JP3463098B2 - モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法 - Google Patents

モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法

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    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定の標的タンパ
ク質、特にヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）のTatタ
ンパク質と特異的に結合するモジュレートアプタマー、
及びこれを用いた標的タンパク質、特にHIV-1 Tatタン
パク質の検出方法並びに検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸リガンド（アプタマー）の中には、
タンパク質に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗
体の親和性・特異性に匹敵するものがあることが報告さ
れており、これをバイオセンサーにおける分子認識因子
として利用することが期待されている（Osborn, S.E.及
びEllington, A.D., Chem. Rev. 97, 349-370 (199
7)）。このため、全長のアプタマーを用いて行った研究
が奨励され、遂行された（Drolet, D.W., Moon-McDermo
tt, L.及びRoming, T.S. Nature Biotechnol. 14, 1021
-1025 (1996); Kleinjung, F.ら、Anal. Chem. 70, 328
-331 (1998); Potyrailo, R.A., Conrad, C.R., Elling
ton, A.D.及びHieftje, G.M. Anal. Chem. 70,3419-342
5 (1998)）。
【０００３】更に、HIV-1及びHIV-2のTatタンパク質に
対して高い親和性を示すアプタマーは、感染細胞から放
出された、または感染患者血清中のTatタンパク質の量
を測定することができるくらい感度が高いと考えられて
いる（Westendrop, M.O.ら,Nature 375, 497-500 (199
5); Pantaleo, G.ら, Nature 362, 355-358 (1993);Emb
retson, J.ら, Nature 362, 359-362 (1993)）。
【０００４】一方、最近、相補的な標的配列を見つけだ
すための道具として、モレキュラービーコンというステ
ム・ループ構造を持つ核酸モチーフが開発された（Tyag
i, S. and Kramer, F.R. (1996) Nature Biotechnology
14, 303-308）。このモレキュラービーコンは、標的配
列に相補的なプローブとなるループ配列と、プローブ配
列の両端にある二つの相補的なアーム配列のアニーリン
グにより形成されるステム構造の二つの構造組成物を含
むものである。ステム構造を形成する一方のアームの先
端に一つの蛍光プローブが共有結合でつながっており、
他方のアームの先端にクエンチャー物質が共有結合でつ
ながっている。このビーコンのステム形成により蛍光プ
ローブ及びクエンチャー物質は近接しており、そのため
に蛍光を発さない。このモレキュラービーコンが標的分
子に出会うと、モレキュラービーコンのステム構造より
も安定なプローブ（ループ構造）・標的ハイブリッドが
形成される。ステム・ループモチーフの構造変化により
二つのアーム配列は引き離され、蛍光が発せられるよう
になる。従って、モレキュラービーコンを用いると、反
応を中断することなくリアルタイムで特異的な核酸を検
出する事ができ、また生きた細胞にも応用できることが
報告されている（Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1998)
Nature Biotechnology 16, 49-53; Matsuo, T. (1998)
Biochem. Biophys Acta. 1379, 178-184; Sokol, D.
L., Zhang, X., Lu, P. and Gewirtz, A.M. (1998) Pro
c Natl. Acad. Sci. USA 95, 11538-11543）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
最初に行われたアプローチにはいくつかの制限があっ
た。例えば、アプタマーの長さが長くなるほど化学合成
の効率が下がること、ヌクレアーゼに対して全長アプタ
マーの保護が必要であること、複数の解析の場合、長い
アプタマーでは構造化、再構造化の効率が比較的低いこ
となどである。すなわち、アプタマーのサイズや認識様
式が理由で、アプタマーをバイオセンサーを用いた実験
に応用するのには限界があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決し、標的タンパク質や解析物の存在下でのみ複合
体が形成されて安定化し、効果的なバイオセンサーとし
て使用できる新しい戦略を開発した。具体的には、先に
出願したHIV-1 Tatタンパク質のアプタマーRNA（特開平
１１−１２７８６４号）に基づき、アプタマー配列を独
立した二本鎖に分けて、Tatタンパク質の検出により効
果的なモジュレートアプタマーを構築した。
【０００７】本発明に係るHIV-1 TatのアプタマーRNA由
来のモジュレートアプタマーは、1nM以下のHIV-1 Tatタ
ンパク質またはTat由来ペプチドの存在下で複合体を形
成するが、他のRNA結合タンパク質や核抽出物の存在下
では複合体を形成しないことが見出された。
【０００８】すなわち、本発明は、相補的な二本のオリ
ゴヌクレオチド鎖から構成されるアプタマーであって、
標的タンパク質の存在下においてのみ複合体を形成し、
安定化することを特徴とするモジュレートアプタマー、
特に標的タンパク質がHIV-1Tatタンパク質及び／または
その断片であることを特徴とするモジュレートアプタマ
ーに関する。本発明のモジュレートアプタマーの一例と
して、下記の二次構造（I）によって表されるヌクレオ
チド配列を有するモジュレートアプタマーを挙げること
ができる。
【０００９】
【化８】
【００１０】（構造中、N1a及びN1bは相補的塩基対形成
が可能な少なくとも１対の核酸塩基であり、N2a及びN2b
は相補的塩基対形成が可能な少なくとも1対の核酸塩基
であり、N3及びN4はそれぞれ独立に１または2個の核酸
塩基であり、N5a及びN5bは相補的塩基対形成が可能な少
なくとも1対の核酸塩基であり、N6a及びN6bは相補的塩
基対形成が可能な少なくとも1対の核酸塩基であり、そ
して実線は核酸塩基間の水素結合を表す。） 本発明において特に好ましいモジュレートアプタマーと
しては、下記の二次構造（II）によって表されるヌクレ
オチド配列を有するモジュレートアプタマーを挙げるこ
とができる。
【００１１】
【化９】
【００１２】（構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を
表す。） また、上記モジュレートアプタマーを用いて、HIV-1 Ta
tタンパク質等の標的タンパク質を検出できる簡便で高
感度の検出方法、具体的には蛍光を用いたマイクロタイ
タープレートアッセイを開発した。このアッセイはDNA
アレイと同様に利用できる可能性があり、ウイルスタン
パク質や他の小分子物質の検出に取り入れ、拡張するこ
とができると考えられる。
【００１３】本発明は更に、その一態様として、モジュ
レートアプタマーを構成する一方のオリゴヌクレオチド
鎖が分子内に互いに相補的な4個以上の連続ヌクレオチ
ド配列を有し、標的タンパク質の非存在下ではステム・
ループ構造であることを特徴とする上記のモジュレート
