Totowa,NJ,和Marras等人,2002,Nucl.Acids Res.30,e122(两者均通过引用并入本文)。此外，当在彼此接近时导致可检测信号的增加的部分可以用作本文所述的测定中的替代标记物，例如，作为荧光共振能量转移(“FRET”)的结果；合适的配对包括但不限于荧光素和四甲基罗丹明；罗丹明6G和孔雀石绿，以及FITC和缩氨基硫脲，仅举几例。
5.1.一级适配体
“一级适配体”(AP)结合靶分析物(配体，L)。一级适配体可以通过溶液相或固相选择分离(鉴定为与其靶分析物结合)。
一级适配体(Ap)和相关的寡核苷酸(例如，抗适配体、传感器寡核苷酸、comp寡核苷酸和夹心寡核苷酸(也称为“二级适配体”或As))可以具有与其预期功能一致的任何大小。在某些非限制性实施方案中，一级适配体或相关寡核苷酸长度为约20-250个核苷酸。例如，但不通过限制的方式，长度可以为约20-200个核苷酸，或约20-150个核苷酸，或约30-200个核苷酸，或约40-200个核苷酸，或约50-200个核苷酸，或约60-200个核苷酸，或约70-200个核苷酸，或约80-200个核苷酸，或约100-200个核苷酸，或约150-200个核苷酸，或约30-150个核苷酸，或约30-100个核苷酸，或约30-80个核苷酸，或约30-50个核苷酸，或约40-100个核苷酸；或至少约20个核苷酸，或至少约30个核苷酸，或最多达约100个核苷酸，或最多达约200个核苷酸(其中“约”意指正或负20％)，或20-250个核苷酸，或25至100个核苷酸。在某些非限制性实施方案中，一级适配体和/或相关寡核苷酸是spiegelmer或含有非天然的对映异构体。22-25
在具体实施方案中，提供了包含充当靶分析物的结合口袋的核心序列的一级适配体。在某些实施方案中，提供了包含特定核心序列或共有核心序列的一级适配体。一级适配体可以进一步包含在特定测定中发挥功能作用的操作序列，如下所述。除了核心序列或操作序列以外，一级适配体还可以任选地包含其他序列，其基本上不影响其功能。包含结合目标靶分析物的核心序列的一级适配体可用于多种测定，包括但不限于本文例举的那些。
5.1.1.用于分离一级适配体的方法
可以鉴定一级适配体，其与多种靶分析物选择性结合，所述靶分析物包括但不限于氨基酸、单糖和寡糖、类固醇、儿茶酚胺、血清素、褪黑激素、脂质、激素和/或肽。在某些非限制性实施方案中，该方法可用于产生与spiegelmer结合的用于血管加压素、氨基糖苷和其他抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤剂、杀虫剂、激素等的一级适配体。
例如，且不通过限制的方式，可以使用SELEX方法进行一级适配体的分离。在某些非限制性实施方案中，一级适配体通过固体(传统)或较新的溶液相选择分离16-21。进一步，在某些非限制性实施方案中，溶液相选择对于小分子具有固有的优点，例如更高的亲和力和易于筛选适配体。
在某些非限制性实施方案中，该方法包括将与PCR引物之一互补的生物素化的链(CB)附接至琼脂糖-链霉抗生物素蛋白(图7)，和通过与引物的CB的互补相互作用附接来自文库(例如，但不限于，N8-N100)的序列。文库上的两个引物，5’-和3’-，也是部分互补的；文库的所有成员(其以有利于这些引物的互补区域之间的茎形成的方式与靶标相互作用)通过置换互补序列CB从琼脂糖释放，并用于现在产生潜在适配体的富集文库的PCR扩增中。
在溶液相选择中，使用分子而没有任何附接至基质，因此，没有“浪费”官能团。这使与适配体的相互作用最大化，导致高亲和力。可以使用的化合物浓度达到溶解度极限，允许分离弱亲和力适配体(例如，针对代谢物和葡萄糖)。
在某些非限制性实施方案中，荧光传感器可以通过如下直接从该选择获得：用dabcyl取代生物素并将荧光素附接至适配体(图6，CD)，证实适配体结合，测定其Kd(这是竞争性测定，因此半响应移位远离Kd 80，并且CD过量存在)，并建立选择性。
在某些非限制性实施方案中，所述方法包括：
(1)通过溶液相(图7)或固相选择分离一级适配体(Ap)，除非它们已经可用；使用对映异构体适配体(spiegelmer)，如果需要，以使Watson-Crick碱基配对最小化(例如，融合适配体或使没有分析物的背景相互作用最小化)；
(2)测试呈其结构转换形式的一级适配体并修改其结构转换形式，然后将其转变为假夹心测定形式(图6C)；
(3)通过溶液相或固相选择(图9A-B)，在与靶标的复合物中使用一级适配体或spiegelmer，分离二级夹心适配体(As)；
(4)对靶标实施夹心测定(图8A-C)和/或
(5)制备最初分离的缩短形式的一级适配体；
(6)通过引入操作序列来修饰任选缩短的一级适配体；和/或
(7)通过取代其结合口袋中的一个或多个核苷酸来修饰任选缩短的一级适配体，以改善预期测定中的结合特性。
5.1.2结合葡萄糖的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-1M的解离常数(亲和力10)结合葡萄糖，并与葡萄糖相比于半乳糖选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含序列CCGTGTGT(SEQID NO:157)和AGTGTCCATTG(SEQ ID NO:158)或AGTGTCCTTTG(SEQ ID NO:159)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-1M的解离常数(亲和力10)结合葡萄糖，并与葡萄糖相比于半乳糖或果糖选择性结合(参见，例如，图50B)。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，所述包含序列CCGTGTGT(SEQ ID NO:157)和AGTGTCCATTG(SEQ ID NO:158)或AGTGTCCTTTG(SEQ ID NO:159)或其变体的结合葡萄糖的一级适配体对葡萄糖的结合亲和力为具有SEQ ID NO:68的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％。)。在某些非限制性实施方案中，所述包含序列CCGTGTGT(SEQ IDNO:157)和AGTGTCCATTG(SEQ ID NO:158)或AGTGTCCTTTG(SEQ ID NO:159)或其变体的结合葡萄糖的一级适配体与具有SEQ ID NO:68的一级适配体竞争葡萄糖结合。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含序列CCGTGTGT(SEQ ID NO:157)和AGTGTCCATTG(SEQ ID NO:158)或AGTGTCCTTTG(SEQ ID NO:159)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含序列CCGTGTGT(SEQ IDNO:157)和AGTGTCCATTG(SEQ ID NO:158)或AGTGTCCTTTG(SEQ ID NO:159)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含序列CCGTGTGT(SEQ ID NO:157)和AGTGTCCATTG(SEQ ID NO:158)或AGTGTCCTTTG(SEQ ID NO:159)或其变体，和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含序列CCGTGTGT(SEQ ID NO:157)和AGTGTCCATTG(SEQ ID NO:158)或AGTGTCCTTTG(SEQ ID NO:159)或其变体，和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体具有预测的二级结构，其包含通过与葡萄糖结合(例如，与葡萄糖相比于半乳糖的选择性结合)的序列连接的两个茎和/或以下中的一种或多种：4-O-R-葡萄糖表位，其中R是氢、烷基基团、另一种碳水化合物或蛋白质；纤维二糖；和/或麦芽糖。参见，例如，图50A-B。
例如，但不通过限制的方式，结合葡萄糖的一级适配体可以包含选自以下的序列：
>S-Glu01:CTCTCGGGACGACCGTGTGTGTTGCTCTGTAAC---------AGTGTCCATTGTCGTCCC(SEQ ID NO:160)；
>S-Glu02:
CTCTCGGGACGACCGTGTGTGGTAGAGTCGTCGGGCTCTAACAGTGTCCTTTGTCGTCCC(SEQ IDNO:161)；
>S-Glu03:
CTCTCGGGACGACCGTGTGTGACGTGCGCCGTGGGGAACGTCAGTGTTCTTTGTCGTCCC(SEQ IDNO:162)；
>S-Glu04:CTCTCGGGACGACCGTGTGTCGACTTAGAGTCG---------AGTGTCCTTTGTCGTCCC(SEQ ID NO:163)；和
>S-Glu05:CTCTCGGGACGACCGTGTGTTGCAATTCTTGCA---------AGTGTTCTTTGTCGTCCC(SEQ ID NO:164)。
在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含如SEQ ID NO:83(图10B)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:83(图10B)中所示的核心序列的结合葡萄糖的一级适配体对葡萄糖的结合亲和力为具有SEQ ID NO:68的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:83(图10B)中所示的核心序列的结合葡萄糖的一级适配体与具有SEQ ID NO:68的一级适配体竞争葡萄糖结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含如SEQ ID NO:83(图10B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含如SEQ ID NO:83(图10B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含如SEQ ID NO:83(图10B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合葡萄糖的一级适配体包含如SEQ ID NO:83(图10B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合葡萄糖的一级适配体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:149的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合葡萄糖的一级适配体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:149的核苷酸序列。所述适配体可以结合葡萄糖，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.3结合苯丙氨酸的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与苯丙氨酸结合，并与苯丙氨酸相比于酪氨酸(或羟基-苯丙氨酸)或色氨酸选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GCGT(SEQ ID165)和AGC和GGTT(SEQ ID NO:166)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与苯丙氨酸结合，并与苯丙氨酸相比于酪氨酸(或羟基-苯丙氨酸)或色氨酸选择性结合(参见，例如，图51A-B)。在某些非限制性实施方案中，所述包含序列GCGT(SEQ ID 165)和AGC和GGTT(SEQID NO:166)或其变体的结合苯丙氨酸的一级适配体对苯丙氨酸的结合亲和力为具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:67的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％。在某些非限制性实施方案中，所述包含序列GCGT(SEQ ID165)和AGC和GGTT(SEQ ID NO:166)或其变体的结合苯丙氨酸的一级适配体与具有SEQ IDNO:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:67的结合苯丙氨酸的一级适配体竞争。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GCGT(SEQID165)和AGC和GGTT(SEQ ID NO:166)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GCGT(SEQ ID 165)和AGC和GGTT(SEQ ID NO:166)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GCGT(SEQ ID 165)和AGC和GGTT(SEQ ID NO:166)或其变体，和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GCGT(SEQ ID 165)和AGC和GGTT(SEQ ID NO:166)或其变体，和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合苯丙氨酸的一级适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CCG CGT TTC CCA AGA AAG CAA GTA TTG GTT GGT CGT CCC(SEQ ID NO:2)或其包含图11B中所示的核心(SEQ ID NO:85)的部分(参见图51A(SEQ ID NO:167)。
在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:85(图11B)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:85(图11B)中所示的核心序列的结合苯丙氨酸的一级适配体对苯丙氨酸的结合亲和力为具有SEQ IDNO:167的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:85(图11B)中所示的核心序列的结合苯丙氨酸的一级适配体与具有SEQ ID NO:167的一级适配体竞争苯丙氨酸结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ IDNO:85(图11B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:85(图11B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:85(图11B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:85(图11B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GG和GGGGG(SEQ ID NO:168)和GGGG(SEQ ID NO:169)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与苯丙氨酸结合(参见图52A-B)，并与苯丙氨酸相比于酪氨酸(或羟基-苯丙氨酸)或色氨酸选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GG和GGGGG(SEQ ID NO:168)和GGGG(SEQ ID NO:169)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GG和GGGGG(SEQ ID NO:168)和GGGG(SEQ ID NO:169)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GG和GGGGG(SEQ IDNO:168)和GGGG(SEQ ID NO:169)或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GG和GGGGG(SEQ ID NO:168)和GGGG(SEQ ID NO:169)或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合苯丙氨酸的适配体可以包含以下序列：
CTC TCG GGA CGA CCG GTG GGG GTT CTT TTT CAG GGG AGG TAC GGT CGT CCC(SEQ ID NO:3)。
在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:87(图12B；图52A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:87(图12B)中所示的核心序列的结合苯丙氨酸的一级适配体对苯丙氨酸的结合亲和力为具有SEQID NO:67的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:87(图12B)中所示的核心序列的结合苯丙氨酸的一级适配体与具有SEQ ID NO:67的一级适配体竞争苯丙氨酸结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ IDNO:87(图12B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:87(图12B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:87(图12B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:87(图12B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GAGG(SEQ IDNO:170)和CATT(SEQ ID NO:171)或CCGG(SEQ ID NO:172)和TGTT(SEQ ID NO:173)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与苯丙氨酸结合，并与苯丙氨酸相比于酪氨酸(或羟基-苯丙氨酸)或色氨酸选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GAGG(SEQ ID NO:170)和CATT(SEQ ID NO:171)或CCGG(SEQ IDNO:172)和TGTT(SEQ ID NO:173)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GAGG(SEQ ID NO:170)和CATT(SEQ ID NO:171)或CCGG(SEQ ID NO:172)和TGTT(SEQ ID NO:173)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GAGG(SEQ ID NO:170)和CATT(SEQID NO:171)或CCGG(SEQ ID NO:172)和TGTT(SEQ ID NO:173)或其变体和在任一侧(侧接)这四个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含序列GAGG(SEQ ID NO:170)和CATT(SEQ ID NO:171)或CCGG(SEQ ID NO:172)和TGTT(SEQ ID NO:173)或其变体和在任一侧(侧接)这四个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合苯丙氨酸的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CGA GGC TGG ATG CAT TCGCCG GAT GTT CGA TGT CGT CCC(SEQ ID NO:4)或相关序列(SEQ ID NO:174，图53A)。
在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:89(图13B；图53A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:89(图13B)中所示的核心序列的结合苯丙氨酸的一级适配体对苯丙氨酸的结合亲和力为具有SEQID NO:174的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:89(图13B)中所示的核心序列的结合苯丙氨酸的一级适配体与具有SEQ ID NO:174的一级适配体竞争苯丙氨酸结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ IDNO:89(图13B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:89(图13B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:89(图13B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合苯丙氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:89(图13B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合苯丙氨酸的一级适配体包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:174的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合苯丙氨酸的一级适配体包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:174的核苷酸序列。所述适配体可以结合苯丙氨酸，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.4结合氢化可的松的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与氢化可的松结合，并与皮质酮、11-脱氧皮质酮和/或(17α,21-二羟基孕酮)选择性结合和/或与具有连接至一个氧的C.17碳的类固醇相比于在C.17位没有氧的类固醇选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQID NO:175)和ATGTTC(SEQ ID NO:176)和GGATAGT(SEQ ID NO:177)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与氢化可的松结合，并与氢化可的松相比于在C.17位没有氧的类固醇选择性结合(参见图54B)。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和ATGTTC(SEQ ID NO:176)和GGATAGT(SEQ IDNO:177)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和ATGTTC(SEQ ID NO:176)和GGATAGT(SEQ ID NO:177)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和ATGTTC(SEQ ID NO:176)和GGATAGT(SEQ ID NO:177)或其变体，并且进一步包含在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和ATGTTC(SEQ ID NO:176)和GGATAGT(SEQ ID NO:177)或其变体，并且进一步包含在任一侧(侧接)这四个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合氢化可的松的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGC CCG CAT GTT CCA TGG ATA GTC TTG ACT AGT CGT CCC(SEQID NO:5,图14A)或其短版本(图54A,SEQ ID NO:178)。
