KR20190015385A - 압타머-기반의 분석물 분석법 - Google Patents

압타머-기반의 분석물 분석법 Download PDF

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밀란 스토자노빅
경애 양
스티븐 테일러
네나드 밀로사빅
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더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

본 발명은 1차 및 2차 압타머를 포함하는, 분석물을 포획 및/또는 검출하기 위한 압타머-기반의 분석법, 및 이러한 1차 및 2차 압타머를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 분석물은, 항체에 대해 제한된 상호 비-경쟁적인 에피토프를 제공하는, 즉, 1차 및 2차 항체 또는 1차 및 2차 압타머를 사용하는 비-경쟁적 샌드위치 분석법에서의 측정에서 제한된 능력을 가지는 소분자들을 포함한다.

Description

압타머-기반의 분석물 분석법
우선권 주장
본 출원은 2016년 6월 3일에 출원된 미국 가출원번호 62/345,641 및 62/345,697, 및 2016년 6월 6일에 출원된 미국 가출원번호 62/346,374에 대해 우선권을 주장하며, 상기 각 문헌들의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
승인 정보
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인 번호 RGM104960 및 미국국립과학재단(National Science Foundation) 에 의해 수여된 승인 번호 CCF1518715하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 항체에 대해 제한된 상호 비-경쟁적인 에피토프를 제공하기 때문에 전통적인 항체 샌드위치-형 분석법을 사용한 검출 또는 측정이 어려운 소분자들을 포함하는 분석물을 포획 및/또는 검출하기 위한 압타머-기반의 분석법에 관한 것이다.
비-경쟁적인 샌드위치 분석법은 분석물을 포획하여 검출하는 두 개의 상이한 결합 요소들을 사용한다1 -5. 예를 들어, 샌드위치 분석 포맷의 전형적인 예는 플레이트 상에서의 효소결합 면역흡착법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)으로, 표적 분석물(예를 들어, 단백질)에 대한 하나의 항체(포획 항체)가 고체 지지체(예를 들어, 플레이트)에 결합되고, 분석물이 결합한 다음, 검출가능한 모이어티를 포함하는 2차 항체("검출 항체")가 도입되어 포획된 분석물 상의 다른 부위에 결합한다. 선택적인 결합 부위들이 전형적으로 분석물 상에 존재하기 때문에, 과량의 시약의 존재에서, 이들 분석법은 경쟁적 분석법보다 더 민감하고, 증가된 신호로 리간드를 검출하고, 더 적은 노이즈를 가질 수 있다. 상기 샌드위치 원리는 또한 비-특이적 상호작용을 최소화하는 더 엄격한 세척 프로토콜을 허용한다. 표적 분석물과 상호작용하는 두 개 이상의 결합 요소를 이용한 원리(즉, "샌드위칭")는 또한 ELISA 외에도 측방 유동 분석법(lateral flow assay) 또는 라텍스-기반의 응집 분석법(latex-bead agglutination assay)과 같은 다른 분석법에 사용될 수 있다.
샌드위치 접근법은, 두 개의 항체가 한번에 결합하기에는 너무 작을 수 있는 작은 분석물들(예를 들어, 스테로이드 또는 카테콜아민, 또는 바소프레신과 같은 일부 소펩타이드) 또는 비-면역원성인 작은 분석물들(예를 들어, 페닐알라닌 또는 글루코스와 같은 분자들)에 대해서는 문제가 된다. 소분자들에 대한 항체가 이용가능할 때, 몇가지 특이한 접근법들이6 -9 소분자들에 대한 ELISA-유사 분석을 개발하였다.
압타머(aptamer)는 소분자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드-기반의 수용체이다9-15. 압타머는 전통적인 샌드위치 분석법에 예전에 사용되었지만, 전통적인 샌드위치 분석법은 분석물의 하나 이상의 결합 부위의 이용가능성에 의존한다. 따라서, 다양한 에피톱들의 결핍으로 인한 문제를 극복하는, 소분자들을 검출하는 수단에 대한 필요가 존재한다.
Cox, K. L.; Devanarayan, V.; Kriauciunas, A.; Manetta, J.' Montrose, C.; Sittampalam, S. "Immunoassay Methods" in Assay Guidance Manual (Internet), NCBI Resources Bookshelf; last updated: December 24, 2014.. Gan, S.D.; Patel, K. R. "Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" J Investig Derm 133, e12 (2013) Lequin, R. "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Clinical Chemistry 51(12): 2415-2418 (2005). Fan, M.; He, J. "Recent Progress in Noncompetitive Hapten Immunoassays: A review" Chapter 5 in Trends in Immunolabelled and Related Techniques, www.intechopen.com , accessed at: 06/01/2015. Wilson, R. "Sensitivity and Specificity: Twin Goals of Proteomics Assays" Expert Rev Proteomics 10(2): 135-149 (2013). Dong, J.-X.; Xu, C.; Wang, H.' Xiao, Z.-L.; Gee, S. J.; Li, Z.-F.; Wang, F.; Wu, W.-J.; Shen, Y.-D.; Yang, J.-Y.; Sun, Y.-M.; Hammock, B. D. "Enhanced Sensitive Immunoassay" Noncompetitive Phage AntiImmune Complex Assay for the Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green" J Agric Food Chem 62(34): 8752-8758 (2014). Ihara, M.; Suzuki, T.; Kobayashi, N.; Goto, J.; Ueda, H. "Open-Sandwich Enzyme Immunoassay for One-Step Noncompetitive Detection of Corticosteroid 11-Deoxycortisol" Anal Chem 81(20): 8298-8304 (2009). Shen, J.; :Li, Y.; Gu, H.; Xia, F.; Zuo, X. "Recent Development of Sandwich Assay based on Nanobiotechnologies for Proteins, Nucleic Acids, Small Molecules, and Ions" Chem Rev 114(15): 7631-7677 (page 7662) (2014). Ozer, A.; Pagano, J. M.; Lis, J. T. "New Technologies Provide Quantum Changes in the Scale, Speed, and Success of SELEX Methods and Aptamer Characterization" Molecular Therapy Nucleic Acids 3: e 183 (2014). McKeague, M.; Derosa, M. C. "Challenges and opportunities for small molecule aptamer development." J Nucleic Acids, Article ID 748913 (2012). Rohloff, J. C.; Gelinas, A. D.; Jarvis, T. C.; Ochsner, U. A.; Schenider, D. J.; Gold, L.; Janjic, N. "Nucleic Acid Ligands with Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents" Molecular Therapy Nucleic Acids 3: e:201 (2014). Ellington, A. D. & Szostak, J. W. "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands" Nature (London) 346: 818-822 (1990). Tuerk, C. & Gold, L. "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" Science 249(4968):505-510 (1990). Cho, E. J.; Lee, J.-W.; Ellington, A. D. "Applications of Aptamers as Sensors" Annu. Rev. Anal Chem 2:241-264 (2009). Keefe, A. D.; Pai, S.; Ellington, A. "Aptamers as therapeutics" Nat Rev Drug Discovery, 9:537-550 (2010). Yang, K.-A.; Pei, R.; Stefanovic, D.; Stojanovic, M. N. "Optimizing Cros-reactivity with Evolutionary Search for Sensors" J Am Chem Soc 134:1642-1647 (2012). Stoltenburg, R.; Nikolaus, N.; Strehlitz, B. "Capture-SELEX: Selection of DNA Aptamers for Aminoglycoside Antibiotics" J Anal Meth Chem 15697 (2012). Rajendran M,; Ellington, A. D. "Selection of fluorescent aptamer beacons that light up in the presence of zinc" Anal Bioanal Chem 390:1067-75 (2008). Nutiu, R.; Li, Y. "In vitro selection of structure-switching signaling aptamers" Angew Chem Int Ed 44: 1061-1065 (2005). Hu, J.; Easley, C. J.; "A simple and rapid approach for measurement of dissociation constants of DNA aptamers against proteins and small molecules via automated microchip electrophoresis" Analyst 136:3461-3468 (2011). Nutiu, R., and Li, Y. "Structure-switching signaling aptamers" J Am Chem Soc 125:4771-4778 (2003). Vater, A.; Klussmann, S. "Toward third-generation aptamers: Spiegelmers and their therapeutics prospects." Curr Opin Drug Discov Devel 6: 253-261 (2003). Vater, A.; Klussmann, S. "Turning mirror-image oligonucleotides into drugs: the evolution of Spiegelmer therapeutics" Drug Discovery Today 20(1): 147-155 (2015). Williams, K. P.; Liu, X. N.; Schumacher, T. N.; Lin, H. Y.; Ausiello, D. A.; Kim, P. S.; Bartel, D. P. "Bioactive and Nuclease-resistant L-DNA Ligand of Vasopressin." Proc Natl Acad Sci. USA, 94(21):11285-11290 (1997). Purschke, W. G.; Eulberg, D.; Buchner, K.; Vonhoff, S.; Klussmann, S. "An L-RNA-based aquaretic agent that inhibits vasopressin in vivo." Proc Natl Acad Sci USA 103:5173-5178 (2003). Yang, K.A; Barbu, M.; Halim, M.; Pallavi, P.; Kim, B.; Kokpashchikov, D.; Pecic, S.; Taylor, S.; Worgall, T. S.; Stojanovic, M. N. "Recognition and Sensing of Low-Epitope Targets via Ternary Complexes with Oligonucleotides and Synthetic Receptors" Nat Chem. 6:1003-1008 (2014). Ozer, A.; Pagano, J. M.; Lis, J. T. "New Technologies Provide Quantum Changes in the Scale, Speed, and Success of SELEX Methods and Aptamer Characterization" Molecular Therapy Nucleic Acids 3: e 183 (2014). McKeague, M.; Derosa, M. C. "Challenges and opportunities for small molecule aptamer development." J Nucleic Acids, Article ID 748913 (2012). Rohloff, J. C.; Gelinas, A. D.; Jarvis, T. C.; Ochsner, U. A.; Schenider, D. J.; Gold, L.; Janjic, N. "Nucleic Acid Ligands with Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents" Molecular Therapy Nucleic Acids 3: e:201 (2014). Ellington, A. D. & Szostak, J. W. "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands" Nature (London) 346: 818-822 (1990). Tuerk, C. & Gold, L. "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" Science 249(4968):505-510 (1990). Robertson, D. L.; Joyce, G. F. "Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves singlestranded DNA" Nature 344:467-468 (1990). Cho, E. J.; Lee, J.-W.; Ellington, A. D. "Applications of Aptamers as Sensors" Annu. Rev. Anal Chem 2:241-264 (2009). Keefe, A. D.; Pai, S.; Ellington, A. "Aptamers as therapeutics" Nat Rev Drug Discovery, 9:537-550 (2010). Anslyn, E. "Supramolecular Analytical Chemistry" J Org Chem 72(3):687-699 (2007). Gennady V.; Oshovsky, D.; Reinhoudt, D. V.;Verboom, W. "Supramolecular Chemistry in Water" Angew. Chem. Int. Ed. 46(14): 2366-2393 (2007). Jonathan W. Steed (Editor-in-Chief), Philip A. Gale (Editor-in-Chief) "Supramolecular Chemistry: From Molecules to Nanomaterials" Wiley, 8 Volume Set (2012). Steed, J. W.; Atwood, J. L.; Supramolecular Chemistry, 2nd Edition, Willey, (2009). Pedersen, C. J. "Cyclic polyethers and their complexes with metal salts" J Am Chem Soc 89(26):7017-7036 (1967). Kyba, E. P.; Siegel, M. G.; Sousa, L. R.; Sogah, G. D. Y.; Cram, D. J. "Chiral, hinged, and functionalized multiheteromacrocycles" J Am Chem Soc 95:2691-2692 (1973). Dietrich, B.; Lehn, J.-M.; Sauvage, J.-P. "Diaza-polyoxa- macrocycles et macrobicycles" Tet Lett 2885-2888 (1969). Costa J.B.; Andreiev A.I.; Dieckmann T. "Thermodynamics and kinetics of adaptive binding in the malachite green RNA aptamer" Biochemistry 24;52(38):6575-83 (2013). Hermann, T.; Patel, D. J. "Adaptive Recognition by Nucleic Acids" Science 287:820-825 (2000). Xia, T.; Yuan, J.; Fang, X.; Conformational dynamics of an ATP-binding DNA aptamer: a single molecule study. J Phys Chem B 117(48): 14994-50003 (2013). Vater, A.; Klussmann, S. "Toward third-generation aptamers: Spiegelmers and their therapeutics prospects." Curr Opin Drug Discov Devel 6: 253-261 (2003). Vater, A.; Klussmann, S. "Turning mirror-image oligonucleotides into drugs: the evolution of Spiegelmer therapeutics" Drug Discovery Today 20(1): 147-155 (2015). Williams, K. P.; Liu, X. N.; Schumacher, T. N.; Lin, H. Y.; Ausiello, D. A.; Kim, P. S.; Bartel, D. P. "Bioactive and Nuclease-resistant L-DNA Ligand of Vasopressin." Proc Natl Acad Sci. USA, 94(21):11285-11290 (1997). Purschke, W. G.; Eulberg, D.; Buchner, K.; Vonhoff, S.; Klussmann, S. "An L-RNA-based aquaretic agent that inhibits vasopressin in vivo." Proc Natl Acad Sci USA 103:5173-5178 (2003). Kato, T.; Yano, K.; Ikebukuro, K.;and Karube, I. "Interaction of three-way DNA junctions with steroids" Nucleic Acids Res 28:1963-1968 (2000). Stojanovic, M. N.; Green, E. G.; Semova, S.; Nikic, D.B.; Landry, D.W. "Cross-reactive arrays based on three-way junctions" J Am Chem Soc 125:6085-6089 (2003). Yang, K.-A.; Pei, R.; Stefanovic, D.; Stojanovic, M. N. "Optimizing Cros-reactivity with Evolutionary Search for Sensors" J Am Chem Soc 134:1642-1647 (2012). Iskander, K. N.; Osuchowski, M. F.; Stearns-Kurosava, D. J.; Stepien, D.; Valentine, C.; Remick, D. G. "Sepsis: multiple abnormalities, heterogenous responses, and evolving understanding" Phys. Rev. 93(3): 1247-1288 (2013). Benedict, C. R.; Rose, J. A. "Arterial norepinephrine changes in patients with septic shock" Circ Shock 38(3): 165-172 (1992). Wilson, M. F.; Brackett, D. J.; Tompkins, P, Benjamin, B.; Archer, L. T.; Hinshaw, L. B. "Elevated plasma vasopressin concentrations during endotoxin and E. coli shock" Adv Shock Res 6:15-26 (1981). Landry D. W., Levin H. R., Gallant E. M., Ashton R. C., Seo S., D'Alessandro D., Oz M. C., Oliver J. A. "Vasopressin deficiency contributes to the vasodilation of septic shock" Circulation 95: 1122-1125 (1997). Lin, I. Y.; Ma, H. P.; Lin, A. C.; Chong, C. F.; Lin, C. M.; Wang, T. "Low plasma vasopressin/norepinephrine ratio predicts septic shock" Am J Emrg Med 23(6): 718-724 (2005). Sam, S.; Corbridge, T. C.; Mokhlesi, B.; Comellas, A. P.; Molitch, M. E. "Cortisol levels and mortality in severe sepsis" Clin Endorinol (Oxf) 60(1): 29-35 (2004). Bendel, S.; Karlsson, S.; Pettila, V.; Loisa, P.; Varpula, M.; Ruokonen, E.; Finnsepsis Study Group "Freel cortisol in sepsis and septic shock" Anesth Analq 106(6): 1813-1819 (2008). Annane, D.; Maximi, V.; Ibrahim, F.; Alvarez, J. C.; Abe, E.; Boudou, P. "Diagnosis of Adrenal Insufficiency in Severe Sepsis and Septic Shock" Am J Respir Crit Care Med 174:1319-1326, 2006. Moares, R. B.; Freidman, G.; Viana, M. V.; Tonietto, T.; Saltz, H.; Czepielewski, M. A. "Aldosterone secretion in patients with septic shock: a prospective study." Arq Bras Endorcinol Metabol 57(8): 636-641 (2013). Salgado, D. R.; Rocco, J. R.; Silva, E.; Vincent, J. L. "Modulation of the renin-angiotensin-aldosterone system in sepsis: a new therapeutic approach?" Expert Opin Ther Targets 14(1): 11-20 (2010). Zhang, W.; Chen, X.; Huang, L.; Lu, N.; Zhou, L.; Wu, G.; Chen, Y. "Severe sepsis: Low expression of renin-angiotensin system is associated with poor prognosis" Exper Therap Med 7(5): 1342-1348 (2014). Sato, Y.; Fujiwara, H.; Takatsu, Y. "Cardiac troponin and heart failure in the era of high-sensitivity assays" J. Cardiology 60(3): 160-167 (2012). Sherwood, M. W.; Newby, K. "High-Sensitivity Troponin Assays: Evidence, Indications, and Reasonable Use" J Am Heath Assoc.3: e000403 (2014). Cox, K. L.;D evanarayan, V.; Kriauciunas, A.; Manetta, J.' Montrose, C.; Sittampalam, S. "Immunoassay Methods" in Assay Guidance Manual (Internet), NCBI Resources Bookshelf; last updated: December 24, 2014. Gan, S.D.; Patel, K. R. "Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" J Investig Derm 133, e12 (2013). Lequin, R. "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Clinical Chemistry 51(12): 2415-2418 (2005). Fan, M.; He, J. "Recent Progress in Noncompetitive Hapten Immunoassays: A review" Chapter 5 in Trends in Immunolabelled and Related Techniques, www.intechopen.com, accessed at: 06/01/2015. Wilson, R. "Sensitivity and Specificity: Twin Goals of Proteomics Assays" Expert Rev Proteomics 10(2): 135-149 (2013). De Lemos, J. A.; Morrow, D. A.; "Brain Natriuretic Peptide Measurement in Acute Coronary Syndromes" Circulation 106: 2686-2870 (2002). Osborne, S. E.; Ellington, E. D. "Nucleic acid selection and the challenge of combinatorial chemistry" Chemical Reviews 97 (2): 349-370 (1997). Vant-Hull B., Gold L, Zichi DA. "Theoretical principles of in vitro selection using combinatorial nucleic acid libraries" Curr Protoc Nucleic Acid Chem. Chapter 9: Unit 9.1 (2000). Dong, J.-X.; Xu, C.; Wang, H.' Xiao, Z.-L.; Gee, S. J.; Li, Z.-F.; Wang, F.; Wu, W.-J.; Shen, Y.-D.; Yang, J.-Y.; Sun, Y.-M.; Hammock, B. D. "Enhanced Sensitive Immunoassay" Noncompetitive Phage AntiImmune Complex Assay for the Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green" J Agric Food Chem 62(34): 8752-8758 (2014). Ihara, M.; Suzuki, T.; Kobayashi, N.; Goto, J.; Ueda, H. "Open-Sandwich Enzyme Immunoassay for One-Step Noncompetitive Detection of Corticosteroid 11-Deoxycortisol" Anal Chem 81(20): 8298-8304 (2009). Shen, J.; :Li, Y.; Gu, H.; Xia, F.; Zuo, X. "Recent Development of Sandwich Assay based on Nanobiotechnologies for Proteins, Nucleic Acids, Small Molecules, and Ions" Chem Rev 114(15): 7631-7677 (page 7662) (2014). Stojanovic, M. N., de Prada, P., Landry, D. W. "Self-assembling aptameric sensors" J Am Chem Soc, 122:11547-11548 (2000). Chandra, M.; Silverman, S. K. "DNA and RNA Can Be Equally Efficient Catalysts for Carbon-Carbon Bond Formation", J Am Chem Soc 130:2936-2937 (2008). Pinheiro, V. B.; Holliger, P. "Towards XNA nanotechnology: new materials from synthetic genetic polymers" Trends Biotechnology 32(6): 321-328 (2014). Santoro, S. W.; Joyce, G. F.; Sakthivel, K.; Gramatikova, S.; Barbas, C. F. "RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality" J Am Chem Soc 122:2433-2439 (2000). Perrin D.M.; Garestier, T.; Helene, C. "Bridging the gap between proteins and nucleic acids: a metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities" J Am Chem Soc 123:1556-1563 (2001). Kimoto, M.; Yamashige, R.; Matsunaga, K-I.; Yokoyama, S.; Hirao, I. "Generation of high-affinity DNA aptamers using an expanded genetic alphabet" Nature Biotechnol 31,453-457 (2013). Imaizumi, Y.; Kasahare, Y.; Fujita, H.; Kitadume, S.; Ozaki, H.; Endoh, T.; Kuwhara, M.; Sugimoto, N. "Efficacy of base-modification on target binding of small molecule DNA aptamers" J Am Chem Soc 135, 9412-9419 (2013). Brukner, I.; El-Ramahi, R.; Gorska-Flipot, I.; Krajinovic, M.; Labuda, D. "An in vitro selection scheme for oligonucleotide probes to discriminate between closely related DNA sequences." Nucleic Acids Res. 35(9): e66, (2007), and literature cited therein. Brukner, I.; Krajinovic, M.; Dascal, A.; Labuda, D. "A protocol for the in vitro selection of specific oligonucleotide probes for high-resolution DNA typing." Nat Protoc 2(11):2807-14 (2007). Ayel, E.; Escude, C. "In vitro selection of oligonucleotides that bind double-stranded DNA in the presence of triplex-stabilizing agents." Nucleic Acids Res 38(5):e31 (2010), and literature cited therein. Darfeuille, F.; S. Reigadas; J. Hansen; H. Orum; C. Di Primo; J. Toulme (2006). "Aptamers targeted to an RNA hairpin show improved specificity compared to that of complementary oligonucleotides." Biochemistry 45 (39):12076-12082. Durand, G.; Lisi, S.; Ravelet, C.; Dausse, E.; Peyrin, E.; Toulme, J.-J. "Riboswitches Based on Kissing Complexes for the Detection of Small Ligands" Angew Chem Int Ed 53(27): 6942-6945 (2014). Luense, C. E.; Michlewski, G.; Hopp, C. S.; Rentmeister, A.; Caceres, J. F.; Famulok, M.; Mayer, G. "An aptamer targeting the apical-loop domain modulates pri-miRNA processing" Angew Chem Int Ed 49(27):4674-4677, (2010). Butcher, S. E.; Pyle, A. M. "The Molecular Interactions that Stabilize RNA Tertiary Structure: RNA Motifs, Patterns, and Networks" Acc. Chem. Res. 44(12):1302-1311 (2011). Abraham, M.; Dror, O.; Nussinov, R.; Wolfson, H. J. "Analysis and classification of RNA tertiary structures" RNA 14(11):2274-2289 (2008). Butcher, S. E.; Heckman, J. E.; Burke, J. M. "Reconstitution of hairpin ribozyme activity following separation of functional domains". Journal Biol Chem 270 (50): 29648-29651 (1995). Doherty, EA; Doudna JA "Ribozyme structures and mechanisms". Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30: 457-475 (2001). Corbett, P. T.; Leclaire, J.; Vial, L.; West, K. R.; Wietor, J.-L.; Sanders, J. K. M.; Otto, S. "Dynamic combinatorial chemistry". Chem Rev 106 (9):3652-3711 (2006). Wang Y.; Rando R.R. "Specific binding of aminoglycoside antibiotics to RNA" Chemistry & Biology 2:281-290 (1995). Stojanovic, M.N.; de Prada, P.; Landry, D.W. "Fluorescent Sensors based on aptamer self-assembly" J Am Chem Soc 122: 9678-9679 (2000). Stojanovic, M.N.; de Prada, P.; Landry, D.W. "Aptamer-based folding fluorescent sensor for cocaine", J Am Chem Soc 123: 4928-4929, (2001). Stojanovic, M.N.; Landry, D.W. "Aptamer-based colorimetric sensor for cocaine" J Am Chem Soc 124: 9678-9679 (2002). Stojanovic, M.N. Kolpashchikov, D.M. "Modular allosteric sensors" J Am Chem Soc 126: 9266-9270, (2004). Pei, R.; Shen, A; Olah, M.; Stefanovic, D.; Worgall, T.; Stojanoviζ, M.N. " High-resolution crossreactive array for alkaloids" Chem Commun. (Camb);(22):3193-5 (2009). Green, E.G.; Olah, M.J.; Abramova, T.; Williams, L.; Stefanovic, D.; Worgall, T.; Stojanovic, M.N. "Rational Approach to Minimal Cross-reactive Arrays" J Am Chem Soc 128: 15278-15282 (2006). Stoltenburg, R.; Nikolaus, N.; Strehlitz, B. "Capture-SELEX: Selection of DNA Aptamers for Aminoglycoside Antibiotics" J Anal Meth Chem 15697 (2012). Rajendran M,; Ellington, A. D. "Selection of fluorescent aptamer beacons that light up in the presence of zinc" Anal Bioanal Chem 390:1067-75 (2008). Nutiu, R.; Li, Y. "In vitro selection of structure-switching signaling aptamers" Angew Chem Int Ed 44: 1061-1065 (2005). Hu, J.; Easley, C. J.; "A simple and rapid approach for measurement of dissociation constants of DNA aptamers against proteins and small molecules via automated microchip electrophoresis" Analyst 136:3461-3468 (2011). Nutiu, R., and Li, Y. "Structure-switching signaling aptamers" J Am Chem Soc 125:4771-4778 (2003). Nguyen, T. H.; Pei, R.; Landry, D.; Stojanovic, M.; Lin. Q "Label-free microfluidic characterization of temperature dependent biomolecular interactions," Biomicrofluid 5:34118-341187 (2011). Nguyen, T. H.; Pei, R.; Landry, D.; Stojanovic, M.; Lin. Q "Microfluidic Aptameric Affinity Sensing of Vasopressin for Clinical Diagnostic and Therapeutic Applications," Sensors and Actuators B: Chemical 154: 59-66 (2011). Nguyen, T. H.; Pei, R.; Landry, D.; Stojanovic, M.; Lin. Q . "An Aptameric Microfluidic System for Specific Purification, Enrichment and Mass Spectrometric Detection of Biomolecules," J of Microelectromechanical Syst 18(6): 1198-1207 (2009). Hilton, J. P.; Olsen, T.; Kim, J.; Zhu, J.; Nguyen, T. H.; Barbu, M.; Pei, R.; Stojanovic, M.; Lin, Q. "Isolation of thermally sensitive protein-binding oligonucleotides on a microchip" Microfluidics and Nanofluidics, 19(4):795-804 (2015). Linnet, K. "Necessary sample size for method comparison studies based on regression analysis" Clin Chem 45:882-894 (1999). Magari, R. T. "Evaluating Agreement Between Two Analytical Methods in Clinical Chemistry" Clin Chem Lab Med 38: 1021-1025 (2000). Linnet, K. "Performance of Deming regression analysis in case of misspecified analytic error ratio in method comparison studies" Clin Chem 44:1024-1031 (1998). Dewitte, K.; Fierens, C.; Stockl, D.; Thienport, L. M. "Application of the Bland-Altman plot for interpretation of method-comparison studies: a critical investigation of its practice" Clin Chem 48:799-801 (2002). Yang, L.; Flint Beal, M. "Determination of Neurotransmitter Levels in Models of Parkinson`s Disease by HPLC-ECD" in Giovanni Manfredi and Hibiki Kawamata (eds.), Neurodegeneration: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,. vol. 793: 401-415, 2011. Kennedy, B.; Ziegler, M. G. "A more sensitive and specific radioenzymatic assay for catecholamines" Life Sci 47(23):2143-53 (1990). "http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=KA1887" and other vendors, accessed on 3/2/2016. Clark, J. J.; Sandberg, S. G.; Wanat, M. J.; Gan, J. O.; Home, E. A.; Hart, A. S.; Akers, C. A. et al. "Chronic microsensors for longitudinal subsecond dopamine detection in behaving animals" Nat. Methods 7(2):126-129 (2010). Mannironi, C.; Di Nardo, A.; Fruscoloni, P.; Tocchini-Valentini, G. P. "In vitro selection of dopamine RNA ligands" Biochem 36(32): 9726-9734 (1997). Simpson, N.; Maffei, A.; Freeby, M.; Burroughs, S.; Freyberg, Z.; Javitch, J.; Leibel, R. L.; Harris, P. E. "Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro" Mol Endocrinol (10):1757-72 (2012). Hauser, N. C.; Martinez, R.; Jacob, A.; Rupp, S.; Hoheisel, J. D.; Matysiak, S. "Utilising the left helical conformation of L-DNA for analyzing different marker types on a single universal microarrays platform" Nucleic Acids Res 34(18): 501-5111 (2006). Hampshire, A. J.; Rusling, D. A.; Broughton-Head, V. J.; Fox, K. R. "Footprinting: A method for determining the sequence selectivity, affinity, and kinetics of DNA_binding ligands" Methods 42(2): 128-140 (2007). Regulski, E. E.; Breaker, R. R. "In-Line Probing Analysis of Riboswitches" Methods in Molecular Biology 419: 53-75, Totowa, NJ (2008). Franksson, G.; Anggard, E. "The Plasma Protein Binding of Amphetamine, Catecholamines and Related Compounds" Acta Pharm Tox 28(3):209-214 (2009). Appendix. Normal Hormone Reference Ranges. Greenspan's Basic & Clinical Endocrinology. Ninth Edition. the McGraw-Hill Companies (2011). Elias, A. N.; Nosratola, D.; Vaziri, M. D.; Maksy, M. "Plasma Norepinephrine, Epinephrine, and Dopamine Levels in End-Stage Renal Disease" Arch Intern Med 145:101301015 (1985). Plunker, J. J.; Reeves, J. D.; Ngo, L.; Bellows, W., Shafer, S. L.; Roache, G.; Howse, J.; Herskowitz, A.; Mangano, D. T. et al "Urine and Plasma Catecholamine and Cortisol Concentrations after Myocardial Revascularization" Anest 86:785-796 (1997). Zuker, M. "Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction" Nucleic Acids Res 31 (13), 3406-15, (2003). Zadeh, J.N., Steenberg, C. D.; Bois, J. S.; Wolfe, B. R.; Khan, A. R.; Pierce, M. B.; Dirks, R. M.; Pierce, N. A. "NUPACK: analysis and design of nucleic acid systems" J Comp Chem 32:170-173 (2011). (http://www.enzolifesciences.com/ADI-900-017A/arg8-vasopressin-elisa-kit/) and other similar kits, accessed on 03/03/2015. (https://www.buhlmannlabs.ch/products-solutions/special-products/vasopressin-adh/) and similar kits, accessed on 03/03/2015. Zhang, D.; Rios, D. R.; Tam, V. H.; Chow, D. S. "Development and validation of a highly sensitive LC-MS/MS assay for the quantification of arginine vasopressin in human plasma and urine: Application in preterm neonates and child" J Pharm Biomed Anal 96:67-73 (2014). Bassi, E.; Park, M.; Azavedo, L. C. P. "Therapeutic Strategies for High-Dose Vasopressor-Dependent Shock" volume 2013: ID 654708, 10 pages (2013). Raff, H.; Findling, J. W. "Aldosterone control in critically ill patients: ACTH, metoclopramide, and atrial natriuretric peptide" Crit Care Med 18(9):915-920 (1997). Dick, M.; Dasta, J. F.; Choban, P. S.; Sinha, R.; Flancbaum, L. "Serum Aldosterone Concentrations and Urine Output in Oliguric Intensive Care Unit Patients Receiving Low-Dose Dopamine" Ann Pharmacotherapy 28:837-840 (1994). Lichtarowicz-Krynska, E. J.; Cole, T. J.; Camacho-Hubner, C.; Britto, J.; Levin, M.; Klein, N.; Aynsley-Green, A. "Circulating Aldosterone Levels are Unexpectedly Low in Children with Actute Meningococcal Disease" J Clin Endocrin Met 89(3):1410-1414 (2004). Meurant, G. "The Adrenal Cortex" chapter in Molecular and Cell Endocrinology in Principles of Medical Biology, v. 10A, p. 241 (1997). Folan, M. M.; Stone, R. A.; Pittenger, A. L.; Pittenger, A. L.; Stofferl, J. A.; Hess, M. M.; Kroboth, P. D. "Dehydroepiisoandreosterone, dehydroepiisoandrosterone-sulfate, and cortisol concentrations in intensive care unit patients" Crit Care Med 20(5):965-970 (2001). Vd Berghe, G.; d Zegher, F.; Wouters, P.; Schetz, M.; Verwaest, C.; Ferdinande, P.; Lauwers, P. "Dehydroepiandrosterone sulphate in critical illness: effect of dopamine" Clin Endocrin 43:457-463 (1995). 다양한 참고문헌들이 본원에 인용되며, 이들 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.