アプタマーを提供する。
【００１４】具体的には、例えば、上記ステム・ループ
構造のオリゴヌクレオチド鎖の５’または３’末端に蛍
光物質を、３’または５’末端に該蛍光物質に対するク
エンチャー物質を結合させ、標的タンパク質の存在下に
おいてのみ複合体を形成し、蛍光を発するようにすると
検出が非常に容易になる。このステム・ループ構造のオ
リゴヌクレオチド鎖の好ましいものとして、下記の二次
構造（III）によって表されるヌクレオチド配列を有す
るものが挙げられる。
【００１５】
【化１０】
【００１６】（構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を
表す。） この「モジュレートアプタマー」の新しい戦略は、様々
な分子に対して分子認識因子を特徴づけるバイオセンサ
ーに容易に応用できる。
【００１７】従って、本発明はまた、上記のモジュレー
トアプタマーの一方のオリゴヌクレオチド鎖を放射性又
は非放射性標識し、標的タンパク質の存在下で形成した
複合体の有無及び／または量によって標的タンパク質の
存在及び／または量を検出することを特徴とする、標的
タンパク質、特にHIV-1Tatタンパク質及び／またはその
断片の検出方法を提供する。本発明の方法の一態様にお
いて、前記非放射性標識はフルオレセインであり、その
蛍光シグナルによって前記複合体を検出する。
【００１８】また、本発明は、上記のモジュレートアプ
タマーの一方のオリゴヌクレオチド鎖を支持体上に固定
化し、放射性又は非放射性標識した他方のオリゴヌクレ
オチド鎖の添加によって形成した複合体の有無及び／ま
たは量によって標的タンパク質の存在及び／または量を
検出することを特徴とする、標的タンパク質、特にHIV-
1Tatタンパク質及び／またはその断片の検出方法を提供
する。本発明の方法の一態様において、前記固定化は、
アビジンまたはストレプトアビジン及びビオチンの特異
的結合による。
【００１９】本発明は更に、支持体、支持体上に固定化
される上記のモジュレートアプタマーの一方のオリゴヌ
クレオチド鎖、標的タンパク質の存在下で複合体を形成
する他方のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなることを特
徴とする、標的タンパク質、特にHIV-1 Tatタンパク質
及び／またはその断片の検出キットを提供する。
【００２０】本発明のキットにおいて、具体的には、上
記モジュレートアプタマーの5'-鎖（図２における左側
の鎖）または3'-鎖（図２における右側の鎖）を前記一
方のオリゴヌクレオチド鎖とし、3'-鎖または5'-鎖を前
記他方のオリゴヌクレオチド鎖とする。
【００２１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、「アプタマー」とは、ある標的タンパ
ク質に特異的に強く結合するように人工的に創製された
核酸リガンドをいい、「モジュレートアプタマー」と
は、アプタマーのコアの部分を、Tm値の低い、短い二本
鎖オリゴヌクレオチドに分け、標的タンパク質の存在下
でのみ安定に二本鎖を組むように設計されたものをい
う。「モレキュラービーコンアプタマー」は、標的配列
に相補的なプローブとなるループ配列と、プローブ配列
の両端にある二つの相補的なアーム配列のアニーリング
により形成されるステム構造の二つの構造組成物を含む
ものである。
【００２２】また、本発明において、「相補的」及び
「相補的塩基対形成」とは、核酸の塩基がアデニンとウ
ラシル、グアニンとシトシンの間で水素結合により対合
することをいう。相補的塩基対形成が可能な核酸塩基対
としては、アデニンとウラシル、グアニンとシトシンの
組み合わせを挙げることができる。
【００２３】「複合体」とは、本発明の二本鎖モジュレ
ートアプタマー及び標的タンパク質から構成され、水素
結合、疎水的相互作用等の非共有結合によって結合し、
安定化状態にあるものをいう。ここで、安定化とは、結
合・解離の平衡状態が、より結合の状態に偏り、解離し
にくい複合体を形成することをいう。
【００２４】「放射性標識」とは、3Ｈ、13Ｃ、32Ｐ等
の放射性同位元素を含有する物質を使用して標識するこ
とをいい、「非放射性標識」とは、放射性物質を使用せ
ずに標識することをいう。非放射性標識において、標識
物質としては具体的には発光分子、フルオレセイン等の
蛍光分子、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ
等の酵素、抗体、ビオチン等の特定の分子と結合性を有
する分子等の当該分野で使用されているものが挙げら
れ、特に限定されない。
【００２５】「支持体」とは、本発明の検出方法及び検
出キットにおいて、複合体形成反応を固定位置で行うた
めに使用するものをいい、ガラス、プラスティック等の
吸光を示さないものであればいずれでも良いが、反応液
が微量の本発明のアッセイにおいてはマイクロタイター
プレート等が特に好ましい。
【００２６】「標的タンパク質」とは、本発明のモジュ
レートアプタマーが高い親和性及び特異性をもって結合
して安定化し、その存在及び／または量を検出できるタ
ンパク質またはペプチドをいい、例えばHIV-1 Tat及び
アミノ酸鎖長が約４０のその断片、CQペプチド、REペプ
チド等、HIV Revタンパク質等が挙げられる。また、HIV
としてHIV-1及びHIV-2が知られているが、本明細書にお
いて、Tat-1、TAR-1とは、それぞれHIV-1のTat（トラン
ス活性化因子）タンパク質及びTAR（トランス活性化応
答領域）をいい、Tat-2、TAR-2とは、それぞれHIV-2のT
atタンパク質及びTARをいう。
【００２７】本発明者らは先に、HIV-1のTAR（図１中
央）よりも高い特異性及び親和性でHIV-1 Tatタンパク
質に結合するアプタマーRNATat（図１左、配列番号１）
を単離し、HIVが関与する疾病を診断、予防及び治療す
るための医薬組成物におけるその利用についても報告し
た（Yamamoto, R., Murakami, K., Taira, K.及びKuma
r, P.K.R., Gene Ther. Mol. Biol. 1, 451-466 (199
8)、特開平１１−１２７８６４号）。このアプタマーは
Tatタンパク質に対して高い親和性（Tat-1に対するKd値
はTAR-1 RNA（59 mer、図１中央、配列番号２）よりも1
00倍低く、Tat-2に対するKd値はTAR-2 RNA (123 mer、
図１右、配列番号３）よりも40倍低い）を有し、また、
アプタマーのループ部分の配列はTatタンパク質結合部
位ではないため、アプタマーを二本鎖に分割することが
可能である。
【００２８】この観点から、本発明者らはTat-1タンパ
ク質に対するコア結合因子（図１において実線で囲まれ
た部分）を含む、異なる長さのいくつかのモジュレート
アプタマーオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２９】すなわち、まず本発明のモジュレートアプ
タマーの5'-側に相当するオリゴヌクレオチド鎖及び3'-
側に相当するオリゴヌクレオチド鎖をそれぞれ化学合成
した。使用に際しては、相補的な二本のオリゴヌクレオ
チド鎖の一方または双方を、先に定義したように検出可
能に放射性又は非放射性標識して使用できる。本発明の
モジュレートアプタマーは、標的タンパク質の存在下で
上記オリゴヌクレオチド鎖から再構成されるものであ
り、好ましいものとしては下記の二次構造（I）によっ
て表されるものが挙げられる。
【００３０】
【化１１】
【００３１】（構造中、N1a及びN1bは相補的塩基対形成
が可能な少なくとも１対の核酸塩基であり、N2a及びN2b
は相補的塩基対形成が可能な少なくとも1対の核酸塩基
であり、N3及びN4はそれぞれ独立に１または2個の核酸
塩基であり、N5a及びN5bは相補的塩基対形成が可能な少
なくとも1対の核酸塩基であり、N6a及びN6bは相補的塩
基対形成が可能な少なくとも1対の核酸塩基であり、そ