在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:91(图14B；图54A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:91(图14B)中所示的核心序列的结合氢化可的松的一级适配体对氢化可的松的结合亲和力为具有SEQ ID NO:178的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:91(图14B)中所示的核心序列的结合氢化可的松的一级适配体与具有SEQ ID NO:178的一级适配体竞争氢化可的松结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:91(图14B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:91(图14B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ IDNO:91(图14B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:91(图14B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQID NO:175)和TACGA(SEQ ID NO:179)和GGATA(SEQ ID NO:180)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与氢化可的松结合，并与氢化可的松相比于在C.17位没有氧的类固醇选择性结合(参见图55B)。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和TACGA(SEQ ID NO:179)和GGATA(SEQ ID NO:180)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和TACGA(SEQ ID NO:179)和GGATA(SEQ ID NO:180)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和TACGA(SEQ ID NO:179)和GGATA(SEQ ID NO:180)或其变体，并且进一步包含在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含序列CGCC(SEQ ID NO:175)和TACGA(SEQ IDNO:179)和GGATA(SEQ ID NO:180)或其变体，并且进一步包含在任一侧(侧接)这四个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合氢化可的松的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CTA GCG TAT GCG CCA GAA GTA TAC GAG GAT AGT CGT CCC(SEQ ID NO:6,图15A)或其短版本(图55A,SEQ ID NO:181)。
在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:93(图15B；图55A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:93(图15B)中所示的核心序列的结合氢化可的松的一级适配体对氢化可的松的结合亲和力为具有SEQ ID NO:181的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:93(图15B)中所示的核心序列的结合氢化可的松的一级适配体与具有SEQ ID NO:181的一级适配体竞争氢化可的松结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:93(图15B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:93(图15B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ IDNO:93(图15B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:93(图15B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合氢化可的松的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CGC CAG AAG TTT ACG AGG ATA TGG TAA CAT AGT CGT CCC(SEQ ID NO:7,图16A)或其短版本(图56A,SEQ ID NO:182)。
在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:95(图16B；图56A-B)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:95(图16B)中所示的核心序列的结合氢化可的松的一级适配体对氢化可的松的结合亲和力为具有SEQ ID NO:182的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:95(图16B)中所示的核心序列的结合氢化可的松的一级适配体与具有SEQ ID NO:182的一级适配体竞争氢化可的松结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:95(图16B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:95(图16B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQID NO:95(图16B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合氢化可的松的一级适配体包含如SEQ ID NO:95(图16B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合氢化可的松的一级适配体包含SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:64(图1C)、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:148或SEQ ID NO:182的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合氢化可的松的一级适配体包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:64(图1C)、SEQ ID NO:181、SEQ IDNO:148或SEQ ID NO:182的核苷酸序列。所述适配体可以结合氢化可的松，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.5.结合脱氢异雄甾酮的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与脱氢异雄甾酮结合，并与脱氢异雄甾酮相比于脱氧皮质酮选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含序列GGG、GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与脱氢异雄甾酮结合，并与脱氢异雄甾酮相比于脱氧皮质酮和/或其它类固醇选择性结合(参见图57B、58B和59B)。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含序列GGG、GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含序列GGG、GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含序列GGG、GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含序列GGG、GGGG(SEQ IDNO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合脱氢异雄甾酮的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CGG GGG TGG CAT AGG GTA GGC TAG GGT CAC TGT CGT CCC(SEQ ID NO:9)或相关序列(SEQ ID NO:183,图57A)。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:99(图18B；图57A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:99(图18B)中所示的核心序列的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体对脱氢异雄甾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:183的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:99(图18B)中所示的核心序列的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:183的一级适配体竞争脱氢异雄甾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:99(图18B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:99(图18B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:99(图18B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:99(图18B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合脱氢异雄甾酮的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CGT GGC TAG GTA GGT TGC ATG CGG CAT AGG GGT CGT CCC(SEQ ID NO:10)或相关序列(SEQ ID NO:184,图58A)。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:101(图19B；图58A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:101(图19B)中所示的核心序列的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体对脱氢异雄甾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:184的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:101(图19B)中所示的核心序列的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:184的一级适配体竞争脱氢异雄甾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:101(图19B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:101(图19B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:101(图19B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:101(图19B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合脱氢异雄甾酮的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CGT GAC GGT GTG TAG TTG GGT TGT GGC AGG AGT CGT CCC(SEQ ID NO:11)或相关序列(SEQ ID NO:185,图59A)。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:103(图20B；图59A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:103(图20B)中所示的核心序列的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体对脱氢异雄甾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:185的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:103(图20B)中所示的核心序列的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:185的一级适配体竞争脱氢异雄甾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:103(图20B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:103(图20B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:103(图20B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:103(图20B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合脱氢异雄甾酮的一级适配体包含SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:185的核苷酸序列。所述适配体可以结合脱氢异雄甾酮，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.6结合脱氧皮质酮的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与脱氧皮质酮结合，并与脱氧皮质酮相比于脱氢异雄甾酮选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含序列AGCT(SEQID NO:186)和GCGG(SEQ ID NO:187)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与脱氧皮质酮结合，并与脱氧皮质酮相比于脱氢异雄甾酮和/或其它类固醇选择性结合(参见图60B、61B)。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含序列AGCT(SEQ ID NO:186)和GCGG(SEQ ID NO:187)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含序列AGCT(SEQ ID NO:186)和GCGG(SEQ ID NO:187)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含序列AGCT(SEQ ID NO:186)和GCGG(SEQ ID NO:187)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含序列AGCT(SEQ ID NO:186)和GCGG(SEQ ID NO:187)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合脱氧皮质酮的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CCC GGA TTT TCC GAG TGG AAC TAG CTG TGG CGG TCG TCC C(SEQ ID NO:12)或相关序列(例如，SEQ ID NO:188,图60A；SEQ ID NO:62,图1A)。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:105(图21B；图60A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:105(图21B)中所示的核心序列的结合脱氧皮质酮的一级适配体对脱氧皮质酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:188的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ IDNO:105(图21B)中所示的核心序列的结合脱氧皮质酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:188的一级适配体竞争脱氧皮质酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:105(图21B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:105(图21B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:105(图21B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合脱氧皮质酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:105(图21B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合脱氧皮质酮的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CGG GGA TTT TCC AGT GCA ACT AGC TGA AAG CGG TCG TCC C(SEQ ID NO:189；图61A)。例如，但不通过限制的方式，结合脱氧皮质酮的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CCA GGA TTT TCC AGT GTA ACT AGC TAC AGC GGG TCG TCC C(SEQ ID NO:190；图61A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合脱氧皮质酮的一级适配体包含SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合脱氧皮质酮的一级适配体包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189或SEQ ID NO:190的核苷酸序列。所述适配体可以结合脱氧皮质酮，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.7结合睾酮的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与睾酮结合，并与睾酮相比于11-脱氧皮质酮选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ IDNO:169)和GG或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸(包括添加或缺失G残基)而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与睾酮结合，并与睾酮(参见图62B和63B)相比于11-脱氧皮质酮选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合睾酮的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG GAT GTC CGG GGT ACG GTG GTT GCA GTT CGT CGT CCC(SEQ ID NO:13)或相关序列(例如，SEQ ID NO:65,图1D；SEQ ID NO:191,图62A)。