발명의 요약
본 발명은 항체-기반의 분석법에 적합하지 않을 수 있는 분석물을 포획 및 검출하는 압타머-기반의 분석법에 관한 것이다. 세 가지 상이한 예시적인 분석법과, 코어 서열(core sequence) 및 작동 서열(operative sequence)을 포함하는 다양한 압타머들이 제공되며, 상기 작동 서열은 사용되는 분석법에 따라 달라질 수 있다.
첫번째 구체예는 "항-압타머 분석법"을 제공하는데, 여기에서 관심 대상 목적물의 존재 및/또는 양이 테스트될 샘플은, (1) 분석물에 결합하는 코어 서열을 포함하는 1차 압타머 및 (2) 1차 압타머의 적어도 일부에 상보적인 항-압타머의 유효량들과 접촉되며, 상기 1차 압타머 및/또는 항-압타머는 1차 압타머 및 항-압타머가 서로 결합했는지 또는 결합하지 않았는지 검출하는 검출가능한 모이어티를 포함하고; 분석물에 결합한 1차 압타머는 항-압타머에 결합하지 않는다. 상기 분석물은 1차 압타머에 결합하기 위해 항-압타머와 경쟁하므로, 결합한(또는 결합하지 않은) 항-압타머의 양은 존재하는 분석물의 양과 관련된다.
두번째 구체예는 "가짜(pseudo)-샌드위치 분석법"을 제공하는데, 여기에서 관심 대상 목적물의 존재 및/또는 양이 테스트될 샘플은, (1) 분석물에 결합하는 코어 서열 및 구조-스위칭 "센서 올리고뉴클레오티드"에 상보적인 적어도 일부를 포함하는, 1차 압타머; 및 (2) "콤프(comp)" (상보적("complementary")) 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 더욱 포함하는고체 지지체에 선택적으로(optionally) 결합하는, 센서 뉴클레오티드의 유효량들과 접촉되며, 상기 1차 압타머 및/또는 센서 올리고뉴클레오티드 및/또는 콤프 올리고뉴클레오티드는 1차 압타머와 센서 올리고뉴클레오티드가 서로 결합하였는지 결합하지 않았는지 여부를 검출할 수 있는 검출가능한 모이어티를 포함하고; 상기 1차 압타머 및 센서 올리고뉴클레오티드는, 검출가능하게 해리되는 부분적인 이중 가닥 나선을 형성하거나, 1차 압타머가 분석물에 결합될 때에는 이를 형성하지 않는다. 예를 들어, 테스트 샘플이 1차 압타머 및 센서 올리고뉴클레오티드 및 콤프 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복합체의 유효량에 첨가될 수 있고; 복합체로부터 방출되는 1차 압타머의 양은 테스트 샘플 내 분석물의 양과 관련된다 (그리고 콤프 및 센서 올리고뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 이중-가닥 구조를 형성한다). 추가적인 예시로, 이에 제한되는 것은 아니나, 복합체들은 고체 지지체에 연결될 수 있고, 테스트 샘플이 적용된 다음, 방출된 1차 압타머가 검출될 수 있다. 더 구체적인 비-제한적인 예시로, 센서 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 연결되고 1차 압타머와 복합체를 형성할 수 있고, 그 결과 형성된 복합체가 테스트 샘플과 접촉되고, 방출된 1차 압타머의 양이 검출되며, 예를 들어, 지지체로부터 씻겨없어질 수 있다(washed off).
세번째 구체예는 "샌드위치 분석법"을 제공하는데, 여기에서 관심 대상 목적물의 존재 및/또는 양이 테스트될 샘플은, (1) 분석물에 결합하는 코어 서열 및 분석물에 결합되었을 때 2차 압타머과 결합하는 적어도 일부를 포함하는, 1차 압타머; 및 (2) 1차 압타머가 분석물에 결합하여 삼원 복합체("샌드위치")를 형성할 경우 1차 압타머에 결합하는 샌드위치 압타머("2차 압타머"라고도 함) 의 유효량들과 접촉되며; 상기 1차 압타머 및/또는 샌드위치 압타머는, 1차 압타머 및 샌드위치 올리고뉴클레오티드가 서로 결합하였는지 결합하지 않았는지를 검출할 수 있는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 테스트 샘플이 1차 압타머 및 샌드위치 압타머의 유효량들에 첨가된 다음, 1차 압타머/샌드위치 압타머 복합체의 양, 또는 결합하지 않은 1차 압타머 또는 샌드위치 압타머의 양이 검출될 수 있다.
본원에서는 또한 컨센선스(consensus) 코어 서열, 코어 서열, 및 1차 압타머가 제공되며, 1차 압타머는 글루코스, 히드로코르티손(hydrocortisone), 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론(dehydroisoandrosterone), 데옥시코르티손(deoxycortisone), 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염(sphingosine-1-phosphate), 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌 블루, 암모늄, 보론산(boronic acid), 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신을 포함하는 관심 대상 분석물에 결합할 수 있다.
또한, 관련된 항-압타머, 센서, 콤프 및 샌드위치 압타머/올리고뉴클레오티드가 제공된다.
또한, 전술한 1차 압타머 및/또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트에 대한 구체예들이 제공된다.
도 1A-G. 1차 압타머(짧은 형태) 및 대응되는 표적 분석물의 구조. (A) 1차 압타머(서열번호 62, 서열번호 12의 부분서열) 및 이의 표적 분석물, 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드 ("DOG"), (B) 1차 압타머(서열번호 63) 및 이의 표적 분석물, 알도스테론("ALDS"); (C) 1차 압타머(서열번호 64, 서열번호 5의 부분서열) 및 이의 표적 분석물, 코르티솔("CS"); (D) 1차 압타머(서열번호 65, 서열번호 13의 부분서열) 및 이의 표적 분석물, 테스토스테론("TES"); (E) 1차 압타머(서열번호 66) 및 이의 표적 분석물, Phe-CpRh; (F) 1차 압타머(서열번호 67) 및 이의 표적 분석물, L-페닐알라닌; (G) 1차 압타머(서열번호 68, 서열번호 1의 부분서열) 및 이의 표적 분석물, 글루코스.
도 2A-C. "항-압타머 분석법"의 설계 원리. (A) 형광 표지자(예를 들어, F=플루오레세인)로 표지된 1차 압타머("압타머") 및 소광물질(quencher)(예를 들어, D=dabcyl quencher)로 표지된 이의 "상보물(complement)" 올리고뉴클레오티드(일명 "항-압타머")의 유효량들이 혼성화하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 압타머 상의 표지자의 형광은 듀플렉스 형성에 따라 소광된다. (B) 표적 분석물의 존재에서, 1차 압타머는 이의 상보물인 항-압타머 대신 분석물에 결합하고, 이의 표지자의 형광은 소광되지 않는다. (C) 는 가열된 샘플에서와는 달리, 가열되지 않은 샘플에서 표적 분석물 DOG의 농도 증가와 함께 형광의 증가를 나타낸다 (가열이 분석물/압타머 결합을 방해하기 때문).
도 3A-L. "짧은 형태(short form)" 1차 압타머를 사용한 다양한 표적 분석물들에 대한 항-압타머 분석법의 결과 예시들. (A) 형광 표지자(예를 들어, F=플루오레세인)와 연결된, 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드 ("DOG")(서열번호 62)에 대한 1차 압타머 및 소광물질(예를 들어, D = dabcyl quencher)로 표지된 이의 상보물인 항-압타머(서열번호 69)가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(서열번호 70에 의해 도식적으로 나타냄); DOG의 존재에서 듀플렉스가 적게 형성될수록 형광 신호가 증가한다. (B) 1:1 비율의, (A)에 따른1차 압타머 및 항-압타머가, 0 에서 100 μM 범위에서 증가하는 농도의 DOG와 조합된다. 그래프는 시간에 따른 형광을 나타낸다. (C) 형광 표지자(예를 들어, F=플루오레세인)와 연결된, 알도스테론("ALDS")에 대한 1차 압타머(서열번호 63) 및 소광물질(예를 들어, D = dabcyl quencher)로 표지된 이의 상보물인 항-압타머가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(서열번호 71에 의해 도식적으로 나타냄); ALDS의 존재에서 듀플렉스가 적게 형성될수록 형광 신호가 증가한다. (D) 1:1 비율의, (C)에 따른1차 압타머 및 항-압타머가, 0 에서 100 μM 범위에서 증가하는 농도의 ALDS와 조합된다. 그래프는 시간에 따른 형광을 나타낸다. (E) 형광 표지자(예를 들어, F=플루오레세인)와 연결된, 코르티솔("CS") (서열번호 64)에 대한 1차 압타머 및 소광물질(예를 들어, D = dabcyl quencher)로 표지된 이의 상보물인 항-압타머가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(서열번호 72에 의해 도식적으로 나타냄); CS 의 존재에서 듀플렉스가 적게 형성될수록 형광 신호가 증가한다. (F) 1:10 비율의, (E)에 따른1차 압타머 및 항-압타머가, 0 에서 125 μM 범위에서 증가하는 농도의 CS와 조합된다. 그래프는 시간에 따른 형광을 나타낸다. (G) 형광 표지자(예를 들어, F=플루오레세인)와 연결된, 테스토스테론("TES") (서열번호 65)에 대한 1차 압타머 및 소광물질(예를 들어, D = dabcyl quencher)로 표지된 이의 상보적 항-압타머가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(서열번호 73에 의해 도식적으로 나타냄); TES 의 존재에서 듀플렉스가 적게 형성될수록 형광 신호가 증가한다. (H) 1:1 비율의, (G)에 따른1차 압타머 및 항-압타머가, 0 에서 100 μM 범위에서 증가하는 농도의 TES 와 조합된다. 그래프는 시간에 따른 형광을 나타낸다. (I) 형광 표지자(예를 들어, F=플루오레세인)와 연결된, Phe-CpRh (서열번호 66)에 대한 1차 압타머 및 소광물질(예를 들어, D = dabcyl quencher)로 표지된 이의 상보적 항-압타머가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(서열번호 74에 의해 도식적으로 나타냄); Phe-CpRh 의 존재에서 듀플렉스가 적게 형성될수록 형광 신호가 증가한다. (J) 1:1 비율의, (I)에 따른1차 압타머 및 항-압타머가, 0 에서 100 μM 범위에서 증가하는 농도의 Phe-CpRh 와 조합된다. 그래프는 시간에 따른 형광을 나타낸다. (K) 형광 표지자(예를 들어, F=플루오레세인)와 연결된, 페닐알라닌("Phe") (서열번호 67)에 대한 1차 압타머 및 소광물질(예를 들어, D = dabcyl quencher)로 표지된 이의 상보적 항-압타머가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(서열번호 75에 의해 도식적으로 나타냄); Phe 의 존재에서 듀플렉스가 적게 형성될수록 형광 신호가 증가한다. (L) 1:1 비율의, (K)에 따른 1차 압타머 및 항-압타머가, 0 에서 2 mM 범위에서 증가하는 농도의 Phe 와 조합된다. 그래프는 시간에 따른 형광을 나타낸다. 이 결과들은 압타머 및 항-압타머 가닥들의 혼성화에 대한 표적 분석물-농도 의존적 효과를 입증한다.
도 4A-C. 압타머/항-압타머(짧은 형태)가 플레이트-기반의 분석법 포맷을 유도한다. 신호가 TMB 및 HRP-태그된 항-압타머 상보물(complement) 간의 반응에서 비롯된다. (A) DOG: 항-압타머로 코팅된 플레이트를 1μM DOG-압타머 용액 및 DOG 표적물에 30분간 노출시켰다. (B) 글루코스: 2 μM 글루코스-압타머 용액 및 글루코스 표적물을 0.2 μM 항-압타머에 10분간 노출시킨 후, 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 위에 "쏟았다(pulled-down)". (C) 페닐알라닌: 1 μM Phe-압타머 용액 및 페닐알라닌 표적물을 0.2 μM 항-압타머에 5분간 노출킨 후, 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 위에 "쏟았다(pulled-down)".
도 5A-F. "긴 형태(long form)" 1차 압타머를 사용한 다양한 표적 분석물들에 대한 항-압타머 분석법의 결과 예시들. (A) 형광 표지자(예를 들어, FAM=플루오레세인)와 연결된, 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드 ("DOG")(서열번호 66으로, 이는 서열번호 62 및 서열번호 12를 포함함)에 대한 1차 압타머의 긴 형태 및 소광물질(예를 들어, QFBkA13 quencher)로 표지된 이의 상보적 항-압타머(서열번호 69)가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(B: 서열번호 78). (C) 다양한 농도의 표적물의 존재에서 압타머와 항-압타머를 혼합한 후의 시간에 따른 형광 신호. 이 결과들은 압타머 및 항-압타머 가닥들의 혼성화에 대한 표적물-농도 의존적 효과를 입증한다. (D) 형광 표지자(예를 들어, FAM=플루오레세인)와 연결된, 알도스테론("ALDS") (서열번호 79로, 이는 서열번호 63을 포함함)에 대한 1차 압타머의 긴 형태 및 소광물질(예를 들어, QFBkA13 ("Iowa Black"; Integrated DNA Technologies) quencher)로 표지된 이의 상보적 항-압타머(서열번호 80)가 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있다(E: 서열번호 81). (F) 다양한 농도의 표적물의 존재에서 압타머와 항-압타머를 혼합한 후의 시간에 따른 형광 신호. 이 결과들은 압타머 및 항-압타머 가닥들의 혼성화에 대한 표적물-농도 의존적 효과를 입증한다.
도 6A-C. 가짜(pseudo)-샌드위치 분석법의 설계 원리. (A) 1차 압타머(AP)와 이의 리간드(L)의 복합체. (B) AP 가 신장되며(AP ext) 상보적인 올리고뉴클레오티드(CD)가 첨가되어 구조-스위칭 센서(structure-switching sensor)가 획득된다(여기에서는 형광 신호를 달성하기 위한 방식을 보여줌; F=플루오레세인 및 D=dabcyl quencher). 이는 평형 과정(equilibrium process)이며, 표면에 부착되어 ELISA-유사 포맷을 달성하면, 시스템은 구성요소들의 제거 없이는 세척될 수 없다. (C) 가짜(pseudo)-샌드위치 분석법은 이러한 문제들을 극복하고 평형 반응을 안정한 이중 나선 구조로 바꾼다. 이를 달성하기 위해, CD 는 CDext 로 신장된 다음 CDext comp 는 다른 평형을 확립하는데 사용된다. CDext 가 표면에 부착될 경우 (하나의 가능한 구현임, 다른 하나의 구현에서는 CDext comp 가 표면에 부착됨), 리간드의 결합에 따라, CDext 및 CDext comp 가 안정한 이중 나선 복합체를 형성하여, 표면상에 형성될 경우, 광범위하게 세척될 수 있다.
도 7. 1차 압타머의 선별(selection). 용액-상(solution-phase) 선별의 도식화된 그림에서, 올리고뉴클레오티드 라이브러리(불변 영역, 즉, PCR 증폭을 위한 프라이머들이 측면에 연결된, 8 내지 100 뉴클레오티드의 무작위 영역 M을 가지는, NM; N 은 A, T, G, 또는 C 의 어느 하나일 수 있음)가 비오티닐화된 상보적 올리고뉴클레오티드(CB)를 통해 아가로스-스트렙타비딘 칼럼에 부착된다. 표적물(파란 형체; 붉은 형체는 교차-반응성의 제거를 통해 특이성을 보장하는 대응(counter)-표적물임)에의 노출로 인해 스템(S)이 안정화된 수용체가 용출(elution)된 후 이들 서열들이 증폭된다.
도 8A-C. 소분자들에 대한 샌드위치 분석법의 설계 원리 및 2차 "샌드위치" 압타머의 개념. (A) AP와 이의 리간드(L)의 복합체. (B) AP가 L과의 복합체로 있는 경우에만 2차 "샌드위치" 압타머가 AP에 결합하여 삼원 복합체를 형성한다. (C) AP 가 표면에 부착된 경우, AS 가 자신을 AP와 L 의 복합체에 부착하여 샌드위치가 형성될 것이다.
도 9A-B. 2차 "샌드위치" 압타머의 선별, (A) 고체-상태(solid-state) 선별: 표적 압타머(Ap)가 매트릭스(예를 들어, 비드)에 부착되고, L의 존재에서 라이브러리(예를 들어, 스템을 형성하는 부분적으로 자가-상보적인 프라이머들을 가진, 구조화된 N40; 대안으로는 비구조화된 NM)와 함께 인큐베이션되어, AP*L 복합체에 대해 친화성을 가진 압타머 후보자들을 분리한다. 이 올리고뉴클레오티드들은 PCR-증폭되고, 단일-가닥 종들로 재생성된 후, 다음 선별 사이클에 사용된다. 이 과정은 수렴(convergence)에 도달할 때까지 반복되고, 풀(pool) 클로닝되고 서열분석되어, AS 후보자들을 도출한다. 카운터-선별은 L의 부재에서 AP 에 대한 결합자의 제거에 의해 수행된다. (B) 용액-상에서의 과정은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 통해 매트릭스에 부착된 예비-구조화된(pre-structured) 라이브러리를 사용하고, AS 후보자들이 선별되는데, 이는 AP 와의 결합을 통해 이들의 루프가 닫히고 이들이 고체 표면으로부터 방출되기 때문이다. 이 경우 카운터-선별은 리간드가 없는 AP, 및 리간드 그 자체에 대한 것이다.
도 10A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 글루코스에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 82)에 결합한 1차 압타머(서열번호 1). (B) 코어/포켓(서열번호 83); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광(Dose/fluorescent) 반응 곡선.
도 11A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 페닐알라닌에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 84)에 결합한 1차 압타머(서열번호 2). (B) 코어/포켓(서열번호 85); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 12A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 페닐알라닌에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 86)에 결합한 1차 압타머(서열번호 3). (B) 코어/포켓(서열번호 87); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 13A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 페닐알라닌에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 88)에 결합한 1차 압타머(서열번호 4). (B) 코어/포켓(서열번호 89); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 14A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 히드로코르티손에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 90)에 결합한 1차 압타머(서열번호 5). (B) 코어/포켓(서열번호 91); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 15A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 히드로코르티손에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 92)에 결합한 1차 압타머(서열번호 6). (B) 코어/포켓(서열번호 93); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 16A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 히드로코르티손에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 94)에 결합한 1차 압타머(서열번호 7). (B) 코어/포켓(서열번호 95); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 17A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 데히드로이소안드로스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 96)에 결합한 1차 압타머(서열번호 8). (B) 코어/포켓(서열번호 97); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 18A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 데히드로이소안드로스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 98)에 결합한 1차 압타머(서열번호 9). (B) 코어/포켓(서열번호 99); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 19A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 데히드로이소안드로스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 100)에 결합한 1차 압타머(서열번호 10). (B) 코어/포켓(서열번호 101); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 20A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 데히드로이소안드로스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 102)에 결합한 1차 압타머(서열번호 11). (B) 코어/포켓(서열번호 103); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 21A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 데옥시코르티코스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 104)에 결합한 1차 압타머(서열번호 12). (B) 코어/포켓(서열번호 105); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 22A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 테스토스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 106)에 결합한 1차 압타머(서열번호 13). (B) 코어/포켓(서열번호 107); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 23A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 테스토스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 108)에 결합한 1차 압타머(서열번호 14). (B) 코어/포켓(서열번호 109); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 24A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 테스토스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 110)에 결합한 1차 압타머(서열번호 15). (B) 코어/포켓(서열번호 111); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 25A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 테스토스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 112)에 결합한 1차 압타머(서열번호 16). (B) 코어/포켓(서열번호 113); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 26A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 테스토스테론에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 114)에 결합한 1차 압타머(서열번호 17). (B) 코어/포켓(서열번호 115); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 27A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 스핑고신-1-인산염(d18:1)에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 116)에 결합한 1차 압타머(서열번호 18). (B) 코어/포켓(서열번호 117); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 28A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 118)에 결합한 1차 압타머(서열번호 19). (B) 코어/포켓(서열번호 119); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 29A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 120)에 결합한 1차 압타머(서열번호 20). (B) 코어/포켓(서열번호 121); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 30A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 122)에 결합한 1차 압타머(서열번호 21). (B) 코어/포켓(서열번호 123); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 31A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 124)에 결합한 1차 압타머(서열번호 22). (B) 코어/포켓(서열번호 125); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 32A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 126)에 결합한 1차 압타머(서열번호 23). (B) 코어/포켓(서열번호 127); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 33A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 128)에 결합한 1차 압타머(서열번호 24). (B) 코어/포켓(서열번호 129); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 34A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 130)에 결합한 1차 압타머(서열번호 25). (B) 코어/포켓(서열번호 131); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 35A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 132)에 결합한 1차 압타머(서열번호 26). (B) 코어/포켓(서열번호 133); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 36A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 134)에 결합한 1차 압타머(서열번호 27). (B) 코어/포켓(서열번호 135); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 37A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 136)에 결합한 1차 압타머(서열번호 28). (B) 코어/포켓(서열번호 137); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 38A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 138)에 결합한 1차 압타머(서열번호 29). (B) 코어/포켓(서열번호 139); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 39A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 140)에 결합한 1차 압타머(서열번호 30). (B) 코어/포켓(서열번호 141); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 40A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 142)에 결합한 1차 압타머(서열번호 31). (B) 코어/포켓(서열번호 143); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 41A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 144)에 결합한 1차 압타머(서열번호 32). (B) 코어/포켓(서열번호 145); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 42A-C. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 도파민에 대한 1차 압타머. (A) 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 146)에 결합한 1차 압타머(서열번호 33). (B) 코어/포켓(서열번호 147); 헤어핀의 가장 왼쪽 가닥이 5' 말단이다. (C) 농도/형광 반응 곡선.
도 43A-B. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 데옥시코르티코스테론에 대한 1차 압타머. 특정 비-제한적인 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 약 30nM인, 데옥시코르티코스테론에 대한 결합 친화도(해리 상수, Kd)를 가진다(실온 또는 25℃ 의 수성 용액에서).
도 44A-B. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 코르티솔에 대한 1차 압타머. 특정 비-제한적인 구체예에서, 코르티솔-결합 1차 압타머는 약 30nM인, 코르티솔 에 대한 결합 친화도(해리 상수, Kd)를 가진다(실온 또는 25℃ 의 수성 용액에서).
도 45A-B. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 세로토닌에 대한 1차 압타머. 특정 비-제한적인 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 약 25nM인, 세로토닌 에 대한 결합 친화도(해리 상수, Kd)를 가진다(실온 또는 25℃ 의 수성 용액에서).
도 46A-B. 가짜 샌드위치 분석법에서 사용된 글루코스에 대한 1차 압타머. 특정 비-제한적인 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 약 8nM인, 글루코스에 대한 결합 친화도(해리 상수, Kd)를 가지며(실온 또는 25℃ 의 수성 용액에서), 갈락토스 대비 글루코스에 선택적으로 결합한다.
도 47A-F. 용액에서 및 플레이트 상에서 실행된, 가짜 샌드위치 분석법의 예시들. (A) 용액에서 가짜 샌드위치 분석법의 예시. 가짜 샌드위치 분석법에 참여한 서열들, AP 는 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드(DOG)에 대한 1차 압타머이다(플루오레세인으로 표지되어 나타남)(서열번호 12; 서열번호 150). Cext 는 신장된 경쟁자이고(소광물질, Q로 표지됨), Cext comp 는 안정한 이중 나선을 형성하는 상보적 올리고뉴클레오티드이다. Cext 및 Cext comp 간의 이중 나선의 형성을 보여주는 농도-형광 반응 곡선, 및 형광성의 표지된 압타머의 방출(도 6B; 이 경우 Cext 는 소광물질, Q로 표지되었고, AP 는 플루오레세인, F로 표지되었다). (B) 용액에서 가짜 샌드위치 분석법의 예시. 가짜 샌드위치 분석법에 참여한 서열들, AP 는 L-페닐알라닌에 대한 1차 압타머이다(플루오레세인으로 표지되어 나타남)(서열번호 2; 서열번호 151). Cext 는 신장된 경쟁자이고(소광물질, Q로 표지됨), Cext comp 는 안정한 이중 나선을 형성하는 상보적 올리고뉴클레오티드이다. Cext 및 Cext comp 간의 이중 나선의 형성을 보여주는 농도-형광 반응 곡선, 및 형광성의 표지된 압타머의 방출(도 6B; 이 경우 Cext 는 소광물질, Q로 표지되었고, AP 는 플루오레세인, F로 표지되었다). (C) 용액에서 가짜 샌드위치 분석법의 예시. 가짜 샌드위치 분석법에 참여한 서열들, AP 는 D-글루코스에 대한 1차 압타머이다(플루오레세인으로 표지되어 나타남)(서열번호 1; 서열번호 152). Cext 는 신장된 경쟁자이고(소광물질, Q로 표지됨), Cext comp 는 안정한 이중 나선을 형성하는 상보적 올리고뉴클레오티드이다. Cext 및 Cext comp 간의 이중 나선의 형성을 보여주는 농도-형광 반응 곡선, 및 형광성의 표지된 압타머의 방출(도 6B; 이 경우 Cext 는 소광물질, Q로 표지되었고, AP 는 플루오레세인, F로 표지되었다). (D) 용액에서 가짜 샌드위치 분석법의 예시. 가짜 샌드위치 분석법에 참여한 서열들, AP 는 L-타이로신에 대한 1차 압타머이다(플루오레세인으로 표지되어 나타남)(서열번호 33; 서열번호 153). Cext 는 신장된 경쟁자이고(소광물질, Q로 표지됨), Cext comp 는 안정한 이중 나선을 형성하는 상보적 올리고뉴클레오티드이다. Cext 및 Cext comp 간의 이중 나선의 형성을 보여주는 농도-형광 반응 곡선, 및 형광성의 표지된 압타머의 방출(도 6B; 이 경우 Cext 는 소광물질, Q로 표지되었고, AP 는 플루오레세인, F로 표지되었다). (E) 가짜 샌드위치 분석 플레이트의 예시. 플레이트 상에서 분석법에 사용된 서열들 (서열번호 12; 서열번호 154); 서열들은 도 47A 에서와 동일하지만 샌드위치가 플레이트 상에서 형성되도록 조정된다 (호스래디쉬 퍼옥시다아제-스트렙타비딘 접합체(HRP-STV)가 샌드위치를 증폭하는데 사용됨). 플레이트 표면 상에 리간드-농도-의존적 샌드위치 형성을 나타내는 농도-색깔 강도(Dose-color intensity) 강도 반응. (F) 가짜 샌드위치 분석 플레이트의 예시. 플레이트 상에서 분석법에 사용된 서열들(서열번호 2; 서열번호 155); 서열들은 도 47B 에서와 동일하지만 샌드위치가 플레이트 상에서 형성되도록 조정된다 (호스래디쉬 퍼옥시다아제-스트렙타비딘 접합체(HRP-STV)가 샌드위치를 증폭하는데 사용됨). 플레이트 표면 상에 리간드-농도-의존적 샌드위치 형성을 나타내는 농도-색깔 강도(Dose-color intensity) 강도 반응.