して実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００３２】上記二次構造（I）で表される本発明のモ
ジュレートアプタマーは、TAR-1 RNAのコア因子が逆向
きに並んだ繰り返しによりHIV-1 Tatタンパク質に対し
て高い親和性を示し、配列特異的にTat-1タンパク質ま
たはCQ等のTat-由来ペプチドに結合する。また、相補的
塩基対形成から飛び出したバルジ残基の存在がHIV-1 Ta
tタンパク質の認識及び効率的な結合に必須であること
も明らかとなった。また、本発明において特に好ましい
モジュレートアプタマーとして、下記の二次構造（II）
によって表されるヌクレオチド配列を有するものが挙げ
られる。
【００３３】
【化１２】
【００３４】（構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を
表す。） 一方、以前の生化学的実験から、HIV-1 Tatタンパク質
において、RNA認識及び結合に必要な最小限の領域がわ
かっている。CQペプチドと呼ばれるこのペプチド領域は
37-72アミノ酸残基からなり（配列番号４）、TAR-1 RNA
に全長のTat-1タンパク質と同等の効率で結合する（Wee
ks, K.M., Ampe, C., Schultz, S.C., Steitz, T.A.及
びCrothers, D.M., Scienec 249, 1281-1285 (1990); C
alnan, B.J., Biancalnan, S., Hudson, D.及びFranke
l, A.D., Genes Dev. 5, 201-210 (1991)）。このこと
から、モジュレートアプタマーの能力を調べる実験で
は、標的タンパク質としてTat-1タンパク質またはCQ等
のTat-由来ペプチドを用いて行った。また、Tat-1ペプ
チド由来の他のペプチドとしてRE（配列番号５）、Tat-
2由来ペプチドCP（配列番号６）も使用した。
【００３５】また、本発明において、標的タンパク質の
存在下でのみ複合体を形成するモジュレートアプタマー
RNAを用いた標的タンパク質の新規検出方法を提供す
る。この方法は、特にHIV-1 Tatタンパク質を標的とし
たモジュレートアプタマーを用いて解析した。本発明の
モジュレートアプタマーはTatタンパク質の存在下で効
率よく複合体を形成し、他のRNA結合タンパク質の存在
下では複合体を形成しない。従って、Tatタンパク質の
存在及び量をモジュレートアプタマーを用いて測定でき
る。
【００３６】本発明の一態様として、本発明のモジュレ
ートアプタマーの一方のオリゴヌクレオチド鎖を先に定
義した放射性標識し、他方のオリゴヌクレオチド鎖及び
標的タンパク質の存在下で複合体を形成させ、該複合体
形成の有無及び／または量を検出する。複合体形成反応
の条件は、例えばｐH７〜８のトリスバッファー中で、
３０℃、３０分であるが、当業者であれば、反応温度、
反応時間、反応液の組成等の条件を適宜変更することが
できる。
【００３７】複合体形成後、複合体の形成を直接検出す
ることも可能であるが、場合により、電気泳動等の当該
分野で通常用いられる方法によって形成した複合体を分
離することもできる。前記放射性標識の代わりに非放射
性標識を使用しても良く、例えばフルオレセインを使用
した場合には、その蛍光シグナルによって検出すること
ができる。
【００３８】本発明の方法の別の態様においては、一方
のオリゴヌクレオチド鎖を先に定義した支持体上に固定
化し、放射性または非放射性標識した他方の鎖の添加に
よって標的タンパク質の存在下で形成した複合体を検出
する。この場合、複合体形成反応の後、必要により、検
出前に複合体を形成していないオリゴヌクレオチド等を
洗浄によって除去する。固定化は、当該分野で通常行わ
れるものであればいずれでも良く、物理的手段、化学的
手段等、特に限定するものではないが、アビジンまたは
ストレプトアビジンとビオチンとの特異的結合を利用す
るのが好ましい。
【００３９】また本発明は、上記支持体、支持体上に固
定化される本発明のモジュレートアプタマーの一方のオ
リゴヌクレオチド鎖、標的タンパク質の存在下で複合体
を形成する、放射性または非放射性標識された他方のオ
リゴヌクレオチド鎖を含む、標的タンパク質の検出キッ
トを提供する。支持体上への固定化は、使用時に行うよ
うにしても良いが、予め固定化したものをキットとして
提供しても良い。上記と同様、固定化は、当該分野で通
常行われるものであればいずれでも良く、特に限定する
ものではないが、アビジンまたはストレプトアビジンと
ビオチンとの特異的結合を利用するのが好ましい。
【００４０】本発明のモジュレートアプタマーの特異性
は、HeLa核抽出物のような粗精製サンプル中でも保た
れ、感染細胞中等においても、直接本発明の検出方法が
使用できる。本発明によって、アプタマー由来のオリゴ
ヌクレオチドの安定な二重鎖構造の形成を、標的タンパ
ク質の存在下で効率よく調節できたことから、これを利
用して、本発明において、初めてモレキュラービーコン
アプタマーを利用した標的タンパク質、特にTatタンパ
ク質またはその断片の検出法を提供する。
【００４１】本発明において使用されるモレキュラービ
ーコンアプタマーは、上記のモジュレートアプタマーの
一態様において使用され、このモジュレートアプタマー
を構成する一方のオリゴヌクレオチド鎖が互いに相補的
な４個以上の連続ヌクレオチド配列を有し、標的タンパ
ク質の非存在下ではステム・ループ構造であることを特
徴とする。互いに相補的な配列が３個以下では、安定な
ステム・ループ構造をとることができないので好ましく
ない。このステム・ループ構造の一例として、下記の二
次構造（III）によって表されるヌクレオチド配列を有
するものが挙げられる。
【００４２】
【化１３】
【００４３】（構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を
表す。） 本発明においてモレキュラービーコンアプタマーを使用
する際は、ステム・ループ構造のオリゴヌクレオチド鎖
の５’または３’末端に蛍光物質を、３’または５’末
端に該蛍光物質に対するクエンチャー物質を結合させ
る。
【００４４】具体的には、モジュレートアプタマーの配
列に基づいて、アプタマーを構成する一方のオリゴヌク
レオチド鎖、すなわちステム・ループ構造をとる配列の
5'末端に[4'-(4'-ジメチル-アミノフェニルアゾ) 安息
香酸（DABSYL）]等のクエンチャー物質、3' 末端にフル
オレセイン、クーマリン、テトラメチルローダミン等の
蛍光物質を共有結合でつなぎ、モレキュラービーコンア
プタマーを構築する（図13左）。対照として、このモレ
キュラービーコンアプタマーと完全に相補的な配列を持
つRNAオリゴヌクレオチドを合成し、蛍光物質とクエン
チャー物質間の距離が離れたときの蛍光強度の相対的な
量を評価するのに用いる。
【００４５】モジュレートアプタマーの一方のオリゴヌ
クレオチドを構成するDA-13 (C-A)（図１３左）は、プ
ローブ（モジュレートアプタマーの他方の鎖）と標的タ
ンパク質の双方が存在するときのみにステム・ループ構
造から二重鎖構造への構造変化が起こり、プローブまた
は標的タンパク質の非存在下では、この構造変化は起こ
らない。従って、本発明において、モレキュラービーコ
ンは標的タンパク質の存在により構造変化し、これを効
率よく検出できる。
【００４６】上記モレキュラービーコンアプタマーはこ
れまで記載したモジュレートアプタマーの一態様であっ
て、これを使用して、先に記載した標的タンパク質の検
出方法及び検出キットが同様に好適に提供されることは
理解されるであろう。
【００４７】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。 実施例１Tat由来ペプチド、アプタマー、及びモジュレートアプ
タマーの合成 Tat-1由来ペプチドCQ（37〜72アミノ酸；配列番号
４）、RE（49〜86アミノ酸；配列番号５）、Tat-2由来
ペプチドCP（66〜97アミノ酸；配列番号６）はいずれも