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:107(图22B；图62A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:107(图22B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体对睾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:191的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:107(图22B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:191的一级适配体竞争睾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ IDNO:107(图22B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:107(图22B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:107(图22B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:107(图22B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合睾酮的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG GTG GTC ATT GAG TGG TCT TAG GCA GGT AGT CGT CCC(SEQ ID NO:17)或相关序列(SEQ ID NO:192,图63A)。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:115(图26B；图63A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQID NO:115(图26B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体对睾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:192的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:115(图26B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:192的一级适配体竞争睾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:115(图26B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:115(图26B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:115(图26B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:115(图26B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:109(图23B)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:109(图23B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体对睾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:14的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:109(图23B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:14的一级适配体竞争睾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:109(图23B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:109(图23B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。
在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:109(图23B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:109(图23B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:111(图24B)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:111(图24B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体对睾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:15的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:111(图24B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:15的一级适配体竞争睾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:111(图24B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:111(图24B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:111(图24B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:111(图24B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:113(图25B)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:111(图25B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体对睾酮的结合亲和力为具有SEQ ID NO:16的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:113(图25B)中所示的核心序列的结合睾酮的一级适配体与具有SEQ ID NO:16的一级适配体竞争睾酮结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:113(图25B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:113(图25B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:113(图25B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合睾酮的一级适配体包含如SEQ ID NO:113(图25B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合睾酮的一级适配体包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:191或SEQ ID NO:192的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合睾酮的一级适配体包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:191或SEQ ID NO:192的核苷酸序列。所述适配体可以结合睾酮，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.8结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与鞘氨醇-1-磷酸结合(参见图64B)。
在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGGGG(SEQ ID NO:168)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与鞘氨醇-1-磷酸结合，并与鞘氨醇-1-磷酸选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGGGG(SEQ ID NO:168)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGGGG(SEQ ID NO:168)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGGGG(SEQ ID NO:168)或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGGGG(SEQ ID NO:168)或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合鞘氨醇-1-磷酸的适配体可以包含以下序列：CTCTCG GGA CGA CGT GGT GTG GGA GAA AGA ATT TTC ATT GGG GTA GGG GGT CGT CCC(SEQID NO:18)或相关序列(SEQ ID NO:193,图64A)。
在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含如SEQ IDNO:117(图27B；图64A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:117(图27B)中所示的核心序列的结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体对鞘氨醇-1-磷酸的结合亲和力为具有SEQ ID NO:193的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:117(图27B)中所示的核心序列的结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体与具有SEQ ID NO:193的一级适配体竞争鞘氨醇-1-磷酸结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:117(图27B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:117(图27B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:117(图27B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:117(图27B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含SEQID NO:18、SEQ ID NO:193的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:193的核苷酸序列。所述适配体可以结合鞘氨醇-1-磷酸，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.9结合多巴胺的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与多巴胺结合，并与多巴胺选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CCGAT(SEQ IDNO:194)和GGTGT(SEQ ID NO:195)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与多巴胺结合，并与多巴胺相比于血清素或去甲肾上腺素选择性结合(图65B)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CCGAT(SEQ ID NO:194)和GGTGT(SEQ ID NO:195)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CCGAT(SEQ ID NO:194)和GGTGT(SEQ ID NO:195)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CCGAT(SEQ IDNO:194)和GGTGT(SEQ ID NO:195)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CCGAT(SEQ ID NO:194)和GGTGT(SEQ ID NO:195)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合多巴胺的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CGC CAG TTT GAAGGT TCG TTC GCA GGT GTG GAG TGA CGT CGT CCC(SEQ ID NO:21)或相关序列(SEQ IDNO:196,图65A)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:123(图30B；图65A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:123(图30B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体对多巴胺的结合亲和力为具有SEQID NO:196的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:123(图30B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体与具有SEQ ID NO:196的一级适配体竞争多巴胺结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:123(图30B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:123(图30B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:123(图30B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:123(图30B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQID NO:169)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与多巴胺结合，并与多巴胺相比于血清素或酪氨酸选择性结合(图66B)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ ID NO:169)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQID NO:169)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ ID NO:169)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGG和GGGG(SEQ ID NO:169)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合多巴胺的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CTG CAG CCT GGG GTT GTG GGG GGT AGG GGAGGT CTG AGT CGT CCC(SEQ ID NO:22；图31A)或相关序列(SEQ ID NO:197,图66A)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:125(图31B；图66A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:125(图31B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体对多巴胺的结合亲和力为具有SEQ ID NO:197的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ IDNO:125(图31B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体与具有SEQ ID NO:197的一级适配体竞争多巴胺结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:125(图31B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:125(图31B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:125(图31B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:125(图31B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CACAG(SEQ IDNO:198)和CACAA(SEQ ID NO:199)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与多巴胺结合，并与多巴胺相比于血清素、褪黑激素或酪氨酸选择性结合(图67B)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CACAG(SEQ ID NO:198)和CACAA(SEQ ID NO:199)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CACAG(SEQ ID NO:198)和CACAA(SEQ ID NO:199)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CACAG(SEQID NO:198)和CACAA(SEQ ID NO:199)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列CACAG(SEQ IDNO:198)和CACAA(SEQ ID NO:199)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合多巴胺的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CCA CAC AGAGGC ACA ACT CGC AGG AGC AAA GCG GCA GGT CGT CCC(SEQ ID NO:23；图32A)或相关序列(SEQ ID NO:200,图67A)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:127(图32B；图67A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQID NO:127(图32B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体对多巴胺的结合亲和力为具有SEQ ID NO:200的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:125(图31B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体与具有SEQ ID NO:200的一级适配体竞争多巴胺结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQID NO:127(图32B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:127(图32B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:127(图32B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:127(图32B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ IDNO:169)和GG或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与多巴胺结合，并与多巴胺相比于血清素、褪黑激素或酪氨酸选择性结合(图68B)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ IDNO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合多巴胺的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CGG GGA GGA GTT AGC ATG ACGGCA ACT TTA GTA CTT CGT CGT CCC(SEQ ID NO:20；图29A)或相关序列(SEQ ID NO:201,图68A)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:121(图29B；图68A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:121(图29B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体对多巴胺的结合亲和力为具有SEQ IDNO:201的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:121(图29B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体与具有SEQ ID NO:201的一级适配体竞争多巴胺结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:121(图29B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:121(图29B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:121(图29B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:121(图29B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ IDNO:169)和GG或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与多巴胺结合，并与多巴胺相比于血清素、褪黑激素或酪氨酸选择性结合(图69B)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ ID NO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含序列GGGG(SEQ IDNO:169)和GG或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合多巴胺的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CCA CTT CAG ACG CTC AAC GTTTGG GGA GGC ACG GCA GGT CGT CCC(SEQ ID NO:19；图28A)或相关序列(SEQ ID NO:202,图69A)。