도 48A-E. 2차 압타머의 예시 및 용액에서 및 플레이트 상의 샌드위치 분석법의 예시. (A) 2차 압타머의 예시 및 용액에서의 분석법. 1차 압타머와 복합체를 형성하기 위해 사용된 표적 분자로서의 데옥시코르티코스테론. 2차 압타머의 선별에서 사용된 1차 압타머(AP)의 추정된 2차 구조(서열번호 62; 서열번호 12에서 유래함). 상기 구조에 결합하는 2차 압타머(AS)의 추정된 2차 구조(서열번호 34). 표적물의 양 증가에 따른 농도-형광 반응 곡선이 붉은 곡선으로 나타나고, 파란 곡선은 1차 압타머가 제거된 대조군을 나타낸다. 이 분석의 목적상 2차 압타머가 플루오레세인으로 표지되었고, 소광물질을 가진 Cext 이 이에 첨가되었다. (B) 2차 압타머의 예시 및 용액에서의 분석법. 1차 압타머와 복합체를 형성하기 위해 사용된 표적 분자로서의 데옥시코르티코스테론. 2차 압타머의 선별에서 사용된 1차 압타머(AP)의 추정된 2차 구조(서열번호 62; 서열번호 12에서 유래함). 상기 구조에 결합하는 2차 압타머(AS)의 추정된 2차 구조(서열번호 35). 표적물의 양 증가에 따른 농도-형광 반응 곡선이 붉은 곡선으로 나타나고, 파란 곡선은 1차 압타머가 제거된 대조군을 나타낸다. 이 분석의 목적상 2차 압타머가 플루오레세인으로 표지되었고, 소광물질을 가진 Cext 이 이에 첨가되었다. (C) 2차 압타머의 예시 및 용액에서의 분석법. 1차 압타머와 복합체를 형성하기 위해 사용된 표적 분자로서의 세로토닌. 2차 압타머의 선별에서 사용된 1차 압타머(AP)의 추정된 2차 구조(서열번호 58; 서열번호 25에서 유래함). 상기 구조에 결합하는 2차 압타머(AS)의 추정된 2차 구조(서열번호 59). 표적물의 양 증가에 따른 농도-형광 반응 곡선이 붉은 곡선으로 나타나고, 파란 곡선은 1차 압타머가 제거된 대조군을 나타낸다. 이 분석의 목적상 2차 압타머가 플루오레세인으로 표지되었고, 소광물질을 가진 Cext 이 이에 첨가되었다. (D) 플레이트 상의 샌드위치 분석법의 예시. 1차 압타머와 복합체를 형성하기 위해 사용된 표적 분자로서의 세로토닌. 2차 압타머의 선별에서 사용된 1차 압타머(AP)의 추정된 2차 구조(서열번호 58; 서열번호 25에서 유래함). 상기 구조에 결합하는 2차 압타머(AS)의 추정된 2차 구조(서열번호 59; 서열번호 36에서 유래함). 리간드에 대한 농도-형광 반응 곡선; 색깔은 HRP-STV 반응에 의해 발생한다.
도 49A-Q. 예시적인 샌드위치 분석법.
도 50A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 글루코스-결합 1차 압타머(서열번호 68). (B) 서열번호 68, 및 도 10A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 갈락토스(중간 곡선) 또는 프럭토스(가장 아래 곡선) 대비 글루코스(가장 윗 곡선) 에 대한 선택적인 결합을 나타낸다.
도 51A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 페닐알라닌-결합 1차 압타머(서열번호 167). (B) 서열번호 167, 및 도 11A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 페닐알라닌에 대한 결합을 나타낸다.
도 52A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 페닐알라닌-결합 1차 압타머(서열번호 67). (B) 서열번호 67, 및 도 12A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 페닐알라닌에 대한 결합을 나타낸다.
도 53A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 페닐알라닌-결합 1차 압타머(서열번호 174). (B) 서열번호 174 및 도 13A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 타이로신, 글라이신 및 트립토판 대비 페닐알라닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 54A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 히드로코르티손-결합 1차 압타머(서열번호 178). (B) 서열번호 178 및 도 14A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 히드로코르티손(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 55A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 히드로코르티손-결합 1차 압타머(서열번호 181). (B) 서열번호 181 및 도 15A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 히드로코르티손(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 56A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 히드로코르티손-결합 1차 압타머(서열번호 182). (B) 서열번호 182 및 도 16A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 히드로코르티손(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 57A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머(서열번호 183). (B) 서열번호 183 및 도 18A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 데히드로이소안드로스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 58A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머(서열번호 184). (B) 서열번호 184 및 도 19A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 데히드로이소안드로스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 59A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머(서열번호 185). (B) 서열번호 185 및 도 20A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 데히드로이소안드로스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 60A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머(서열번호 188). (B) 서열번호 188 및 도 21A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 데히드로이소안드로스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 61A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머(서열번호 189 및 190). (B) 선택적 결합을 보여주는 겔 분석.
도 62A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 테스토스테론-결합 1차 압타머(서열번호 191). (B) 서열번호 191 및 도 22A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 테스토스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 63A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 테스토스테론-결합 1차 압타머(서열번호 192). (B) 서열번호 192 및 도 26A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드들 대비 테스토스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 64A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머(서열번호 193). (B) 서열번호 13 및 도 27A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 스핑고신-1-인산염에 대한 결합을 나타낸다.
도 65A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 도파민-결합 1차 압타머(서열번호 196). (B) 서열번호 196 및 도 30A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, (곡선 내림차순으로) 노르에피네프린, 세로토닌 및 5-HIAA 대비 도파민(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 66A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 도파민-결합 1차 압타머(서열번호 197). (B) 서열번호 197 및 도 31A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, (곡선 내림차순으로) L-도파, 세로토닌 및 타이로신 대비 도파민(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 67A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 도파민-결합 1차 압타머(서열번호 200). (B) 서열번호 200 및 도 32A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, (곡선 내림차순으로) 세로토닌 및 타이로신 대비 도파민(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 68A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 도파민-결합 1차 압타머(서열번호 201). (B) 서열번호 201 및 도 29A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, (곡선 내림차순으로) L-도파, 세로토닌, 및 타이로신 및 멜라토닌을 포함하는 다양한 기타물질들 대비 도파민(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 69A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 도파민-결합 1차 압타머(서열번호 202). (B) 서열번호 202 및 도 28A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, (곡선 내림차순으로) 세로토닌, 및 타이로신을 포함하는 다양한 기타물질들 대비 도파민(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 70A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 세로토닌-결합 1차 압타머(서열번호 203). (B) 서열번호 203 및 도 34A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, (곡선 내림차순으로) H-IAA, 노르에피네프린 및 도파민 대비 세로토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 71A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 세로토닌-결합 1차 압타머(서열번호 204). (B) 서열번호 204 및 도 37A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, (곡선 내림차순으로) 도파민 및 다양한 다른 화합물들 대비 세로토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 72A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 세로토닌-결합 1차 압타머(서열번호 205). (B) 서열번호 205 및 도 33A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 예컨대 멜라토닌, 5-HIAA 및 트립토판 대비 세로토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 73A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 세로토닌-결합 1차 압타머(서열번호 206). (B) 서열번호 206 및 도 35A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 예컨대 멜라토닌, 5-HIAA 및 트립토판 대비 세로토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 74A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 세로토닌-결합 1차 압타머(서열번호 207). (B) 서열번호 207 및 도 36A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 화합물들 대비 세로토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 75A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 세로토닌-결합 1차 압타머(서열번호 208). (B) 서열번호 208 및 도 38A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 화합물들 대비 세로토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 76A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 세로토닌-결합 1차 압타머(서열번호 209). (B) 서열번호 209 및 도 39A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 화합물들 대비 세로토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 77A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 멜라토닌-결합 1차 압타머(서열번호 210). (B) 서열번호 210 및 도 42A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 화합물들 대비 멜라토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 78A-B. (A) 스템과 루프 구조를 나타내는 멜라토닌-결합 1차 압타머(서열번호 211). (B) 서열번호 211 및 도 40A-C 과 유사한 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 화합물들 대비 멜라토닌(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 79A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 알도스테론-결합 1차 압타머(서열번호 214). (B) 서열번호 214 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드 화합물들 대비 알도스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 80A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 알도스테론-결합 1차 압타머(서열번호 215). (B) 서열번호 215 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 다른 스테로이드 화합물들 대비 알도스테론(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 81A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 토브라마이신-결합 1차 압타머(서열번호 218). (B) 서열번호 218 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 아미카신 및 카나마이신 대비 토브라마이신(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 82A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 토브라마이신-결합 1차 압타머(서열번호 221). (B) 서열번호 221 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 아미카신 및 카나마이신 대비 토브라마이신(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 83A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 아미카신-결합 1차 압타머(서열번호 225). (B) 서열번호 225 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 토브라마이신 및 카나마이신 대비 아미카신(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 84A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 아미카신-결합 1차 압타머(서열번호 228). (B) 서열번호 228 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 토브라마이신 및 카나마이신 대비 아미카신(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 85A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 아미카신-결합 1차 압타머(서열번호 230). (B) 서열번호 230 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 토브라마이신 및 카나마이신 대비 아미카신(가장 윗 곡선)에 대한 결합을 나타낸다.
도 86A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 메틸렌 블루-결합 1차 압타머(서열번호 231). (B) 서열번호 231 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 메틸렌 블루에 대한 결합을 나타낸다.
도 87A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 메틸렌 블루-결합 1차 압타머(서열번호 232). (B) 서열번호 232 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 메틸렌 블루에 대한 결합을 나타낸다.
도 88A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 메틸렌 블루-결합 1차 압타머(서열번호 233). (B) 서열번호 233 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 메틸렌 블루에 대한 결합을 나타낸다.
도 89A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 메틸렌 블루-결합 1차 압타머(서열번호 234). (B) 서열번호 234 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 메틸렌 블루에 대한 결합을 나타낸다.
도 90A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 메틸렌 블루-결합 1차 압타머(서열번호 235). (B) 서열번호 235 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 메틸렌 블루에 대한 결합을 나타낸다.
도 91A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 메틸렌 블루-결합 1차 압타머(서열번호 236). (B) 서열번호 236 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 메틸렌 블루에 대한 결합을 나타낸다.
도 92A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 암모늄-결합 1차 압타머(서열번호 239). (B) 서열번호 239 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 93A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 암모늄-결합 1차 압타머(서열번호 240). (B) 서열번호 240 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 94A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 암모늄-결합 1차 압타머(서열번호 241). (B) 서열번호 241 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 95A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 암모늄-결합 1차 압타머(서열번호 242). (B) 서열번호 242 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 96A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 암모늄-결합 1차 압타머(서열번호 243). (B) 서열번호 243 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 97A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 암모늄-결합 1차 압타머(서열번호 244). (B) 서열번호 244 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 98A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 암모늄-결합 1차 압타머(서열번호 245). (B) 서열번호 245 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 99A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 보론산-결합 1차 압타머(서열번호 247). (B) 서열번호 247 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 비스보론산, 예를 들어 글루코스와 복합된 비스보론산 대비 보론산에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 100A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 보론산-결합 1차 압타머(서열번호 248). (B) 서열번호 248 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 비스보론산, 예를 들어 글루코스와 복합된 비스보론산 대비 보론산에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
도 101A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 에피네프린-결합 1차 압타머(서열번호 249). (B) 서열번호 249 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 에피네프린 에 대한 선택적 결합, 그리고 내림차순으로, 세로토닌, 노르에피네프린 및 도파민에 대한 결합을 나타낸다.
도 102A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 에피네프린-결합 1차 압타머(서열번호 250). (B) 서열번호 250 및 센서 올레고뉴클레오티드에 상보적인 추가적인 작동 서열을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 에피네프린 에 대한 선택적 결합, 그리고 내림차순으로, 세로토닌, 도파민 및 노르에피네프린에 대한 결합을 나타낸다.
도 103A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 크레아티닌-결합 1차 압타머(서열번호 256). (B) 서열번호 256 을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 크레아티닌에 대한 결합을 나타낸다.
도 104A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 크레아티닌-결합 1차 압타머(서열번호 257). (B) 서열번호 257 을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 크레아티닌에 대한 결합을 나타낸다.
도 105A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 크레아티닌-결합 1차 압타머(서열번호 258). (B) 서열번호 258 을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 크레아티닌에 대한 결합을 나타낸다.
도 106A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 크레아티닌-결합 1차 압타머(서열번호 259). (B) 서열번호 259를 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 크레아티닌에 대한 결합을 나타낸다.
도 107A-B. 스템과 루프 구조를 나타내는 바소프레신-결합 1차 압타머(서열번호 261). (B) 서열번호 261 을 포함하는 1차 압타머에서 비롯된 농도/형광 반응 곡선으로, 바소프레신에 대한 결합을 나타낸다.
본 발명은 분석물을 포획 및 검출하기 위한 압타머-기반의 분석법에 관한 것이다. 본원에 기재된 1차 압타머, 관련 올리고뉴클레오티드 및 분석 방법과 함께, 상기 방법론은 다른 압타머, 관련 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 적용될 수 있고, 분자 종류, 이용가능한 시약 및 정량적 목표, 예를 들어 실제 임상 샘플의 농도 및/또는 분리된 시약의 친화성에 의해 확립된 정량적 목표를 조정한, 압타머 또는 압타머 쌍을 이용한 유사한 분석법을 설계하는데 적용될 수 있다. 또한, 다양한 핵산 혼합물을 이용하는 분석법은, 가닥-치환 캐스케이드를 형성하는 핵산 요소들과 같은 다른 핵산 요소들과 조합될 수 있다.
제한을 위한 것이 아니라 개시의 명료함을 위하여, 본 발명의 상세한 설명은 다음의 섹션들로 나뉜다:
5.1. 1차 압타머(Primary aptamers);
5.2. 항-압타머 분석법(Anti-Aptamer Assays);
5.3. 가짜 샌드위치 분석법(Pseudosandwich Assays); 및
5.4. 샌드위치 분석법(Sandwich Assays).
본원에서 제공되는 서열이 뉴클레오티드 "N"을 지칭하는 경우, 서열의 그 위치는 달리 특정되지 않는 한 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드로 채워질 수 있다.
용어 "에피토프"는 표적 분석물 상의 1 차 압타머에 대한 결합 부위를 지칭하는 것으로 본원에서 사용되거나, 샌드위치 분석법의 경우, 표적 분석물 및 2 차 압타머상의 결합 부위 일 수있다.
특정 구체예에서, 본 발명이 말단 CTCTC(서열번호 237) 5' 서열을 가지는 서열을 제공하는 경우, 본 발명은 또한 개시 CTCTC(서열번호 237) 서열이 결여된 서열의 대안적인 버전을 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명이 말단 CTCTC GGG (서열번호 238) 5' 서열을 가지는 서열을 제공하는 경우, 본 발명은 또한 개시 CTCTCGGG (서열번호 238) 서열이 결여된 상기 서열의 대안적인 버전을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명이 TCCC (서열번호 246) 3' 서열을 가지는 서열을 제공하는 경우, 본 발명은 또한 마지막 TCCC (서열번호 246) 서열이 결여된 상기 서열의 대안적인 버전을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명이 CTCTC GGG (서열번호 238) 5' 말단 서열 및 TCCC (서열번호 246) 3' 말단 서열을 가지는 서열을 제공하는 경우, 본 발명은 이들 두 서열이 결여된 대안적인 버전을 제공한다.
본원에 기재된 분석법에서, 검출가능한 표지자가 사용된다. 특정 구체예에서, 형광성 모이어티는 결합 쌍의 한 파트너에 포함되고, 소광성 모이어티는 결합 쌍의 다른 멤버에 포함된다. 분석법은 검출가능한 표지, 예를 들어 형광성 모이어티가, 쌍의 하나의 멤버 상에 존재하도록 설계될 수 있다. 형광성/소광성 화합물은 당업계 알려져 있으며, Mary Katherine Johansson, Methods in Molecular Biol. 335:Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs 및 Protocols, 2006, Didenko, ed., Humana Press, Totowa, NJ, and Marras et al., 2002, Nucl. Acids Res. 30, e122 을 참조하라 (두 문헌 모두 본원에 참조로 통합됨). 또한, 서로 근접할 때 검출가능한 신호의 증가를 가져오는 모이어티들이, 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, "FRET")의 결과로서 본원에 기재된 분석법에서 대안적인 표지자로서 사용될 수 있다; 적합한 쌍으로는, 몇가지 에를 들자면 플루오로세인, 테트라메틸로다민; 로다민 6G 및 말라카이트 그린, 및 FITC 및 티오세미카바졸을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
5.1. 1차 압타머
"1차 압타머" (AP)는 표적 분석물(리간드, L)에 결합한다. 1차 압타머는 용액-상 또는 고체-상 선별에 의해 분리될 수 있다 (이의 표적 분석물에의 결합으로 확인됨).
1차 압타머(AP) 및 관련 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 항-압타머, 센서 올리고뉴클레오티드, 콤프 올리고뉴클레오티드, 샌드위치 올리고뉴클레오티드("2차 압타머" 또는 As 로도 언급됨))는 의도된 기능과 일치하는 임의의 크기를 가질 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머 또는 관련 올리고뉴클레오티드는 약 20-250 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 길이는 약 20-200 뉴클레오티드, 또는 약 20-150 뉴클레오티드, 또는 약 30-200 뉴클레오티드, 또는 약 40-200 뉴클레오티드, 또는 약 50-200 뉴클레오티드, 또는 약 60-200 뉴클레오티드, 또는 약 70-200 뉴클레오티드, 또는 약 80-200 뉴클레오티드, 또는 약 100-200 뉴클레오티드, 또는 약 150-200 뉴클레오티드, 또는 약 30-150뉴클레오티드, 또는 약 30-100 뉴클레오티드, 또는 약 30-80 뉴클레오티드, 또는 약 30-50 뉴클레오티드, 또는 약 40-100 뉴클레오티드; 또는 약 20뉴클레오티드 이상, 또는 약 30 뉴클레오티드 이상, 또는 약 100 뉴클레오티드 이하, 또는 약 200 뉴클레오티드 이하(여기에서 "약"은 + 또는 - 20%를 의미함), 또는 약 20-250 뉴클레오티드, 또는 약 25-100뉴클레오티드일 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머 및/또는 관련 올리고뉴클레오티드는 스피에겔머(spiegelmer) 또는 핵산의 특정 비천연적 거울상 이성질체일 수 있다22-25.
특정 구체예에서, 표적 분석물에 대해 결합 포켓으로 작용하는 코어 서열을 포함하는 1차 압타머가 제공된다. 특정 구체예에서, 특정 코어 서열 또는 콘센서스 코어 서열을 포함하는 1차 압타머가 제공된다. 1차 압타머는 후술될 바와 같이 특정 분석법에서 기능적 역할을 수행하는 작동 서열을 더욱 포함할 수 있다. 1차 압타머는 또한 그의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는, 코어 서열 또는 작동 서열 이외의 부가적인 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 관심 대상 표적 분석물에 결합하는 코어 서열을 포함하는 1차 압타머는, 아래에 예시된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 분석법에 이용될 수 있다.
5.1.1. 1차 압타머를 분리하는 방법
아미노산, 단당류, 올리고당류, 스테로이드, 카테콜아민, 세로토닌, 멜라토닌, 지질, 호르몬 및/또는 펩타이드를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 표적 분석물에 선택적으로 결합하는 1차 압타머가 식별될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 상기 방법은 바소프레신, 아미노글리코시드 및 다른 항생제, 면역억제제, 항종양제, 살충제, 호르몬 등에 대한 스피에겔머(spiegelmer)에 결합하는 1차 압타머를 제조하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 1차 압타머의 식별은 SELEX 방법을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머는 고체- (전통적) 또는 새로운 용액-상 선별에 의해 식별된다16 -21. 또한, 특정 비-제한적 구체예에서, 용액-상 선별은, 압타머의 높은 친화도 및 스크리닝의 용이성과 같은, 소분자들에 대한 고유의 장점들을 가진다.
특정 비-제한적 구체예에서, 상기 방법은 PCR 프라이머 중 하나에 상보적인 비오티닐화된 가닥(CB)을 아가로스-스트렙타비딘에 부착시키고(도 7), 상보적 상호작용을 통해 라이브러리(예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, N8-N100)의 서열들을 프라이머의 CB 에 부착시키는 것을 포함한다. 라이브러리 상의 2개의 프라이머, 5'- 및 3'- 또한 부분적으로 상보적이다; 이들 프라이머들의 상보적 영역 사이에 스템 형성을 돕는 방식으로 표적과 상호작용하는 라이브러리 구성원들이 상보물 CB 를 대체함으로써 아가로스로부터 방출되고, 잠재적인 압타머들의 농축된 풀을 생성하는 PCR 증폭에 사용된다.
용액-상 선별에서, 분자들은 매트릭스에 아무런 부착 없이 사용되므로, 작용기들이 "버려지지" 않는다. 이는 압타머와의 상호작용을 극대화하여 친화성을 높인다. 사용될 수 있는 화합물의 농도는 용해도의 한계까지 올라가서, 약한-친화력의 압타머가 분리되도록 한다(예를 들어, 대사산물 및 글루코스에 대한 압타머).
특정 비-제한적 구체예에서, 비오틴을 답실(dabcyl)로 치환하고 플루오레세인을 압타머에 부착시켜(도 6, CD), 압타머가 결합하는 것을 확인하고, 이들의 Kd (이는 경쟁적 분석법이므로, 절반-반응(half-response)이 Kd 80로부터 멀어지고, CD 가 과도하게 존재함)를 결정하고 선택성을 확립함으로써, 형광 센서가 이 선별로부터 직접적으로 획득될 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(1) 이미 이용가능하지 않은 한, 용액-상(도 7) 또는 고체-상 선별에 의해 1차 압타머(Ap)를 분리하는 단계; 왓슨-크릭 염기쌍을 최소화하길 원하는 경우, 에난티오머성 압타머(스피에겔머)의 사용(예를 들어, 압타머의 융합, 또는 분석물 없이 백그라운드 상호작용을 최소화하기 위함);
(2) 구조-스위칭 형태에서 1차 압타머를 테스트하고 이의 구조 스위칭 형태를 변형하여, 가짜-샌드위치 분석법 포맷으로 변환하는 단계(도 6C);
(3) 표적물과의 복합체로 있는 1차 압타머 또는 스피에겔머를 사용하여, 용액-상 또는 고체 상 선별에 의해 2차 샌드위치 압타머(As)를 분리하는 단계(도 9A-B);
(4) 표적물에 대한 샌드위치 분석법을 수행하는 단계(도 8A-C) 및/또는
(5) 최초 분리된 1차 압타머의 단축 형태(shortened form)를 제조하는 단계;
(6) 작동 서열을 도입함으로써 선택적으로 단축된 1차 압타머를 변형하는 단계; 및/또는
(7) 대상 분석법에서 결합 특성을 개선시키기 위하여 결합 포켓에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환하여 선택적으로 단축된 1차 압타머를 변형하는 단계.
5.1.2 글루코스-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-1 M 미만의 해리 상수(친화도 10)로 수성 용액 중에서 글루코스와 결합하고, 갈락토스 대비 글루코스 에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머가 서열 CCGTGTGT(서열번호 157) 및 AGTGTCCATTG(서열번호 158) 또는 AGTGTCCTTTG(서열번호 159) 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-1 M 미만의 해리 상수(친화도 10)로 수성 용액 중에서 글루코스와 결합하고, 갈락토스 또는 프럭토스 대비 글루코스에 선택적으로 결합한다(예를 들어, 도 50B 참조). 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열 CCGTGTGT(서열번호 157) 및 AGTGTCCATTG(서열번호 158) 또는 AGTGTCCTTTG(서열번호 159) 또는 이들의 변이체를 포함하는 글루코스-결합 1차 압타머가 가지는 글루코스에 대한 결합 친화도는, 서열번호 68을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열 CCGTGTGT(서열번호 157) 및 AGTGTCCATTG(서열번호 158) 또는 AGTGTCCTTTG(서열번호 159) 또는 이들의 변이체를 포함하는 글루코스-결합 1차 압타머는, 글루코스 결합을 위해 서열번호 68을 가지는 1차 압타머와 경쟁한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열 CCGTGTGT(서열번호 157) 및 AGTGTCCATTG(서열번호 158) 또는 AGTGTCCTTTG(서열번호 159) 또는 이들의 변이체를 포함하는 글루코스-결합 1차 압타머는, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열 CCGTGTGT(서열번호 157) 및 AGTGTCCATTG(서열번호 158) 또는 AGTGTCCTTTG(서열번호 159) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 하나 이상의 작동 서열을 더 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열 CCGTGTGT(서열번호 157) 및 AGTGTCCATTG(서열번호 158) 또는 AGTGTCCTTTG(서열번호 159) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열 CCGTGTGT(서열번호 157) 및 AGTGTCCATTG(서열번호 158) 또는 AGTGTCCTTTG(서열번호 159) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 글루코스(예를 들어, 갈락토스 대비 글루코스에 선택적으로 결합) 및/또는 다음 중 하나 이상에 결합하는 서열들에 의해 연결된 두 개의 스템을 포함하는 예측된 2차 구조를 가진다: 4-O-R 글루코스 에피토프로서, 여기에서 R은 수소, 알킬기, 다른 탄수화물 또는 단백질; 셀로비오스; 및/또는 말토오스이다. 예를 들어, 도 50A-B 참고.
예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 글루코스-결합 1차 압타머는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
>S-Glu01: CTCTCGGGACGACCGTGTGTGTTGCTCTGTAAC---------AGTGTCCATTGTCGTCCC (서열번호 160);
>S-Glu02: CTCTCGGGACGACCGTGTGTGGTAGAGTCGTCGGGCTCTAACAGTGTCCTTTGTCGTCCC (서열번호 161);
>S-Glu03: CTCTCGGGACGACCGTGTGTGACGTGCGCCGTGGGGAACGTCAGTGTTCTTTGTCGTCCC (서열번호 162);
>S-Glu04: CTCTCGGGACGACCGTGTGTCGACTTAGAGTCG---------AGTGTCCTTTGTCGTCCC (서열번호 163); 및
>S-Glu05: CTCTCGGGACGACCGTGTGTTGCAATTCTTGCA---------AGTGTTCTTTGTCGTCCC (서열번호 164).
특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열번호 83의 코어 서열을 포함한다(도 10B). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 83의 코어 서열을 포함하는 글루코스-결합 1차 압타머가 가지는 글루코스에 대한 결합 친화도는, 서열번호 68을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 83의 코어 서열을 포함하는 글루코스-결합 1차 압타머는 글루코스 결합을 위해 서열번호 68을 가지는 1차 압타머와 경쟁한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열번호 83의 코어 서열을 포함하고(도 10B) 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열번호 83의 코어 서열을 포함하고(도 10B) 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열번호 83의 코어 서열(도 10B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 글루코스-결합 1차 압타머는 서열번호 83의 코어 서열(도 10B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 글루코스-결합 1차 압타머는 서열번호 1, 서열번호 68, 또는 서열번호 149 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 글루코스-결합 1차 압타머는 서열번호 1, 서열번호 68 또는 서열번호 149의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 글루코스에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.3 페닐알라닌-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 페닐알라닌과 결합하고, 타이로신(또는 하이드록실-페닐알라닌) 또는 트립토판 대비 페닐알라닌에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GCGT(서열번호 165) 및 AGC 및 GGTT(서열번호 166) 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 페닐알라닌과 결합하고, 타이로신(또는 하이드록실-페닐알라닌) 또는 트립토판 대비 페닐알라닌에 선택적으로 결합한다(예를 들어, 도 51A-B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열 GCGT(서열번호 165) 및 AGC 및 GGTT(서열번호 166) 또는 이들의 변이체를 포함하는 상기 페닐알라닌-결합 1차 압타머가 가지는 페닐알라닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 67을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열 GCGT(서열번호 165) 및 AGC 및 GGTT(서열번호 166) 또는 이들의 변이체를 포함하는 상기 페닐알라닌-결합 1차 압타머는, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 67을 가지는 페닐알라닌-결합 1차 압타머와 경쟁한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GCGT(서열번호 165) 및 AGC 및 GGTT(서열번호 166) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GCGT(서열번호 165) 및 AGC 및 GGTT(서열번호 166) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GCGT(서열번호 165) 및 AGC 및 GGTT(서열번호 166) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GCGT(서열번호 165) 및 AGC 및 GGTT(서열번호 166) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCG CGT TTC CCA AGA AAG CAA GTA TTG GTT GGT CGT CCC (서열번호 2)
또는 도 11B에 나타난 코어(서열번호 85)를 포함하는 이의 부분 (도 51A 참조)(서열번호 167).