TANA Lab. L.C.（Texas, USA）に化学合成を依頼した。
【００４８】図１に示したアプタマーRNATatオリゴヌク
レオチド（アプタマーRNA、配列番号１）は、フォスフ
ォロアミダイト（Glen Corporation、アメリカ）を用い
て、RNA/DNA合成機（Applied Biosystemモデル394）で
合成した後、本発明者らが記載した公知の方法で脱保
護、精製した（Yamamoto, R., Murakami, K., Taira,
K.及びKumar, P.K.R., Gene Ther. Mol. Biol. 1, 451-
466 (1998)）。
【００４９】一方、本発明のモジュレートアプタマーの
5'-側に相当するオリゴヌクレオチド鎖（DA-1、DA-3、D
A-5、及びDA-7、それぞれ配列番号７、８、９、及び１
０）、及び3'-側に相当するオリゴヌクレオチド鎖（DA-
2、DA-4、DA-6、及びDA-8、それぞれ配列番号１１、１
２、１３、及び１４）をそれぞれ上記アプタマーRNAと
同様に化学合成し、脱保護した。モジュレートRNAの5'-
鎖は、T4ポリヌクレオチドキナーゼでγ-32P-ATP標識し
た。
【００５０】実施例２ゲルシフトアッセイ ゲルシフトアッセイを用いて、５種のモジュレートアプ
タマーの複合体形成について調べた。RNAオリゴヌクレ
オチドによる二重鎖形成は、先に報告した手法（Yamamo
to, R., Murakami, K., Taira, K.及びKumar, P.K.R.,
Gene Ther. Mol. Biol. 1, 451-466 (1998)）で、Tatま
たはTat由来のペプチド、CQ、RE、CP存在下で解析し
た。
【００５１】５種の二重鎖を形成する可能性のある８本
のRNAオリゴヌクレオチドを解析した（図２）。全ての
場合において、二重鎖アプタマーRNAの5'-鎖（DA-1、DA
-3、DA-5、DA-7、それぞれ配列番号７、８、９、及び１
０）をγ-32P-ATPで標識した。10μl Tat結合バッファ
ー（10 mM Tris-HCl、pH7.8、70 mM NaCl、2 mM EDTA、
0.01% Nonidet P-40）中、40 nM大腸菌tRNAの存在下
で、5'-末端標識したRNA（2 kcpm）と200 nMの標識して
いない相補鎖RNA（DA-1に対してDA-2またはDA-4、DA-3
に対してDA-4、DA-5に対してDA-6、DA-7に対してDA-8）
を混合した。
【００５２】これに20 nM CQペプチドまたは200 nM Tat
タンパク質を加え、30 ℃で１時間放置した。反応産物
は非変性ポリアクリルアミドゲル（15%）上で分離し、
タンパク質またはペプチドの存在下及び非存在下での複
合体の形成量をイメージアナライザーで測定した（BAS2
000、フジフィルム、日本）。
【００５３】結果を図３に示す。5種のオリゴヌクレオ
チド対のうち４つ、DA-1/DA-2、DA-3/DA-4、DA-5/DA-
6、DA-1/DA-4（図２及び図３中それぞれi、ii、iii、
v）は、Tatタンパク質（200 nM、レーン4）またはTat由
来ペプチドCQ（20 nM、レーン3）の存在下では高い親和
性で複合体を形成したが、Tatタンパク質の非存在下
（レーン2）では複合体を形成しなかった。特にDA-5/DA
-6オリゴヌクレオチドはTatタンパク質またはCQペプチ
ドの存在下で他のモジュレートアプタマーよりも効率よ
く複合体を形成し、Tatとの複合体は50%、CQとの複合体
は84%であった（図３iii）。
【００５４】実施例３反応速度論的解析 実施例１で得られたモジュレートアプタマーRNAオリゴ
ヌクレオチドDA-1/DA-2（図２ｉ）及びDA-5/DA-6（図２
iii）とCQペプチドとの複合体の平衡解離定数（Kd）値
を、様々な濃度のCQ（それぞれ0.1〜12.8 nM、2〜64 n
M）の存在下でゲルシフトアッセイを行って解析した。
5’−末端標識RNA（50 pM）DA-1またはDA-5とその相補
鎖RNAを10μl Tat結合バッファー中で混合し、40 nM tR
NAを非特異的競合剤として加えた。CQペプチド（0.5〜6
4 nM）を加え、30℃で１時間放置した。反応産物を非変
性ポリアクリルアミドゲル（15%）上で分離し、解析し
た。下記の結合方程式からBmaxとKdを求めた。
【００５５】Y=Bmax・X/Kd+X Y：特異的な結合、Bmax：最大の結合、X：リガンドの濃
度 Graphpad PRISMソフト（Graphpad Software Inc、アメ
リカ）を用いて、非直線退行解析を行った。
【００５６】図４及び５に示す結果から明らかなよう
に、DA-5/DA-6−CQ、DA-1/DA-2−CQ複合体のKd値はそれ
ぞれ0.5 nMと400 nMであり、DA-1/DA-2−CQ複合体のKd
値はDA-5/DA-6−CQ複合体のKd値よりも800倍高かった。
この違いは主として、DA-5/DA-6−CQ複合体における分
子の両端にある二つの付加G-C塩基対の形成に起因する
と考えられる。
【００５７】他のTatペプチドにおいても同様の結果が
得られ、モジュレートアプタマーはTatまたはCQペプチ
ドの存在下でRNA二本鎖を再構成し、そのTatタンパク質
に対する親和性や特異性はヘアピンアプタマーRNATat
（図１左）に匹敵することが示された。
【００５８】実施例４コア因子変異体との比較１ DA-5/DA-6−CQ複合体のKd値はヘアピンアプタマーRNATa
tのKd値と近似していることから、モジュレートアプタ
マー、特にDA-5/DA-6はTatタンパク質またはCQペプチド
の存在下で結合コア因子を再構成すると考えられる。ア
プタマーRNATatのTatタンパク質結合に必要な結合コア
因子は、中央の4塩基対のヘリックスとその両側の２残
基ずつを含む二つのバルジからなり、部位特異的変異実
験より両方のバルジのU残基がTatタンパク質との結合の
ために大変重要であることがわかっている。従って、ヘ
アピンアプタマーとモジュレートアプタマーオリゴヌク
レオチドDA-5/DA-6の反応速度論的解析から、RNA組成
物、DA-5とDA-6の両方の鎖がTatタンパク質と相互作用
していると推測される。
【００５９】このことを確かめるために、DA-5とDA-6の
C残基をU残基に置換した変異体（DA-5i/DA-6i(配列番号
１５／１６)、DA-5iはγ-32P-ATPで標識した）を合成し
（図６A）、実施例２と同様にして複合体形成能を調べ
た。CQペプチドを用いて行った結果を図６Bに示す。図
６Bの結果から明らかな如く、このオリゴヌクレオチド
対（DA-5i/DA-6i）は複合体を形成することはできなか
った。この結果は、ヘアピンアプタマーのTat-1への結
合に重要な官能基（例えば、U残基の３位の窒素）が、
モジュレートアプタマーDA-5/DA-6のTat-1への結合にも
重要であることを示している。
【００６０】実施例５コア因子変異体との比較２ TAR-1 RNA由来のRNAオリゴヌクレオチド、DT-1/DT-2
（図７A、DT-1は配列番号１７）についても、実施例２
と同様にしてTat-1タンパク質またはCQペプチドとの結
合をDA-5/DA-6と比較した。CQペプチドを用いて行った
結果を図７Bに示す。図７Bの結果から明らかな如く、DT
-1/DT-2は過剰のオリゴヌクレオチド（DT-2）と過剰のC
Qの存在下でも複合体を形成しなかった。
【００６１】これらの結果から、モジュレートアプタマ
ーは、TAR-1 RNAのコア因子が逆向きに並んだ繰り返し
により高い親和性を示し、配列特異的にTatタンパク質
やCQペプチドに結合することがわかった。
【００６２】実施例６標的タンパク質に対する結合特異性 プロテアーゼドメインとRNAヘリカーゼドメインを有す
るRNA結合タンパク質であるHCV NS3タンパク質の存在下
でモジュレートアプタマーオリゴヌクレオチド（DA-1/D
A-2、DA-3/DA-4、DA-5/DA-6、DA-7/DA-8、DA-1/DA-4）
とのゲルシフト結合アッセイを行った。このNS3タンパ