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:119(图28B；图69A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:119(图28B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体对多巴胺的结合亲和力为具有SEQ IDNO:202的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:119(图28B)中所示的核心序列的结合多巴胺的一级适配体与具有SEQ ID NO:202的一级适配体竞争多巴胺结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:119(图28B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:119(图28B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:119(图28B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合多巴胺的一级适配体包含如SEQ ID NO:119(图28B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合多巴胺的一级适配体包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:200、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:202的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合多巴胺的一级适配体包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:201、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:202的核苷酸序列。所述适配体可以结合多巴胺，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.10结合血清素的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与血清素结合，并与多巴胺相比于血清素、褪黑激素和5-羟色氨酸选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQID NO:169)和GGG或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与血清素结合，并与血清素相比于多巴胺、褪黑激素或5-羟色氨酸选择性结合(图70B、71B、72B、73B、74B、75B、76B)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGG或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGG或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含序列GG和GGGG(SEQ ID NO:169)和GGG或其变体和在任一侧(侧接)这三个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血清素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CTG GTA GGC AGA TAG GGG AAG CTG ATT CGA TGC GTG GGT CGT CCC(SEQ IDNO:25；图34A)或相关序列(SEQ ID NO:203,图70A)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:131(图34B；图70A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:131(图34B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体对血清素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:203的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:131(图34B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体与具有SEQ ID NO:203的一级适配体竞争血清素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:131(图34B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:131(图34B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:131(图34B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:131(图34B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血清素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CTG GTA GGC AAC AGG GGA AGG GAG TTC TGC GTA CGT GGG TCG TCC C(SEQ IDNO:28；图37A)或相关序列(SEQ ID NO:204,图71A)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:137(图37B；图71A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:137(图37B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体对血清素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:204的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:137(图37B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体与具有SEQ ID NO:204的一级适配体竞争血清素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:137(图37B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:137(图37B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:137(图37B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:137(图37B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血清素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CAG GGG CAT ATA TAG TCT AGG GTT TGG TGT GGG TAG TGT CGT CCC(SEQ IDNO:24；图33A)或相关序列(SEQ ID NO:205,图72A)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:129(图33B；图72A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:129(图33B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体对血清素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:205的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:129(图33B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体与具有SEQ ID NO:205的一级适配体竞争血清素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:129(图33B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:129(图33B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:129(图33B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:129(图33B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血清素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CTG GTA GGC AGC AGG GGA AGT AGG CGT GTC CTC GTG GGT CGT CCC(SEQ IDNO:26；图35A)或相关序列(SEQ ID NO:206,图73A)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:133(图35B；图73A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:133(图35B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体对血清素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:206的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:133(图35B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体与具有SEQ ID NO:206的一级适配体竞争血清素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:133(图35B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:133(图35B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:133(图35B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:133(图35B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血清素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CCA GTA GGG GAT CCA CAG TGA GGG GTT TGT ATG GGT GGT CGT CCC(SEQ IDNO:27；图36A)或相关序列(SEQ ID NO:207,图74A)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:135(图36B；图74A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:135(图36B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体对血清素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:207的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:135(图36B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体与具有SEQ ID NO:207的一级适配体竞争血清素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:135(图36B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:135(图36B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:135(图36B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:135(图36B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血清素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGG AGG TGG TGT CTT GGA CAG TGG TAT TCG CAG TTG CGT CGT CCC(SEQ IDNO:29；图38A)或相关序列(SEQ ID NO:208,图75A)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:139(图38B；图75A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:139(图38B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体对血清素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:208的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:139(图38B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体与具有SEQ ID NO:208的一级适配体竞争血清素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:139(图38B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:139(图38B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:139(图38B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:139(图38B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血清素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CAG AGA CGG GGT GCT TAC TTG GTT CAG GGG AGT CGA CGT CGT CCC(SEQ IDNO:30；图39A)或相关序列(SEQ ID NO:209,图76A)。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:141(图39B；图76A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:141(图39B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体对血清素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:209的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:141(图39B)中所示的核心序列的结合血清素的一级适配体与具有SEQ ID NO:209的一级适配体竞争血清素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:141(图39B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:141(图39B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:141(图39B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血清素的一级适配体包含如SEQ ID NO:139(图38B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合血清素的一级适配体包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:205、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:208、SEQID NO:30、SEQ ID NO:209的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合血清素的一级适配体包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:24、SEQID NO:205、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:209的核苷酸序列。所述适配体可以结合血清素，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.11结合褪黑激素的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与褪黑激素结合，并与血清素相比于血清素或色氨酸选择性结合(参见图77B和78B)。