특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 85에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 11B). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 85에 제시된 코어 서열(도 11B)을 포함하는 페닐알라닌-결합 1차 압타머가 가지는 결합 친화도는, 서열번호 167을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 85에 제시된 코어 서열(도 11B)을 포함하는 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 167을 가지는 1차 압타머와 페닐알라닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 85에 제시된 코어 서열(도 11B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 85에 제시된 코어 서열(도 11B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 85에 제시된 코어 서열(도 11B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 85에 제시된 코어 서열(도 11B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGGG(서열번호168) 및 GGGG(서열번호169) 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 페닐알라닌과 결합하고, 타이로신(또는 하이드록실-페닐알라닌) 또는 트립토판 대비 페닐알라닌에 선택적으로 결합한다 (도 52A-B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGGG (서열번호 168) 및 GGGG (서열번호 169) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGGG (서열번호 168) 및 GGGG (서열번호 169) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 하나 이상의 작동 서열을 더 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGGG (서열번호 168) 및 GGGG (서열번호 169) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGGG (서열번호 168) 및 GGGG (서열번호 169) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 페닐알라닌-결합 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
CTC TCG GGA CGA CCG GTG GGG GTT CTT TTT CAG GGG AGG TAC GGT CGT CCC (서열번호 3).
특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 87에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 12B; 도 52A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 87에 제시된 코어 서열을 포함하는 페닐알라닌-결합 압타머가 가지는 페닐알라닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 67을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 87에 제시된 코어 서열(도 12B) 을 포함하는 페닐알라닌-결합 압타머는 서열번호 67을 가지는 1차 압타머와 페닐알라닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 87에 제시된 코어 서열(도 12B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 87에 제시된 코어 서열(도 12B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 87에 제시된 코어 서열(도 12B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 87에 제시된 코어 서열(도 12B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GAGG (서열번호 170) 및 CATT (서열번호 171) 또는 CCGG (서열번호 172) 및 TGTT (서열번호 173) 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 페닐알라닌과 결합하고, 타이로신(또는 하이드록실-페닐알라닌) 또는 트립토판 대비 페닐알라닌에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GAGG (서열번호 170) 및 CATT (서열번호 171) 또는 CCGG (서열번호 172) 및 TGTT (서열번호 173) 또는 이의 변이체를 포함하고, 하나 이상의 작동 서열을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GAGG (서열번호 170) 및 CATT (서열번호 171) 또는 CCGG (서열번호 172) 및 TGTT (서열번호 173) 또는 이의 변이체를 포함하고, 하나 이상의 작동 서열을 더 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GAGG (서열번호 170) 및 CATT (서열번호 171) 또는 CCGG (서열번호 172) 및 TGTT (서열번호 173) 또는 이의 변이체, 및 이들 네 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열 GAGG (서열번호 170) 및 CATT (서열번호 171) 또는 CCGG (서열번호 172) 및 TGTT (서열번호 173) 또는 이의 변이체, 및 이들 네 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 페닐알라닌-결합 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGA GGC TGG ATG CAT TCG CCG GAT GTT CGA TGT CGT CCC (서열번호 4) 또는 관련 서열 (서열번호 174, 도 53A).
특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 89에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 13B; 도 53). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 89에 제시된 코어 서열(도 13B) 을 포함하는 페닐알라닌-결합 압타머가 가지는 페닐알라닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 174를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 89에 제시된 코어 서열(도 13B) 을 포함하는 페닐알라닌-결합 압타머는 서열번호 174를 가지는 1차 압타머와 페닐알라닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 89에 제시된 코어 서열(도 13B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 89에 제시된 코어 서열(도 13B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 89에 제시된 코어 서열(도 13B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 89에 제시된 코어 서열(도 13B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 67, 서열번호 167, 서열번호 174 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 페닐알라닌-결합 1차 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 67, 서열번호 167 또는 서열번호 174의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 페닐알라닌에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.4 히드로코르티손-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 히드로코르티손과 결합하고, 코르티코스테론, 11-데옥시코르티코스테론 및/또는 17α,21-디하이드록시프로게스테론과 선택적으로 결합하고 및/또는 C.17 위치에 산소를 가지지 않는 스테로이드 대비 하나의 산소와 결합된 C.17 탄소를 가지는 스테로이드에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 ATGTTC (서열번호 176) 및 GGATAGT(서열번호 177) 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 히드로코르티손과 결합하고, C.17 위치에 산소를 가지지 않는 스테로이드 대비 히드로코르티손에 선택적으로 결합한다(예를 들어, 도 54B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 ATGTTC (서열번호 176) 및 GGATAGT(서열번호 177) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 ATGTTC (서열번호 176) 및 GGATAGT(서열번호 177) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 ATGTTC (서열번호 176) 및 GGATAGT(서열번호 177) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 ATGTTC (서열번호 176) 및 GGATAGT(서열번호 177) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGC CCG CAT GTT CCA TGG ATA GTC TTG ACT AGT CGT CCC (서열번호 5, 도 14A) 또는 이의 단축 버전(short version)(도 54A, 서열번호 178).
특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 91에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 14B; 도 54A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 91에 제시된 코어 서열(도 14B)을 포함하는 히드로코르티손-결합 1차 압타머가 가지는 히드로코르티손에 대한 결합 친화도는, 서열번호 178을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 91에 제시된 코어 서열(도 14B)을 포함하는 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 178을 가지는 1차 압타머와 히드로코르티손 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 91에 제시된 코어 서열(도 14B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 91에 제시된 코어 서열(도 14B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 91에 제시된 코어 서열(도 14B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 91에 제시된 코어 서열(도 14B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 TACGA(서열번호 179) 및 GGATA (서열번호 180) 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 히드로코르티손과 결합하고, C.17 위치에 산소를 가지지 않는 스테로이드 대비 히드로코르티손에 선택적으로 결합한다(예를 들어, 도 55B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 TACGA(서열번호 179) 및 GGATA (서열번호 180) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 TACGA(서열번호 179) 및 GGATA (서열번호 180) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 TACGA(서열번호 179) 및 GGATA (서열번호 180) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열 CGCC (서열번호 175) 및 TACGA(서열번호 179) 및 GGATA (서열번호 180) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CTA GCG TAT GCG CCA GAA GTA TAC GAG GAT AGT CGT CCC (서열번호 6, 도 15A) 또는 이의 단축 버전(short version) (도 55A, 서열번호 181).
특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 93에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 15B; 도 55A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 93에 제시된 코어 서열(도 15B)을 포함하는 히드로코르티손-결합 1차 압타머가 가지는 히드로코르티손에 대한 결합 친화도는, 서열번호 181을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 93에 제시된 코어 서열(도 15B)을 포함하는 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 181을 가지는 1차 압타머와 히드로코르티손 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 93에 제시된 코어 서열(도 15B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 93에 제시된 코어 서열(도 15B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 93에 제시된 코어 서열(도 15B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 93에 제시된 코어 서열(도 15B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGC CAG AAG TTT ACG AGG ATA TGG TAA CAT AGT CGT CCC (서열번호 7, 도 16A) 또는 이의 단축 버전 (도 56A, 서열번호 182).
특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 95에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 16B; 도 56A-B). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 95에 제시된 코어 서열(도 16B)을 포함하는 히드로코르티손-결합 1차 압타머가 가지는 히드로코르티손에 대한 결합 친화도는, 서열번호 182을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 95에 제시된 코어 서열(도 16B)을 포함하는 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 182를 가지는 1차 압타머와 히드로코르티손 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 95에 제시된 코어 서열(도 16B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 95에 제시된 코어 서열(도 16B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 95에 제시된 코어 서열(도 16B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 95에 제시된 코어 서열(도 16B)및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 64 (도 1C), 서열번호 181, 서열번호 148, 또는 서열번호 182 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 히드로코르티손-결합 1차 압타머는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 64 (도 1C), 서열번호 181, 서열번호 148, 또는 서열번호 182의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 히드로코르티손에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.5. 데히드로이소안드로스테론 -결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 데히드로이소안드로스테론과 결합하고, 데옥시코르티코스테론 대비 데히드로이소안드로스테론에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG, GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 데히드로이소안드로스테론과 결합하고, 데옥시코르티코스테론 및/또는 다른 스테로이드 대비 데히드로이소안드로스테론에 선택적으로 결합한다(예를 들어, 도 57B, 58B 및 59B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG, GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG, GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG, GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG, GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GGG TGG CAT AGG GTA GGC TAG GGT CAC TGT CGT CCC (서열번호 9) 또는 관련 서열(서열번호 183, 도 57A). 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 99에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 18B; 도 57A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 99에 제시된 코어 서열(도 18B)을 포함하는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머가 가지는 데히드로이소안드로스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 183을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 99에 제시된 코어 서열(도 18B)을 포함하는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 183을 가지는 1차 압타머와 데히드로이소안드로스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 99에 제시된 코어 서열 (도 18B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 99에 제시된 코어 서열 (도 18B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 99에 제시된 코어 서열 (도 18B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 99에 제시된 코어 서열 (도 18B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGT GGC TAG GTA GGT TGC ATG CGG CAT AGG GGT CGT CCC (서열번호 10) 또는 관련 서열 (서열번호 184, 도 58A). 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 101에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 19B; 도 58A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 101에 제시된 코어 서열(도 19B)을 포함하는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머가 가지는 데히드로이소안드로스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 184를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 101에 제시된 코어 서열(도 19B)을 포함하는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 184를 가지는 1차 압타머와 데히드로이소안드로스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 101에 제시된 코어 서열 (도 19B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 101에 제시된 코어 서열 (도 19B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 101에 제시된 코어 서열 (도 19B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 101에 제시된 코어 서열 (도 19B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGT GAC GGT GTG TAG TTG GGT TGT GGC AGG AGT CGT CCC (서열번호 11) 또는 관련 서열 (서열번호 185, 도 59A). 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 103에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 20B; 도 59A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 103에 제시된 코어 서열(도 20B)을 포함하는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머가 가지는 데히드로이소안드로스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 185을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 103에 제시된 코어 서열(도 20B)을 포함하는 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 185를 가지는 1차 압타머와 데히드로이소안드로스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 103에 제시된 코어 서열(도 20B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 103에 제시된 코어 서열(도 20B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 103에 제시된 코어 서열(도 20B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 103에 제시된 코어 서열(도 20B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 183, 서열번호 184, 서열번호 185또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 데히드로이소안드로스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 183, 서열번호 184, 또는 서열번호 185의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 데히드로이소안드로스테론에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.6 데옥시코르티코스테론 -결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 데옥시코르티코스테론과 결합하고, 데히드로이소안드로스테론 대비 데옥시코르티코스테론에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열 AGCT (서열번호 186) 및 GCGG (서열번호 187) 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 데히드로이소안드로스테론 및/또는 다른 스테로이드 대비 데옥시코르티코스테론에 선택적으로 결합한다(도 60B, 61B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열 AGCT (서열번호 186) 및 GCGG (서열번호 187) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열 AGCT (서열번호 186) 및 GCGG (서열번호 187) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열 AGCT (서열번호 186) 및 GCGG (서열번호 187) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열 AGCT (서열번호 186) 및 GCGG (서열번호 187) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCC GGA TTT TCC GAG TGG AAC TAG CTG TGG CGG TCG TCC C (서열번호 12) 또는 관련 서열 (예를 들어, 서열번호 188, 도 60A; 서열번호 62, 도 1A). 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 105에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 21B; 도 60A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 105에 제시된 코어 서열(도 21B)을 포함하는 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머가 가지는 데옥시코르티코스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 188을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 105에 제시된 코어 서열(도 21B)을 포함하는 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 188을 가지는 1차 압타머와 데옥시코르티코스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 105에 제시된 코어 서열(도 21B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 105에 제시된 코어 서열(도 21B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 105에 제시된 코어 서열(도 21B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 105에 제시된 코어 서열(도 21B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GGA TTT TCC AGT GCA ACT AGC TGA AAG CGG TCG TCC C (서열번호 189; 도 61A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA GGA TTT TCC AGT GTA ACT AGC TAC AGC GGG TCG TCC C (서열번호 190; 도 61A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 12, 서열번호 62, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 데옥시코르티코스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 12, 서열번호 62, 서열번호 188, 서열번호 189, 또는 서열번호 190의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 데옥시코르티코스테론에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.7 테스토스테론-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 테스토스테론과 결합하고, 11-데옥시코르티코스테론 대비 테스토스테론에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG (서열번호 169) 및 GG, 또는 G 잔기의 부가 또는 결실을 포함하여, 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 11-데옥시코르티코스테론 대비 테스토스테론에 선택적으로 결합한다(도 62B 및 63B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG (서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GAT GTC CGG GGT ACG GTG GTT GCA GTT CGT CGT CCC (서열번호 13) 또는 관련 서열(예를 들어, 서열번호 65, 도 1D; 서열번호 191, 도 62A). 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 107에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 22B; 도 62A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 107에 제시된 코어 서열(도 22B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머가 가지는 테스토스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 191을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 107에 제시된 코어 서열(도 22B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 191을 가지는 1차 압타머와 테스토스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 107에 제시된 코어 서열(도 22B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 107에 제시된 코어 서열(도 22B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 107에 제시된 코어 서열(도 22B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 107에 제시된 코어 서열(도 22B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GTG GTC ATT GAG TGG TCT TAG GCA GGT AGT CGT CCC (서열번호 17) 또는 관련 서열 (서열번호 192, 도 63A). 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 115에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 26B; 도 63A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 115에 제시된 코어 서열(도 26B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머가 가지는 테스토스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 192를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 115에 제시된 코어 서열(도 26B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 192를 가지는 1차 압타머와 테스토스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 115에 제시된 코어 서열(도 26B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 115에 제시된 코어 서열(도 26B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 115에 제시된 코어 서열(도 26B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 115에 제시된 코어 서열(도 26B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 109에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 23B). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 109에 제시된 코어 서열(도 23B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머가 가지는 테스토스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 14를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 109에 제시된 코어 서열(도 23B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 14를 가지는 1차 압타머와 테스토스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 109에 제시된 코어 서열(도 23B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 109에 제시된 코어 서열(도 23B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다.
특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 109에 제시된 코어 서열(도 23B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 109에 제시된 코어 서열(도 23B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 111에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 24B). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 111에 제시된 코어 서열(도 24B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머가 가지는 테스토스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 15를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 111에 제시된 코어 서열(도 24B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 15를 가지는 1차 압타머와 테스토스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 111에 제시된 코어 서열(도 24B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 111에 제시된 코어 서열(도 24B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 111에 제시된 코어 서열(도 24B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 111에 제시된 코어 서열(도 24B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 113에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 25B). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 13에 제시된 코어 서열(도 25B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머가 가지는 테스토스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 16을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 113에 제시된 코어 서열(도 25B)을 포함하는 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 16을 가지는 1차 압타머와 테스토스테론 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 113에 제시된 코어 서열(도 25B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 113에 제시된 코어 서열(도 25B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 113에 제시된 코어 서열(도 25B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 113에 제시된 코어 서열(도 25B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 65, 서열번호 191, 또는 서열번호 192또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 테스토스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 65, 서열번호 191, 또는 서열번호 192의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 테스토스테론 에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.8 스핑고신 -1-인산염-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 스핑고신-1-인산염과 결합한다(도 64B 참조).
특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGGGG (서열번호 168), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 스핑고신-1-인산염에 선택적으로 결합한다(도 62B 및 63B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGGGG (서열번호 168) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGGGG (서열번호 168) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGGGG (서열번호 168) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGGGG (서열번호 168) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGT GGT GTG GGA GAA AGA ATT TTC ATT GGG GTA GGG GGT CGT CCC (서열번호 18) 또는 관련 서열 (서열번호 193, 도 64A).
특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 117에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 27B; 도 64A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 117에 제시된 코어 서열(도 27B)을 포함하는 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머가 가지는 테스토스테론에 대한 결합 친화도는, 서열번호 193을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 117에 제시된 코어 서열(도 27B)을 포함하는 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 193을 가지는 1차 압타머와 스핑고신-1-인산염 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 117에 제시된 코어 서열(도 27B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 117에 제시된 코어 서열(도 27B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 117에 제시된 코어 서열(도 27B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 117에 제시된 코어 서열(도 27B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 18, 서열번호 193 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 스핑고신-1-인산염-결합 1차 압타머는 서열번호 18 또는 서열번호 193 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 스핑고신-1-인산염 에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.9 도파민-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 도파민과 결합하고, 도파민에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CCGAT (서열번호 194) 및 GGTGT (서열번호 195), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 세로토닌 또는 노르에피네프린 대비 도파민에 선택적으로 결합한다(도 65B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CCGAT (서열번호 194) 및 GGTGT (서열번호 195) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CCGAT (서열번호 194) 및 GGTGT (서열번호 195) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CCGAT (서열번호 194) 및 GGTGT (서열번호 195) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CCGAT (서열번호 194) 및 GGTGT (서열번호 195) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 도파민-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGC CAG TTT GAA GGT TCG TTC GCA GGT GTG GAG TGA CGT CGT CCC (서열번호 21) 또는 관련 서열 (서열번호 196, 도 65A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 123에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 30B; 도 65A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 123에 제시된 코어 서열(도 30B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머가 가지는 도파민에 대한 결합 친화도는, 서열번호 196을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 123에 제시된 코어 서열(도 30B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 196을 가지는 1차 압타머와 도파민 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 123에 제시된 코어 서열(도 30B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 123에 제시된 코어 서열(도 30B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 123에 제시된 코어 서열(도 30B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 123에 제시된 코어 서열(도 30B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG(서열번호 169), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 세로토닌 또는 타이로신 대비 도파민에 선택적으로 결합한다(도 66B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG(서열번호 169) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG(서열번호 169) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG(서열번호 169) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGG 및 GGGG(서열번호 169) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 도파민-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CTG CAG CCT GGG GTT GTG GGG GGT AGG GGA GGT CTG AGT CGT CCC (서열번호 22; 도 31A) 또는 관련 서열 (서열번호 197, 도 66A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 125에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 31B; 도 66A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 125에 제시된 코어 서열(도 31B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머가 가지는 도파민에 대한 결합 친화도는, 서열번호 197을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 125에 제시된 코어 서열(도 31B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 197을 가지는 1차 압타머와 도파민 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 125에 제시된 코어 서열(도 31B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 125에 제시된 코어 서열(도 31B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 125에 제시된 코어 서열(도 31B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 125에 제시된 코어 서열(도 31B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CACAG (서열번호 198) 및 CACAA (서열번호 199), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 세로토닌, 멜라토닌 또는 타이로신 대비 도파민에 선택적으로 결합한다(도 67B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CACAG (서열번호 198) 및 CACAA (서열번호 199) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CACAG (서열번호 198) 및 CACAA (서열번호 199) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CACAG (서열번호 198) 및 CACAA (서열번호 199) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CACAG (서열번호 198) 및 CACAA (서열번호 199) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 도파민-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA CAC AGA GGC ACA ACT CGC AGG AGC AAA GCG GCA GGT CGT CCC (서열번호 23; 도 32A) 또는 관련 서열 (서열번호 200, 도 67A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 127에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 32B; 도 67A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 127에 제시된 코어 서열(도 32B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머가 가지는 도파민에 대한 결합 친화도는, 서열번호 200을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 127에 제시된 코어 서열(도 32B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 200을 가지는 1차 압타머와 도파민 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 127에 제시된 코어 서열(도 32B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 127에 제시된 코어 서열(도 32B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 127에 제시된 코어 서열(도 32B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 127에 제시된 코어 서열(도 32B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG, 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 세로토닌, 멜라토닌 또는 타이로신 대비 도파민에 선택적으로 결합한다(도 68B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 CACAG (서열번호 198) 및 CACAA (서열번호 199) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 도파민-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GGA GGA GTT AGC ATG ACG GCA ACT TTA GTA CTT CGT CGT CCC (서열번호 20; 도 29A) 또는 관련 서열 (서열번호 201, 도 68A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 121에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 29B; 도 68A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 121에 제시된 코어 서열(도 29B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머가 가지는 도파민에 대한 결합 친화도는, 서열번호 201을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 121에 제시된 코어 서열(도 29B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 201을 가지는 1차 압타머와 도파민 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 121에 제시된 코어 서열(도 29B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 121에 제시된 코어 서열(도 29B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 121에 제시된 코어 서열(도 29B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 121에 제시된 코어 서열(도 29B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG, 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 세로토닌, 멜라토닌 또는 타이로신 대비 도파민에 선택적으로 결합한다(도 69B 참조). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열 GGGG(서열번호 169) 및 GG 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 도파민-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA CTT CAG ACG CTC AAC GTT TGG GGA GGC ACG GCA GGT CGT CCC (서열번호 19; 도 28A) 또는 관련 서열 (서열번호 202, 도 69A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 119에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 28B; 도 69A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 119에 제시된 코어 서열(도 28B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머가 가지는 도파민에 대한 결합 친화도는, 서열번호 202를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 119에 제시된 코어 서열(도 28B)을 포함하는 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 202를 가지는 1차 압타머와 도파민 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 119에 제시된 코어 서열(도 28B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 119에 제시된 코어 서열(도 28B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 119에 제시된 코어 서열(도 28B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 119에 제시된 코어 서열(도 28B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 21, 서열번호 196, 서열번호 22, 서열번호 197, 서열번호 23, 서열번호 200, 서열번호 20, 서열번호 201, 서열번호 19, 서열번호 202 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 21, 서열번호 196, 서열번호 22, 서열번호 197, 서열번호 23, 서열번호 200, 서열번호 20, 서열번호 201, 서열번호 19, 또는 서열번호 202 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 도파민에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.10 세로토닌-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 세로토닌과 결합하고, 도파민, 멜라토닌, 및 5-히드록시트립토판 대비 세로토닌에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGG, 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 도파민, 멜라토닌, 및 5-히드록시트립토판 대비 세로토닌에 선택적으로 결합한다(도 70B, 71B, 72B, 73B, 74B, 75B, 76B). 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGG 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGG 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGG 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열 GG 및 GGGG(서열번호 169) 및 GGG 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 세로토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CTG GTA GGC AGA TAG GGG AAG CTG ATT CGA TGC GTG GGT CGT CCC (서열번호 25; 도 34A) 또는 관련 서열 (서열번호 203, 도 70A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 131에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 34B; 도 70A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 131에 제시된 코어 서열(도 34B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머가 가지는 세로토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 203을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 131에 제시된 코어 서열(도 34B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 203을 가지는 1차 압타머와 세로토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 131에 제시된 코어 서열(도 34B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 131에 제시된 코어 서열(도 34B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 131에 제시된 코어 서열(도 34B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 131에 제시된 코어 서열(도 34B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 세로토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CTG GTA GGC AAC AGG GGA AGG GAG TTC TGC GTA CGT GGG TCG TCC C (서열번호 28; 도 37A) 또는 관련 서열 (서열번호 204, 도 71A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 137에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 37B; 도 71A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 137에 제시된 코어 서열(도 37B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머가 가지는 세로토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 204를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 137에 제시된 코어 서열(도 37B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 204를 가지는 1차 압타머와 세로토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 137에 제시된 코어 서열(도 37B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 137에 제시된 코어 서열(도 37B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 137에 제시된 코어 서열(도 37B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 137에 제시된 코어 서열(도 37B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 세로토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CAG GGG CAT ATA TAG TCT AGG GTT TGG TGT GGG TAG TGT CGT CCC (서열번호 24; 도 33A) 또는 관련 서열 (서열번호 205, 도 72A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 129에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 33B; 도 72A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 129에 제시된 코어 서열(도 33B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머가 가지는 세로토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 205를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 129에 제시된 코어 서열(도 33B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 205를 가지는 1차 압타머와 세로토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 129에 제시된 코어 서열(도 33B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 129에 제시된 코어 서열(도 33B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 129에 제시된 코어 서열(도 33B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 129에 제시된 코어 서열(도 33B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 세로토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CTG GTA GGC AGC AGG GGA AGT AGG CGT GTC CTC GTG GGT CGT CCC (서열번호 26; 도 35A) 또는 관련 서열 (서열번호 206, 도 73A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 133에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 35B; 도 73A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 133에 제시된 코어 서열(도 35B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머가 가지는 세로토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 206을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 133에 제시된 코어 서열(도 35B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 206을 가지는 1차 압타머와 세로토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 133에 제시된 코어 서열(도 35B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 133에 제시된 코어 서열(도 35B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 133에 제시된 코어 서열(도 35B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 133에 제시된 코어 서열(도 35B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 세로토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA GTA GGG GAT CCA CAG TGA GGG GTT TGT ATG GGT GGT CGT CCC (서열번호 27; 도 36A) 또는 관련 서열 (서열번호 207, 도 74A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 135에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 36B; 도 74A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 135에 제시된 코어 서열(도 36B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머가 가지는 세로토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 207을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 135에 제시된 코어 서열(도 36B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 207을 가지는 1차 압타머와 세로토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 135에 제시된 코어 서열(도 36B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 135에 제시된 코어 서열(도 36B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 135에 제시된 코어 서열(도 36B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 135에 제시된 코어 서열(도 36B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 세로토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG AGG TGG TGT CTT GGA CAG TGG TAT TCG CAG TTG CGT CGT CCC (서열번호 29; 도 38A) 또는 관련 서열 (서열번호 208, 도 75A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 139에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 38B; 도 75A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 139에 제시된 코어 서열(도 38B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머가 가지는 세로토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 208을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 139에 제시된 코어 서열(도 38B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 208을 가지는 1차 압타머와 세로토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 139에 제시된 코어 서열(도 38B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 139에 제시된 코어 서열(도 38B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 139에 제시된 코어 서열(도 38B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 139에 제시된 코어 서열(도 38B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 세로토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CAG AGA CGG GGT GCT TAC TTG GTT CAG GGG AGT CGA CGT CGT CCC (서열번호 30; 도 39A) 또는 관련 서열 (서열번호 209, 도 76A). 특정 비-제한적 구체예에서, 도파민-결합 1차 압타머는 서열번호 141에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 39B; 도 76A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 141에 제시된 코어 서열(도 39B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머가 가지는 세로토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 209를 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 141에 제시된 코어 서열(도 39B)을 포함하는 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 209를 가지는 1차 압타머와 세로토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 141에 제시된 코어 서열(도 39B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 141에 제시된 코어 서열(도 39B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 141에 제시된 코어 서열(도 39B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 141에 제시된 코어 서열(도 39B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 25, 서열번호 203, 서열번호 28, 서열번호 204, 서열번호 24, 서열번호 205, 서열번호 26, 서열번호 206, 서열번호 27, 서열번호 207, 서열번호 29, 서열번호 208, 서열번호 30, 서열번호 209 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 세로토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 25, 서열번호 203, 서열번호 28, 서열번호 204, 서열번호 24, 서열번호 205, 서열번호 26, 서열번호 206, 서열번호 27, 서열번호 207, 서열번호 29, 서열번호 208, 서열번호 30, 서열번호 209 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 세로토닌에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.11 멜라토닌-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 멜라토닌과 결합하고, 세로토닌 또는 트립토판 대비 멜라토닌에 선택적으로 결합한다(도 77B 및 78B 참조).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGT CTT GGG GGT GGT GGG TTT GGC TGG TAC TTA GGG CGT CGT CCC (서열번호 32; 도 41A) 또는 관련 서열 (서열번호 210, 도 77A). 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 145에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 41B; 도 77A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 145에 제시된 코어 서열(도 41B)을 포함하는 멜라토닌-결합 1차 압타머가 가지는 멜라토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 210을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 145에 제시된 코어 서열(도 41B)을 포함하는 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 210을 가지는 1차 압타머와 멜라토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 145에 제시된 코어 서열(도 41B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 145에 제시된 코어 서열(도 41B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 145에 제시된 코어 서열(도 41B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 145에 제시된 코어 서열(도 41B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CAG CCA AGG TCG TAA GGT ACG GTC AGT GTA CTC GGT TGT CGT CCC (서열번호 31; 도 40A) 또는 관련 서열 (서열번호 211, 도 78A). 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 143에 제시된 코어 서열을 포함한다(도 40B; 도 78A). 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 143에 제시된 코어 서열(도 40B)을 포함하는 멜라토닌-결합 1차 압타머가 가지는 멜라토닌에 대한 결합 친화도는, 서열번호 211을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 143에 제시된 코어 서열(도 40B)을 포함하는 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 211을 가지는 1차 압타머와 멜라토닌 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 143에 제시된 코어 서열(도 40B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 143에 제시된 코어 서열(도 40B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 143에 제시된 코어 서열(도 40B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 143에 제시된 코어 서열(도 40B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 31, 서열번호 211, 서열번호 32, 서열번호 210 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 멜라토닌-결합 1차 압타머는 서열번호 31, 서열번호 211, 서열번호 32, 또는 서열번호 210 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 멜라토닌에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.12 타이로신 -결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 147에 제시된 코어 서열(도 42B)을 포함하는 타이로신-결합 1차 압타머가 가지는 타이로신에 대한 결합 친화도는, 서열번호 33을 가지는 1차 압타머의 결합 친화도의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 147에 제시된 코어 서열(도 42B)을 포함하는 타이로신-결합 1차 압타머는 서열번호 33을 가지는 1차 압타머와 타이로신 결합을 위하여 경쟁한다. 비-제한적 구체예에서, 상기 1차 압타머는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 70 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가진다. 특정 비-제한적 구체예에서, 타이로신-결합 1차 압타머는 서열번호 147에 제시된 코어 서열(도 42B)을 포함하며 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 타이로신-결합 1차 압타머는 서열번호 147에 제시된 코어 서열(도 42B)을 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 타이로신-결합 1차 압타머는 서열번호 147에 제시된 코어 서열(도 42B)을 포함하며 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 타이로신-결합 1차 압타머는 서열번호 147에 제시된 코어 서열(도 42B) 및 코어 서열의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하며, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 타이로신-결합 1차 압타머는 서열번호 33, 서열번호 147 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 타이로신-결합 1차 압타머는 서열번호 33 또는 서열번호 147 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 타이로신에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.13 알도스테론-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 알도스테론과 결합하고, 코르티손, 코르티솔 또는 데옥시코르티손 대비 알도스테론에 선택적으로 결합하고(도 79B 및 80B 참조), C18 위치에 결합된 메틸을 가지는 스테로이드 대비 하나 또는 두 개의 산소 원자와 결합된 C18을 가지는 스테로이드에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 알도스테론-결합 1차 압타머는 서열 GATAGT (서열번호 212) 및 ATGTTC (서열번호 213), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 코르티손, 코르티솔 또는 데옥시코르티손 대비 알도스테론에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 알도스테론-결합 1차 압타머는 서열 GATAGT (서열번호 212) 및 ATGTTC (서열번호 213) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 알도스테론-결합 1차 압타머는 서열 GATAGT (서열번호 212) 및 ATGTTC (서열번호 213) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 알도스테론-결합 1차 압타머는 서열 GATAGT (서열번호 212) 및 ATGTTC (서열번호 213) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 알도스테론-결합 1차 압타머는 서열 GATAGT (서열번호 212) 및 ATGTTC (서열번호 213) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 알도스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CAG ATA GTT GTT CTT AGC GAT GTT CAG CGT TGT CGT CCC (서열번호 214, 도 79A) 또는 관련 서열 (서열번호 63, 도1B).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 알도스테론-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG TAG GTA GGC CAA CTG GGT ATT TAC TGG TGT CGT CCC (서열번호 215, 도 80A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 알도스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 214, 서열번호 215, 서열번호 63 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 알도스테론-결합 1차 압타머는 서열번호 214, 서열번호 215 또는 서열번호 63 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 알도스테론에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.14 토브라마이신 -결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 토브라마이신과 결합하고, 아미카신 또는 카나마이신 대비 토브라마이신에 선택적으로 결합한다(도 81B 및 82B 참조).