ク質はゲルシフト解析においてはHIV-1Tatタンパク質を
標的タンパク質とする本発明のモジュレートアプタマー
オリゴヌクレオチドとの複合体を形成しなかった（デー
タは示さない）。
【００６３】実施例７HIV-2 Tatタンパク質との親和性 HIV-1及びHIV-2のTatタンパク質は、そのコア領域（Tat
-2のシステイン36からプロリン57）に約65%の相同性を
持つことが示されている。加えて、本発明者らの研究か
らアプタマーがTAR-2 RNAよりも高い親和性でTat-2ペプ
チド（CP、66〜97アミノ酸、配列番号６）に結合するこ
とがわかっており、このことから二つのタンパク質のRN
A結合の特徴は類似していることが示された。図８で、T
at-1ペプチドCQ、REと比べると効率は落ちるが、Tat-2
ペプチドCPも効率よくモジュレートアプタマーDA-5/DA-
6の二重鎖形成を促進していることが示される。
【００６４】実施例８解析物（Tat）依存型結合オリゴヌクレオチドアッセイ 本発明のモジュレートアプタマーはTatタンパク質等の
標的タンパク質の検出用の道具としての可能性を持って
いる。図９に示すような診断アッセイを開発し、テスト
した。この解析物依存型結合オリゴヌクレオチドアッセ
イ（analyte-dependent hybridizing oligonucleotide
assay, ADHONA）では、3'-フルオレセンオリゴヌクレオ
チド（DA-9、配列番号１８）と3'-ビオチンオリゴヌク
レオチド（DA-10、配列番号１９）、ストレプトアビジ
ンコートしたマイクロタイタープレートを用いた（図９
A及びB）。
【００６５】ストレプトアビジンコートしたマイクロタ
イタープレートはフィンランドのLabsystemsから購入し
た。3’-ビオチン化オリゴヌクレオチドDA-10（5 pmo
l）をストレプトアビジンプレート（ウェル）に入れ、5
0μl Tat結合バッファー中で10分間室温で放置し、スト
レプトアビジンに結合させた後、200μl Tat結合バッフ
ァーで洗浄して結合しなかったオリゴヌクレオチドを洗
い流した。次に10 pmolの 3’-フルオレセンDA-9とTat-
1またはTatペプチド（CQまたはCP）を含む50μl Tat結
合バッファーを加え、30℃で30分間放置し、最後に200
μl Tat結合バッファーで再び洗浄して結合していない
ものを除いた。蛍光をフルオロイメージアナライザー
（FluorImager595）で解析した。488 nmの波長で励起
し、530 nmで検出した。コントロールとして、Tat-1タ
ンパク質またはTatペプチドの非存在下で同様の操作を
行った。
【００６６】結果を図１０及び１１に示す。10〜100 pm
olのCQペプチドの存在下で、蛍光強度はコントロールと
比較して500〜2500倍に上昇した（図１０）。また、Tat
-1タンパク質（200 pmol）を用い、10 pmol CQペプチド
と同等の蛍光シグナルが得られた（図１１）。上記の結
果から明らかな如く、標的タンパク質であるCQペプチド
またはTat-1タンパク質の存在下においてのみ複合体が
検出され、標的タンパク質の存在が本発明のモジュレー
トアプタマーを使用して検出された。
【００６７】実施例９ほ乳類細胞核抽出物共存下における反応 効率の良い診断道具とするためには、図９に示したアッ
セイにおいて、ほ乳類細胞核抽出物のような粗精製サン
プルの存在下でも量的な結果を示すことができなければ
ならない。粗精製サンプルはアッセイの妨げになるタン
パク質や混合物、さらに相補配列のアニーリングを促進
するタンパク質を含む可能性がある（Portman, D.S.及
びDreyfuss, G., EMBO J. 13, 213-221 (1994)）。そこ
で、上記のアッセイをDA-9/DA-10と８ユニットのHeLa核
抽出物（Promega、アメリカ）、40ユニットのRNase阻害
剤（東洋紡、日本）の存在下で同様のアッセイを行っ
た。結果を図１２に示す。HeLa核抽出物のみ存在する場
合は、モジュレートアプタマーオリゴヌクレオチドが二
重鎖を形成せずマイクロタイターウェルに残らない（40
ユニットのRNase阻害剤存在下でも少量のRNase活性が残
っている）。この結果より、本発明のアッセイが感染細
胞中等のほ乳類細胞核抽出物の存在下におけるTatタン
パク質の検出にも適していることが示された。
【００６８】実施例１０モレキュラービーコンアプタマーとしての利用 上記のように、DA-5とDA-6のようなアプタマー由来のオ
リゴヌクレオチドの安定な二重鎖構造の形成を、Tatま
たはTat由来のペプチドにより効率よく調節できたこと
から、これを利用して、本発明において、初めてモレキ
ュラービーコンアプタマーを利用したTatまたはそのペ
プチドの検出法を提供する。
【００６９】モジュレートアプタマーの配列に基づい
て、分子内に互いに相補的な６個の連続ヌクレオチド配
列を有して単独ではステム・ループ構造をとり、かつDA
-6と対となってモジュレートアプタマーを形成し得るオ
リゴヌクレオチド鎖（配列番号２０）の5' 末端にクエ
ンチャー物質[4'-(4'-ジメチル-アミノフェニルアゾ)
安息香酸（DABSYL）]を、3' 末端に蛍光物質フルオレセ
インを共有結合でつなげたモレキュラービーコンアプタ
マーを構築し、合成した（DA13(C-A)、図１３左）。具
体的には、フォスフォロアミダイト（Glen Corporatio
n、アメリカ）を用いて、RNA/DNA合成機（Applied Bios
ystemモデル394）でオリゴヌクレオチドを合成し、5'-
フルオレセン化、3'-DABSYL化した後、当該分野におい
て確立された方法で脱保護した。このDA13(C-A)とDA-6
との相補対形成を図１３中に示す。一方、蛍光物質とク
エンチャー物質間の距離が離れたときの蛍光強度の相対
的な量を評価するために、DA-13 (C-A)と完全に相補的
な配列を持つDA-13C（配列番号２１）を、フォスフォロ
アミダイト（Glen Corporation、アメリカ）を用い、RN
A/DNA合成機（Applied Biosystemモデル394）で合成し
た（図１３右）。
【００７０】モレキュラービーコンアプタマーを用いた
TatまたはTatペプチドの検出は、以下のようにして行っ
た。0.5 mlチューブ中、40 nM大腸菌tRNAを含む50 μl
Tat結合バッファー（10 mMTris-HCl、pH7.8、70 mM NaC
l、2 mM EDTA、0.01% Nonidet P-40）中で、10 nMDA-13
(C-A)と100 nM DA-6を、100 nM CQペプチドの存在下、
非存在下で混合し、30℃で30分放置した。この結果発せ
られる蛍光強度を、FluorImager (Molecular Dynamic
s）で測定した。比較として、同様の条件下で10 nM DA-
13 (C-A)のみ、または10 nM DA-13 (C-A)/100 nM DA-13
Cについても蛍光強度を測定した。
【００７１】結果を図１４及び１５に示すように、DA-1
3 (C-A)は、単独では図１３左に示すステム・ループ構
造をとっており、蛍光はほとんど検出されなかった。DA
-6、及び標的タンパク質であるCQの両方が存在する場
合、このステム・ループ構造から二重鎖構造への構造変
化が起こり、蛍光強度が顕著に増加した。DA-6オリゴま
たはCQの非存在下では、DA-13 (C-A)オリゴのこの構造
変化は起こらなかった。一方、DA-13 (C-A)オリゴヌク
レオチドとDA-13CオリゴヌクレオチドはCQ非存在下にお
いてもTat結合バッファー中で複合体を形成し、その蛍
光強度は最高値を示した。これはおそらく、DA-13 (C-
A)/DA-6複合体と比較して、DA-13 (C-A)/DA-13Cの蛍光
物質結合部がクエンチャー物質結合部から25塩基対分の
距離だけ離れていること、またDA-13 (C-A)/DA-6複合体
よりもDA-13 (C-A)/DA-13C複合体の方がより安定である
ことによると思われる。
【００７２】上記の結果から明らかなように、DA-6及び