例如，但不通过限制的方式，结合褪黑激素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGT CTT GGG GGT GGT GGG TTT GGC TGG TAC TTA GGG CGT CGT CCC(SEQ IDNO:32；图41A)或相关序列(SEQ ID NO:210,图77A)。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:145(图41B；图77A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:145(图41B)中所示的核心序列的结合褪黑激素的一级适配体对褪黑激素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:210的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:145(图41B)中所示的核心序列的结合褪黑激素的一级适配体与具有SEQ ID NO:210的一级适配体竞争褪黑激素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:145(图41B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:145(图41B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:145(图41B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQID NO:145(图41B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合褪黑激素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CAG CCA AGG TCG TAA GGT ACG GTC AGT GTA CTC GGT TGT CGT CCC(SEQ IDNO:31；图40A)或相关序列(SEQ ID NO:211,图78A)。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:143(图40B；图78A)中所示的核心序列。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:143(图40B)中所示的核心序列的结合褪黑激素的一级适配体对褪黑激素的结合亲和力为具有SEQ ID NO:211的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:143(图40B)中所示的核心序列的结合褪黑激素的一级适配体与具有SEQ ID NO:211的一级适配体竞争褪黑激素结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:143(图40B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:143(图40B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQ ID NO:143(图40B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合褪黑激素的一级适配体包含如SEQID NO:143(图40B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合褪黑激素的一级适配体包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:210的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合褪黑激素的一级适配体包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:32或SEQ IDNO:210的核苷酸序列。所述适配体可以结合褪黑激素，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.12结合酪氨酸的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:147(图42B)中所示的核心序列的结合酪氨酸的一级适配体对酪氨酸的结合亲和力为具有SEQ ID NO:33的一级适配体的结合亲和力的至少约50％或至少约75％)。在某些非限制性实施方案中，包含如SEQ ID NO:147(图42B)中所示的核心序列的结合酪氨酸的一级适配体与具有SEQ ID NO:33的一级适配体竞争酪氨酸结合。在非限制性实施方案中，所述一级适配体具有约30至约100个核苷酸，或约30至80个核苷酸，或约30至70个核苷酸，或约30至60个核苷酸的长度。在某些非限制性实施方案中，结合酪氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:147(图42B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合酪氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:147(图42B)中所示的核心序列，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合酪氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:147(图42B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合酪氨酸的一级适配体包含如SEQ ID NO:147(图42B)中所示的核心序列和在任一侧(侧接)核心序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合酪氨酸的一级适配体包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:147的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合酪氨酸的一级适配体包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:147的核苷酸序列。所述适配体可以结合酪氨酸，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.13结合醛固酮的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与醛固酮结合，并与醛固酮(参见图79B和80B)相比于可的松、皮质醇或脱氧可的松选择性结合，或与具有结合至一个或两个氧原子的C18的类固醇相比于具有连接至C18位的甲基的类固醇选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合醛固酮的一级适配体包含序列GATAGT(SEQ IDNO:212)和ATGTTC(SEQ ID NO:213)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与醛固酮结合，并与醛固酮相比于可的松、皮质醇或脱氧可的松选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合醛固酮的一级适配体包含序列GATAGT(SEQ ID NO:212)和ATGTTC(SEQ ID NO:213)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合醛固酮的一级适配体包含序列GATAGT(SEQ ID NO:212)和ATGTTC(SEQ ID NO:213)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合醛固酮的一级适配体包含序列GATAGT(SEQ IDNO:212)和ATGTTC(SEQ ID NO:213)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合醛固酮的一级适配体包含序列GATAGT(SEQ IDNO:212)和ATGTTC(SEQ ID NO:213)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合醛固酮的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CAG ATA GTT GTT CTT AGC GAT GTT CAG CGT TGT CGT CCC(SEQ ID NO:214,图79A)或相关序列(SEQ ID NO:63,图1B)。
例如，但不通过限制的方式，结合醛固酮的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGG TAG GTA GGC CAA CTG GGT ATT TAC TGG TGT CGT CCC(SEQ ID NO:215,图80A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合醛固酮的一级适配体包含SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:63的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合醛固酮的一级适配体包含SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:63的核苷酸序列。所述适配体可以结合醛固酮，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.14结合妥布霉素的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与妥布霉素结合，并与妥布霉素(参见图81B和82B)相比于阿米卡星或卡那霉素选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列TGAAA(SEQ IDNO:216)和/或AAGTG(SEQ ID NO:217)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与妥布霉素结合，并与妥布霉素相比于阿米卡星或卡那霉素选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列TGAAA(SEQ ID NO:216)和/或AAGTG(SEQ ID NO:217)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列TGAAA(SEQ ID NO:216)和/或AAGTG(SEQID NO:217)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列TGAAA(SEQ ID NO:216)和/或AAGTG(SEQ ID NO:217)或其变体和在任一侧(侧接)该一个或多个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列TGAAA(SEQ ID NO:216)和/或AAGTG(SEQ ID NO:217)或其变体和在任一侧(侧接)该一个或多个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合妥布霉素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGG CCC CGC AAG GGG TGA AAT GAC AGA GTC AAA GTG CGT CGT CCC(SEQ IDNO:218,图81A)。
在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列GTAGTC(SEQID NO:219)和/或TCGGTAG(SEQ ID NO:220)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与妥布霉素结合，并与妥布霉素相比于阿米卡星或卡那霉素选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列GTAGTC(SEQ ID NO:219)和/或TCGGTAG(SEQ ID NO:220)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列GTAGTC(SEQ ID NO:219)和/或TCGGTAG(SEQ ID NO:220)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列T GTAGTC(SEQ ID NO:219)和/或TCGGTAG(SEQ ID NO:220)或其变体和在任一侧(侧接)该一个或多个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合妥布霉素的一级适配体包含序列GTAGTC(SEQ ID NO:219)和/或TCGGTAG(SEQ ID NO:220)或其变体和在任一侧(侧接)该一个或多个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合妥布霉素的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CGT AGT CGG AAA CGG TGT CTC AGT TCCTCG GTA GAG TCG TCC C(SEQ ID NO:221,图82A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合妥布霉素的一级适配体包含SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:221的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合妥布霉素的一级适配体包含SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:221的核苷酸序列。所述适配体可以结合妥布霉素，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.15结合阿米卡星的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与阿米卡星结合，并与阿米卡星相比于妥布霉素或卡那霉素选择性结合(参见图83B、84B和85B)。
在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GC和GCCC(SEQID NO:222)和GTTTAGA(SEQ ID NO:223)和AGTCTT(SEQ ID NO:224)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与阿米卡星结合，并与阿米卡星相比于妥布霉素和卡那霉素选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GC和GCCC(SEQ ID NO:222)和GTTTAGA(SEQ ID NO:223)和AGTCTT(SEQ ID NO:224)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GC和GCCC(SEQ ID NO:222)和GTTTAGA(SEQ ID NO:223)和AGTCTT(SEQ ID NO:224)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GC和GCCC(SEQ ID NO:222)和GTTTAGA(SEQ ID NO:223)和AGTCTT(SEQ ID NO:224)或其变体和在任一侧(侧接)这四个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GC和GCCC(SEQ ID NO:222)和GTTTAGA(SEQ ID NO:223)和AGTCTT(SEQ ID NO:224)或其变体和在任一侧(侧接)这四个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合阿米卡星的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CCG CTT GCC CCCTGG CAT GTT TAG AGC AGA GTC TTT GGT CGT CCC(SEQ ID NO:225；图83A)。
在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GGTTCAT(SEQID NO:226)和ATGTGGG(SEQ ID NO:227)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与阿米卡星结合，并与阿米卡星相比于妥布霉素和卡那霉素选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GGTTCAT(SEQ ID NO:226)和ATGTGGG(SEQ ID NO:227)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GGTTCAT(SEQ ID NO:226)和ATGTGGG(SEQ ID NO:227)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GGTTCAT(SEQ ID NO:226)和ATGTGGG(SEQ ID NO:227)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列GGTTCAT(SEQ ID NO:226)和ATGTGGG(SEQ ID NO:227)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合阿米卡星的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CGT CCG GTT CAT GAC TTC AGT AGT CTA GTG GGG GTC TGT CGTCCC(SEQ ID NO:228；图84A)。
在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列CAA和CGTCTACGGCTTAGC(SEQ ID NO:229)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与阿米卡星结合，并与阿米卡星相比于妥布霉素和卡那霉素选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列CAA和CGTCTACGGCTTAGC(SEQ IDNO:229)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列CAA和CGTCTACGGCTTAGC(SEQ ID NO:229)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列CAA和CGTCTACGGCTTAGC(SEQID NO:229)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合阿米卡星的一级适配体包含序列CAA和CGTCTACGGCTTAGC(SEQ ID NO:229)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。例如，但不通过限制的方式，结合阿米卡星的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGA CGA CGC AAC CAT TCC AGT GGC GTC TAC GGCTTA GCT TTT CGT CGT CCC(SEQ ID NO:230；图85A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合阿米卡星的一级适配体包含SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合阿米卡星的一级适配体包含SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:230的核苷酸序列。所述适配体可以结合阿米卡星，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.16结合亚甲基蓝的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-6M的解离常数与亚甲基蓝结合，并与亚甲基蓝选择性结合(参见图86B、87B、88B、89B、90B和91B)。
例如，但不通过限制的方式，结合亚甲基蓝的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CCA GGA TGC TGT TCC ACC GGG GTA CAG GTA GGT CGC TGT CGT CCC(SEQ IDNO:231；图86A)。
例如，但不通过限制的方式，结合亚甲基蓝的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGG GCG TAG CGA TAG AAG AGA GCA GGG GGA GAG ACC TGT CGT CCC(SEQ IDNO:232；图87A)。
例如，但不通过限制的方式，结合亚甲基蓝的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGG GAA GGA GTT CCG GGG TAC GCG GGT AAG GGA AGG AGT CGT CCC(SEQ IDNO:233；图88A)。
例如，但不通过限制的方式，结合亚甲基蓝的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CCA ACG AGT ATA CGC TTA CGT CAC GTT GAT GCT GTG GGT CGT CCC(SEQ IDNO:234；图89A)。
例如，但不通过限制的方式，结合亚甲基蓝的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGC ATT GAT GTA CAA GCT CGA TTC GTA TCC CTT GAT CGT CGT CCC(SEQ IDNO:235；图90A)。
例如，但不通过限制的方式，结合亚甲基蓝的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CTG GGC TCG TGT TCT ATG GAC AAG GGG GAG TGA CCT GGT CGT CCC(SEQ IDNO:236；图91A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合亚甲基蓝的一级适配体包含SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合亚甲基蓝的一级适配体包含SEQ ID NO:231、SEQ IDNO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235或SEQ ID NO:236的核苷酸序列。所述适配体可以结合亚甲基蓝，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.17结合铵的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-2M的解离常数与铵离子结合，并与铵相比于甘氨酸或乙醇胺或钾离子选择性结合(参见图92B、93B、94B、95B、96B、97B和98B)。
例如，但不通过限制的方式，结合铵的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG AAG AGG CTC AGT GCT ATC TTA TCT GAG AGG GTT TGT CGT CCC(SEQ ID NO:239；图92A)。
例如，但不通过限制的方式，结合铵的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG GAG TGT CTC CTA AGG CCT TAG TAA GAA GGG TCC TGT CGT CCC(SEQ ID NO:240；图93A)。
例如，但不通过限制的方式，结合铵的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG GAA GAG GCT CGT GAG TTG ATG GGG AGA GGG TCC GGT CGT CCC(SEQ ID NO:241；图94A)。
例如，但不通过限制的方式，结合铵的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG AAG GGT CCC GTT GAG TTT GCA ATG GTG AGG GTT TGT CGT CCC(SEQ ID NO:242；图95A)。
例如，但不通过限制的方式，结合铵的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGC CGA TGG AAG GGG CCC TGG TGG GAG GGT CAA AGG GGT CGT CCC(SEQ ID NO:243；图96A)。