특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 TGAAA (서열번호 216) 및/또는 AAGTG (서열번호 217), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 아미카신 또는 카나마이신 대비 토브라마이신에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 TGAAA (서열번호 216) 및/또는 AAGTG (서열번호 217) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 TGAAA (서열번호 216) 및/또는 AAGTG (서열번호 217) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 TGAAA (서열번호 216) 및/또는 AAGTG (서열번호 217) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 TGAAA (서열번호 216) 및/또는 AAGTG (서열번호 217) 또는 이들의 변이체, 및 이들 세 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG CCC CGC AAG GGG TGA AAT GAC AGA GTC AAA GTG CGT CGT CCC (서열번호 218, 도 81A).
특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTC (서열번호 219) 및/또는 TCGGTAG (서열번호 220), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 아미카신 또는 카나마이신 대비 토브라마이신에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTC (서열번호 219) 및/또는 TCGGTAG (서열번호 220) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTC (서열번호 219) 및/또는 TCGGTAG (서열번호 220) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTC (서열번호 219) 및/또는 TCGGTAG (서열번호 220) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이 서열 또는 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTC (서열번호 219) 및/또는 TCGGTAG (서열번호 220) 또는 이들의 변이체, 및 이 서열 또는 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 토브라마이신-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGT AGT CGG AAA CGG TGT CTC AGT TCC TCG GTA GAG TCG TCC C (서열번호 221, 도 82A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열번호 218, 서열번호 221 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 토브라마이신-결합 1차 압타머는 서열번호 218 또는 서열번호 221 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 토브라마이신에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.15 아미카신-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 아미카신과 결합하고, 토브라마이신 또는 카나마이신 대비 아미카신에 선택적으로 결합한다(도 83B, 84B 및 85B 참조).
특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GC 및 GCCC(서열번호 222) 및 GTTTAGA (서열번호 223) 및 AGTCTT (서열번호 224), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 토브라마이신 또는 카나마이신 대비 아미카신에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GC 및 GCCC(서열번호 222) 및 GTTTAGA (서열번호 223) 및 AGTCTT (서열번호 224) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GC 및 GCCC(서열번호 222) 및 GTTTAGA (서열번호 223) 및 AGTCTT (서열번호 224) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GC 및 GCCC(서열번호 222) 및 GTTTAGA (서열번호 223) 및 AGTCTT (서열번호 224) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 네 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GC 및 GCCC(서열번호 222) 및 GTTTAGA (서열번호 223) 및 AGTCTT (서열번호 224) 또는 이들의 변이체, 및 이들 네 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 아미카신-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCG CTT GCC CCC TGG CAT GTT TAG AGC AGA GTC TTT GGT CGT CCC (서열번호 225; 도 83A).
특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GGTTCAT (서열번호 226) 및 ATGTGGG (서열번호 227), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 토브라마이신 또는 카나마이신 대비 아미카신에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GGTTCAT (서열번호 226) 및 ATGTGGG (서열번호 227) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GGTTCAT (서열번호 226) 및 ATGTGGG (서열번호 227) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GGTTCAT (서열번호 226) 및 ATGTGGG (서열번호 227) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 GGTTCAT (서열번호 226) 및 ATGTGGG (서열번호 227) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 아미카신-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGT CCG GTT CAT GAC TTC AGT AGT CTA GTG GGG GTC TGT CGT CCC (서열번호 228; 도 84A).
특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 CAA 및 CGTCTACGGCTTAGC (서열번호 229), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서, 토브라마이신 또는 카나마이신 대비 아미카신에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 CAA 및 CGTCTACGGCTTAGC (서열번호 229) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 CAA 및 CGTCTACGGCTTAGC (서열번호 229) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 CAA 및 CGTCTACGGCTTAGC (서열번호 229) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 아미카신-결합 1차 압타머는 서열 CAA 및 CGTCTACGGCTTAGC (서열번호 229) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 아미카신-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGC AAC CAT TCC AGT GGC GTC TAC GGC TTA GCT TTT CGT CGT CCC (서열번호 230; 도 85A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 아미카신-결합 1차 압타머는 서열번호 225, 서열번호 228, 서열번호 230 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 아미카신-결합 1차 압타머는 서열번호 225, 서열번호 228, 또는 서열번호 230 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 아미카신에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.16 메틸렌 블루 -결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-6 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 메틸렌 블루에 결합하고, 메틸렌 블루에 선택적으로 결합한다(도 86B, 87B, 88B, 89B, 90B 및 91B 참조).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA GGA TGC TGT TCC ACC GGG GTA CAG GTA GGT CGC TGT CGT CCC (서열번호 231; 도 86A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GCG TAG CGA TAG AAG AGA GCA GGG GGA GAG ACC TGT CGT CCC (서열번호 232; 도 87A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GAA GGA GTT CCG GGG TAC GCG GGT AAG GGA AGG AGT CGT CCC (서열번호 233; 도 88A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA ACG AGT ATA CGC TTA CGT CAC GTT GAT GCT GTG GGT CGT CCC (서열번호 234; 도 89A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGC ATT GAT GTA CAA GCT CGA TTC GTA TCC CTT GAT CGT CGT CCC (서열번호 235; 도 90A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CTG GGC TCG TGT TCT ATG GAC AAG GGG GAG TGA CCT GGT CGT CCC (서열번호 236; 도 91A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 서열번호 231, 서열번호 232, 서열번호 233, 서열번호 234, 서열번호 235, 서열번호 236 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 메틸렌 블루-결합 1차 압타머는 서열번호 231, 서열번호 232, 서열번호 233, 서열번호 234, 서열번호 235, 또는 서열번호 236 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 메틸렌 블루에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.17 암모늄-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-2 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 암모늄에 결합하고, 글라이신 또는 에탄올아민 또는 칼륨 이온 대비 암모늄에 선택적으로 결합한다(도 92B, 93B, 94B, 95B, 96B, 97B 및 98B 참조).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 암모늄-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG AAG AGG CTC AGT GCT ATC TTA TCT GAG AGG GTT TGT CGT CCC (서열번호 239; 도 92A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 암모늄-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GAG TGT CTC CTA AGG CCT TAG TAA GAA GGG TCC TGT CGT CCC (서열번호 240; 도 93A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 암모늄-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GAA GAG GCT CGT GAG TTG ATG GGG AGA GGG TCC GGT CGT CCC (서열번호 241; 도 94A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 암모늄-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG AAG GGT CCC GTT GAG TTT GCA ATG GTG AGG GTT TGT CGT CCC (서열번호 242; 도 95A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 암모늄-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGC CGA TGG AAG GGG CCC TGG TGG GAG GGT CAA AGG GGT CGT CCC (서열번호 243; 도 96A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 암모늄-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GCA GGT AGA TCT ACA TGA ATA TGA AGG AAT GAT CGT CGT CCC (서열번호 244; 도 97A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 암모늄-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG GGA GTA GCC GGG TGG TTA GTG TCT CGC GAG GAA GTC GTC CC (서열번호 245; 도 98A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 암모늄-결합 1차 압타머는 서열번호 239, 서열번호 240, 서열번호 241, 서열번호 242, 서열번호 243, 서열번호 244, 서열번호 245 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 암모늄-결합 1차 압타머는 서열번호 239, 서열번호 240, 서열번호 241, 서열번호 242, 서열번호 243, 서열번호 244, 또는 서열번호 245 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 암모늄에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.18 보론산 -결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-2 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 보론산에 결합하고, 비스보론산, 예를 들어 글루코스와 복합된 비스보론산 대비 보론산에 선택적으로 결합한다(도 99B, 100B 참조).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 보론산-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA GGT GGG GCT GCT CAA GTG GAG GTT CCT CGT CGT CCC (서열번호 247; 도 99A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 보론산-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCA GAG GGG CCT CAA ATG TGG GGT GTT GCT CGT CGT CCC (서열번호 248; 도 100A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 보론산-결합 1차 압타머는 서열번호 247, 서열번호 248 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 보론산-결합 1차 압타머는 서열번호 247 또는 서열번호 248 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 보론산에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.19 에피네프린-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-3 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 에피네프린에 결합하고, 세로토닌, 노르에피네프린 또는 도파민 대비 에피네프린에 선택적으로 결합한다(도 101B, 102B).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 에피네프린-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CCG GGG TAG GGG TTA GGT GGG AAT GGA GCT GGA CCG TGT CGT CCC (서열번호 249; 도 101A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 에피네프린-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA CGG ACC GTT GCC CTG GGG TAG TGC GCG CTT CGT TTA CGT CGT CCC (서열번호 250; 도 102A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 에피네프린-결합 1차 압타머는 서열번호 249, 서열번호 250 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 에피네프린-결합 1차 압타머는 서열번호 249 또는 서열번호 250 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 에피네프린에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.20 크레아티닌-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-2 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 크레아티닌에 결합하고, 크레아틴 또는 우레아 대비 크레아티닌에 선택적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 서열 GGTGGCCT (서열번호 254) 및 AGGGGTG (서열번호 255), 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-2 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 크레아티닌에 결합하며(도 103B, 104B. 105B, 106B 참조), 크레아틴 또는 우레아 대비 크레아티닌에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 GGTGGCCT (서열번호 254) 및 AGGGGTG (서열번호 255) 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 서열 GGTGGCCT (서열번호 254) 및 AGGGGTG (서열번호 255) 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 서열 GGTGGCCT (서열번호 254) 및 AGGGGTG (서열번호 255) 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 서열 GGTGGCCT (서열번호 254) 및 AGGGGTG (서열번호 255) 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: GA CGA CGGTGGCCTTAATAGATAGATGATATTCTTAT ATGTG TGAGGGGTG GT CGT C (서열번호 256; 도 103A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: GA CGA C GGTGGCCTATATTGGTATGTATGAA GAATAGAACTATTAGGGGGT GT C (서열번호 257; 도 104A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CGA C GGTGGCCTATTAAATAGCTTTAGTT TAAGAAAAGTAATAGGGGGT GT CG (서열번호 258; 도 105A).
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 크레아티닌-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: CTC TCG GGA CGA C GGTGGCCTATTAAGTAGCTTTA GTTCAAGAAAAGTAATAGGGGGT GT CGT CCC (서열번호 259; 도 106A).
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 크레아티닌-결합 1차 압타머는 서열번호 256, 서열번호 257, 서열번호 258, 서열번호 259 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 크레아티닌-결합 1차 압타머는 서열번호 256, 서열번호 257, 서열번호 258 또는 서열번호 259 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 크레아티닌에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.1.21. 바소프레신-결합 1차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머가 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 바소프레신에 결합하고, 옥시토신 또는 프레시노산(pressinoic acid) 대비 바소프레신에 선택적으로 결합한다
특정 비-제한적 구체예에서, 바소프레신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTACGTT (서열번호 260) 및 CAT, 또는 치환, 결실, 삽입 또는 연장에 의해 1개 또는 2개의 염기가 다른, 이들 서열의 변이체를 포함하며, 상기 1차 압타머는 실온 또는 25℃에서 10-4 M 미만의 해리 상수로 수성 용액 중에서 바소프레신에 결합하며(도 107B 참조), 옥시토신 또는 프레시노산(pressinoic acid) 대비 바소프레신에 선택적으로 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 바소프레신-결합 1차 압타머는 GTAGTACGTT (서열번호 260) 및 CAT 또는 이들의 변이체를 포함하며, 하나 이상의 작동 서열(operative sequence)을 더 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 바소프레신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTACGTT (서열번호 260) 및 CAT 또는 이들의 변이체를 포함하고 하나 이상의 작동 서열을 더욱 포함하며, 상기 작동 서열은 센서 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열에 상보적이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 바소프레신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTACGTT (서열번호 260) 및 CAT 또는 이들의 변이체를 포함하고, 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 바소프레신-결합 1차 압타머는 서열 GTAGTACGTT (서열번호 260) 및 CAT 또는 이들의 변이체, 및 이들 두 서열들의 어느 한쪽(측면)에 하나 이상의 작동 서열을 포함하고, 상기 작동 서열 중 2개는 상호 상보적인 부분을 포함하여 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 바소프레신-결합 1차 압타머는 다음의 서열을 포함할 수 있다: GA C GTCCAAGTAGTACGTTTAATTAGG ATTTCCGAATTATTGGCATGC GT C (서열번호 261; 도 107A)
특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 바소프레신-결합 1차 압타머는 서열번호 261 또는 이들 서열들의 변이체로서 원래의 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 상동성을 가지는, 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 수득되거나 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. % 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 분리된 바소프레신-결합 1차 압타머는 서열번호 261 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 압타머는 바소프레신에 결합할 수 있고 이들의 구조-스위칭 포맷에서(예를 들어, 항-압타머 분석법, 가짜 샌드위치 분석법, 또는 샌드위치 분석법에서) 이들은 형광의 증가로 반응할 수 있다.
5.2 항- 압타머 분석법
특정 구체예에서, "항-압타머 분석법(anti-aptamer assay)"이 제공되는데, 여기에서 관심 대상 분석물의 존재 및/또는 양이 테스트될 샘플이, (i) 분석물에 결합하는 코어 서열을 포함하는 1차 압타머 및 (2) 1차 압타머의 적어도 일부에 상보적인 "항-압타머"의 유효량들과 접촉되며, 상기 1차 압타머 및/또는 항-압타머는 1차 압타머 및 항-압타머가 서로 결합했는지 또는 결합하지 않았는지 검출하는 검출가능한 모이어티를 포함하고; 분석물에 결합한 1차 압타머는 이의 항-압타머에 결합하지 않는다.
특정 구체예는, (i) 샘플의 적어도 일부를, 1차 압타머 및 상기 1차 압타머의 적어도 일부에 상보적인 항-압타머의 유효량들과 접촉시키는 단계로서, 상기 1차 압타머 및/또는 항-압타머가, 표적 분석물이 존재하지 않는 경우 상기 1차 압타머와 항-압타머 간의 듀플렉스(duplex) 형성을 허용하는 조건 하에서, 분석물에 결합한 1차 압타머의 양이 검출 및/또는 측정되도록 하는 모이어티를 포함하는 것인, 단계; 및 (ii) 항-압타머에 결합하지 않는 1차 압타머의 양을 검출하고 선택적으로는 정량화하는 단계를 포함하는, 샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다.
샘플은, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 뇨 샘플, 조직 샘플, 뇌척수액 샘플, 가래 샘플, 분변 샘플, 물 샘플, 산업적 샘플 등일 수 있다.
구체적인 예시로서, 이에 제한되지 않지만, 샘플 내 관심 대상 분석물의 존재 또는 양은 (i) 샘플의 적어도 일부를, (a) 형광 표지자를 포함하는 1차 압타머 및 (b) 1차 압타머와 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 상보적인 항-압타머의 유효량들과 접촉시키는 단계로서, 상기 항-압타머가, 분석물이 존재하지 않을 경우 1차 압타머와 항-압타머 간의 듀플렉스(duplex) 형성이 일어나도록 허용하는 조건 하에서, 1차 압타머와 항-압타머가 듀플렉스 내에서 (예를 들어, 이중 가닥 분자로서) 함께 결합하는 경우 상기 형광 표지자의 형광을 소광시키는 모이어티를 포함하는 것인, 단계; 및 (ii) 형광의 양을 검출하고 선택적으로는 정량화하는 단계에 의해 결정할 수 있다. 형광의 양은 분석물의 알려진 양의 존재에서(예를 들어, 표준 곡선) 또는 샘플의 부재에서 1차 압타머와 항-압타머의 대조군 혼합물로부터 발생한 형광의 양과 더욱 비교될 수 있다. 이 예시는 당업자에게 알려진 바대로 변형될 수 있다. 예를 들어, 비색 표지자(colorimetric label), 효소적 표지자, 방사성 표지자 등과 같은 상이한 모이어티들이 듀플렉스 형성을 검출하는 데 사용될 수 있고, 분석법 설계에 따라, 검출가능한 표지자가 항-압타머에 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 1차 압타머는 항-압타머에 상보적인 하나 이상의 작동 서열을 포함하여 듀플렉스 형성을 촉진한다. 예를 들어, 듀플렉스를 형성을 용이하게 하는 뉴클레오티드 조성을 갖는 작동서열이 사용될 수 있다(일명, "발판(toe hold)" 서열).
항-압타머 분석법 및 이를 사용하는 방법은, 본원에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 관심 대상 분석물에 결합하는 임의의 1차 압타머를 사용할 수 있다.
항-압타머는 이의 대응되는 1차 압타머와 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 95% 이상 상보적인 서열을 가진다.
항-압타머 분석법에 사용하기 위한 1차 압타머 또는 항-압타머는 약 30 내지 약 200 뉴클레오티드, 약 30 내지 100 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 80 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 상기 분석법에서 1차 압타머 및 항-압타머는 약 1:1 의 비율로 존재할 수 있다. 분석물 및 1차 압타머 간의 및/또는 1차 압타머 및 항-압타머 간의 결합 강도에 따라, 이 비율을 변경하여 바람직한 특성을 가지는 농도-반응 곡선을 생성하는 것이 요망될 수 있다(예를 들어, 특정 농도에서 분석물을 측정/검출할 수 있음). 구체적인 예시로서, 이에 제한되지 않지만, 1차 압타머와 분석물 간의 결합이 1차 압타머와 항-압타머 간의 친화력에 비하여 매우 강할 경우, 항-압타머의 상대적 양을 증가시켜 비율이 1:1초과(1:greater than 1)가 되는게 바람직할 수 있다. 비-제한적인 예시는 약 1:1이다.
특정 비-제한적 구체예에서, 항-압타머 분석은 용액 내에서 수행될 수 있다. 용액 내에서 다양한 분석물을 검출하기 위한 항-압타머 분석의 비-제한적인 예시가 도 3A-L에 나타나 있으며, 이들은 데옥시코르티손(도 3A-B); 알도스테론 (도 3C-D); 코르티손 (도 3E-F); 테스토스테론 (도 3G-H); Phen-CpRh (FIGUR 3I-J), 및 페닐알라닌(도 3K-L)을 측정한 결과이다. 실례로서 제공되는 구체적인 비-제한적 예시에서, 400 nM FAM-압타머 용액 및 4배 농축된 Iowa Black-항-압타머("상보 가닥") 용액을 버퍼 내 각각 준비한다(20 mM HEPES, 1 M NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM KCl, pH 7.5). 이들 용액을 끓는 물에서 5분간 인큐베이션에 의해 어닐링하고 ~30분간 실온에서 식힌다. 한편, 2배 농축된, 각 압타머의 표적 용액을 준비한다. 압타머 및 항-압타머 용액의 30분간 인큐베이션한 후, 우선 18.75 μl 의 압타머 용액을 384-웰 플레이트에 첨가한 다음 37.5 μl의 표적 용액을 첨가한 직후, 18.75 ul의 항-압타머 용액을 첨가한다. 인큐베이션 없이, 형광 측정을 시작하여 Fluorescence plate reader (Victor II microplate reader, PerkinElmer)를 사용하여 >8시간 동안 실온에서 5분마다 판독한다. 75 μl 반응 부피 내 CS 압타머(1000 nM)를 제외하고는 모두 압타머의 최종 농도는 100 nM이고 상보 가닥의 농도는 100 nM이다.
특정 비-제한적 구체예에서, 항-압타머 분석법은, 고체상에 결합하는 1차 압타머 및 항-압타머를 사용하여 고체상 분석으로 수행될 수 있다. 다양한 분석물을 검출하기 위한, 고체상 분석법으로서 항-압타머 분석법의 사용의 비-제한적 예시가, 데옥시코르티손 (도 4A), 글루코스 (도 4B) 및 페닐알라닌(도 4C)에 대하여 도 4A-C 에 나타나 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 본원에 기재된 항-압타머 분석법을 실시하기 위한 키트가 제공된다. 예를 들어, 상기 키트는 관심 대상 분석물에 대한 1차 압타머 및 대응되는 항-압타머를 포함한다. 이러한 키트에 포함될 수 있는 1차 압타머의 비-제한적인 예시는 본원에 기재된, 예를 들어 항목 5.1 및 도 50A-B 내지 102AB에 기재된 바와 같은 1차 압타머, 및 본원에 기재된 대응되는 항-압타머를 포함한다. 상기 키트는 표적 분석물, 예를 들어, 표적 분석물을 포함하는 대조군 용액, 및/또는 표적 곡선을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
5.3 가짜샌드위치 분석법
본 출원은 용액 내(도 47A-D) 및 플레이트 상에서(도 47E-F)의 가짜샌드위치 분석법을 개시한다. 특정 비-제한적 구체예에서 가짜샌드위치 분석법은 1차 압타머를 사용한다.
특정 구체예는 "가짜샌드위치 분석법(pseudosandwich assay)", 또는 (i) 샘플의 적어도 일부를, (a) 분석물에 결합하는 코어 서열 및 센서 올리고뉴클레오티드에 상보적인 부분을 포함하는 1차 압타머; (b) 센서 올리고뉴클레오티드; 및 선택적으로 (c) 콤프(comp) 올리고뉴클레오티드의 유효량들과 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 방법으로서, 상기 중 하나 이상이, 1차 압타머와 센서 올리고뉴클레오티드가 서로 결합하였는지 또는 1차 압타머가 분석물에 결합하였는지를 검출할 수 있는 검출가능한 모이어티에 결합된 것인, 방법을 제공한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(1) 이미 이용가능하지 않은 한, 용액-상(도 7) 또는 고체-상 선별에 의해 1차 압타머(Ap)를 분리하는 단계; 왓슨-크릭 염기쌍을 최소화하길 원하는 경우, 에난티오머성 압타머(스피에겔머)의 사용(예를 들어, 압타머의 융합, 또는 분석물 없이 백그라운드 상호작용을 최소화하기 위함);
(2) 구조-스위칭 형태에서 1차 압타머를 테스트하고 구조 스위칭 형태를 변형하여, 가짜-샌드위치 분석법 포맷으로 변환하는 단계(도 6C);
(3) 표적물과의 복합체로 있는 1차 압타머 또는 스피에겔머를 사용하여, 용액-상 또는 고체 상 선별에 의해 2차 샌드위치 압타머(As)를 분리하는 단계(도 9); 및
(4) 표적물에 대한 샌드위치 분석법을 수행하는 단계 (도 8).
개시된 1차 압타머의 예시적인 목록이, 이들의 관련된 센서 올리고뉴클레오티드와 함께, 이들의 센서 (구조-스위칭) 형태로 도 10-46에 제공된다16 -21. 개시된 1차 압타머가 용액-상 선별을 사용하여 분리되었고, 샌드위치 및 가짜샌드위치 분석법에 제한되지 않는 압타머-기반의 분석법에 사용될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머(도 10-46)는 스피에겔머 또는 핵산의 비천연적 거울상 이성질체일 수 있다22 -25. 특정 비-제한적 구체예에서, 1차 압타머는 "가짜샌드위치" 분석법에 사용되도록 직접적으로 조작될 수 있다(도 6, 도 47 및 도 48 참조).
"가짜-샌드위치" 분석법은 분석물-결합 압타머(1차 압타머 또는 AP)들의 가역적 상호작용을, 용액-상 분석(도 6 및 도 47A-D) 또는 용액-상태 분석(플레이트, 비드, 또는 측면 유동 장치의 구성요소)에 사용될 수 있는 보다 안정한 부분적 이중 나선 복합체로 변환시키며, 이는 광범위한 세척을 허용할 수 있다(도 6 및 도 47E-F).
1차 압타머가 이의 분석물에 결합되면 방출된 안정한 이중 나선 생성물이 고체 상태 표면(예를 들어, 플레이트 웰 또는 비드 또는 측면 유동 패드)에 포획되어 광범위한 세척을 받게 되어, 구조 스위칭 원리를 사용하는 다른 압타머-기반 분석법들에서의 높은 백그라운드의 많은 소스들을 제거할 수 있다. 그 후 포획 올리고뉴클레오티드와 복합체로 된 올리고뉴클레오티드는, 통상적인 샌드위치 ELISA 에서와 같이, 초기에 결합된 분석물의 존재와 양을 나타내는 증폭된 판독(readout)을 생성하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 상보적 올리고뉴클레오티드(CD)는 압타머로 확장될 수 있다(CDext). 자체적으로 CD 가 평형 상태에 있고 3-5 당량을 사용하여 플루오레신으로 압타머를 소광시키는데 사용되는 반면, CDext 는 하나의 등가물만을 필요로 하며 거의 비가역적으로 압타머에 결합한다. 이는 절반-반응점(half-response point)에 도움이 된다.
CDext 는 동역학적으로 보호된 안정한 복합체가 CDext (CDext comp)에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 상호작용할 수 있도록 하는 "발판(toehold)" 영역을 추가함으로써 더욱 확장될 수 있다. 용액에서 과량의 CDext comp 의 존재는 소량의 압타머가 결합 포켓을 형성하고 L과 상호작용하도록 허용한다. 이는 용액의 이중 나선 방출에 따라 실질적으로 증가하는 일정량의 이중 나선 형성을 유도하는 평형의 확립을 촉발시킨다. 이 과정은 용액에서 형광의 증가로 모니터할 수 있다.