CQ存在下で蛍光強度が顕著に増加することから、モレキ
ュラービーコン[DA-13 (C-A)/DA-6]は標的タンパク質で
あるTatまたはTatペプチドの存在により構造変化し、こ
の構造変化を蛍光測定でモニターすることによって、Ta
tを効率よく検出できることが示された。
【００７３】
【発明の効果】本発明のモジュレートアプタマーは、従
来公知の長い非モジュレートアプタマーと比較して、次
のような多くの利点がある。 1）短いRNAオリゴヌクレオチドは長いものと比べ合成が
高効率である。 2）核酸の安定化のための修飾はアプタマーの一部分で
よい。 3）コストが低い。 4）モジュレートアプタマーの適切な構造化は解析物に
より促進される。
【００７４】さらに、上記の結果より本発明に係るモジ
ュレートアプタマーによるタンパク質の検出方法は高感
度で、特異性が高く、複雑な手順の解析の核酸アレイ技
術にた易く応用できることが示されている。また、本発
明のRNAアプタマーをリボヌクレアーゼから完全に保護
するようにすれば、この方法はより良いものとなる。本
発明の方法は、適切な非モジュレート、モジュレート種
を組み合わせライブラリーから選択することにより、HI
V Tatタンパク質だけではなく、RRE（Rev response ele
ment）のモジュレートアプタマーを使用したHIV Revタ
ンパク質の検出等、他のタンパク質の検出にも一般化で
きる。
【００７５】さらに、本発明のモジュレートアプタマー
の一態様であるモレキュラービーコンアプタマーについ
ても、核酸分解酵素に対して耐性を持つように修飾する
ことも可能であり、これらの安定化モレキュラービーコ
ンアプタマーは生きた細胞中（例えばHIV感染細胞中）
でのTatタンパク質の検出に応用できる。
【００７６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of Agency of Industrial Science and Technology <120> Modulate aptamers and the method of detecting target proteins using them <130> 11900286 <160> 21 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer RNA for HIV-1 Tat protein <400> 1 cgaagcuuga ucccguuugc cggucgaucg cuucg 35 <210> 2 <211> 59 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggucucucu gguuagacca gauuugagcc ugggagcucu cuggcuaacu agggaaccc 59 <210> 3 <211> 124 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gggucgcucu gcggagaggc uggcagauug agcccuggga gguucucucc agcacuagca 60 gguagagccu gggaguuccc ugcuagacuc ucaccagcac uuggccggug cugggcagac 120 ggcc 124 <210> 4 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Phe Thr Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15 Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser 20 25 30 Leu Ser Lys Gln 35 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr 1 5 10 15 His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp 20 25 30 Pro Thr Gly Pro Lys Glu 35 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Cys Phe Leu Asn Lys Gly Leu Gly Ile Cys Tyr Glu Arg Lys Gly Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Thr Pro Lys Lys Thr Lys Thr His Pro Ser Pro Thr Pro 20 25 30 <210> 7 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 7 aagcuugauc ccga 14 <210> 8 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 8 agcuugaucc cga 13 <210> 9 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 9 gaagcuugau cccgag 16 <210> 10 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 10 agcuugaucc ca 12 <210> 11 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 11 ucggucgauc gcuu 14 <210> 12 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 12 cggucgaucg cuu 13 <210> 13 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 13 cucggucgau cgcuuc 16 <210> 14 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 14 uggucgaucg cu 12 <210> 15 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> altered 5'-half oligonucleotide <400> 15 gaagccugau cccgag 16 <210> 16 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> altered 3'-half oligonucleotide <400> 16 cucggccgau cgcuuc 16 <210> 17 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> altered 5'-half oligonucleotide <400> 17 cagauuugau c 11 <210> 18 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 18 gaagcuugau cccgaa 16 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-half oligonucleotide of modulate aptamer <400> 19 ucggucgauc gcuucauaa 19 <210> 20 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molecular beacon aptamer <400> 20 cgcgaagcuu gaucccgaga gcuua 25 <210> 21 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide complementary to molecular beacon aptamer <400> 21 gaagcucucg ggaucaagcu ucgcg 25