例如，但不通过限制的方式，结合铵的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG GCA GGT AGA TCT ACA TGA ATA TGA AGG AAT GAT CGT CGT CCC(SEQ ID NO:244；图97A)。
例如，但不通过限制的方式，结合铵的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CGG GGA GTA GCC GGG TGG TTA GTG TCT CGC GAG GAA GTC GTC CC(SEQ ID NO:245；图98A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合铵的一级适配体包含SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ IDNO:245的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合铵的一级适配体包含SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQID NO:245的核苷酸序列。所述适配体可以结合铵，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.18结合硼酸的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-2M的解离常数与硼酸结合，并与硼酸相比于双硼酸(例如，与葡萄糖络合的双硼酸)选择性结合(图99B、100B)。
例如，但不通过限制的方式，结合硼酸的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CCA GGT GGG GCT GCT CAA GTG GAG GTT CCT CGT CGT CCC(SEQ ID NO:247；图99A)。
例如，但不通过限制的方式，结合硼酸的适配体可以包含以下序列：CTC TCG GGACGA CCA GAG GGG CCT CAA ATG TGG GGT GTT GCT CGT CGT CCC(SEQ ID NO:248；图100A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合硼酸的一级适配体包含SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合硼酸的一级适配体包含SEQID NO:247或SEQ ID NO:248的核苷酸序列。所述适配体可以结合硼酸，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.19结合肾上腺素的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-3M的解离常数与肾上腺素结合，并与肾上腺素相比于血清素、去甲肾上腺素或多巴胺选择性结合(图101B、102B)。
例如，但不通过限制的方式，结合肾上腺素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CCG GGG TAG GGG TTA GGT GGG AAT GGA GCT GGA CCG TGT CGT CCC(SEQ IDNO:249；图101A)。
例如，但不通过限制的方式，结合肾上腺素的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA CGG ACC GTT GCC CTG GGG TAG TGC GCG CTT CGT TTA CGT CGT CCC(SEQ IDNO:250；图102A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合肾上腺素的一级适配体包含SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合肾上腺素的一级适配体包含SEQ ID NO:249或SEQ ID NO:250的核苷酸序列。所述适配体可以结合肾上腺素，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.20结合肌酸酐的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-2M的解离常数与肌酸酐结合，并与肌酸酐相比于肌酸或尿素选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合肌酸酐的一级适配体包含序列GGTGGCCT(SEQID NO:254)和AGGGGTG(SEQ ID NO:255)或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-2M的解离常数与肌酸酐结合(参见图103B、104B、105B、106B)，并与肌酸酐相比于肌酸或尿素选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合肌酸酐的一级适配体包含序列GGTGGCCT(SEQID NO:254)和AGGGGTG(SEQ ID NO:255)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合肌酸酐的一级适配体包含序列GGTGGCCT(SEQ ID NO:254)和AGGGGTG(SEQ ID NO:255)或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合肌酸酐的一级适配体包含序列GGTGGCCT(SEQ ID NO:254)和AGGGGTG(SEQ ID NO:255)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合肌酸酐的一级适配体包含序列GGTGGCCT(SEQ ID NO:254)和AGGGGTG(SEQ ID NO:255)或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合肌酸酐的适配体可以包含以下序列：GA CGA CGGTGGCCTTAATAGATAGATGATATTCTTAT ATGTG TGAGGGGTG GT CGT C(SEQ ID NO:256；图103A)。
例如，但不通过限制的方式，结合肌酸酐的适配体可以包含以下序列：GA CGA CGGTGGCCTATATTGGTATGTATGAA GAATAGAACTATTAGGGGGT GT C(SEQ ID NO:257；图104A)。
例如，但不通过限制的方式，结合肌酸酐的适配体可以包含以下序列：CGA CGGTGGCCTATTAAATAGCTTTAGTT TAAGAAAAGTAATAGGGGGT GT CG(SEQ ID NO:258；图105A)。
例如，但不通过限制的方式，结合肌酸酐的适配体可以包含以下序列：CTC TCGGGA CGA C GGTGGCCTATTAAGTAGCTTTA GTTCAAGAAAAGTAATAGGGGGT GT CGT CCC(SEQ IDNO:259；图106A)。
在某些非限制性实施方案中，分离的结合肌酸酐的一级适配体包含SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合肌酸酐的一级适配体包含SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258或SEQID NO:259的核苷酸序列。所述适配体可以结合肌酸酐，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.1.21.结合血管加压素的一级适配体
在某些非限制性实施方案中，一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与血管加压素结合，并与血管加压素相比于催产素或pressinoic acid选择性结合。
在某些非限制性实施方案中，结合血管加压素的一级适配体包含序列GTAGTACGTT(SEQ ID NO:260)和CAT或任何这些序列通过取代、缺失、插入或延伸而相差一个或两个碱基的变体，其中所述一级适配体在室温或25℃下在水溶液中以小于10-4M的解离常数与血管加压素结合(参见图107B)，并与血管加压素相比于催产素或pressinoic acid选择性结合。在某些非限制性实施方案中，结合血管加压素的一级适配体包含序列GTAGTACGTT(SEQ IDNO:260)和CAT或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血管加压素的一级适配体包含序列GTAGTACGTT(SEQ ID NO:260)和CAT或其变体，并且进一步包含至少一个操作序列，所述操作序列与传感器寡核苷酸中包含的序列互补。在某些非限制性实施方案中，结合血管加压素的一级适配体包含序列GTAGTACGTT(SEQ ID NO:260)和CAT或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列。在某些非限制性实施方案中，结合血管加压素的一级适配体包含序列GTAGTACGTT(SEQ ID NO:260)和CAT或其变体和在任一侧(侧接)这两个序列的至少一个操作序列，其中所述操作序列中的两个含有相互互补的部分并且可以形成双链体。
例如，但不通过限制的方式，结合血管加压素的适配体可以包含以下序列：GA CGTCCAAGTAGTACGTTTAATTAGG ATTTCCGAATTATTGGCATGC GT C(SEQ ID NO:261；图107A)
在某些非限制性实施方案中，分离的结合血管加压素的一级适配体包含SEQ IDNO:261的核苷酸序列或这些序列与原始序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％同源性的变体(例如通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处突变获得)。同源性百分比可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA确定。在某些非限制性实施方案中，分离的结合血管加压素的一级适配体包含SEQID NO:261的核苷酸序列。所述适配体可以结合血管加压素，并且以其结构转换形式(例如，在抗适配体测定、假夹心测定或夹心测定中)，它们可以通过荧光的增加来响应。
5.2抗适配体测定法
在某些实施方案中，提供了“抗适配体测定法”，其中使待测试目标分析物的存在和/或量的样品与有效量的以下物质接触：(1)包含与分析物结合的核心序列的一级适配体，和(2)与一级适配体的至少一部分互补的“抗适配体”，其中所述一级适配体和/或抗适配体包含可检测部分，所述可检测部分检测所述一级适配体和抗适配体是否与彼此结合；且其中与所述分析物结合的一级适配体不结合其抗适配体。
某些实施方案提供了检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)在如果不存在靶分析物则允许一级适配体和抗适配体之间形成双链体的条件下使样品的至少一部分与有效量的一级适配体和与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体接触，所述一级适配体和/或抗适配体包含允许检测和/或测量与分析物结合的一级适配体的量；和(ii)检测和任选地定量未与抗适配体结合的一级适配体的量。
样品可以是，例如且不限于，血液样品、血浆样品、血清样品、尿液样品、组织样品、脑脊髓液样品、痰液样品、粪便样品、水样品、工业样品等。
作为一个说明性实例，且不通过限制的方式，样品中目标分析物的存在或量可以通过如下测定：(i)在如果不存在分析物则允许发生在一级适配体和抗适配体之间的双链体形成的条件下使样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(a)包含荧光标记物的一级适配体和(b)与一级适配体的至少80％或至少90％或至少95％或至少98％互补的抗适配体，其包含如果一级适配体和抗适配体在双链体中(例如，作为双链分子)结合在一起则猝灭所述荧光标记物的荧光的部分；和(ii)检测和任选地定量荧光的量。可以将荧光的量与在样品不存在的情况下或在已知量的分析物(例如，标准曲线)存在的情况下由一级适配体和抗适配体的对照混合物产生的荧光的量进行进一步比较。如本领域技术人员所知，可以修改该实例。例如，可以使用不同的部分来检测双链体形成，诸如比色标记物、酶促标记物、放射性标记物等，并且可以在抗适配体上携带可检测的标记物，这取决于测定设计。
在某些实施方案中，一级适配体包含一个或多个操作序列，所述操作序列与抗适配体互补并促进双链体形成。例如，可以使用具有有利于双链体形成的核苷酸组成的操作序列(也就是说，“立足点(toe hold)”序列)。
抗适配体测定法和使用它的方法可以利用结合目标分析物的任何一级适配体，包括但不限于本文所述的那些。
抗适配体具有与其相应一级适配体的至少80％或至少90％或至少95％或至少98％互补的序列。
用于抗适配体测定中的一级适配体或抗适配体可以长度为约30至约200个核苷酸，或约30至100个核苷酸，或约30至80个核苷酸。
在某些非限制性实施方案中，一级适配体和抗适配体可以在测定中以约1:1的比率存在。取决于分析物和一级适配体之间和/或一级适配体和抗适配体之间的结合强度，可能需要改变该比率以产生具有所需特征的剂量-响应曲线(例如，能够测量/检测特定浓度的分析物)。作为一个说明性实例，且不通过限制的方式，如果一级适配体和分析物之间的结合相对于一级适配体和抗适配体之间的亲和力非常强，则可能需要增加抗适配体的相对量，使得比率为1:大于1。非限制性实例是约1:1；
在某些非限制性实施方案中，可以在溶液中进行抗适配体测定。在溶液中使用抗适配体测定法来检测各种分析物的非限制性实例显示于图3A-L中，其显示测量脱氧可的松(图3A-B)；醛固酮(图3C-D)；可的松(图3E-F)；睾酮(图3G-H)；Phen-CpRh(图3I-J)和苯丙氨酸(图3K-L)的结果。在如说明所提供的一个具体非限制性实例中，在缓冲液(20mM HEPES、1M NaCl、10mM MgCl2、5mM KCl,pH 7.5)中分开制备400nM FAM-适配体溶液和四倍浓缩的Iowa Black-抗适配体(“补体链”)溶液。通过在沸水中孵育5分钟来将这些溶液分别退火，并在室温下冷却～30分钟。同时，准备每种适配体的靶溶液的两倍浓缩物。在适配体和抗适配体溶液孵育30分钟时段之后，首先将18.75ul适配体溶液添加至384-孔板中，然后添加37.5ul靶溶液，然后立即添加18.75ul抗适配体溶液。在没有孵育的情况下，开始荧光测量并通过使用荧光读板器(Victor II微读板器,PerkinElmer)在室温下每5分钟读取>8小时。对于所有，适配体的最终浓度为100nM，互补链的浓度为100nM，除了75μL反应体积中的CS适配体(1000nM)。
在某些非限制性实施方案中，抗适配体测定可以在固相测定中进行，其中一级适配体或抗适配体结合至固相(例如，ELISA样形式)。使用抗适配体测定作为固相测定用于检测各种分析物的非限制性实例显示于图4A-C中：脱氧可的松(图4A)、葡萄糖(图4B)和苯丙氨酸(图4C)。
在某些非限制性实施方案中，提供了用于实施如本文所述的抗适配体测定的试剂盒。例如，所述试剂盒包含针对目标分析物的一级适配体和相应的抗适配体。可以在此类试剂盒中包含的一级适配体的非限制性实例包括本文所述、例如如部分5.1和图50A-B至102AB中所述的一级适配体，以及如本文所述的相应的抗适配体。所述试剂盒可以任选地进一步包含靶分析物，例如包含靶分析物的对照溶液，和/或标准曲线。
5.3假夹心测定
本申请公开了溶液中(图47A-D)和板上(图47E-F)的假夹心测定。在某些非限制性实施方案中，假夹心测定采用一级适配体。
某些实施方案提供了“假夹心测定”，或检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)使样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(a)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列和与传感器寡核苷酸互补的部分；(b)传感器寡核苷酸；和任选地(c)comp寡核苷酸；其中一个或多个与可检测部分结合，所述可检测部分可以检测一级适配体和传感器寡核苷酸是否与彼此结合或者一级适配体是否与分析物结合。
在某些非限制性实施方案中，所述方法包括：
(1)通过溶液相(图7)或固相选择分离一级适配体(Ap)，除非它们已经可用；使用对映异构体适配体(spiegelmer)，如果需要，以使Watson-Crick碱基配对最小化(例如，融合适配体或使没有分析物的背景相互作用最小化)；
(2)测试呈其结构转换形式的一级适配体并修改其结构转换形式，然后将其转变为假夹心测定形式(图6C)；
(3)通过溶液相或固相选择(图9)，在与靶标的复合物中使用一级适配体或spiegelmer，分离二级适配体(As)；和
(4)对靶标实施夹心测定(图8)。
公开的一级适配体的示例性列表以其传感器(结构转换)形式16-21连同其相关的传感器寡核苷酸提供于图10-46中。公开的一级适配体使用溶液相选择分离，并且可以用于基于适配体的测定中，不限于夹心和假夹心测定中。在某些非限制性实施方案中，一级适配体(图10-46)可以是核酸的spiegelmer或非天然的对映异构体22-25。在某些非限制性实施方案中，可以直接工程改造一级适配体以用于“假夹心”测定中(参见图6、图47和图48)。
“假夹心”测定将结合分析物的适配体(一级适配体或AP)的可逆相互作用转化为更稳定的部分双螺旋复合物，其可用于溶液相测定中(图6和图47A-D)，或溶液态测定中(板、珠粒或侧向流装置的组件)，在该情况下，其可以允许充分洗涤(图6和图47E-F)。
一旦一级适配体与其分析物结合就释放的稳定双螺旋产物也可以捕获至固态表面(例如，板孔或珠粒或侧向流垫)并进行充分洗涤，因此消除使用结构转换原理的其他基于适配体的测定中的许多高背景来源。然后可以使用与捕获寡核苷酸复合的寡核苷酸来生成扩增的读出值，其指示最初结合的分析物的存在和量，如在典型夹心ELISA中。
例如，互补寡核苷酸(CD)可以延伸(CDext)成适配体。尽管CD本身处于平衡状态，并且使用3-5当量来实现具有荧光素的适配体的猝灭，但CDext仅需要一个当量并且其几乎不可逆地与适配体结合。这有助于半响应点。
然后可以通过添加“立足点”区域进一步扩展CDext，所述“立足点”区域允许该动力学保护的稳定复合物和与CDext互补的寡核苷酸(CDext comp)相互作用。在溶液中过量的CDext comp的存在允许少量适配体形成结合口袋并与L相互作用。这触发平衡的建立，导致特定量的双螺旋形成，其随着双螺旋释放至溶液中而显著增加。该过程可以通过溶液中的荧光的增加来监测。
假夹心测定-在溶液中：
在某些非限制性实施方案中，可以进行溶液中的假夹心测定，其中双螺旋形成由脱氧皮质酮触发。在某些非限制性实施方案中，包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或类似物的一级适配体可以与CDext形成复合物并且在CDext comp存在的情况下在脱氧皮质酮和类似物存在的情况下可以产生荧光的增加。
在某些非限制性实施方案中，可以进行溶液中的假夹心测定，其中双螺旋形成由酪氨酸触发。在某些非限制性实施方案中，包含SEQID NO:33的核苷酸序列或类似物的一级适配体可以与CDext形成复合物并且在CDext comp存在的情况下在酪氨酸和类似物存在的情况下可以产生荧光的增加。
在某些非限制性实施方案中，可以进行溶液中的假夹心测定，其中双螺旋形成由葡萄糖触发。在某些非限制性实施方案中，包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或类似物的一级适配体可以与CDext形成复合物并且在CDext comp存在的情况下在葡萄糖和类似物存在的情况下可以产生荧光的增加。
在某些非限制性实施方案中，可以进行溶液中的假夹心测定，其中双螺旋形成由苯丙氨酸触发。在某些非限制性实施方案中，包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或类似物的一级适配体可以与CDext形成复合物并且在CDext comp存在的情况下在苯丙氨酸和类似物存在的情况下可以产生荧光的增加。
在某些非限制性实施方案中，如果CDext沉积在板上，当除去剩余溶液时，双螺旋仍然附接至板，并且现在可以将其充分洗涤。该双螺旋可以多种方式用于信号产生。
在板上的假夹心测定：
在某些非限制性实施方案中，调整溶液进化的适配体传感器用于固体表面形式应用、例如ELISA型测定中。具体地，溶液传感器-由分析物和包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列的特定适配体构成，所述特定适配体与CDext部分杂交-用附接化学法修饰以使得其能够锚定至固体表面。
在某些非限制性实施方案中，附接化学法包括使用生物素或马来酰亚胺和巯基官能团之间的共价键合。此外，用生物素-标签修饰竞争寡核苷酸CDext的互补链(CDext comp)(经优化以在分析物存在的情况下与CDext结合)，所述生物素-标签用于捕获产生“读出值”的分子，例如HRP缀合物。在某些非限制性实施方案中，使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(HRP的底物)进行“读出”，用于可视化。
在某些非限制性实施方案中，可以通过调整几种参数实施表面结合的传感器相对于+/-分析物的响应的优化，所述参数包括：表面上传感器的量；附接化学法，互补竞争寡核苷酸的浓度；每个步骤中的缓冲液；洗涤步骤；HRP浓度；HRP底物。
在某些实施方案中，一级适配体包含与传感器寡核苷酸的至少一部分互补的至少一个操作序列。
显示一级适配体和传感器寡核苷酸的配对的非限制性说明性实例显示于图10A-42A中。例如，但不通过限制的方式，结合葡萄糖的一级适配体(SEQ ID NO:1)包含与传感器寡核苷酸互补的操作序列(SEQ ID NO:82)；结合苯丙氨酸的一级适配体SEQ ID NO:2包含与传感器寡核苷酸互补的操作序列(SEQ ID NO:84)；结合苯丙氨酸的一级适配体SEQ IDNO:3包含与传感器寡核苷酸互补的操作序列(SEQ ID NO:86)；结合氢化可的松的一级适配体(SEQ ID NO5)包含与传感器寡核苷酸互补的操作序列(SEQ ID NO:90)，等。在某些非限制性实施方案中，可以进行在板上的假夹心测定以检测脱氧皮质酮。