가짜샌드위치 분석법-용액에서:
특정 비-제한적 구체예에서 용액내 가짜샌드위치 분석법이 수행될 수 있고, 여기에서 이중 나선 형성이 데옥시코르티코스테론에 의해 촉발된다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1차 압타머 또는 유사체들이 CDext 와 복합체를 형성할 수 있고 CDext comp 의 존재시 데옥시코르티코스테론 및 유사체들의 존재에서 형광의 증가를 생성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서 용액내 가짜샌드위치 분석법이 수행될 수 있고, 여기에서 이중 나선 형성이 타이로신에 의해 촉발된다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1차 압타머 또는 유사체들이 CDext 와 복합체를 형성할 수 있고 CDext comp 의 존재시 타이로신 및 유사체들의 존재에서 형광의 증가를 생성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서 용액내 가짜샌드위치 분석법이 수행될 수 있고, 여기에서 이중 나선 형성이 글루코스에 의해 촉발된다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1차 압타머 또는 유사체들이 CDext 와 복합체를 형성할 수 있고 CDext comp 의 존재시 글루코스 및 유사체들의 존재에서 형광의 증가를 생성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서 용액내 가짜샌드위치 분석법이 수행될 수 있고, 여기에서 이중 나선 형성이 페닐알라닌에 의해 촉발된다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1차 압타머 또는 유사체들이 CDext 와 복합체를 형성할 수 있고 CDext comp 의 존재시 페닐알라닌 및 유사체들의 존재에서 형광의 증가를 생성할 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, CDext 가 플레이트 상에 침착되면, 용액의 나머지가 제거될 때 이중 나선이 플레이트에 부착된 상태로 유지되고 이제는 광범위하게 세척될 수 있다. 이 이중 나선은 신호 개발을 위해 다양한 방법으로 사용될 수 있다.
가짜샌드위치 분석법-플레이트 상에서:
특정 비-제한적 구체예에서 용액-진전된(solution-evolved) 압타머 센서가 고체 표면-포맷 적용, 예를 들어 ELISA-타입 분석에 사용되기 위해 조정된다. 구체적으로, CDext 와 부분적으로 혼성화된 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 특정 압타머 및 분석물로 이루어진 용액 센서가 고체 표면에 고정될 수 있도록 부착 화학에 의해 변형된다.
특정 비-제한적 구체예에서 부착 화학은 비오틴의 사용 또는 말레이미드 및 술프히드릴 작용기 간의 공유 결합을 포함한다. 또한, 경쟁자 올리고뉴클레오티드 CDext (CDext comp)에 상보적인 가닥이, "판독(read-out)" 생산 분자, 예컨대 HRP 접합체를 포획하는데 사용되는 비오틴-태그로 변형된다. "판독(read-out)"은 시각화를 위해, HRP 의 기질인, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)를 사용하여 수행된다.
특정 비-제한적 구체예에서, +/- 분석물에 비해 표면-결합 센서의 반응 최적화는 여러가지 파라미터들을 조정하여 수행할 수 있다: 표면 상 센서의 양; 부착 화학; 상보적인 경쟁자 올리고뉴클레오티드의 농도; 각 단계에서의 버퍼; 세척 단계; HRP 농도; HRP 기질.
특정 구체예에서, 1차 압타머는 센서 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 하나 이상의 작동 서열을 포함한다.
1차 압타머 및 센서 올리고뉴클레오티드 쌍을 보여주는 비-제한적인 설명적 예시를 도 10A-42A에 나타내었다. 에를 들어, 이에 제한되지 않지만, 글루코스-결합 1차 압타머(서열번호 1)는 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 82)에 상보적인 작동 서열을 포함하고; 페닐알라닌-결합 1차 압타머(서열번호 2)는 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 84)에 상보적인 작동 서열을 포함하고; 페닐알라닌-결합 1차 압타머(서열번호 3)는 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 86)에 상보적인 작동 서열을 포함하고; 히드로코르티손-결합 1차 압타머(서열번호 5)는 센서 올리고뉴클레오티드(서열번호 90)에 상보적인 작동 서열을 포함하는 등이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 플레이트 상의 가짜샌드위치 분석법은 데옥시코르티코스테론을 검출하기 위해 수행될 수 있다.
샘플은, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 뇨 샘플, 조직 샘플, 뇌척수액 샘플, 가래 샘플, 분변 샘플, 물 샘플, 산업적 샘플 등일 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 전술한 분석법은 임의의 관심 대상 분석물을 검출 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있고, 분자량 약 1000달톤 미만, 약 500 달톤 미만, 또는 약 200 달톤 미만인 분석물을 검출 및/또는 정량화하는 현존하는 방법들에 비해 특히 유리할 수 있는데, 상기 분석물은 이에 제한되지 않지만 스테로이드 화합물을 포함하고, 이에 제하되지 않지만 예를 들어 코르티솔, 알도스테론, 데히드로이소안드로스테론, 프로게스테론, 테스토스테론; 글루코스; 이에 제한되지 않지만 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 시트룰린, 타이로신, 알라닌과 같은 아미노산; 약학적 화합물, 비타민, 독소, 신경전달물질(예를 들어, 카테콜아민, 세로토닌), 펩타이드(바소프레신, 옥시토신, 안지오텐신, 나트륨이뇨펩타이드, 글루카곤, 인슐린 및 기타), 항생제 및 항진균 화합물들(예를 들어, 아미노글리코시드), 거대고리 분자 면역억제제(macrocyclic immunosuppressant), 또는 지질 또는 지질 복합체를 포함한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 상기 분석법은 큰 분자, 예를 들어, 1000D 이상의 분자에도 적용될 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 본원에 기재된 가짜-샌드위치 분석법을 실시하기 위한 키트가 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 키트는 관심 대상 분석물에 대한 1차 압타머 및 대응되는 센서 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 키트에 포함될 수 있는 1차 압타머의 비-제한적인 예시는 본원에 기재된, 예를 들어 항목 6.1 및 도 50A-B 내지 102AB에 기재된 바와 같은 1차 압타머, 및 본원에 기재된 대응되는 센서 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 1차 압타머/센서 올리고뉴클레오티드 쌍의 비-제한적 예시는 도 10A-42A에 제시된다. 상기 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 콤프 올리고뉴클레오티드를 더욱 포함할 수 있다. 상기 키트는 표적 분석물, 예를 들어, 표적 분석물을 포함하는 대조군 용액, 및/또는 표적 곡선을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
5.4 샌드위치 분석법
"2차 압타머"(AS)는 유리 1차 압타머에 대비하여 표적 분석물(리간드, L)에 대한 1차 압타머(AP)의 복합체(AP*L)에 결합하여 삼원 복합체(Ap*L*AS)를 형성한다. 2차 압타머는 용액-상 또는 고체-상 선별에 의해 분리된다. 개시된 2차 압타머의 예시적인 비-제한적 목록이 도 48 및 49에 제공된다. 개시된 2차 압타머는 전술한 항목들 중 하나에 의해 분리되었다.
특정 구체예에서, 샌드위치 분석법이 제공되며, 이는 (i) 샘플의 적어도 일부를, (a) 분석물에 결합하는 코어 서열 및 1차 압타머가 분석물에 결합될 때 2차 "샌드위치" 압타머에 결합하는 부분을 포함하는 1차 압타머; 및 (b) 2차 "샌드위치" 압타머의 유효량들과 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 방법으로서, 상기 중 하나 이상은 1차 압타머와 2차 "샌드위치" 압타머가 서로 결합하였는지 결합하지 않았는지를 검출할 수 있는 검출가능한 모이어티에 결합된 것인, 방법을 포함한다.
특정 구체예에서, 1차 압타머는 샌드위치 압타머(일명 2차 압타머)에 결합하는 하나 이상의 작동 서열을 포함한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 압타머(1차)에 결합하는 압타머('2차')를 포함하는데, 압타머(1차)가 이의 리간드(관심 대상 분석물)에 결합할 때 압타머(2차)가 압타머(1차)에 우선적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 다른 서열(1차)에 결합하는 서열('2차')를 포함하는데, 그 서열(1차)이 분자에 결합할 때 서열(2차)이 서열(1차)에 우선적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 본 발명은 두 올리고뉴클레오티드를 사용하는 분자의 분석법(형광 분석법 또는 ELISA-유사)을 개시하는데, 하나의 뉴클레오티드가 그 분자에 결합할 때 다른 하나의 뉴클레오티드가 그 뉴클레오티드에 우선적으로 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 하나의 압타머(1차)는 수용체(receptor)를 형성하기에 충분하다.
분자 내 두번째 결합 부위(에피토프)의 이용가능성이 없는, "샌드위치" 분석법은 삼원 복합체(AP*L*AS)를 형성하는 2차 압타머(AS; 일명 샌드위치 압타머 또는 2차 샌드위치 압타머)에 의해 가능해진다(도 8). 개시된 샌드위치 분석법에서, 1차 및 2차 압타머는 L을 표적으로 하는 "샌드위칭(sandwiching)" 성분이다. 특정 비-제한적 구체예에서, 샌드위치 분석법은 용액 내(도 48 및 49) 또는 비-제한적 예시로 플레이트, 비드, 또는 측면 유동 장치의 임의의 구성요소인, 고체 표면 상에서(도 49) 수행될 수 있다.
특정 비-제한적 구체예에서, 본원에 기재된 샌드위치 분석법을 실시하기 위한 키트가 제공된다. 예를 들어, 상기 키트는 관심 대상 분석물에 대한 1차 압타머 및 대응되는 샌드위치 압타머(일명 2차 압타머)를 포함한다. 이러한 키트에 포함될 수 있는 1차 압타머의 비-제한적인 예시는 본원에 기재된, 예를 들어 항목 6.1 및 도 50A-B 내지 102AB에 기재된 바와 같은 1차 압타머, 및 본원에 기재된 대응되는 샌드위치/2차 압타머를 포함한다. 상기 키트는 표적 분석물, 예를 들어, 표적 분석물을 포함하는 대조군 용액, 및/또는 표적 곡선을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
샘플은, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 뇨 샘플, 조직 샘플, 뇌척수액 샘플, 가래 샘플, 분변 샘플, 물 샘플, 산업적 샘플 등일 수 있다.
5.4.1. 2차 압타머의 분리
본 출원은 SELEX 방법을 사용한 2차 압타머의 분리를 개시한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머(As)를 선별하는 방법이 수행될 수 있고, 이는 또한 몇몇 경우에 조합될 수 있고(도 9), 고체-상태 선별 및 용액-상 선별을 포함한다.
고체-상태 선별
고체-상태 선별 동안, 표적 압타머(Ap)가, 표적 분석물 L 의 존재 하에 라이브러리(예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 예비-구조화되거나 비구조화된 N20- 100)와 인큐베이션된 매트릭스(예를 들어, 비드)에 부착되어, Ap*L 복합체에 대한 친화성을 가진 압타머 후보자들을 분리한다(도 9A). 이 올리고뉴클레오티드들은 PCR-증폭되고, 단일-가닥 종(species)들로 재생된 다음, 다음 선별 사이클에 이용된다. 이 과정은 수렴(convergence)에 도달할 때까지 반복되고, 풀(pool) 클로닝되고 서열분석되어, AS 후보자들을 도출한다. 카운터-선별은 L의 부재에서 AP 에 대한 결합자의 제거에 의해 수행되어 복합체에 대한 결합을 보장한다.
용액-상 선별
용액-상에서의 이 과정은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 통해 매트릭스에 부착된 프라이머들 간에 스템 형성을 가능하게 하는 예비-구조화된(pre-structured) 라이브러리를 사용하고, AS 후보자들이 선별되는데, 이는 AP 와의 결합을 통해 이들의 루프가 닫히고 이들이 고체 표면으로부터 방출되기 때문이다(도 9B). 이 경우 카운터-선별은 리간드가 없는 AP, 및 리간드 그 자체에 대한 것이다.
특정 비-제한적 구체예에서, 선별에 사용되는 1차 압타머는 DNA, RNA, 변형된 뉴클레오티드, 또는 스피에겔머로 만들 수 있다. 스피에겔머는 L-데옥시리보스 또는 리보스가 있는 거울상 핵산20 -23이고 천연 DNA 와의 인접한 왓슨 크릭 염기쌍을 확정하지 않기 때문에, 백그라운드를 최소화하고, 친화성을 높이고, 2차 압타머의 특성을 개선시키는데 특히 적합하다. 특정 비-제한적 구체예에서, 이러한 스피에겔머는 세로토닌 또는 도파민(도 28-39에 묘사된 압타머들이 반전될 수 있음) 또는 다른 신경전달물질과 같은 대칭성 면을 가지는 분자 또는 평면형 분자에 대한 압타머를 반전시킴으로써 수득될 수 있다.
5.4.2. 글루코스 -결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
보다 구체적으로, 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 글루코스에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 글루코스와 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 단당류 또는 올리고당류와 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 글루코스와 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.3. 페닐알라닌-결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 페닐알라닌에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 페닐알라닌과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 아미노산 또는 펩타이드와 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 페닐알라닌과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.4. 히드로코르티손-결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 히드로코르티손에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 히드로코르티손과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 히드로코르티손과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.5. 데히드로이소안드로스테론 -결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 데히드로이소안드로스테론에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 데히드로이소안드로스테론과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 데히드로이소안드로스테론과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.6. 데옥시코르티코스테론 -결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 데옥시코르티코스테론에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 34-35 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2차 압타머(도 48), 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1차 압타머(도 21)가 데히드로이소안드로스테론과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 데옥시코르티코스테론과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.7. 테스토스테론-결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 테스토스테론에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 테스토스테론과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 테스토스테론과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.8. 스핑고신 -1-인산염-결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 스핑고신-1-인산염에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 스핑고신-1-인산염과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 스핑고신-1-인산염과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.9. 도파민-결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 도파민에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 도파민과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 도파민과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.10. 세로토닌-결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 세로토닌에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 서열번호 36, 서열번호 59, 및 서열번호 60 의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 2차 압타머(도 48), 및 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체들 중 어느 하나는, 서열번호 25 및 서열번호 58 의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 1차 압타머(도 34 및 도 48C 및 D)가 세로토닌과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 세로토닌과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.11. 타이로신 -결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 타이로신에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 타이로신과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 타이로신과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5.4.12. L- 타이로신 -결합 1차 압타머에 대한 2차 압타머
특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머는 L-타이로신에 대한 전술한 방법에 따라 분리될 수 있다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 왓슨-크릭 염기쌍의 치환, 결실 및 삽입에 의해 또는 비-보존적 위치에서의 돌연변이에 의해 수득된 이의 유사체는, 1차 압타머가 L-타이로신과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합한다. 특정 비-제한적 구체예에서, 2차 압타머 또는 이의 유사체는, 1차 압타머가 L-타이로신과 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하며, 상기 유사체는 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 2차 압타머의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 이 프로토콜은 도 49에 나타난 바와 같은 1차 압타머의 모든 비-제한적 예시들 및 이들의 유사체들(스피에겔머 포함)에 대한 2차 압타머를 분리하기 위해 적절히 변형되고 최적화될 수 있다. 이는 분자량 100000 달톤 이하, 2000 달톤 이하, 1000 달톤 이하, 500 달톤 이하 또는 200 달톤 이하를 가지는 임의의 분자에 대한 모든 1차 압타머에도 적용될 수 있으며, 서로 경쟁하지 않는 두 개의 에피토프를 가질 수 없다.
5.4.13 추가적인 샌드위치 분석법 구체예들
특정 비-제한적 구체예에서, 본 발명은 형광 검출 및 ELISA-유사 포맷을 가지는, 샌드위치 분석법을 제공한다.
전술한 가짜샌드위치 분석법에서, 실제 샌드위치 상호작용은 없었고(따라서, '가짜-샌드위치') 리간드*압타머 상호작용이 비경쟁적 샌드위치 ELISA와 유사한 포맷을 허용하는 이중 나선의 존재로 "번역되었다(translated)". 그러나, 특정 구체예에서 샌드위치 분석법은 서로와 경쟁하지 않고 동시에 하나의 분자에 결합하는 두 개의 압타머를 포함한다.
본 출원의 특정 비-제한적 구체예에서 압타머*리간드 복합체에 대한 압타머 또는 2차 압타머는, 리간드와의 복합체가 생성되었을 때 1차 압타머에 결합한다(도 8 및 도 48). 특정 구체예에서 샌드위치 분석법은 높은 민감도를 가져온다. 특정 비-제한적 구체예에서, 압타머*리간드 복합체에 대한 압타머는 정밀하게 조정된 상보성을 가진 정교한 스위치로 작용할 수 있다; 이들 중 하나가 리간드를 감지하면, 이들은 삼원(삼차) 복합체에 모인다(도 49).
용액 내 샌드위치 분석법
특정 비-제한적 구체예에서, 데옥시코르티코스테론 및 세로토닌에 대한 용액에서 샌드위치가 형성되고 형광 판독(read-out)이 측정된다(도 48A-C). 이 분석법에서, 1차 압타머는 용액 내 존재하고, 역시 용액 내 존재하는 2차 압타머는 구조-스위칭 형광 형태로 전환되고, 1차 압타머가 표적 스테로이드와 복합체를 형성할 때 소광물질-표지된 경쟁자 올리고뉴클레오티드의 방출을 통해 1차 압타머와 상호작용한다.
플레이트 상에서 샌드위치 분석법
특정 비-제한적 구체예에서, 플레이트 상 샌드위치 분석법이 세로토닌에 대해 수행된다(도 48D-E). 이 분석법에서, 1차 압타머가 플레이트 상에 침착되고, 2차 압타머는 리간드(이 경우에는 세로토닌)와 복합체에 있을 때 1차 압타머에 결합한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 전술한 분석법은 임의의 관심 대상 분석물을 검출 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있으며, 약 1000 달톤 미만, 약 500 달톤 미만, 또는 약 200 달톤 미만의 분자량을 가지는 분석물을 검출 및/또는 정량화하는 현존하는 방법들에 비해 특히 유리할 수 있는데, 상기 분석물은 이에 제한되지 않지만 스테로이드 화합물을 포함하고, 이에 제하되지 않지만 예를 들어 코르티솔, 알도스테론, 데히드로이소안드로스테론, 프로게스테론, 테스토스테론; 글루코스; 이에 제한되지 않지만 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 시트룰린, 타이로신, 알라닌과 같은 아미노산; 약학적 화합물, 비타민, 독소, 신경전달물질(예를 들어, 카테콜아민, 세로토닌), 펩타이드(바소프레신, 옥시토신, 안지오텐신, 나트륨이뇨펩타이드, 글루카곤, 인슐린 및 기타), 항생제 및 항진균 화합물들(예를 들어, 아미노글리코시드), 거대고리 분자 면역억제제(macrocyclic immunosuppressant), 또는 지질 또는 지질 복합체를 포함한다.
특정 비-제한적 구체예에서, 상기 분석법은 큰 분자, 예를 들어, 1000 달톤 이상의 분자량을 가진 분자에도 적용될 수 있다.
6. 실시예 1 - 1차 압타머의 분리
본원 실시예는 1차 압타머(AP)를 분리하는 방법 및 이들 구조의 예시를 제공한다.
1차 압타머의 분리는 SELEX 방법을 사용하여 수행하였다. 1차 압타머를 용액-상 선별에 의해 분리하였는데, 이는 이 방법이 높은 친화도 및 압타머의 스크리닝 용이성과 같은, 소분자들에 대해 고유한 잇점들을 가지기 때문이다(표 1). 비-제한적 예시들을 도 10-46에 제공한다.
이 방법은 PCR 프라이머 중 하나에 비오티닐화된 상보적 가닥(C B )을 아가로스-스트렙타비딘에 부착시키고 상보적 상호작용을 통해 라이브러리(예를 들어, 이에 제한되지 않지만, N8-N100)의 서열들을 프라이머의 C B 에 부착시키는 것을 토대로 하였다. 라이브러리 상의 두 개의 프라이머인, 5'- 및 3'- 역시 부분적으로 상보적이었다; 이들 프라이머의 상보적 영역 사이에 스템 형성을 돕는 방식으로 표적과 상호작용하는 라이브러리의 모든 구성원들이 상보적인 뉴클레오티드(CB)를 대체함으로써 아가로스로부터 방출되고, PCR 증폭에 사용되었다. 이는 잠재적인 압타머들이 농축된 풀을 생성하였다.
형광 센서는, 비오틴을 답실(dabcyl)로 치환하고 플루오레세인을 압타머에 부착시켜(도 6, CD), 압타머가 결합하는 것을 확인하고 Kd 를 결정하며(이는 경쟁적 분석이었으므로, 절반-반응(half-response)이 Kd 80로부터 멀어지고, CD 가 과도하게 존재하였음) 선택성을 확립함으로써 직접 획득하였다.
전술한 방법에 따라 다음에 대한 1차 압타머가 분리되었다:
1. D-Glucose (서열번호 1);
2. L-페닐알라닌 (서열번호 2-4);
3. 히드로코르티손 (서열번호 5-7);
4. 데히드로이소안드로스테론 및 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드 (DOG) (서열번호 8-12);
5. 테스토스테론 (서열번호 13-17);
6. 스핑고신-1-인산염 (서열번호 18);
7. 도파민 (서열번호 19-23);
8. 세로토닌 (서열번호 24-30);
9. 멜라토닌 (서열번호 31-32); 및
10. L-타이로신 (서열번호 33).
개시된 1차 압타머는 표적 분석 물질에 결합하고 이들의 구조-스위칭 포맷에서 형광의 증가에 의해 그 존재에 반응하였다(도 10-46 및 도 47A-D).
1차 압타머 서열
표적 1차 압타머 서열 서열번호
글루코스 CTCTCGGGACGACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTCGTCCC 1
페닐알라닌 CTCTCGGGACGACCGCGTTTCCCAAGAAAGCAAGTATTGGTTGGTCGTCCC 2
CTCTCGGGACGACCGGTGGGGGTTCTTTTTCAGGGGAGGTACGGTCGTCCC 3
CTCTCGGGACGACGAGGCTGGATGCATTCGCCGGATGTTCGATGTCGTCCC 4
히드로코르티손 CTCTCGGGACGACGCCCGCATGTTCCATGGATAGTCTTGACTAGTCGTCCC 5
CTCTCGGGACGACTAGCGTATGCGCCAGAAGTATACGAGGATAGTCGTCCC 6
CTCTCGGGACGACGCCAGAAGTTTACGAGGATATGGTAACATAGTCGTCCC 7
데히드로이소안드로스테론 및 데옥시코르티코스테론 CTCTCGGGACGACGGGGATTTTCCCAATTGGTTCTTTCAATTTAGTCGTCCC 8
데히드로이소안드로스테론 CTCTCGGGACGACGGGGGTGGCATAGGGTAGGCTAGGGTCACTGTCGTCCC 9
CTCTCGGGACGACGTGGCTAGGTAGGTTGCATGCGGCATAGGGGTCGTCCC 10
CTCTCGGGACGACGTGACGGTGTGTAGTTGGGTTGTGGCAGGAGTCGTCCC 11
데옥시코르티코스테론 CTCTCGGGACGACCCGGATTTTCCGAGTGGAACTAGCTGTGGCGGTCGTCCC 12
테스토스테론 CTCTCGGGACGACGGGATGTCCGGGGTACGGTGGTTGCAGTTCGTCGTCCC 13
CTCTCGGGACGACCAGGTGCCATTAGCGTCAGTGTGCTACGATGTCGTCCC 14
CTCTCGGGACGACCCGTTCGATCTAACCCTTGTTAGCCGTGATGTCGTCCC 15
CTCTCGGGACGACCCCTTCGATCTTCAACCAAAGCCGTTGGATGTCGTCCC 16
CTCTCGGGACGACGGGTGGTCATTGAGTGGTCTTAGGCAGGTAGTCGTCCC 17
스핑고신-1-인산염 CTCTCGGGACGACGTGGTGTGGGAGAAAGAATTTTCATTGGGGTAGGGGGTCGTCCC 18
도파민 CTCTCGGGACGACCACTTCAGACGCTCAACGTTTGGGGAGGCACGGCAGGTCGTCCC 19
CTCTCGGGACGACGGGGAGGAGTTAGCATGACGGCAACTTTAGTACTTCGTCGTCCC 20
CTCTCGGGACGACGCCAGTTTGAAGGTTCGTTCGCAGGTGTGGAGTGACGTCGTCCC 21
CTCTCGGGACGACTGCAGCCTGGGGTTGTGGGGGGTAGGGGAGGTCTGAGTCGTCCC 22
CTCTCGGGACGACCACACAGAGGCACAACTCGCAGGAGCAAAGCGGCAGGTCGTCCC 23
세로토닌 CTCTCGGGACGACAGGGGCATATATAGTCTAGGGTTTGGTGTGGGTAGTGTCGTCCC 24
CTCTCGGGACGACTGGTAGGCAGATAGGGGAAGCTGATTCGATGCGTGGGTCGTCCC 25
CTCTCGGGACGACTGGTAGGCAGCAGGGGAAGTAGGCGTGTCCTCGTGGGTCGTCCC 26
CTCTCGGGACGACCAGTAGGGGATCCACAGTGAGGGGTTTGTATGGGTGGTCGTCCC 27
CTCTCGGGACGACTGGTAGGCAACAGGGGAAGGGAGTTCTGCGTACGTGGGTCGTCCC 28
CTCTCGGGACGACGGAGGTGGTGTCTTGGACAGTGGTATTCGCAGTTGCGTCGTCCC 29
CTCTCGGGACGACAGAGACGGGGTGCTTACTTGGTTCAGGGGAGTCGACGTCGTCCC 30
멜라토닌 CTCTCGGGACGACAGCCAAGGTCGTAAGGTACGGTCAGTGTACTCGGTTGTCGTCCC 31
CTCTCGGGACGACGTCTTGGGGGTGGTGGGTTTGGCTGGTACTTAGGGCGTCGTCCC 32
타이로신 CTCTCGGGACGACGGCCCGATCTCAGAGTAGTCGTCCC 33
선별(CB) 또는 형광 센싱(CD)에 사용된 상보적 뉴클레오티드(C)에 나타난 바와 같이, 추정된 2차 구조에서 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머의 서열, 및 추정된 코어 포켓(도 10-46에 나타난 바와 같음)이 표 2에 기재된다.
추정된 2차 구조에서 세로토닌에 대한 1차 압타머의 서열, 이들의 선별에 사용된 상보적 올리고뉴클레오티드, 및 이들의 추정된 코어 포켓.
서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머
1차 압타머 CTCTCGGGACGACAGGGGCATATATAGTCTAGGGTTTGGTGTGGGTAGTGTCGTCCC (서열번호 37)
상보적 올리고뉴클레오티드 TGTCGTCCCGAGAG (서열번호 38)
코어 포켓 NAGGGGCATATATAGTCTAGGGTTTGGTGTGGGTAGTN, 여기에서 N은 A, T, G, 또는 C 중 어느 하나일 수 있음 (서열번호 39)
서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머
1차 압타머 CTCTCGGGACGACTGGTAGGCAGATAGGGGAAGCTGATTCGATGCGTGGGTCGTCCC (서열번호 40)
상보적 올리고뉴클레오티드 GTCGTCCCGAGAG (서열번호 41)
코어 포켓 NTGGTAGNNNGATAGGGNNNNGCTGANNNGANNNGTGGN, where N can be any one of A, T, G, or C (서열번호 42)
서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머
1차 압타머 CTCTCGGGACGACTGGTAGGCAGCAGGGGAAGTAGGCGTGTCCTCGTGGGTCGTCCC (서열번호 43)
상보적 올리고뉴클레오티드 GTCGTCCCGAGAG (서열번호 44)
코어 포켓 NTGGTAGGCAGCAGGGGAAGTAGGCGTGTCCTCGTGGN, 여기에서 N은 A, T, G, 또는 C 중 어느 하나일 수 있음 (서열번호 45),
서열번호 27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머
1차 압타머 CTCTCGGGACGACCAGTAGGGGATCCACAGTGAGGGGTTTGTATGGGTGGTCGTCCC (서열번호 46)
상보적 올리고뉴클레오티드 GGTCGTCCCGAGAG (서열번호 47)
코어 포켓 NAGTAGGGGANNNCAGTGAGGGGTTTGTANNNNTN, 여기에서 N은 A, T, G, 또는 C 중 어느 하나일 수 있음 (서열번호 48)
서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머
1차 압타머 CTCTCGGGACGACTGGTAGGCAACAGGGGAAGGGAGTTCTGCGTACGTGGGTCGTCCC (서열번호 49)
상보적 올리고뉴클레오티드 GTCGTCCCGAGAG (서열번호 50)
코어 포켓 NTGGNAGGNAACAGGGGNGGGAGNNCTNCGTNCGTGGN, 여기에서 N은 A, T, G, 또는 C 중 어느 하나일 수 있음 (서열번호 51)
서열번호 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머
1차 압타머 CTCTCGGGACGACGGAGGTGGTGTCTTGGACAGTGGTATTCGCAGTTGCGTCGTCCC (서열번호 52)
상보적 올리고뉴클레오티드 CGTCGTCCCGAGAG (서열번호 53)
코어 포켓 NGGAGGTGGNNNNNNNNNNNGTGGTATTCGCAGTTGCN, where N can be any one of A, T, G, or C (서열번호 54)
서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대해 분리된 1차 압타머
1차 압타머 CTCTCGGGACGACAGAGACGGGGTGCTTACTTGGTTCAGGGGAGTCGACGTCGTCCC (SEQ ID NO 55)
상보적 올리고뉴클레오티드 TGTCGTCCCGAGAG (서열번호 56)
코어 포켓 NNAGANNNGGGGTGCTTACTTGGTTCAGGGGANNNGACNN, 여기에서 N은 A, T, G, 또는 C 중 어느 하나일 수 있음 (서열번호 57)
7. 실시예 2 - 가짜샌드위치 분석법
본 실시예에서는 용액 내에서 및 플레이트 상에서 형광 검출에 의한 가짜샌드위치 분석법이 제공된다(ELISA-유사 포맷).