【００７７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：HIV-1 Tatタンパク質に対するアプタマーR
NA 配列番号７：モジュレートアプタマーの５’側オリゴヌ
クレオチド 配列番号８：モジュレートアプタマーの５’側オリゴヌ
クレオチド 配列番号９：モジュレートアプタマーの５’側オリゴヌ
クレオチド 配列番号１０：モジュレートアプタマーの５’側オリゴ
ヌクレオチド 配列番号１１：モジュレートアプタマーの３’側オリゴ
ヌクレオチド 配列番号１２：モジュレートアプタマーの３’側オリゴ
ヌクレオチド 配列番号１３：モジュレートアプタマーの３’側オリゴ
ヌクレオチド 配列番号１４：モジュレートアプタマーの３’側オリゴ
ヌクレオチド 配列番号１５：改変した５’側ヌクレオチド 配列番号１６：改変した３’側ヌクレオチド 配列番号１７：改変した５’側ヌクレオチド 配列番号１８：モジュレートアプタマーの５’側オリゴ
ヌクレオチド 配列番号１９：モジュレートアプタマーの３’側オリゴ
ヌクレオチド 配列番号２０：モレキュラービーコンアプタマー 配列番号２１：モレキュラービーコンアプタマーに相補
的なオリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】アプタマーRNATat 、TAR-1RNA（59mer）及びTA
R-2 RNA（123mer）の二次構造を示す図である。実線で
囲まれた部分はTat結合に必要なコア因子を示す。
【図２】本発明のモジュレートアプタマーRNA（i、DA-1
/DA-2；ii、DA-3/DA-4；iii、DA-5/DA-6；iv、DA-7/DA-
8、v、DA-1/DA-4）の二次構造を示す図である。
【図３】様々なモジュレートアプタマーRNAのオートラ
ジオグラムを示す図である。レーン１、放射標識5’-オ
リゴ（10 nM）のみ；レーン２、放射標識5’-オリゴ（1
0 nM）及び非標識3’-オリゴ（200 nM）；レーン３、20
nM CQ存在下での放射標識5’-オリゴ（10 nM）及び非
標識3’-オリゴ（200 nM）；レーン４、200 nM Tat-1存
在下での放射標識5’-オリゴ（10 nM）及び非標識3’-
オリゴ（200 nM）。太い矢印は、モジュレートアプタマ
ーRNA-TatまたはモジュレートアプタマーRNA-CQ複合体
の位置を示す。遊離5’-オリゴヌクレオチドの位置は細
い矢印で示す。
【図４】モジュレートアプタマーDA-1/DA-2とCQの結合
解析ゲルシフトアッセイのオートラジオグラム、及びモ
ジュレートアプタマーDA-1/DA-2-CQの飽和曲線とScatch
ardプロットを示す図である。太い矢印と細い矢印はそ
れぞれモジュレートアプタマーRNA-CQ複合体と遊離5’-
オリゴヌクレオチドの位置を示す。
【図５】モジュレートアプタマーDA-5/DA-6とCQの結合
解析ゲルシフトアッセイのオートラジオグラム、及びモ
ジュレートアプタマーDA-5/DA-6-CQの飽和曲線とScatch
ardプロットを示す図である。太い矢印と細い矢印はそ
れぞれモジュレートアプタマーRNA-CQ複合体と遊離5’-
オリゴヌクレオチドの位置を示す。
【図６】不活性型モジュレートアプタマー（DA-5i/DA-6
i）の二次構造（A)及びこれとCQペプチドとの結合のゲ
ルシフトアッセイによる解析のオートラジオグラム
（B）を示す図である。レーン１、放射標識5’-オリゴ
（10 nM）；レーン２、放射標識5’-オリゴ（10 nM）
と、非標識3’-オリゴ（200 nM）；レーン３、20 nM CQ
存在下での放射標識5’-オリゴ（10 nM）と、非標識3’
-オリゴ（200 nM）。
【図７】二重鎖TAR RNA（ii、DT-1/DT-2）の二次構造及
びこれとCQペプチドとの結合のゲルシフトアッセイによ
る解析のオートラジオグラム（B）を示す図である。レ
ーン１、放射標識5’-オリゴ（10 nM）；レーン２、放
射標識5’-オリゴ（10 nM）と、非標識3’-オリゴ（200
nM）；レーン３、20 nM CQ存在下での放射標識5’-オ
リゴ（10 nM）と、非標識3’-オリゴ（200 nM）。
【図８】モジュレートアプタマーDA-5/DA-6とTat由来ペ
プチド（CQ、RE、CP）との結合のゲルシフトアッセイの
オートラジオグラムを示す図である。太い矢印と細い矢
印はそれぞれモジュレートアプタマーRNA-CQ複合体と遊
離5’-オリゴヌクレオチドの位置を示す。
【図９】解析物依存型結合オリゴヌクレオチドアッセイ
（ADHONA）を示す図である。ADHONAに用いたモジュレー
トアプタマーDA-9/DA-10の二次構造（A）及びADHONAの
機構(B)
【図１０】ADHONAのCQペプチド濃度依存性：CQペプチド
非存在下（対照）またはCQペプチド存在下（10、50、10
0 pmol）での蛍光シグナル強度を示す図である。結果は
３回の実験の平均値（±標準偏差）を示す。
【図１１】Tat-1ペプチドを用いたADHONAの結果を示す
図である。Tat-1またはCQペプチド非存在下での蛍光シ
グナル強度（対照）；10 pmol CQペプチド存在下での蛍
光シグナル強度（１）；200 pmol Tat-1存在下での蛍光
シグナル強度（２）。結果は３回の実験の平均値（±標
準偏差）を示す。
【図１２】HeLa核抽出物の共存によるADHONAに対する影
響を示す図である。Tat-1またはCQペプチド非存在下で
の蛍光シグナル強度（対照）；8ユニットのHeLa核抽出
物存在下での蛍光シグナル強度（１）；10 pmol CQ存在
下での蛍光シグナル強度（２）。結果は３回の実験の平
均値（±標準偏差）を示す。
【図１３】５’末端にフルオレセイン、３’末端にDABC
YLを結合させたステム・ループ構造のオリゴヌクレオチ
ド鎖DA13(C-A）の二次構造、本発明のモジュレートアプ
タマーRNAであるDA13(C-A)/DA6の二次構造、及びDA13(C
-A）と完全に相補的なDA13Cとの塩基対形成を示す図で
ある。
【図１４】モレキュラービーコンアプタマーを用いたCQ
の蛍光による検出を示す図、及びその際のオリゴヌクレ
オチド鎖の二次構造の模式図である。10nM DA13(C-A）
のみ（対照）；10nM DA13(C-A)＋100nM DA6（CQ-）；10
nM DA13(C-A)＋100nM DA6＋100nM CQペプチド（CQ+）；
10nM DA13(C-A)＋100nM DA13C（DA13C）。
【図１５】図１４と同じ条件のサンプルCQ-、CQ+及びDA
13Cの蛍光強度をFluorImager（Molecular Dynamics）で
測定した図である。結果は３回の実験の平均値（±標準
偏差）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (56)参考文献 特開 平11−127864（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−500012（ＪＰ，Ａ) 特表 平10−509053（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−501943（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−500481（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，1993，Ｖｏｌ．137，Ｎｏ. １，ｐ．33−39 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍ ｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，1999年, Ｖｏｌ．42，ｐ．269−270 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 3/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の二次構造（I）： 【化１】 （構造中、N1a及びN1bは１〜３対の相補的塩基対を形成