样品可以是，例如且不限于，血液样品、血浆样品、血清样品、尿液样品、组织样品、脑脊髓液样品、痰液样品、粪便样品、水样品、工业样品等。
在某些非限制性实施方案中，前述测定可用于检测和/或定量任何目标分析物，并且在检测和/或定量具有小于约1000道尔顿或小于约500道尔顿或小于约200道尔顿的分子量的分析物中特别优于现有方法，所述分析物包括但不限于类固醇化合物，诸如但不限于皮质醇、醛固酮、脱氢异雄甾酮、孕酮、睾酮；葡萄糖；氨基酸，诸如但不限于苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、丙氨酸；药物化合物、维生素、毒素、神经递质(例如，儿茶酚胺、血清素)、多肽(血管加压素、催产素、血管紧张素、利钠肽、胰高血糖素、胰岛素和其它)、抗生素和抗真菌化合物(例如，氨基葡糖苷)、大环免疫抑制剂或脂质或脂质复合物。
在某些非限制性实施方案中，所述测定也可以应用于大分子，例如，高于1000D。
在某些非限制性实施方案中，提供了用于实施如本文所述的假夹心测定的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含针对目标分析物的一级适配体和相应的传感器寡核苷酸。可以在此类试剂盒中包含的一级适配体的非限制性实例包括本文所述、例如如部分6.1和图50A-B至102AB中所述的一级适配体，以及如本文所述的相应的传感器寡核苷酸。一级适配体/传感器寡核苷酸的非限制性实例显示于图10A-42A中。所述试剂盒可以进一步包含一种或多种如本文所述的comp寡核苷酸。所述试剂盒可以任选地进一步包含靶分析物，例如包含靶分析物的对照溶液，和/或标准曲线。
5.4夹心测定
“二级适配体”(AS)使一级适配体(AP)的复合物(AP*L)相比于游离的一级适配体与其靶分析物(配体，L)选择性结合，形成三元复合物(Ap*L*AS)。二级适配体通过溶液相或固相选择分离。公开的二级适配体的示例性非限制性列表提供于图48和49中。公开的二级适配体通过前述选择中的任一种分离。
在某些实施方案中，提供了夹心测定，其包括检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)使样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(a)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列以及当一级适配体与分析物结合时与二级“夹心”适配体结合的部分；(b)二级“夹心”适配体；其中一个或多个与可检测部分结合，所述可检测部分可以检测一级适配体和二级“夹心”适配体是否与彼此结合或未结合。
在某些实施方案中，一级适配体包含与夹心适配体(也称为二级适配体)结合的至少一个操作序列。
在某些非限制性实施方案中，二级适配体包含适配体('二级')，其与适配体(一级)结合，其中当后者与其配体(目标分析物)结合时，前者优先与后者结合。
在某些非限制性实施方案中，二级适配体包含序列('二级')，其与另一序列(一级)结合，其中当后者与分子结合时，前者优先与后者结合。
在某些非限制性实施方案中，本发明公开了分子的测定法(荧光测定法和ELISA样)，其使用两种寡核苷酸，当另一种寡核苷酸与该分子结合时，一种寡核苷酸优先与另一种寡核苷酸结合。
在某些非限制性实施方案中，一种适配体(一级)足以形成受体。
通过形成三元复合物(AP*L*AS)的二级适配体(AS；也称为夹心适配体或二级夹心适配体)实现在分子中没有第二结合位点(表位)的可用的“夹心”测定(图8)。在公开的夹心测定中，一级和二级适配体是“夹心”组分，其中L是靶标。在某些非限制性实施方案中，夹心测定可以在溶液(图48和49)中或在固体表面(图49)(在非限制性实例中，板、珠粒或侧向流装置的任何组件)上实施。
在某些非限制性实施方案中，提供了用于实施如本文所述的夹心测定的试剂盒。例如，所述试剂盒包含针对目标分析物的一级适配体和相应的夹心适配体(也称为二级适配体)。可以在此类试剂盒中包含的一级适配体的非限制性实例包括本文所述、例如如部分6.1和图50A-B至102AB中所述的一级适配体，以及如本文所述的相应的夹心/二级适配体。所述试剂盒可以任选地进一步包含靶分析物，例如包含靶分析物的对照溶液，和/或标准曲线。
样品可以是，例如且不限于，血液样品、血浆样品、血清样品、尿液样品、组织样品、脑脊髓液样品、痰液样品、粪便样品、水样品、工业样品等。
5.4.1.二级适配体的分离
本申请公开了使用SELEX方法分离二级适配体。
在某些非限制性实施方案中，可以进行选择二级适配体(As)的方法，其在一些情况下也可以组合(图9)，包括固态选择和溶液相选择。
固态选择
在固态选择期间，将靶适配体(Ap)附接至基质(例如，珠粒)，在靶分析物L存在的情况下与文库(例如，但不限于，预结构化或非结构化的N20-100)一起孵育，以分离对Ap*L复合物具有亲和力的适配体候选物(图9A)。将这些寡核苷酸PCR-扩增，再生单链种类，然后用于下一选择循环中。重复该过程，直至达到收敛，将合并物克隆和测序，得到As候选物。通过在L不存在的情况下消除针对Ap的结合剂来进行反选择，确保与复合物的结合。
溶液相选择
溶液相中的过程使用经由互补寡核苷酸附接至基质的预结构化的文库以使得能够在引物之间形成茎，并且选择As候选物，因为它们的环通过与Ap的结合而闭合并且它们从固体表面释放(图9B)。在该情况下，反选择是针对没有配体的Ap和配体本身。
在某些非限制性实施方案中，选择中使用的一级适配体可以由DNA、RNA、修饰的核苷酸或spiegelmer制备。Spiegelmer尤其适合于使背景最小化，增加亲和力和改善二级适配体的特性，因为它们是具有L-脱氧核糖或核糖的镜像核酸20-23，其不与天然DNA形成连续的Watson Crick碱基配对。在某些非限制性实施方案中，此类spiegelmer可以通过倒置平面分子或具有对称平面的分子(诸如血清素或多巴胺(可以倒置图28-39中描绘的适配体)或其他神经递质)的适配体来获得。
5.4.2.针对结合葡萄糖的一级适配体的二级适配体
更具体地，在某些非限制性实施方案中，可以针对葡萄糖根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与葡萄糖复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与单糖或寡糖复合时，通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的二级适配体或其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与葡萄糖复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.3.针对结合苯丙氨酸的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对苯丙氨酸根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与苯丙氨酸复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与氨基酸或肽复合时，通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的二级适配体或其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与苯丙氨酸复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.4.针对结合氢化可的松的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对氢化可的松根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与氢化可的松复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与氢化可的松复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.5.针对结合脱氢异雄甾酮的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对脱氢异雄甾酮根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与脱氢异雄甾酮复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与脱氢异雄甾酮复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.6.针对结合脱氧皮质酮的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对脱氧皮质酮使用前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当包含SEQ ID NO:12(图21)的核苷酸序列的一级适配体与脱氧皮质酮复合时，包含SEQ ID NO:34-35(图48)中任一者的核苷酸序列的二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与所述一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与脱氧皮质酮复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.7.针对结合睾酮的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对睾酮根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与睾酮复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与睾酮复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.8.针对结合鞘氨醇-1-磷酸的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对鞘氨醇-1-磷酸根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与鞘氨醇-1-磷酸复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与鞘氨醇-1-磷酸复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.9.针对结合多巴胺的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对多巴胺根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与多巴胺复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与多巴胺复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.10.针对结合血清素的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，针对血清素使用前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:58(图34和图48C和D)的核苷酸序列中任一者的一级适配体与血清素复合时，包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:59和SEQ IDNO:60(图48)的核苷酸序列中任一者的二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物中任一者与所述一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与血清素复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.11.针对结合酪氨酸的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对酪氨酸根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与酪氨酸复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与酪氨酸复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.4.12.针对结合L-酪氨酸的一级适配体的二级适配体
在某些非限制性实施方案中，可以针对L-酪氨酸根据前述方法分离二级适配体。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与L-酪氨酸复合时，二级适配体或通过Watson-Crick碱基对的取代、缺失和插入或通过在非保守位置处的突变获得的其类似物与一级适配体结合。在某些非限制性实施方案中，当一级适配体与L-酪氨酸复合时，二级适配体或其类似物与一级适配体结合，其中所述类似物包含与二级适配体的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；与二级适配体的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；和与二级适配体的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
在某些非限制性实施方案中，可以适当地修改和优化该方案以分离针对一级适配体的所有非限制性实例的二级适配体及其类似物(包括spiegelmer)，如图49中所描绘。对于具有低于100000道尔顿或低于2000道尔顿或低于1000道尔顿或低于500道尔顿或低于200道尔顿的分子量的任何分子，其也可以应用于一级适配体，并且其不能具有两个不彼此竞争的表位。
5.4.13额外的夹心测定实施方案
在某些非限制性实施方案中，本申请提供了具有荧光检测和ELISA样形式的夹心测定。
在上述假夹心测定中，没有真正的夹心相互作用(因此，'假夹心')，并且配体*适配体相互作用被“翻译”成双螺旋的存在，允许类似于非竞争性夹心ELISA的形式。然而，在某些实施方案中，夹心测定包括两个适配体，其同时结合一个分子而不与彼此竞争。
在本申请的某些非限制性实施方案中，已生成针对适配体*配体复合物的适配体或当一级适配体与配体复合时结合一级适配体的二级适配体(图8和图48)。在某些实施方案中，夹心测定导致高灵敏度。在某些非限制性实施方案中，针对适配体*配体复合物的适配体可以充当具有微调的互补性的复杂开关；在通过其中之一传感配体后，它们在三元(三级)复合物中集合在一起(图49)。
在溶液中的夹心测定
在某些非限制性实施方案中，对于脱氧皮质酮和血清素在溶液中形成夹心，并测量荧光读出值(图48A-C)。在该测定中，一级适配体在溶液中，并且也在溶液中的二级适配体以结构转换荧光形式转变，并且当一级适配体与通过猝灭剂标记的竞争寡核苷酸的释放靶向的类固醇复合时与一级适配体相互作用。
在板上的夹心测定
在某些非限制性实施方案中，对于血清素进行在板上的夹心测定(图48D-E)。在该测定中，一级适配体沉积在板上，而二级适配体当其与配体(在该情况下为血清素)复合时与一级适配体结合。
在某些非限制性实施方案中，前述测定可用于检测和/或定量任何目标分析物，并且在检测和/或定量具有小于约1000道尔顿或小于约500道尔顿或小于约200道尔顿的分子量的分析物中特别优于现有方法，所述分析物包括但不限于类固醇化合物，诸如但不限于皮质醇、醛固酮、脱氢表雄酮、孕酮、睾酮；葡萄糖；氨基酸，诸如但不限于苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、丙氨酸；药物化合物、维生素、毒素、神经递质(例如，儿茶酚胺、血清素)、多肽(血管加压素、催产素、血管紧张素、利钠肽、胰高血糖素、胰岛素和其它)、抗生素和抗真菌化合物(例如，氨基葡糖苷)、大环免疫抑制剂或脂质或脂质复合物。
在某些非限制性实施方案中，这些测定也可以应用于具有高于1000道尔顿的分子量的较大分子。
6.实施例1-一级适配体的分离
本实施例提供了用于分离一级适配体(AP)的方法和它们的结构的实例。
使用SELEX方法进行一级适配体的分离。通过溶液相选择分离一级适配体，因为该方法对于小分子具有固有的优点，诸如更高的亲和力和易于筛选适配体(表1)。非限制性实例提供于图10-46中。
该方法基于将与PCR引物之一互补的生物素化的链(CB)附接至琼脂糖-链霉抗生物素蛋白(图7)，和通过与引物的CB的互补相互作用附接来自文库(例如，但不限于，N8-N100)的序列。文库上的两个引物，5’-和3’-，也是部分互补的；文库的所有成员(其以有利于这些引物的互补区域之间的茎形成的方式与靶标相互作用)通过置换互补核苷酸(CB)从琼脂糖释放，并用于PCR扩增中。这产生潜在适配体的富集合并物。
荧光传感器通过如下直接从该选择获得：用dabcyl取代生物素并将荧光素附接至适配体(图6，CD)，证实适配体结合，测定其Kd(这是竞争性测定，因此半响应移位远离Kd 80，并且CD过量存在)，并建立选择性。
针对以下根据前述方法分离一级适配体：
1.D-葡萄糖(SEQ ID NO:1)；
2.L-苯丙氨酸(SEQ ID NO:2-4)；
3.氢化可的松(SEQ ID NO:5-7)；
4.脱氢异雄甾酮和脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)(SEQ ID NO:8-12)；
5.睾酮(SEQ ID NO:13-17)；
6.鞘氨醇-1-磷酸(SEQ ID NO:18)；
7.多巴胺(SEQ ID NO:19-23)；
8.血清素(SEQ ID NO:24-30)；
9.褪黑激素(SEQ ID NO:31-32)；和
10.L-酪氨酸(SEQ ID NO:33)。
公开的一级适配体与它们的靶分析物结合，并且以它们的结构转换形式，它们通过荧光的增加来响应于其存在(图10-46和图47A-D)。
表1.一级适配体序列。
呈其假定的二级结构的对于血清素分离的一级适配体(如用于选择(CB)或荧光传感(CD)中的互补寡核苷酸(C)所示)和假定的核心口袋(如图10-46中所示)的序列包括于表2中。
表2.呈其假定的二级结构的用于血清素的一级适配体、在其选择中使用的互补寡核苷酸和它们假定的核心口袋的序列。
表2-续
7.实施例2-假夹心测定
在本实施例中，提供了具有在溶液中和在板上的荧光检测(ELISA样形式)的假夹心测定。
调整溶液进化的适配体传感器用于固体表面形式应用、例如ELISA型测定中。溶液传感器-由分析物和与竞争寡核苷酸部分杂交的一级适配体构成-使用附接化学法进行修饰，以使得其能够锚定至固体表面。使用的表面附接化学法是生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用。此外，用生物素-标签修饰竞争寡核苷酸的互补链(经优化以在分析物存在的情况下与竞争寡核苷酸结合)，所述生物素-标签用于捕获“检测”分子，例如链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物。HRP底物，TMB，用于可视化。
通过调整参数实施表面结合的传感器相对于+/-分析物的响应的优化，所述参数包括：表面上传感器的量、附接化学法、互补竞争寡核苷酸的浓度、每个步骤中的缓冲液、洗涤步骤、HRP浓度和HRP底物。
假夹心测定的实验程序-在溶液中
溶液缓冲液具有SELEX缓冲液或传感器显示在其中起作用的任何其他缓冲液的组成。每个样品孔含有50nM适配体-CDext双链体的最终浓度(相对于适配体具有化学计量的CDext，或者两倍或三倍过量)。添加选定浓度的分析物，并添加CDext的互补序列至2μM的最终浓度。将最终混合物在室温下孵育20分钟，然后测量荧光信号。
对于以下进行溶液中的假夹心测定，其中由分析物触发双螺旋形成：
1.脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)；
2.L-酪氨酸；
3.D-葡萄糖；和
4.L-苯丙氨酸。
一级适配体与CDext形成复合物，并且在CDext comp存在的情况下在其靶分析物存在的情况下产生荧光的增加(图47A-D)。
如果CDext沉积在板上，当除去剩余溶液时，双螺旋仍然附接至板，并且可以将其充分洗涤。
假夹心测定的实验程序-在固态中
在链霉抗生物素蛋白包被的板上的脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)传感器ELISA如下进行：含有100μl PBS缓冲液的链霉抗生物素蛋白包被的ELISA板(Thermo，结合容量5皮摩尔)的每孔添加PBS pH7.4缓冲溶液中的151.5皮摩尔(6.6μL x 30μM)DOG传感器，以得到1.44μM的最终传感器浓度。将混合物在室温下孵育5分钟。然后从孔中除去溶液，并将孔用PBS缓冲液彻底洗涤8次。接下来，每孔添加100μL TRIS pH 7.4缓冲液(由20mM TRIS、140mMNaCl、5mM KCl和2mM MgCl2构成)，随后添加2μL溶解于DMSO中的2mM DOG，以得到50μM的最终脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)浓度。然后添加含有生物素标签的单链补体(2μL的100μM储备物)，以得到1.79μM的最终浓度。将混合物在室温下孵育20分钟。然后除去溶液，并将孔用PBS缓冲液彻底洗涤8次。然后每孔添加100μl含有1％BSA和8000倍稀释的HRP-STV缀合物的PBS，并在室温下孵育5分钟。除去溶液，并将孔用PBS缓冲液彻底洗涤8次。然后向每个孔中添加100μL TMB/H2O2底物，并在读板器上在652nm处监测反应进程。
链霉抗生物素蛋白-ELISA 96-孔板上的脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)浓度依赖性的结果显示于图47E中。将8个孔用适配体传感器包被并暴露于各种浓度的脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)分析物，随后用HRP酶标记，并通过添加TMB底物定量，所述TMB底物通过H2O2/HRP氧化成蓝色产物。测量与每个孔中结合的HRP酶的量成比例的TMB氧化的时间过程以及浓度依赖性(图47E)。
在链霉抗生物素蛋白包被的板上的苯丙氨酸(Phe)传感器ELISA如下进行：对Phe传感器进行前述程序，除了在20mM HEPES pH7.5、1M NaCl、10mM MgCl2、5mM KCl中实施20分钟孵育步骤。使用的Phe浓度为来自2mM水中的储备溶液的0-200μM。链霉抗生物素蛋白-ELISA 96-孔板上的Phe浓度依赖性的结果显示于图47F中。