용액-진전된 압타머 센서가 고체 표면-포맷 적용, 예를 들어 ELISA-타입 분석법에 사용되기 위해 조정되었다. 분석물 및 경쟁자 올리고뉴클레오티드와 부분적으로 혼성화된 1차 압타머로 구성된, 용액 센서는, 부착 화학을 사용하여 고체 표면에 고정될 수 있도록 변형하였다. 사용된 표면 부착 화학은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용이었다. 또한, 경쟁자 올리고뉴클레오티드에 상보적인 가닥(분석물의 존재에서 경쟁자 올리고뉴클레오티드에 결합하기 위해 최적화됨)은 비오틴-태그로 변형하여 "검출" 분자, 예를 들어 스트렙타비딘-HRP 접합체를 포획하는데 사용하였다. HRP 기질인, TMB 를 시각화에 사용하였다.
+/- 분석물에 비해 표면-결합 센서의 반응 최적화는 다음을 포함하는 파라미터들을 조정하여 수행하였다: 표면 상 센서의 양, 부착 화학, 상보적인 경쟁자 올리고뉴클레오티드의 농도, 각 단계에서의 버퍼, 세척 단계, HRP 농도, 및 HRP 기질.
용액에서 가짜샌드위치 분석법의 실험과정
용액 버퍼는 SELEX 버퍼 또는 센서가 작용하는 것으로 나타난 임의의 다른 버퍼의 조성을 가졌다. 각 샘플 웰은 최종농도 50 nM의 압타머-CDex 듀플렉스(압타머와 관련하여 화학량론적 양의 CDext 를 가지거나 2배 또는 3배 초과)를 함유하였다. 선별된 농도의 분석물을 첨가하고, CDext 에 대한 상보물을 최종 농도 2 μM가 되도록 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 20분간 인큐베이션한 다음 형광 신호를 측정하였다.
이중 나선 형성이 분석물에 의해 촉발된, 용액에서의 가짜샌드위치 분석법이 다음을 위해 수행되었다:
1. 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드 (DOG);
2. L-타이로신;
3. D-글루코스; 및
4. L-페닐알라닌
1차 압타머가 CDext 와 복합체를 형성하고 CDext comp 의 존재시 이들의 표적 분석물의 존재에서 형광의 증가를 생성하였다 (도 47A-D).
CDext 가 플레이트 상에 부착되면, 용액의 나머지가 제거될 때 이중 나선이 플레이트에 부착된 상태로 유지되고 광범위하게 세척될 수 있었다.
가짜샌드위치 분석법의 실험과정 - 고체 상태에서
스트렙타비딘-코팅된 플레이트 상에서 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드(DOG) 센서 ELISA를 다음과 같이 수행하였다: PBS pH 7.4 버퍼 용액 내 151.5 pmoles (6.6 μL x 30 μM)의 DOG 센서를 스트렙타비딘-코팅된 ELISA 플레이트(Thermo, 결합능 5pmoles)에 첨가하여 최종 센서 농도를 1.44μM로 하였다. 혼합물을 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 다음 용액을 웰에서 제거하고 웰을 PBS 버퍼로 8회 완전히 세척하였다. 그 후, TRIS pH 7.4 버퍼(20 mM TRIS, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 및 2 mM MgCl2로 구성됨) 100 μL를 각 웰에 첨가하고 2 mM DOG 2 μL를 DMSO에 용해시켜 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드(DOG)의 최종 농도를 50 μM로 하였다. 그 다음 비오틴 태그를 포함하는 단일-가닥 상보물을 첨가하여(100 μM 스톡의 2 μL) 최종 농도를 1.79 μM으로 하였다. 혼합물을 실온에서 20분간 인큐베이션하였다. 그 다음 용액을 제거하고 PBS 버퍼로 8회 완전히 세척하였다. 1% BSA를 함유하는 100 μL PBS 및 8000-배 희석된 HRP-STV 접합체를 웰마다 첨가하고 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 용액을 제거하고 웰을 PBS 버퍼로 8회 완전히 세척하였다. 100 μL 의 TMB/H2O2 기질을 각 웰에 첨가하고 반응 진행을 652nm에서 플레이트 판독기로 모니터하였다. 스트렙타비딘-ELISA 96-웰 플레이트에서 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드(DOG) 농도 의존성 결과를 도 47E 에 나타내었다. 8개 웰을 압타머 센서로 코팅하고 다양한 농도의 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드(DOG) 분석물에 노출시킨 다음, HRP 효소로 태깅한 후, H2O2/HRP에 의해 청색 생성물로 산화된 TMB 기질을 첨가하여 정량화하였다. 각 웰에 결합된 HRP 효소의 양에 비례하는 TMB 산화의 시간 경과 및 농도 의존성을 측정하였다(도 47E).
스트렙타비딘-코팅된 플레이트 상의 페닐알라닌(Phe) 센서 ELISA 를 다음과 같이 수행하였다: 전술한 과정을 Phe 센서에 대해 수행하되, 20 mM HEPES pH 7.5, 1 M NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM KCl 버퍼에서 20분간 인큐베이션 단계를 수행하였다. 사용된 Phe 농도는 물에서 2 mM 스톡 용액으로부터 0-200 μM 였다. 스트렙타비딘-ELISA 96-웰 플레이트 상에서 Phe 농도 의존성에 대한 결과를 도 47F 에 나타내었다.
8. 실시예 3 - 2차 압타머의 분리
본 실시예는 2차 압타머(AS)를 분리하는 방법 및 이의 구조를 개시한다.
2차 압타머의 분리는 SELEX 방법을 사용하여 수행하였다. 2차 압타머(As)에 대한 두 가지 방법을 수행하였고 몇몇 경우 이들 두 방법은 조합될 수 있다(도 9):
(1) 고체-상 선별
표적 압타머(Ap)를 매트릭스(예를 들어, 비드)에 부착하고, 표적 분석물 L의 존재에서 라이브러리(예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 예비구조화된 또는 비구조화된 N20- 100)와 인큐베이션하여 Ap*L 복합체에 대해 친화도를 가지는 압타머 후보자들을 분리하였다(도 9A). 이들 올리고뉴클레오티드를 PCR-증폭하고, 단일-가닥 종(species)들로 재생한 다음, 다음 선별 사이클에 이용하였다. 이 과정을 수렴에 도달할 때까지 반복하고, 풀을 클로닝하고 서열분석하여, AS 후보자들을 도출하였다. 카운터-선별은 L의 부재 하에 AP 에 대한 결합자의 제거에 의해 수행하여 복합체에 대한 결합을 보장하였다.
(2) 용액-상 선별
용액-상에서의 이 과정은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 통해 매트릭스에 부착된 프라이머들 간에 스템 형성을 가능하게 하는 예비-구조화된(pre-structured) 라이브러리를 사용하였고, AS 후보자들이 선별되었는데, 이는 AP 와의 결합을 통해 이들의 루프가 닫히고 이들이 고체 표면으로부터 방출되기 때문이다(도 9B). 이 경우 카운터-선별은 리간드가 없는 AP, 및 리간드 그 자체에 대한 것이었다.
전술한 방법을 사용하여 다음에 대한 2차 압타머를 분리하였다:
1. 데옥시코르티코스테론 (서열번호 34-35);
2. 세로토닌 (서열번호 36, 59, 및 60);
2차 압타머는, 1차 압타머가 이의 표적 분석물과의 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하였다(도 48).
2차 압타머의 뉴클레오티드 서열을 표 3에 나타내었다.
2차 압타머 서열
표적 2차 압타머 서열 서열번호
데옥시코르티코스테론 GTCATGTGGCGCCTCGACCCCAGCCTTGGTAGCTGTTGGCCACACAAGAGCACATGAC 34
GTCATGTGACGAGACAAGGAGAACGGAAGGCGACCGGATAAATCGGATATCACATGAC 35
세로토닌 GTCATGTGGATTGTGACTTGCCCACAACGATTTTGCCAAACATGCATAGCCACATGAC 36
CATGTGGATTGTGACTTGCCCACAACGATTTTGCCAAACATGCATAGCCACATG 60
세로토닌에 대한 2차 압타머를, 다음을 포함하는 세로토닌에 대한 1차 압타머의 뉴클레오티드 서열을 토대로 분리하였다:
CGACTGGTAGGCAGATAGGGGAAGCTGATTCGATGCGTGGGTCG (서열번호 58)로서, 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열에서 유래됨(도 48A-C).
다음의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세로토닌에 대한 2차 압타머를 분리하였다:
TCTGTGTCATGTGGATTGTGACTTGCCCACAACGATTTTGCCAAACATGCATAGCCACATGAC (서열번호 59), 이의 추정된 2차 구조 내에서 (도 48A-C).
분리된 1차 및 2차 압타머를 실시예 4에 기재된 바와 같은 샌드위치 분석법을 수행하는데 사용하였다. 다음의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오티드를 형광 센싱에 사용하였다: CACATGACACAGA (서열번호 61).
9. 실시예 4 - 샌드위치 분석법
본 실시예에서는, 형광 검출 및 ELISA-유사 포맷을 가지는, 샌드위치 분석법을 제공한다.
상기 기재된 가짜샌드위치 분석법에서, 실제 샌드위치 상호작용은 없었고(따라서, '가짜-샌드위치') 리간드*압타머 상호작용이 비경쟁적 샌드위치 ELISA와 유사한 포맷을 허용하는 이중 나선의 존재로 "번역되었다(translated)". 그러나, 실제 샌드위치는 서로와 경쟁하지 않고 동시에 하나의 분자에 결합하는 두 개의 압타머(두 개의 압타머와 유사하게)를 필요로 한다. 소분자는 두 개의 에피토프가 없다는 단순한 이유로 인해, 소분자에 대해서는 이것이 어려울 수 있다.
대안적인 접근법을 도 8 및 도 48에 나타내었는데, 여기에서 압타머*리간드 복합체에 대한 압타머, 또는 리간드와 복합체로 있을 때 1차 압타머에 결합하는 2차 압타머가 생성되었다. 이 방법의 잇점은 이것이 더 나은 민감도를 가져올 수 있는 진짜 샌드위치라는 것이다. 압타머*리간드 복합체에 대한 압타머는 정밀하게 조정된 상보성을 가진 정교한 스위치로 작용하였다; 이들 중 하나가 리간드를 감지하면, 이들은 삼원(삼차) 복합체에 모였다.
용액에서 샌드위치 분석법의 실험과정
용액 버퍼는 SELEX 버퍼 또는 센서가 작용하는 것으로 보여지는 다른 버퍼의 조성을 가졌다. 세로토닌 측정에 사용된 버퍼는 2mM MgCl2를 포함하는 PBS 버퍼였다. 데옥시코르티코스테론 및 테스토스테론의 측정을 위해, 버퍼는 20 mM HEPES, 1M NaCl, 10 mM MgCl2 및 5 mM KCl (pH 7.5)로 구성되었다.
별도의 용액을 병렬로 준비하였다: (1) 4배 농축된 1차 압타머(AP)를 버퍼에서 제조하고, 풀린(unfolding) 2 차 구조를 위한 사용시까지 끓는점까지 가열한 수조에서 >5 분 인큐베이션 한 후, 4 배 농축된 분석물(L)과 >30분 인큐베이션하였다. 예를 들어, 4X 농축된 AP(예를 들어, 10μM) 20μL 및 4X 농축된 세로토닌 용액(예를 들어, 800μM) 20μL. 세로토닌의 최종 농도는 400 μM이었고 복합체 AP-세로토닌의 농도는 5 μM이었다. 이것은 Apo-세로토닌 복합 용액의 2X 농도이다. (2) 2배 농축된 2차 압타머 (AS) 용액을 준비하였다. FAM 형광 접합된 AS (100 nM) 및 이의 답실-소광물질(dabcyl-quencher) 가닥을 혼합하고, 답실-소광물질은 충분한 소광을 위해 3배에서 5배 초과로 존재하였다. 이 혼합물을 끓는점까지 가열한 수조에서 >5분 동안 인큐베이션하여 2차 구조의 풀림(unfolding) 및 소광물질 가닥과의 혼성화를 촉진시키는데 사용하였다. 별도로 준비한 용액 (1)과 (2)를 각각 40 μL 씩 혼합하고 40 분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 75 μL의 혼합 용액을 취하여 측정하였다. 형광 신호를 측정하였다. 각 시료는 최종 농도 2.5 - 5 μM의 1 차 압타머 (AP), 50 nM의 2 차 압타머 AS, 150 nM - 250 nM의 답실 소광물질 가닥, 및 플롯 상에 나타난 분석물의 농도를 포함하였다.
고체 상태에서 샌드위치 분석법의 실험과정
첫번째로, 리간드(L) 및 1 차 압타머(Ap) 용액을 준비하였다. 400 μL의 2X 농축된 Bio-TEG 접합된 1 차 압타머 (0.6 pmole/μL)를 버퍼에서 준비하고 사용하기 전까지 >5분 끓는 물에서 인큐베이션하였다. 2 회 농축된 세로토닌 용액 (예를 들어, 완충액 내 400 μM, 50 μL)을 준비하고 50 μL의 리간드 및 50 μL의 AP 용액과 혼합하고 >30분 배양하였다. 세로토닌의 최종 농도는 200 μM이었고 복합체 AP- 세로토닌의 농도는 웰 당 30 pmole이었다. 두번째로, Bio-TEG 변형된 2 차 압타머 용액을 대량으로(bulk) 준비하고 웰당 100μL (0.5 pmole /μl)을 적용했다. 이 용액을 끓는점까지 가열된 수조에서 >5분 인큐베이션하고 사용시까지 냉각시켰다. 이들 용액을 제조한 후, ELISA 분석을 수행하였다. ELISA 플레이트 웰을 PBS (+ 2 mM MgCl2) 버퍼로 2 회 세척하고, 세척 사이에 5 분 동안 소킹(soaking)하였다. AS 용액(100μL)을 웰에 첨가한 후 실온에서 ~ 20 분 인큐베이션하여 비오틴이 플레이트에 결합되도록 하였다. 그 후 용액을 제거하고 웰을 동일한 버퍼로 8 회 완전히 씻어내었다. 그런 다음 100 μL의 [L * AP] 용액을 웰에 첨가하고 실온에서 >30 분 인큐베이션했다. 그 후 용액을 제거하고 웰을 동일한 완충액으로 8 회 완전히 씻어 내었다. 1 % BSA 및 10000 배 희석된 HRP-STV 접합체를 함유하는 PBS 100 μL를 웰당 첨가하고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 제거하고 웰을 동일한 버퍼로 10 회 완전히 씻어내었다. 이 세척 직후, TMB/H2O2 기질 100 μL를 각 웰에 첨가하고 반응 진행을 370 또는 652 nm에서 플레이트 판독기로 모니터링 하였다.
샌드위치가 용액에서 형성될 때 형광 판독 (도 48A-C)을 하기 분석물에 대해 수행하였다 :
1. 데옥시코르티코스테론 21-글루코시드 (DOG); 및
2. 세로토닌.
이 분석에서 1 차 압타머가 용액에 있고, 역시 용액에 있는 2 차 압타머가 구조-스위칭 형광 형태로 바뀌었고, 1 차 압타머가 표적 스테로이드와 복합체가 될 때 소광물질-표지된 경쟁자 올리고뉴클레오티드의 방출을 통해 1 차 압타머와 상호 작용했다(도 48A-C). 하기 분석물에 대해 플레이트 상에서 샌드위치 분석을 수행하였다:
1. 세로토닌.
이 분석에서, 1차 압타머는 플레이트 상에 침착되었고, 2차 압타머는 1차 압타머가 세로토닌과 복합체 일 때 1차 압타머에 결합하였다(도 48D-E).
10. 실시예 5. 항- 압타머 분석법
400 nM FAM- 압타머 용액 및 4 배 농축된 Iowa Black -상보 가닥 용액을 버퍼(20 mM HEPES, 1M NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM KCl, pH 7.5)에서 별도로 제조한다. 이들 용액을 끓는 물에서 5분 동안 인큐베이션하여 개별적으로 어닐링한 후 ~30분 동안 실온에서 냉각시켰다. 한편, 각 압타머의 표적 용액의 2 배 농축물을 준비하였다; 최종 농도는 각 플롯에 표시된다. 압타머 및 상보 가닥 용액들을 30분 인큐베이션한 후, 18.75 ㎕의 압타머 용액을 먼저 384-웰 플레이트에 첨가한 다음, 37.5 ㎕의 표적 용액을 첨가한 직후, 18.75 ㎕의 상보적 가닥 용액을 첨가하였다. 인큐베이션없이 형광 측정을 시작하고 형광 플레이트 판독기 (Victor II microplate reader, PerkinElmer)를 사용하여 실온에서 >8 시간동안 5 분마다 판독하였다. 압타머의 최종 농도는 100nM이고, 상보적 가닥의 농도는 75 μL 반응 부피에서 CS 압타머 (1000nM)를 제외한 모든 경우에 100 nM이다. 표적/리간드의 최종 농도는 각 플롯에 표시된다. 각 압타머 및 그 상보적 가닥을 아래에 나열하였다. 결과는도 3A-L에 도시하였다.
(A) DOG 압타머/상보적 (100 nM: 100 nM)
- DOGS.2_sht/ DOGS.2_sht_anti: CGA CCC GGA TTT TCC GAG TGG AAC TAG CTG TGG CGG TCG /36-FAM/; /5IABkFQ/CGA CCG CCA CAG CTA GTT CCA CTC GGA AAA TCC GGG TCG
- DOGS.2_Full/ DOGS.2_Full_anti: /56-FAM/CTC TCG GGA CGA CCC GGA TTT TCC GAG TGG AAC TAG CTG TGG CGG TCG TCC C; GGG ACG ACC GCC ACA GCT AGT TCC ACT CGG AAA ATC CGG GTC GTC CCG AGA G/3IABkFQ/
(B) ALD 압타머/상보적: (100 nM: 100 nM)
- ALDS.1_sht/ ALDS.1_sht_anti: CGA CAG ATA GTT GTT CTT AGC GAT GTT CAG CGT TGT CG/36-FAM/; /5IABkFQ/CGA CAA CGC TGA ACA TCG CTA AGA ACA ACT ATC TGT CG
- ALDS.1_Full/ ALDS.1_Full_anti: /56-FAM/CTC TCG GGA CGA CAG ATA GTT GTT CTT AGC GAT GTT CAG CGT TGT CGT CCC; GGG ACG ACA ACG CTG AAC ATC GCT AAG AAC AAC TAT CTG TCG TCC CGA GAG /3IABkFQ/
(C) CS 압타머/상보적: (100 nM: 1000 nM)
CSS.1_sht/ CSS.1_sht_anti: GAC GAC GCC CGC ATG TTC CAT GGA TAG TCT TGA CTA GTC GTC /36-FAM/; /5IABkFQ/GAC GAC TAG TCA AGA CTA TCC ATG GAA CAT GCG GGC GTC GTC
(D) TES 압타머/상보적: TES.1_sht/ TES.1_sht_anti: ACG GGA TGT CCG GGG TAC GGT GGT TGC AGT TCG T/36-FAM/; /5IABkFQ/ACG AAC TGC AAC CAC CGT ACC CCG GAC ATC CCG T
(E) Phe-CpRh 압타머/상보적:
Phe-CpRh_sht/ Phe-CpRh_sht_anti: /56-FAM/CGA CAC AGC GTG AGC CAA CTA ATT AGT GCG TAT TGT CG; CGA CAA TAC GCA CTA ATT AGT TGG CTC ACG CTG TGT CG/3IABkFQ/
(F) Phe 압타머/상보적:
Phe_ sht/ Phe_sht_anti: / GAC CGG TGG GGG TTC TTT TTC AGG GGA GGT ACG GTC /36-FAM/; /5IABkFQ/GAC CGT ACC TCC CCT GAA AAA GAA CCC CCA CCG GTC
11. 실시예 6 - 샌드위치 분석법
도 49H는 세로토닌 (SRTNS.1)에 결합하는 1 차 압타머 (AP), 및 압타머(1차)에 결합하는 2차 압타머(SRTN 2nd Apt1: GTG GTT AGT AAC TTG CAC GCC GCC CAA TTG CTA TTC ATG ACA AGC CAC (서열번호 251))를 나타내며 1차 압타머가 이의 리간드에 결합할 때 2차 압타머가 1차 압타머에 우선적으로 결합한다. 점선과 함께 색깔있는 글자는 2개의 압타머 사이의 가설적인 부분적 혼성화 영역을 나타낸다. 2 개의 압타머는 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 상의 2차 압타머의 고정화 및 용액 내 1차 압타머를 통해 ELISA-유사 분석에 적용된다. 분광 광도 신호는 세로토닌 분석물에 비례하여 증가한다. SRTNS.1에 접합된 비오틴을 통해 생성된 신호는 스트렙타비딘-HRP 접합체에 결합하고 기질 TMB를 촉매한다(도 49I). 신호의 증가는 존재하는 세로토닌의 농도가 증가할수록 더 많은 결합이 존재함을 확인한다.
도 49J는 세로토닌(금색 공)에 결합하는 1차 압타머 및 압타머(1차)에 결합하는 2차 압타머(AS) (SRTN 2nd Apt.2: TCT GTG TCA TGT GGA TTG TGA CTT GCC CAC AAC GAT TTT GCC AAA CAT GCA TAG CCA CAT GAC (서열번호 252) 를 나타내며 1차 압타머가 이의 리간드에 결합할 때 2차 압타머가 1차 압타머에 우선적으로 결합한다. 점선과 함께 색깔있는 글자는 2개의 압타머 사이의 가설적인 부분적 혼성화 영역을 나타낸다. SRTN 2nd Apt.2 (F 접합된 가닥, 'F'는 플루오레세인을 나타냄)는 리간드와 소광물질(D, dabcyl)를 가진 상보적 올리고뉴클레오티드 사이의 경쟁에 기초한 형식으로 표시된다. 소광물질 가닥(회색 CD)은 먼저 표적(SRTNS.1 + 세로토닌) 결합시 2 차 구조 변화를 통해 압타머의 5' 말단에 혼성화 한다. 이 소광물질은 압타머 가닥으로부터 방출되어 형광 신호 증가로 이어진다. 청색 선보다 높은 빨간색 선은, (아래그림) 1차 압타머(AP)가 존재할 때 (즉, 이미 존재하는 리간드에 대한 1 차 압타머가 첨가될 때 결합이 일어남), 또는 (위 그림) 1차 압타머가 이미 존재하고 세로토닌이 용액에 첨가될 때, 소광물질(CD)를 가진 상보적 올리고뉴클레오티드가 대체됨을 나타낸다 (도 49K).
도 49L는 플레이트 상의 절단된 2차 압타머(SRTN 2nd Apt1) 및 스트렙타비딘에 접합된-HRP인 스트렙타비딘-HRP 접합체를 통해 증폭을 갖는 용액 내 1차 압타머(SRTNS.1) 를 이용한 ELISA 분석을 나타내며 기질 TMB 를 촉매한다. 빨간색 선은 세로토닌이 존재할 때 더 많은 결합이 있음을 보여준다(도 49M). 특정 비-제한적 구체예에서, 1 차 및 2 차 압타머가 존재하는 역방향 포맷이 모두 가능하다.
도 49N은 DOG (DOGS.2)에 결합하는 1차 압타머(AP) 및 압타머(1차)에 결합하는 2차 압타머(AS) (DOG 2nd Apt.1: TCT GTG TCA TGT GGC GCC TCG ACC CCA GCC TTG GTA GCT GTT GGC CAC ACA AGA GCA CAT GAC (서열번호 253)) 를 나타내며 1차 압타머가 이의 리간드에 결합할 때 2차 압타머가 1차 압타머에 우선적으로 결합한다. 점선과 함께 색깔있는 글자는 2개의 압타머 사이의 가설적인 부분적 혼성화 영역을 나타낸다. DOG 2nd Apt.2 (F 접합된 가닥, 'F'는 플루오레세인을 나타냄)는 리간드와 소광물질(D, dabcyl)를 가진 상보적 올리고뉴클레오티드 사이의 경쟁에 기초한 형식으로 표시된다. 소광물질 가닥(회색)은 표적(DOGS.2 + DOG) 결합시 2 차 구조 변화를 통해 압타머의 5' 말단에 먼저 혼성화 한다. 이 소광물질은 압타머 가닥으로부터 방출되어 형광 신호 증가로 이어진다. (위 그림)은 DOG를 첨가하였을 때 2차 압타머가 1차 압타머에 결합한 것을 나타내고(X 축이 스테로이드 농도), (아래 그림)은 1차 압타머가 존재하는 경우에만 2차 압타머가 DOG에 결합한다는 것을 보여준다(도 49O).
12. 실시예 7 - 2차 압타머 ELISA 프로토콜 (샌드위치 분석법)
플레이트 상의 2차 압타머 및 용액 내 1차 압타머 방법 (도 49P). 비오티닐화된 2차 압타머가 실온에서 약 30분간 적절한 버퍼 내에서 스트렙타비딘-코팅된 플레이트에 고정화된 다음 버퍼로 세척하여 과량의 결합되지 않은 압타머를 제거한다. 1차 압타머 및 그 표적을 실온에서 40분간 예비-인큐베이션한 다음 고정화된 2차 압타머에 첨가하여 플레이트 상에서 40분간 인큐베이션한다. 다음으로 100μL PBS(1% BSA)에서 10000배 희석시킨 스트렙타비딘-HRP 를 첨가하고 20 분 동안 인큐베이션 한 다음 PBS로 완전히 세척한다. 이어서 TMB 기질 혼합물을 첨가하고 370 nm에서의 흡광도 변화를 45 분 동안 기록한다.