    し得る核酸塩基であり、N2a及びN2bは相補的塩基対形成
    が可能な１対の核酸塩基であり、N3及びN4はそれぞれ独
    立に１または2個の核酸塩基であり、N5a及びN5bは相補
    的塩基対形成が可能な１対の核酸塩基であり、N6a及びN
    6bは１〜３対の相補的塩基対を形成し得る核酸塩基であ
    り、そして実線は核酸塩基間の水素結合を表す。但し、
    N1a及びN1b、及びN6a及びN6bがいずれも１対の相補対を
    形成する場合には少なくとも一方の相補対がG-CまたはC
    -Gである。）によって表されるヌクレオチド配列からな
    る相補的な二本のオリゴヌクレオチド鎖から構成される
    モジュレートアプタマーの一方のオリゴヌクレオチド鎖
    を放射性又は非放射性標識し、標的タンパク質であるHI
    V-1 Tatタンパク質及び／またはその断片の存在下にお
    ける複合体の形成を指標として該標的タンパク質の存在
    及び／または量を検出することを特徴とする、標的タン
    パク質の検出方法。
  2. 【請求項２】 モジュレートアプタマーが下記の二次構
    造（II）によって表されるヌクレオチド配列からなるも
    のである、請求項１に記載の検出方法。 【化２】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
  3. 【請求項３】 下記の二次構造（I）： 【化３】 （構造中、N1a及びN1bは１〜６対の相補的塩基対を形成
    し得る核酸塩基であり、N2a及びN2bは相補的塩基対形成
    が可能な１対の核酸塩基であり、N3及びN4はそれぞれ独
    立に１または２個の核酸塩基であり、N5a及びN5bは相補
    的塩基対形成が可能な１対の核酸塩基であり、N6a及びN
    6bは１〜９対の相補的塩基対を形成し得る核酸塩基であ
    り、そして実線は核酸塩基間の水素結合を表す。但し、
    N1a及びN1b、及びN6a及びN6bがいずれも１対の相補対を
    形成する場合には少なくとも一方の相補対がG-CまたはC
    -Gである。）によって表されるヌクレオチド配列からな
    る相補的な二本のオリゴヌクレオチド鎖から構成され、
    一方のオリゴヌクレオチド鎖が分子内に互いに相補的な
    ４〜６個の連続ヌクレオチド配列を有し、該一方のオリ
    ゴヌクレオチド鎖が標的タンパク質の非存在下でステム
    ・ループ構造であるモジュレートアプタマーの一方のオ
    リゴヌクレオチド鎖を放射性又は非放射性標識し、標的
    タンパク質であるHIV-1Tatタンパク質及び／またはその
    断片の存在下における複合体の形成を指標として該標的
    タンパク質の存在及び／または量を検出することを特徴
    とする、標的タンパク質の検出方法。
  4. 【請求項４】 モジュレートアプタマーを構成する一方
    のオリゴヌクレオチド鎖が下記の二次構造（III）によ
    って表されるヌクレオチド配列を有することを特徴とす
    る、請求項３に記載の検出方法。 【化４】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
  5. 【請求項５】 上記ステム・ループ構造のオリゴヌクレ
    オチド鎖の５’または３’末端に蛍光物質を、３’また
    は５’末端に該蛍光物質に対するクエンチャー物質を結
    合させることを特徴とする、請求項３または４に記載の
    検出方法。
  6. 【請求項６】 モジュレートアプタマーの一方のオリゴ
    ヌクレオチド鎖を支持体上に固定化し、放射性又は非放
    射性標識した他方のオリゴヌクレオチド鎖及び標的タン
    パク質の添加によって形成した複合体を指標として標的
    タンパク質の存在及び／または量を検出することを特徴
    とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方
    法。
  7. 【請求項７】 前記固定化が、アビジンまたはストレプ
    トアビジン及びビオチンの特異的結合によるものであ
    る、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記非放射性標識がフルオレセインであ
    り、その蛍光シグナルによって前記複合体を検出するこ
    とを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 下記の二次構造（II）： 【化５】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）によ
    って表されるヌクレオチド配列からなる相補的な二本の
    オリゴヌクレオチド鎖から構成されるモジュレートアプ
    タマーであって、HIV-1 Tatタンパク質及び／またはそ
    の断片を標的タンパク質とし、該標的タンパク質の存在
    下においてのみ複合体を形成し、安定化することを特徴
    とするモジュレートアプタマー。
  10. 【請求項１０】 下記の二次構造（I）： 【化６】 （構造中、N1a及びN1bは１〜６対の相補的塩基対を形成
    し得る核酸塩基であり、N2a及びN2bは相補的塩基対形成
    が可能な1対の核酸塩基であり、N3及びN4はそれぞれ独
    立に１または２個の核酸塩基であり、N5a及びN5bは相補
    的塩基対形成が可能な１対の核酸塩基であり、N6a及びN
    6bは１〜９対の相補的塩基対を形成し得る核酸塩基であ
    り、そして実線は核酸塩基間の水素結合を表す。但し、
    N1a及びN1b、及びN6a及びN6bがいずれも１対の相補対を
    形成する場合には少なくとも一方の相補対がG-CまたはC
    -Gである。）によって表されるヌクレオチド配列からな
    る相補的な二本のオリゴヌクレオチド鎖から構成され、
    一方のオリゴヌクレオチド鎖が分子内に互いに相補的な
    ４〜６個の連続ヌクレオチド配列を有し、該一方のオリ
    ゴヌクレオチド鎖が標的タンパク質の非存在下でステム
    ・ループ構造である、HIV-1 Tatタンパク質及び／また
    はその断片を標的タンパク質とするモジュレートアプタ
    マー。
  11. 【請求項１１】 モジュレートアプタマーを構成する一
    方のオリゴヌクレオチド鎖が下記の二次構造（III）に
    よって表されるヌクレオチド配列を有することを特徴と
    する、請求項１０に記載のモジュレートアプタマー。 【化７】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
  12. 【請求項１２】 下記(a)〜(c)； (a)支持体、 (b)支持体上に固定化される請求項９〜１１のいずれか
    １項に記載のモジュレートアプタマーの一方のオリゴヌ
    クレオチド鎖、 (c)標的タンパク質の存在下で複合体を形成する、放射
    性または非放射性標識された他方のオリゴヌクレオチド
    鎖、を含んでなることを特徴とする、標的タンパク質の
    検出キット。
  13. 【請求項１３】 請求項９〜１１のいずれか１項に記載
    のモジュレートアプタマーの5'-鎖または3'-鎖を前記一
    方のオリゴヌクレオチド鎖(b)とし、3'-鎖または5'-鎖
    を前記他方のオリゴヌクレオチド鎖(c)とすることを特
    徴とする、請求項１２に記載のキット。
  14. 【請求項１４】 請求項１０または１１に記載のステム
    ・ループ構造のオリゴヌクレオチド鎖を上記標識された
    オリゴヌクレオチド鎖として使用する、請求項１２また
    は１３に記載のキット。
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