8.实施例3-二级适配体的分离
本实施例公开了分离二级适配体(AS)的方法及其结构。
使用SELEX方法进行二级适配体的分离。进行两种用于选择二级适配体(As)的方法，其在一些情况下也可以组合(图9：
(1)固态选择。
将靶适配体(Ap)附接至基质(例如，珠粒)，在靶分析物L存在的情况下与文库(例如，但不限于，预结构化或非结构化的N20-100)一起孵育，以分离对Ap*L复合物具有亲和力的适配体候选物(图9A)。将这些寡核苷酸PCR-扩增，再生单链种类，然后用于下一选择循环中。重复该过程，直至达到收敛，将合并物克隆和测序，得到As候选物。通过在L不存在的情况下消除针对AP的结合剂来进行反选择，确保与复合物的结合。
(2)溶液相选择。
溶液相中的过程使用经由互补寡核苷酸附接至基质的预结构化的文库以使得能够在引物之间形成茎，并且选择As候选物，因为它们的环通过与Ap的结合而闭合并且它们从固体表面释放(图9B)。在该情况下，反选择是针对没有配体的Ap和配体本身。
针对以下使用前述方法分离二级适配体：
1.脱氧皮质酮(SEQ ID NO:34-35)；
2.血清素(SEQ ID NO:36、59和60)；
当一级适配体与其靶分析物复合时，二级适配体与第一适配体结合(图48)。
二级适配体的核苷酸序列显示于表3中。
表3.二级适配体序列。
基于用于血清素的一级适配体的核苷酸序列分离用于血清素的二级适配体，其包含：CGACTGGTAGGCAGATAGGGGAAGCTGATTCGATGCGTGGG TCG(SEQ ID NO:58)，其衍生自核苷酸序列SEQ ID NO:25(图48A-C)。分离用于血清素的二级适配体，其包含以下核苷酸序列：TCTGTGTCATGTGGATTGTGACTTGCCCACAACGATTTTGCC AAACATGCATAGCCACATGAC(SEQ ID NO:59)，其呈其假定的二级结构(图48A-C)。
使用分离的一级和二级适配体来进行夹心测定，如实施例4中所述。包含以下核苷酸序列的互补寡核苷酸用于荧光传感：CACATGACACAGA(SEQ ID NO:61)。
9.实施例4-夹心测定
在本实施例中，提供了具有荧光检测和ELISA样形式的夹心测定的实例。
在上述假夹心测定中，没有真正的夹心相互作用(因此，'假夹心')，并且配体*适配体相互作用被“翻译”成双螺旋的存在，允许类似于非竞争性夹心ELISA的形式。然而，真正的夹心需要两个适配体(类似于两个抗体)，其同时结合一个分子而不与彼此竞争。这对于小分子可能是困难的，仅仅因为它们缺乏两个表位。
可替代方法描绘于图8和图48中，其中已生成针对适配体*配体复合物的适配体或当一级适配体与配体复合时结合一级适配体的二级适配体。该方法的优点是它是可以导致更好的灵敏度的真正的夹心。针对适配体*配体复合物的适配体充当具有微调的互补性的复杂开关；在通过其中之一传感配体后，它们在三元(三级)复合物中集合在一起。
夹心测定的实验程序-在溶液中
溶液缓冲液具有SELEX缓冲液或传感器显示在其中起作用的任何其他缓冲液的组成。用于测量血清素的缓冲液是包括2mM MgCl2的PBS缓冲液。为了测量脱氧皮质酮和睾酮，缓冲液由20mM HEPES、1M NaCl、10mM MgCl2和5mM KCl(pH 7.5)组成。
平行制备分开的溶液：(1)在缓冲液中制备4倍浓缩的一级适配体(AP)并在加热至沸腾的水浴中孵育>5分钟，直至用于展开二级结构，然后与四倍浓缩的分析物(L)(例如20μL 4X浓缩的AP(例如，10μM)和20μL 4X浓缩的血清素溶液(例如，800μM))混合并孵育>30分钟。血清素的最终浓度为400μM，且复合物AP-血清素的最终浓度为5μM。这是Ap-血清素复合物溶液的2X浓度。(2)制备两倍浓缩的二级适配体(AS)溶液。将FAM荧光缀合的AS(100nM)和其dabcyl-猝灭剂链混合，dabcyl-猝灭剂链为三至五倍过量用于足够猝灭。将该混合物在加热至沸腾的水浴中孵育>5分钟-用于促进二级结构的展开和与猝灭剂链的杂交。将40μL分开制备的溶液(1)和(2)各自混合并孵育40分钟。然后取75μL混合溶液用于测量。测量荧光信号。每种样品含有最终浓度为2.5-5μM一级适配体(AP)、50nM二级适配体AS、150nM-250nM dabcyl猝灭剂链以及图中指定浓度的分析物。
夹心测定–在固态中
首先，制备配体(L)和一级适配体(Ap)溶液。在缓冲液中制备400μL 2X浓缩的Bio-TEG缀合的一级适配体(0.6皮摩尔/μL)，并在沸水中孵育>5分钟，直至使用。制备两倍浓缩的血清素溶液(例如，缓冲液中400μM，50μL)，然后与50μL配体和50μL AP溶液混合并孵育>30分钟。血清素的最终浓度为200μM，且复合物AP-血清素的最终浓度为30皮摩尔/孔。其次，大量制备Bio-TEG修饰的二级适配体溶液，并且每孔应用100μL(0.5皮摩尔/μl)。将该溶液在加热至沸腾的水浴中孵育>5分钟，并使其冷却，直至使用。在制备这些溶液之后，实施ELISA测定。将ELISA板孔用PBS(+2mM MgCl2)缓冲液洗涤2次，其中在洗涤之间浸泡5分钟。将AS溶液(100μL)添加至孔中，然后在室温下孵育～20分钟以使生物素与板结合。然后除去溶液，并将孔用相同的缓冲液彻底洗涤8次。然后，将100μL[L*AP]溶液添加孔中并在室温下孵育>30分钟。然后除去溶液，并将孔用相同的缓冲液彻底洗涤8次。然后每孔添加100μl含有1％BSA和10000倍稀释的HRP-STV缀合物的PBS，并在室温下孵育5分钟。除去溶液，并将孔用相同的缓冲液彻底洗涤10次。直接在该洗涤之后，然后向每个孔中添加100μL TMB/H2O2底物，并在读板器上在370或652nm处监测反应进程。
对以下分析物进行在溶液中形成夹心时的荧光读出值(图48A-C)：
1.脱氧皮质酮21-葡糖苷(DOG)；和
2.血清素。
在该测定中，一级适配体在溶液中，并且也在溶液中的二级适配体以结构转换荧光形式转变，并且当一级适配体与通过猝灭剂标记的竞争寡核苷酸的释放靶向的类固醇复合时与一级适配体相互作用(图48A-C)。
对以下分析物进行在板上的夹心测定：
1.血清素。在该测定中，一级适配体沉积在板上，而二级适配体当其与血清素复合时与一级适配体结合(图48D-E)。
10.实施例5抗适配体测定
在缓冲液(20mM HEPES、1M NaCl、10mM MgCl2、5mM KCl,pH 7.5)中分开制备400nMFAM-适配体溶液和四倍浓缩的IowaBlack-互补链溶液。通过在沸水中孵育5分钟来将这些溶液分别退火，并在室温下冷却～30分钟。同时，制备每种适配体的靶溶液的两倍浓缩物；最终浓度显示于每个图中。在适配体和互补链溶液孵育30分钟时段之后，首先将18.75ul适配体溶液添加至384-孔板中，然后添加37.5ul靶溶液，然后立即添加18.75ul互补链溶液。在没有孵育的情况下，开始荧光测量并通过使用荧光读板器(Victor II微读板器,PerkinElmer)在室温下每5分钟读取>8小时。对于所有，适配体的最终浓度为100nM，互补链的浓度为100nM，除了75μL反应体积中的CS适配体(1000nM)。在每个图中指示靶标/配体的浓度。
每种适配体及其互补链列于下面。结果显示于图3A-L中。
(A)DOG适配体/互补(100nM:100nM)
-DOGS.2_sht/DOGS.2_sht_anti:CGA CCC GGA TTT TCC GAG TGG AAC TAG CTGTGG CGG TCG/36-FAM/；/5IABkFQ/CGA CCG CCA CAG CTA GTT CCA CTC GGA AAA TCC GGGTCG
-DOGS.2_Full/DOGS.2_Full_anti:/56-FAM/CTC TCG GGA CGA CCC GGA TTT TCCGAG TGG AAC TAG CTG TGG CGG TCG TCC C；GGG ACG ACC GCC ACA GCT AGT TCC ACT CGGAAA ATC CGG GTC GTC CCG AGA G/3IABkFQ/
(B)ALD适配体/互补:(100nM:100nM)
-ALDS.1_sht/ALDS.1_sht_anti:CGA CAG ATA GTT GTT CTT AGC GAT GTT CAGCGT TGT CG/36-FAM/；/5IABkFQ/CGA CAA CGC TGA ACA TCG CTA AGA ACA ACT ATC TGTCG
-ALDS.1_Full/ALDS.1_Full_anti:/56-FAM/CTC TCG GGA CGA CAG ATA GTT GTTCTT AGC GAT GTT CAG CGT TGT CGT CCC；GGG ACG ACA ACG CTG AAC ATC GCT AAG AACAAC TAT CTG TCG TCC CGA GAG/3IABkFQ/
(C)CS适配体/互补:(100nM:1000nM)
CSS.1_sht/CSS.1_sht_anti:GAC GAC GCC CGC ATG TTC CAT GGA TAG TCT TGACTA GTC GTC/36-FAM/；/5IABkFQ/GACGAC TAG TCA AGA CTA TCC ATG GAA CAT GCG GGCGTC GTC
(D)TES适配体/互补:TES.1_sht/TES.1_sht_anti:ACG GGA TGT CCG GGG TACGGT GGT TGC AGT TCG T/36-FAM/；/5IABkFQ/ACG AAC TGC AAC CAC CGT ACC CCG GACATC CCG T
(E)Phe-CpRh适配体/互补:
Phe-CpRh_sht/Phe-CpRh_sht_anti:/56-FAM/CGA CAC AGC GTG AGC CAA CTAATT AGT GCG TAT TGT CG；CGA CAA TAC GCA CTA ATT AGT TGG CTC ACG CTG TGT CG/3IABkFQ/
(F)Phe适配体/互补:
Phe_sht/Phe_sht_anti:/GAC CGG TGG GGG TTC TTT TTC AGG GGA GGT ACGGTC/36-FAM/；/5IABkFQ/GAC CGT ACC TCC CCT GAA AAA GAA CCC CCA CCG GTC
11.实施例6-夹心测定
图49H显示与血清素(SRTNS.1)结合的一级适配体(AP)和与适配体(一级)结合的二级适配体(SRTN第2Apt1:GTG GTT AGT AAC TTG CAC GCC GCC CAA TTG CTA TTC ATGACA AGC CAC(SEQ ID NO:251)，其中当后者与其配体结合时前者优先与后者结合。具有虚线的彩色字母表明两个适配体之间的假设的部分杂交区域。通过将二级适配体固定在链霉抗生物素蛋白包被的板上和将一级适配体置于溶液中，将那两种适配体应用于ELISA样测定。分光光度信号与血清素分析物成比例地增加。所述信号通过SRTNS.1上缀合的生物素产生，结合链霉抗生物素蛋白–HRP缀合物，催化底物TMB(图49I)。信号的增加证实当血清素以渐增浓度存在时存在更多的结合。
图49J显示与血清素(金色球)结合的一级适配体和与适配体(一级)结合的二级适配体(AS)(SRTN第2Apt.2：TCT GTG TCA TGT GGATTG TGA CTT GCC CAC AAC GAT TTT GCCAAA CAT GCA TAG CCA CAT GAC(SEQ ID NO:252)，其中当后者与其配体结合时前者优先与后者结合。具有虚线的彩色字母表明两个适配体之间的部分杂交区域。SRTN第2Apt.2(F缀合链，‘F’表示荧光素)以基于配体和携带猝灭剂(D，dabcyl)的互补寡核苷酸之间的竞争的形式显示。猝灭剂链(灰色CD)首先通过靶标(SRTNS.1+血清素)结合后的二级构象变化与适配体的5’末端杂交。该猝灭剂从适配体链释放并导致荧光信号增加。红线高于蓝线表明，当存在(下方)任一适配体(AP)时(即，当添加针对已经存在的配体的一级适配体时发生结合)或当在已经存在一级适配体时向溶液中添加(上方)血清素时，具有猝灭剂(CD)的互补寡核苷酸被置换(图49K)。
图49L显示修整的二级适配体(SRTN第2Apt1)在板上且二级适配体(SRTNS.1)在溶液中的ELISA测定法，其通过缀合至链霉抗生物素蛋白的HRP、链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物扩增，催化底物TMB。红线显示当存在血清素时存在更多结合(图49M)。在某些非限制性实施方案中，其中存在一级和二级适配体的反向形式都是可能的。
图49N显示与DOG(DOGS.2)结合的一级适配体(AP)，与适配体(一级)结合的二级适配体(AS)，其中当后者与其配体结合时前者优先与后者结合(DOG第2Apt.1：TCT GTG TCATGT GGC GCC TCG ACC CCA GCC TTG GTA GCT GTT GGC CAC ACA AGA GCA CAT GAC(SEQID NO:253)。具有虚线的彩色字母表明两个适配体之间的部分杂交区域。DOG第2Apt.2(F缀合链，‘F’表示荧光素)以基于配体和携带猝灭剂(D，dabcyl)的互补寡核苷酸之间的竞争的形式显示。猝灭剂链(灰色)首先通过靶标(DOGS.2+DOG)结合后的二级构象变化与适配体的5’末端杂交，该猝灭剂从适配体链释放。其导致荧光信号增加。(上方)显示，当我们添加DOG(类固醇浓度在X-轴上)，二级适配体与一级适配体结合，且(下方)显示二级适配体仅在一级适配体存在的情况下与DOG结合(图49O)。
12.实施例7-用于二级适配体ELISA(夹心测定)的方案
在板上的二级适配体和溶液方法中的一级适配体(图49P)。将生物素化的二级适配体在适当的缓冲液中在链霉抗生物素蛋白包被的板上在室温下固定约30分钟，然后用缓冲液洗涤以除去过量的未结合的适配体。将一级适配体及其靶标在室温下预孵育40分钟，然后添加至固定的二级适配体中，在板上孵育40分钟。接下来添加在100μl PBS(w.1％BSA)中10000倍稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP，孵育20分钟，然后用PBS彻底洗涤。然后添加TMB底物混合物并记录在370nm处的吸光度变化45分钟。
在板上的一级适配体和在溶液”方法中的二级适配体(图49Q)。将生物素化的一级适配体在适当的缓冲液中在链霉抗生物素蛋白包被的板上在室温下固定约30分钟，然后用缓冲液洗涤以除去过量的未结合的适配体。然后将靶溶液添加至固定的一级适配体中并孵育约40分钟。将二级适配体添加至靶溶液顶部的板上并孵育约40分钟，然后用缓冲液洗涤以除去未结合的二级适配体。接下来添加在100μl PBS(w.1％BSA)中10000倍稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP，孵育20分钟，然后用PBS彻底洗涤。然后添加TMB底物混合物并记录在370nm处的吸光度变化45分钟。
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本文引用各种参考文献，其内容在此以其整体通过引用并入。
Claims (41)
1.用于测试样品中目标分析物的存在和/或量的测定法，其包括使所述样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(1)包含与分析物结合的核心序列的一级适配体，和(2)与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体，其中所述一级适配体和/或抗适配体包含可检测部分，所述可检测部分检测所述一级适配体和抗适配体是否与彼此结合；且其中与所述分析物结合的一级适配体不结合其抗适配体。
2.权利要求1的测定法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
3.权利要求1或2的测定法，其中所述抗适配体包含猝灭剂部分。
4.权利要求1、2或3的测定法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少85％互补。
5.权利要求4的测定法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少95％互补。
6.权利要求1-5中任一项的测定法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸和肾上腺素。
7.检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)在如果不存在靶分析物则允许一级适配体和抗适配体之间形成双链体的条件下使样品的至少一部分与有效量的一级适配体和与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体接触，所述一级适配体和/或抗适配体包含允许检测和/或测量与分析物结合的一级适配体的量；和(ii)检测和任选地定量未与抗适配体结合的一级适配体的量。
8.权利要求7的方法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
9.权利要求7或8的方法，其中所述抗适配体包含猝灭剂部分。
10.权利要求7、8或9的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少85％互补。
11.权利要求10的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少95％互补。
12.权利要求7-11中任一项的方法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
13.检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)在如果不存在分析物则允许一级适配体和抗适配体之间形成双链体的条件下使样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(a)包含荧光标记物的一级适配体和(b)抗适配体，其包含如果一级适配体和抗适配体在双链体中结合在一起则猝灭所述荧光标记物的荧光的部分；和(ii)检测和任选地定量荧光的量。
14.权利要求13的方法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
15.权利要求13或14的方法，其中所述抗适配体包含猝灭剂部分。
16.权利要求13、14或15的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少85％互补。
17.权利要求16的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少95％互补。
18.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
19.试剂盒，其包含与目标分析物结合的一级适配体和与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
21.权利要求19或20的试剂盒，其中所述抗适配体包含猝灭剂部分。
22.权利要求19、20或21的试剂盒，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少85％互补。
23.权利要求22的试剂盒，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少95％互补。
24.权利要求19-23中任一项的试剂盒，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
25.检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)使样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(a)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列和与传感器寡核苷酸互补的部分；(b)传感器寡核苷酸；和任选地(c)comp寡核苷酸；其中一个或多个与可检测部分结合，所述可检测部分可以检测一级适配体和传感器寡核苷酸是否与彼此结合或者一级适配体是否与分析物结合。
26.权利要求25的方法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
27.权利要求25或26的方法，其中所述传感器寡核苷酸包含猝灭剂部分。
28.权利要求25、26或27的方法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
29.试剂盒，其包含与目标分析物结合的一级适配体和与一级适配体的一部分互补的传感器寡核苷酸。
30.权利要求29的试剂盒，其进一步包含comp寡核苷酸。
31.权利要求29或30的试剂盒，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
32.权利要求29、30或31的试剂盒，其中所述传感器寡核苷酸包含猝灭剂部分。
33.权利要求29-32中任一项的试剂盒，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
34.检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)使样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(a)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列以及当一级适配体与分析物结合时与二级“夹心”适配体结合的部分；(b)二级“夹心”适配体；其中一个或多个与可检测部分结合，所述可检测部分可以检测一级适配体和二级“夹心”适配体是否与彼此结合或未结合。
35.权利要求34的方法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
36.权利要求34或35的方法，其中所述二级“夹心”适配体包含猝灭剂部分。
37.权利要求34、35或36的方法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
38.试剂盒，其包含与目标分析物结合的一级适配体和与结合分析物的一级适配体结合的二级“夹心”适配体。
39.权利要求38的试剂盒，其中所述一级适配体包含荧光标记物。
40.权利要求38或39的试剂盒，其中所述二级“夹心”适配体包含猝灭剂部分。
41.权利要求38-40中任一项的试剂盒，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。
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