플레이트 상의 1차 압타머 및 용액 내 2차 압타머 방법 (도 49Q). 비오티닐화된 1차 압타머가 실온에서 약 30분간 적절한 버퍼 내에서 스트렙타비딘-코팅된 플레이트에 고정화된 다음 버퍼로 세척하여 과량의 결합되지 않은 압타머를 제거한다. 그 다음 표적 용액을 고정화된 1차 압타머에 첨가하고 약 40분간 인큐베이션한다. 2차 압타머를 플레이트에 표적 용액의 상에 첨가하고 약 40분간 인큐베이션한 다음 세척하여 결합하지 않은 2차 압타머들을 제거한다. 다음으로 100μL PBS(1% BSA)에서 10000배 희석시킨 스트렙타비딘-HRP 를 첨가하고 20 분 동안 인큐베이션 한 다음 PBS로 완전히 세척한다. 이어서 TMB 기질 혼합물을 첨가하고 370 nm에서의 흡광도 변화를 45 분 동안 기록한다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK <120> APTAMER-BASED ANALYTE ASSAYS <130> 070050.5953 <140> PCT/US2017/035958 <141> 2017-06-05 <150> 62/346,374 <151> 2016-06-06 <150> 62/345,697 <151> 2016-06-03 <150> 62/345,641 <151> 2016-06-03 <160> 322 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ctctcgggac gaccgtgtgt gttgctctgt aacagtgtcc attgtcgtcc c 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ctctcgggac gaccgcgttt cccaagaaag caagtattgg ttggtcgtcc c 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ctctcgggac gaccggtggg ggttcttttt caggggaggt acggtcgtcc c 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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oligonucleotide <400> 9 ctctcgggac gacgggggtg gcatagggta ggctagggtc actgtcgtcc c 51 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ctctcgggac gacgtggcta ggtaggttgc atgcggcata ggggtcgtcc c 51 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ctctcgggac gacgtgacgg tgtgtagttg ggttgtggca ggagtcgtcc c 51 <210> 12 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ctctcgggac gacccggatt ttccgagtgg aactagctgt ggcggtcgtc cc 52 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 ctctcgggac gacgggatgt ccggggtacg gtggttgcag ttcgtcgtcc c 51 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 ctctcgggac gaccaggtgc cattagcgtc agtgtgctac gatgtcgtcc c 51 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 ctctcgggac gacccgttcg atctaaccct tgttagccgt gatgtcgtcc c 51 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 ctctcgggac gaccccttcg atcttcaacc aaagccgttg gatgtcgtcc c 51 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 ctctcgggac gacgggtggt cattgagtgg tcttaggcag gtagtcgtcc c 51 <210> 18 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 ctctcgggac gacgtggtgt gggagaaaga attttcattg gggtaggggg tcgtccc 57 <210> 19 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ctctcgggac gaccacttca gacgctcaac gtttggggag gcacggcagg tcgtccc 57 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ctctcgggac gacggggagg agttagcatg acggcaactt tagtacttcg tcgtccc 57 <210> 21 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 ctctcgggac gacgccagtt tgaaggttcg ttcgcaggtg tggagtgacg tcgtccc 57 <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 ctctcgggac gactgcagcc tggggttgtg gggggtaggg gaggtctgag tcgtccc 57 <210> 23 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ctctcgggac gaccacacag aggcacaact cgcaggagca aagcggcagg tcgtccc 57 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 ctctcgggac gacaggggca tatatagtct agggtttggt gtgggtagtg tcgtccc 57 <210> 25 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ctctcgggac gactggtagg cagatagggg aagctgattc gatgcgtggg tcgtccc 57 <210> 26 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 ctctcgggac gactggtagg cagcagggga agtaggcgtg tcctcgtggg tcgtccc 57 <210> 27 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ctctcgggac gaccagtagg ggatccacag tgaggggttt gtatgggtgg tcgtccc 57 <210> 28 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ctctcgggac gactggtagg caacagggga agggagttct gcgtacgtgg gtcgtccc 58 <210> 29 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 ctctcgggac gacggaggtg gtgtcttgga cagtggtatt cgcagttgcg tcgtccc 57 <210> 30 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 ctctcgggac gacagagacg gggtgcttac ttggttcagg ggagtcgacg tcgtccc 57 <210> 31 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 ctctcgggac gacagccaag gtcgtaaggt acggtcagtg tactcggttg tcgtccc 57 <210> 32 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ctctcgggac gacgtcttgg gggtggtggg tttggctggt acttagggcg tcgtccc 57 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 ctctcgggac gacggcccga tctcagagta gtcgtccc 38 <210> 34 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 tctgtgtcat gtggcgcctc gaccccagcc ttggtagctg ttggccacac aagagcacat 60 gac 63 <210> 35 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 tctgtgtcat gtgacgagac aaggagaacg gaaggcgacc ggataaatcg gatatcacat 60 gac 63 <210> 36 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 gtcatgtgga ttgtgacttg cccacaacga ttttgccaaa catgcatagc cacatgac 58 <210> 37 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 ctctcgggac gacaggggca tatatagtct agggtttggt gtgggtagtg tcgtccc 57 <210> 38 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 tgtcgtcccg agag 14 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> a, c, t or g <400> 39 naggggcata tatagtctag ggtttggtgt gggtagtn 38 <210> 40 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ctctcgggac gactggtagg cagatagggg aagctgattc gatgcgtggg tcgtccc 57 <210> 41 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 gtcgtcccga gag 13 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (8)..(10) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (18)..(21) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (27)..(29) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (32)..(34) <223> a, c, t or g <220> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (32)..(32) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> a, c, t or g <400> 51 ntggnaggna acaggggngg gagnnctncg tncgtggn 38 <210> 52 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 ctctcgggac gacggaggtg gtgtcttgga cagtggtatt cgcagttgcg tcgtccc 57 <210> 53 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 cgtcgtcccg agag 14 <210> 54 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (10)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> a, c, t or g <400> 54 nggaggtggn nnnnnnnnnn gtggtattcg cagttgcn 38 <210> 55 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 ctctcgggac gacagagacg gggtgcttac ttggttcagg ggagtcgacg tcgtccc 57 <210> 56 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 tgtcgtcccg agag 14 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (6)..(8) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (33)..(35) <223> a, c, t or g <220> 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<400> 62 cgacccggat tttccgagtg gaactagctg tggcggtcg 39 <210> 63 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cgacagatag ttgttcttag cgatgttcag cgttgtcg 38 <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 gacgacgccc gcatgttcca tggatagtct tgactagtcg tc 42 <210> 65 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 acgggatgtc cggggtacgg tggttgcagt tcgt 34 <210> 66 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 cgacacagcg tgagccaact aattagtgcg tattgtcg 38 <210> 67 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 gaccggtggg ggttcttttt caggggaggt acggtc 36 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 acgaccgtgt gtgttgctct gtaacagtgt ccattgtcgt 40 <210> 69 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 cgaccgccac agctagttcc actcggaaaa tccgggtcg 39 <210> 70 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 cgacc 5 <210> 71 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 cgaca 5 <210> 72 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 gacgac 6 <210> 73 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 acggg 5 <210> 74 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 cgaca 5 <210> 75 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 gaccg 5 <210> 76 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 ctctcgggac gacccggatt ttccgagtgg aactagctgt ggcggtcgtc cc 52 <210> 77 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 gggacgaccg ccacagctag ttccactcgg aaaatccggg tcgtcccgag ag 52 <210> 78 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 ctctcgggac gacccggatt ttccgagtgg aactagctgt ggcggtcgtc cc 52 <210> 79 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 ctctcgggac gacagatagt tgttcttagc gatgttcagc gttgtcgtcc c 51 <210> 80 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 gggacgacaa cgctgaacat cgctaagaac aactatctgt cgtcccgaga g 51 <210> 81 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ctctcgggac gacagatagt tgttcttagc gatgttcagc gttgtcgtcc c 51 <210> 82 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 ggtcgtcccg agag 14 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (9)..(12) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (22)..(23) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 83 nncgtgtgnn nngtgtccat tnn 23 <210> 84 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 ggtcgtcccg agag 14 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (5)..(8) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (13)..(16) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (18)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (24)..(26) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 85 nncgnnnncc aannnngnnn gtannngtnn 30 <210> 86 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 gtcgtcccga gag 13 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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gtcgtcccga gag 13 <210> 91 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (8)..(11) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (15)..(18) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (23)..(24) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (29)..(34) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 91 nngcccgnnn nttcnnnnga nanncttgnn nnnn 34 <210> 92 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 gtcgtcccga gag 13 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (19)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (31)..(33) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (37)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 127 nnacacagag gcacaactnn naggagcaaa nnngcann 38 <210> 128 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 tgtcgtcccg agag 14 <210> 129 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 129 naggggcata tatagtctag ggtttggtgt gggtagtn 38 <210> 130 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 gtcgtcccga gag 13 <210> 131 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (8)..(10) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (18)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (26)..(28) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (31)..(33) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 131 ntggtagnnn gatagggnnn gctgannnga nnngtggn 38 <210> 132 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 gtcgtcccga gag 13 <210> 133 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 133 ntggtaggca gcaggggaag taggcgtgtc ctcgtggn 38 <210> 134 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 ggtcgtcccg agag 14 <210> 135 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (11)..(14) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (31)..(34) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (36)..(36) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 135 nagtagggga nnnncagtga ggggtttgta nnnntn 36 <210> 136 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 gtcgtcccga gag 13 <210> 137 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (18)..(19) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (25)..(26) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (33)..(33) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (39)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 137 ntggnaggna acaggggnng ggagnnctnc gtncgtggn 39 <210> 138 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 cgtcgtcccg agag 14 <210> 139 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (10)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 139 nggaggtggn nnnnnnnnnn gtggtattcg cagttgcn 38 <210> 140 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 tgtcgtcccg agag 14 <210> 141 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (6)..(8) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (33)..(35) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (39)..(40) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 141 nnagannngg ggtgcttact tggttcaggg gannngacnn 40 <210> 142 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 ctgtcgtccc gagag 15 <210> 143 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (10)..(11) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (17)..(18) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 143 nncaagntcn naaggtnngg tcagtgtant cgnn 34 <210> 144 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 cgtcgtcccg agag 14 <210> 145 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (31)..(32) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (35)..(36) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 145 nncttggggg tggtgggttt ggcnngtact nnggnn 36 <210> 146 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 gtcgtcccga gag 13 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 acggcccgat ctcagagtag t 21 <210> 148 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 cgacgcgcgc atgttccatg gatagtcttg actagtcg 38 <210> 149 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 cgacctggtg tgttgctctg taacagtgtc tattgtcg 38 <210> 150 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 ccggattttc cgagtactaa ggcgccttag tactcggaaa atccgggtcg tcccgagag 59 <210> 151 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 gtgtgtgttg ctctgagtta ttggccttag ttttcttggg aaacgcggtc gtcccgagag 60 <210> 152 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 gtgtgtgttg ctctgagtta ttgcaataac tcagagcaac acacacggtc gtcccgagag 60 <210> 153 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 gcccgatcag gcttggccaa gcctgatcgg gccgtcgtcc cgagag 46 <210> 154 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 ccggattttc cgagtactaa ggcgccttag tactcggaaa atccgggtcg tcccgagag 59 <210> 155 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 gtgtgtgttg ctctgagtta ttggccttag ttttcttggg aaacgcggtc gtcccgagag 60 <210> 156 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 agacacagta cac 13 <210> 157 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 ccgtgtgt 8 <210> 158 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 agtgtccatt g 11 <210> 159 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 agtgtccttt g 11 <210> 160 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 ctctcgggac gaccgtgtgt gttgctctgt aacagtgtcc attgtcgtcc c 51 <210> 161 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 ctctcgggac gaccgtgtgt ggtagagtcg tcgggctcta acagtgtcct ttgtcgtccc 60 <210> 162 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 ctctcgggac gaccgtgtgt gacgtgcgcc gtggggaacg tcagtgttct ttgtcgtccc 60 <210> 163 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 ctctcgggac gaccgtgtgt cgacttagag tcgagtgtcc tttgtcgtcc c 51 <210> 164 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 ctctcgggac gaccgtgtgt tgcaattctt gcaagtgttc tttgtcgtcc c 51 <210> 165 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 gcgt 4 <210> 166 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 ggtt 4 <210> 167 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 gaccgcgttt cccaagaaag caagtattgg ttggtc 36 <210> 168 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 ggggg 5 <210> 169 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 gggg 4 <210> 170 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 gagg 4 <210> 171 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 catt 4 <210> 172 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 ccgg 4 <210> 173 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 tgtt 4 <210> 174 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 cgacgaggct ggatgcattc gccggatgtt cgatgtcg 38 <210> 175 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 cgcc 4 <210> 176 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 atgttc 6 <210> 177 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 ggatagt 7 <210> 178 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 gacgcccgca tgttccatgg atagtcttga ctagtcg 37 <210> 179 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 tacga 5 <210> 180 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 ggata 5 <210> 181 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 actagcgtat gcgccagaag tatacgagga tagt 34 <210> 182 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 gacgccagaa gtttacgagg atatggtaac atagtc 36 <210> 183 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 gacgggggtg gcatagggta ggctagggtc actgtc 36 <210> 184 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 acgacgtggc taggtaggtt gcatgcggca taggggtcgt 40 <210> 185 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 acgacgtgac ggtgtgtagt tgggttgtgg caggagtcgt 40 <210> 186 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 agct 4 <210> 187 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 gcgg 4 <210> 188 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 gacccggatt ttccgagtgg aactagctgt ggcggtc 37 <210> 189 <211> 41 <212> DNA <213> 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Synthetic oligonucleotide <400> 194 ccgat 5 <210> 195 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 ggtgt 5 <210> 196 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 cgacgccagt ttgaaggttc gttcgcaggt gtggagtgac gtcg 44 <210> 197 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 cgactgcagc ctggggttgt ggggggtagg ggaggtctga gtcg 44 <210> 198 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 cacag 5 <210> 199 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 cacaa 5 <210> 200 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 cgaccacaca gaggcacaac tcgcaggagc aaagcggcag gtcg 44 <210> 201 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 cgacggggag gagttagcat gacggcaact ttagtacttc gtcg 44 <210> 202 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 cgaccacttc agacgctcaa cgtttgggga ggcacggcag gtcg 44 <210> 203 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 cgactggtag gcagataggg gaagctgatt cgatgcgtgg gtcg 44 <210> 204 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 cgactggtag gcaacagggg aagggagttc tgcgtacgtg ggtcg 45 <210> 205 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 cgacaggggc atatatagtc tagggtttgg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 cagccaaggt cgtaaggtac ggtcagtgta ctcggttg 38 <210> 212 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 gatagt 6 <210> 213 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 atgttc 6 <210> 214 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 gacagatagt tgttcttagc gatgttcagc gttgtc 36 <210> 215 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 cgacggtagg taggccaact gggtatttac tggtgtcg 38 <210> 216 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 tgaaa 5 <210> 217 <211> 5 <212> DNA <213> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 gtttaga 7 <210> 224 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 agtctt 6 <210> 225 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 cgaccgcttg ccccctggca tgtttagagc agagtctttg gtcg 44 <210> 226 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 ggttcat 7 <210> 227 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 atgtggg 7 <210> 228 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 cgacgtccgg ttcatgactt cagtagtcta gtgggggtct gtcg 44 <210> 229 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 cgtctacggc ttagc 15 <210> 230 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 cgacgcaacc attccagtgg cgtctacggc ttagcttttc gtcg 44 <210> 231 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 acgaccagga tgctgttcca ccggggtaca ggtaggtcgc tgtcgt 46 <210> 232 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 acgggcgtag cgatagaaga gagcaggggg agagacctgt 40 <210> 233 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 acgacgggaa ggagttccgg ggtacgcggg taagggaagg agtcgt 46 <210> 234 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 cgaccaacga gtatacgctt acgtcacgtt gatgctgtgg gtcg 44 <210> 235 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 cgacgcattg atgtacaagc tcgattcgta tcccttgatc gtcg 44 <210> 236 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 ctgggctcgt gttctatgga caagggggag tgacctgg 38 <210> 237 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 ctctc 5 <210> 238 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 ctctcggg 8 <210> 239 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 cgacggaaga ggctcagtgc tatcttatct gagagggttt gtcg 44 <210> 240 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 cgggagtgtc tcctaaggcc ttagtaagaa gggtcctg 38 <210> 241 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 acgacgggaa gaggctcgtg agttgatggg gagagggtcc ggtcgt 46 <210> 242 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 cgacggaagg gtcccgttga gtttgcaatg gtgagggttt gtcg 44 <210> 243 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 acgacgccga tggaaggggc cctggtggga gggtcaaagg ggtcgt 46 <210> 244 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 244 cgacgggcag gtagatctac atgaatatga aggaatgatc gtcg 44 <210> 245 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 245 acgacgggga gtagccgggt ggttagtgtc tcgcgaggag gtcgt 45 <210> 246 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 246 tccc 4 <210> 247 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 247 acgaccaggt ggggctgctc aagtggaggt tcctcgtcgt 40 <210> 248 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 acgaccagag gggcctcaaa tgtggggtgt tgctcgtcgt 40 <210> 249 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 cgaccggggt aggggttagg tgggaatgga gctggaccgt gtcg 44 <210> 250 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 gacggaccgt tgccctgggg tagtgcgcgc ttcgtttacg tc 42 <210> 251 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 gtggttagta acttgcacgc cgcccaattg ctattcatga caagccac 48 <210> 252 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 tctgtgtcat gtggattgtg acttgcccac aacgattttg ccaaacatgc atagccacat 60 gac 63 <210> 253 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 tctgtgtcat gtggcgcctc gaccccagcc ttggtagctg ttggccacac aagagcacat 60 gac 63 <210> 254 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 ggtggcct 8 <210> 255 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 aggggtg 7 <210> 256 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 gacgacggtg gccttaatag atagatgata ttcttatatg tgtgaggggt ggtcgtc 57 <210> 257 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 gacggtggcc tatattggta tgtatgaaga atagaactat tagggggtgt c 51 <210> 258 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 cgacggtggc ctattaaata gctttagttt aagaaaagta atagggggtg tcg 53 <210> 259 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 cgacggtggc ctattaagta gctttagttc aagaaaagta atagggggtg tcg 53 <210> 260 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 gtagtacgtt 10 <210> 261 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 gacgtccaag tagtacgttt aattaggatt tccgaattat tggcatgcgt c 51 <210> 262 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 262 ctctcgggac gacggggatt ttccagtgca actagctgaa agcggtcgtc cc 52 <210> 263 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 ctctcgggac gaccaggatt ttccagtgta actagctaca gcgggtcgtc cc 52 <210> 264 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 ctctcgggac gacagatagt tgttcttagc gatgttcagc gttgtcgtcc c 51 <210> 265 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 ctctcgggac gacggtaggt aggccaactg ggtatttact ggtgtcgtcc c 51 <210> 266 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 ctctcgggac gacggccccg caaggggtga aatgacagag tcaaagtgcg tcgtccc 57 <210> 267 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 ctctcgggac gacgtagtcg gaaacggtgt ctcagttcct cggtagagtc gtccc 55 <210> 268 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 ctctcgggac gaccgcttgc cccctggcat gtttagagca gagtctttgg tcgtccc 57 <210> 269 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 ctctcgggac gacgtccggt tcatgacttc agtagtctag tgggggtctg tcgtccc 57 <210> 270 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 ctctcgggac gacgcaacca ttccagtggc gtctacggct tagcttttcg tcgtccc 57 <210> 271 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 ctctcgggac gaccaggatg ctgttccacc ggggtacagg taggtcgctg tcgtccc 57 <210> 272 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 ctctcgggac gacgggcgta gcgatagaag agagcagggg gagagacctg tcgtccc 57 <210> 273 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 ctctcgggac gacgggaagg agttccgggg tacgcgggta agggaaggag tcgtccc 57 <210> 274 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 ctctcgggac gaccaacgag tatacgctta cgtcacgttg atgctgtggg tcgtccc 57 <210> 275 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 ctctcgggac gacgcattga tgtacaagct cgattcgtat cccttgatcg tcgtccc 57 <210> 276 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 ctctcgggac gactgggctc gtgttctatg gacaaggggg agtgacctgg tcgtccc 57 <210> 277 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 ctctcgggac gacggaagag gctcagtgct atcttatctg agagggtttg tcgtccc 57 <210> 278 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 ctctcgggac gacgggagtg tctcctaagg ccttagtaag aagggtcctg tcgtccc 57 <210> 279 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 ctctcgggac gacgggaaga ggctcgtgag ttgatgggga gagggtccgg tcgtccc 57 <210> 280 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 ctctcgggac gacggaaggg tcccgttgag tttgcaatgg tgagggtttg tcgtccc 57 <210> 281 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 ctctcgggac gacgccgatg gaaggggccc tggtgggagg gtcaaagggg tcgtccc 57 <210> 282 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 ctctcgggac gacgggcagg tagatctaca tgaatatgaa ggaatgatcg tcgtccc 57 <210> 283 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 ctctcgggac gacggggagt agccgggtgg ttagtgtctc gcgaggaagt cgtccc 56 <210> 284 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 ctctcgggac gaccaggtgg ggctgctcaa gtggaggttc ctcgtcgtcc c 51 <210> 285 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 ctctcgggac gaccagaggg gcctcaaatg tggggtgttg ctcgtcgtcc c 51 <210> 286 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 ctctcgggac gaccggggta ggggttaggt gggaatggag ctggaccgtg tcgtccc 57 <210> 287 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 ctctcgggac gacggaccgt tgccctgggg tagtgcgcgc ttcgtttacg tcgtccc 57 <210> 288 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 gacgacggtg gcctatattg gtatgtatga agaatagaac tattaggggg tgtc 54 <210> 289 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 ctctcgggac gacggtggcc tattaagtag ctttagttca agaaaagtaa tagggggtgt 60 cgtccc 66 <210> 290 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 gtcatgtggc gcctcgaccc cagccttggt agctgttggc cacacaagag cacatgac 58 <210> 291 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 gtcatgtgac gagacaagga gaacggaagg cgaccggata aatcggatat cacatgac 58 <210> 292 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 cgacccggat tttccgagtg gaactagctg tggcggtcg 39 <210> 293 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 293 cgaccgccac agctagttcc actcggaaaa tccgggtcg 39 <210> 294 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 294 ctctcgggac gacccggatt ttccgagtgg aactagctgt ggcggtcgtc cc 52 <210> 295 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 295 gggacgaccg ccacagctag ttccactcgg aaaatccggg tcgtcccgag ag 52 <210> 296 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 296 cgacagatag ttgttcttag cgatgttcag cgttgtcg 38 <210> 297 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 297 cgacaacgct gaacatcgct aagaacaact atctgtcg 38 <210> 298 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 298 ctctcgggac gacagatagt tgttcttagc gatgttcagc gttgtcgtcc c 51 <210> 299 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 299 gggacgacaa cgctgaacat cgctaagaac aactatctgt cgtcccgaga g 51 <210> 300 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 gacgacgccc gcatgttcca tggatagtct tgactagtcg tc 42 <210> 301 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 gacgactagt caagactatc catggaacat gcgggcgtcg tc 42 <210> 302 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 302 acgggatgtc cggggtacgg tggttgcagt tcgt 34 <210> 303 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 acgaactgca accaccgtac cccggacatc ccgt 34 <210> 304 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 304 cgacacagcg tgagccaact aattagtgcg tattgtcg 38 <210> 305 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 305 cgacaatacg cactaattag ttggctcacg ctgtgtcg 38 <210> 306 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 306 gaccggtggg ggttcttttt caggggaggt acggtc 36 <210> 307 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 307 gaccgtacct cccctgaaaa agaaccccca ccggtc 36 <210> 308 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 308 gtcgtcccga gagcc 15 <210> 309 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(26) <223> a, c, t or g <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 309 ggctctcggg acgacnnnnn nnnnnngtcg tccc 34 <210> 310 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 310 cgactggtag gcagataggg gaagctgatt cgatgcgtgg gtcg 44 <210> 311 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 311 catgtggatt gtgacttgcc cacaacgatt ttgccaaaca tgcatagcca catg 54 <210> 312 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 312 cgactggtag gcagataggg gaagctgatt cgatgcgtgg gtcg 44 <210> 313 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 gtggttagta acttgcacgc cgcccaattg ctattcatga caagccac 48 <210> 314 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 cgactggtag gcagataggg gaagctgatt cgatgcgtgg gtcg 44 <210> 315 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 ccacatgaca caga 14 <210> 316 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 tctgtgtcat gtggattgtg acttgcccac aacgattttg ccaaacatgc atagccacat 60 gac 63 <210> 317 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 cgactggtag gcagataggg gaagctgatt cgatgcgtgg gtcg 44 <210> 318 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 catgtggatt gtgacttgcc cacaacgatt ttgccaaaca tgcatagcca catg 54 <210> 319 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 acatgacaca ga 12 <210> 320 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 tctgtgtcat gtggcgcctc gaccccagcc ttggtagctg ttggccacac aagagcacat 60 gac 63 <210> 321 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 cgacccggat tttccgagtg gaactagctg tggcggtcg 39 <210> 322 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 ctctcgggac gaccgcgttt cccaagaaag caagtattgg ttgtcgtccc 50

Claims (41)

  1. 샘플의 적어도 일부를 (1) 분석물에 결합하는 코어 서열을 포함하는 1차 압타머 및 (2) 1차 압타머의 적어도 일부에 상보적인 항-압타머의 유효량들과 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 및/또는 양을 테스트하는 분석법으로,
    상기 1차 압타머 및/또는 항-압타머는 1차 압타머 및 항-압타머가 서로 결합했는지 또는 결합하지 않았는지 검출하는 검출가능한 모이어티를 포함하고, 상기 분석물에 결합한 1차 압타머는 이의 항-압타머에 결합하지 않는 것인, 분석법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 분석법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-압타머가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 분석법.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 85% 이상에 상보적인, 분석법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 95% 이상에 상보적인, 분석법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 및 에피네프린으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 분석법.
  7. (i) 샘플의 적어도 일부를, 1차 압타머 및 상기 1차 압타머의 적어도 일부에 상보적인 항-압타머의 유효량들과 접촉시키는 단계로서, 상기 1차 압타머 및/또는 항-압타머가, 표적 분석물이 존재하지 않는 경우 상기 1차 압타머와 항-압타머 간의 듀플렉스(duplex) 형성을 허용하는 조건 하에서, 분석물에 결합한 1차 압타머의 양이 검출 및/또는 측정되도록 하는 모이어티를 포함하는 것인, 단계; 및 (ii) 항-압타머에 결합하지 않는 1차 압타머의 양을 검출하고 선택적으로는 정량화하는 단계를 포함하는,
    샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항-압타머가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 방법.
  10. 제7항, 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 85% 이상에 상보적인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 95% 이상에 상보적인, 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  13. (i) 샘플의 적어도 일부를, (a) 형광 표지자를 포함하는 1차 압타머 및 (b) 항-압타머의 유효량들과 접촉시키는 단계로서, 상기 항-압타머가, 분석물이 존재하지 않을 경우 1차 압타머와 항-압타머 간의 듀플렉스(duplex) 형성이 일어나도록 허용하는 조건 하에서, 1차 압타머와 항-압타머가 듀플렉스 내에서 함께 결합하는 경우 상기 형광 표지자의 형광을 소광시키는 모이어티를 포함하는 것인, 단계; 및 (ii) 형광의 양을 검출하고 선택적으로는 정량화하는 단계를 포함하는,
    샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항-압타머가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 방법.
  16. 제13항, 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 85% 이상에 상보적인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 95% 이상에 상보적인, 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  19. 관심 대상 분석물에 결합하는 1차 압타머 및 상기 1차 압타머의 적어도 일부에 상보적인 항-압타머를 포함하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 키트.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 항-압타머가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 키트.
  22. 제19항, 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 85% 이상에 상보적인, 키트.
  23. 제22항에 있어서, 상기 항-압타머가 1차 압타머의 95% 이상에 상보적인, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 키트.
  25. (i) 샘플의 적어도 일부를, (a) 분석물에 결합하는 코어 서열 및 센서 올리고뉴클레오티드에 상보적인 부분을 포함하는 1차 압타머; (b) 센서 올리고뉴클레오티드; 및 선택적으로 (c) 콤프(comp) 올리고뉴클레오티드의 유효량들과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 방법으로서,
    상기 (a) 내지 (c) 중 하나 이상이, 1차 압타머와 센서 올리고뉴클레오티드가 서로 결합하였는지 또는 1차 압타머가 분석물에 결합하였는지를 검출할 수 있는 검출가능한 모이어티에 결합된 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 센서 올리고뉴클레오티드가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 방법.
  28. 제25항, 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  29. 관심 대상 분석물에 결합하는 1차 압타머 및 상기 1차 압타머의 적어도 일부에 상보적인 센서 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  30. 제29항에 있어서, 콤프(comp) 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 키트.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 키트.
  32. 제29항, 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 센서 올리고뉴클레오티드가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 키트.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 키트.
  34. (i) 샘플의 적어도 일부를, (a) 분석물에 결합하는 코어 서열, 및 1차 압타머가 분석물에 결합될 때 2차 "샌드위치" 압타머에 결합하는 부분을 포함하는 1차 압타머; 및 (b) 2차 "샌드위치" 압타머의 유효량들과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    샘플에서 관심 대상 분석물의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 방법으로서,
    상기 (a) 또는 (b) 중 하나 이상이 1차 압타머와 2차 "샌드위치" 압타머가 서로 결합하였는지 결합하지 않았는지를 검출할 수 있는 검출가능한 모이어티에 결합된 것인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 2차 "샌드위치" 압타머가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 방법.
  37. 제34항, 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  38. 관심 대상 분석물에 결합하는 1차 압타머, 및 분석물에 결합한 1차 압타머에 결합하는 2차 "샌드위치" 압타머를 포함하는, 키트.
  39. 제38항에 있어서, 상기 1차 압타머가 형광 표지자를 포함하는, 키트.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 2차 "샌드위치" 압타머가 소광(quencher) 모이어티를 포함하는, 키트.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 글루코스, 히드로코르티손, 페닐알라닌, 데히드로이소안드로스테론, 데옥시코르티손, 테스토스테론, 알도스테론, 도파민, 스핑고신-1-인산염, 세로토닌, 멜라토닌, 타이로신, 토브라마이신, 아미카신, 메틸렌블루, 암모늄, 보론산, 에피네프린, 크레아티닌, 및 바소프레신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 키트.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020037250A2 (en) * 2018-08-17 2020-02-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Stem-loop receptor-based field-effect transistor sensor devices target detection for small-molecule under physiological salt concentrations
AU2019352901A1 (en) 2018-10-02 2021-05-27 WearOptimo Pty Ltd Measurement system
EP3783362A3 (en) * 2019-08-22 2021-06-09 Laboratorium M. Nuytinck Biosignatures for chronic mental stress
CN113640268B (zh) * 2021-08-30 2023-03-28 南京林业大学 一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法
US20240288452A1 (en) * 2023-02-28 2024-08-29 Giner, Inc. Detection of oxytocin in a biological sample

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050089864A1 (en) * 2002-01-22 2005-04-28 Yingfu Li Signalling aptamer complexes
WO2005051174A2 (en) * 2003-11-21 2005-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleic acid aptamer-based compositions and methods
JP5223237B2 (ja) * 2007-05-14 2013-06-26 ソニー株式会社 検出用核酸鎖及び物質間の結合又は相互作用検出方法
US20110065086A1 (en) * 2008-02-21 2011-03-17 Otc Biotechnologies, Llc Methods of producing homogeneous plastic-adherent aptamer-magnetic bead-fluorophore and other sandwich assays
JP2012213388A (ja) * 2011-03-25 2012-11-08 Canon Inc ヒドロコルチゾンに対して親和性を有する核酸リガンド
JP5949767B2 (ja) * 2011-07-25 2016-07-13 日本電気株式会社 標的物質の検出方法
WO2013145939A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 日本電気株式会社 標的物質の検出方法、検査キット、および検出装置
WO2014144744A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aptamer methods and compositions

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