JP5543052B2 - アプタマーを用いた標的分子の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、特定のタンパク質に結合するアプタマーと、標的分子と結合するプローブとの組み合わせを用いて、特定のタンパク質の特性を指標として、標的分子を検出する方法に関する。

目的の塩基配列を検出する場合、それと相補的な塩基配列を有するＤＮＡを合成し、これをプローブとして標的とする核酸とのハイブリダイゼーションを検出することが一般的である。このハイブリダイゼーションは、一般に蛍光物質や放射性同位体を結合させたプローブ、すなわち蛍光物質や放射性同位体で標識したプローブを用い、標的塩基配列を含むＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、その結果生じるプローブの標識物質が発する信号、すなわち蛍光強度や放射活性を測定することによって検出する。また、目的のタンパク質や小分子を検出する場合、これらと結合しうる物質、例えば、抗体、リガンド、レセプター等を蛍光物質、放射性同位体、酵素等により標識して、蛍光強度、放射活性、酵素活性を測定することによって検出する。
これらの方法の改良により、現在ｎＭレベルの濃度の標的分子の検出が可能となっているが、当該技術分野においては、さらに高感度の検出方法の開発が求められている。また、蛍光を測定する場合は蛍光光度計や蛍光顕微鏡、放射活牲を測定する場合はシンチレーションカウンターが必要であり、従来法による標的分子の検出には高価な大型機器を必要とする。さらに、従来法の多くは、標的と結合した標識物質と結合していない標識物質との分離（Ｂ／Ｆ分離）を必要とするため、操作が複雑であった。このため、特殊な分析機器やＢ／Ｆ分離を必要としない、より簡便な検出方法の開発が求められている。
したがって、本発明の目的は、感度が高く簡便な、新たな標的分子検出方法を提供することである。

本発明者らは、特定のタンパク質に結合しその特性を変化させるアプタマーと、標的と結合しうるプローブとを組み合わせた複合体を用いることにより、タンパク質の特性の変化を指標として標的を検出しうることを見いだして、本発明を完成させた。
本発明は、標的分子の存在を検出するためのアプタマー・プローブ複合体を提供する。本発明のアプタマー・プローブ複合体は、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、標的分子と結合することができるプローブ部分とを含み、プローブ部分が標的分子と結合したときにアプタマー部分と指示タンパク質との結合様式が変化するように構成されていることを特徴とする。
本発明のアプタマー・プローブ複合体の１つの好ましい態様においては、標的分子は核酸であり、アプタマー・プローブ複合体のプローブ部分はこの核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドである。また別の好ましい態様においては、標的分子はタンパク質または小分子であり、アプタマー・プローブ複合体のプローブ部分はこのタンパク質または小分子と結合しうるアプタマーである。
また好ましくは、指示タンパク質は酵素であり、特に好ましくはトロンビンである。
本発明の１つの好ましい態様においては、プローブ部分が標的分子に結合することにより、アプタマー部分と指示タンパク質との結合が強まる。また別の好ましい態様においては、プローブ部分が標的分子に結合することにより、アプタマー部分と指示タンパク質との結合が弱まる。
本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いて検出しうる標的分子の好ましい例は、サルモネラ菌およびＳＡＲＳウイルスの遺伝子またはその一部である。
別の観点においては、本発明は、上述の本発明のアプタマー・プローブ複合体を含む、標的分子の存在を検出するためのキットを提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いて試料中の標的分子の存在を検出する方法を提供する。この方法は、標的分子の存在または量について調べるべき試料と、本発明のアプタマー・プローブ複合体とを接触させ、指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出することを含む。指示タンパク質が酵素である場合、酵素活性の変化は分光学的手法または電気化学的手法により測定することができる。

図１は、プローブ部分と標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによりアプタマー部分と指示タンパク質との結合が強まるアプタマー・プローブ複合体の例を示す。
図２は、図１のアプタマー・プローブ複合体を用いる標的ＤＮＡの検出方法を示す。
図３は、図１のアプタマー・プローブ複合体を用いる標的ＤＮＡの検出の結果を示す。
図４は、プローブ部分と標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによりアプタマー部分と指示タンパク質との結合が弱まるアプタマー・プローブ複合体の例を示す。
図５は、図４のアプタマー・プローブ複合体を用いる標的ＤＮＡの検出方法を示す。
図６は、図４のアプタマー・プローブ複合体を用いる標的ＤＮＡの検出の結果を示す。
図７は、プローブ部分と標的分子との結合によりアプタマー部分と指示タンパク質との結合が強まるアプタマー・プローブ複合体の例を示す。
図８は、図７のアプタマー・プローブ複合体を用いる標的分子の検出方法を示す。
図９は、図７のアプタマー・プローブ複合体を用いる標的分子の検出の結果を示す。
図１０は、本発明のアプタマー・プローブ複合体の別の態様を用いる標的ＤＮＡの検出の結果を示す。
発明の詳細な説明
アプタマー・プローブ複合体の構造
本発明のアプタマー・プローブ複合体は、アプタマー部分とプローブ部分から構成されるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ＰＮＡ等の核酸模倣体であってもよい。また、ポリヌクレオチドは、塩基、糖、および／またはヌクレオチド間結合に種々の修飾を含んでいてもよい。
アプタマー部分とは、指示タンパク質に対してアプタマーとして作用し、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができる領域である。本明細書において用いる場合、「アプタマー」とは、特定の分子に結合する核酸リガンドを表す。アプタマーは、１９９０年にＧｏｌｄらによって初めてその概念が報告されており、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法を用いて獲得される（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．ａｎｄ Ｇｏｌｄ Ｌ．（１９９０）．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）。これまでにアプタマーが得られているターゲットの例としては、以下のものが挙げられる：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒ１７コートタンパク質、ＭＳ２コートタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１タンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｈｏタンパク質、Ｅ．ｅｏｌｉ ３０Ｓ粒子＋Ｓ１、Ｅ．ｃｏｌｉ３０Ｓ粒子−Ｓ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｅｔＪタンパク質、ＱＢレプリカーゼ、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパク質、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質、ＨＩＶ−１ ｉｎｔタンパク質、ＨＩＶ−１リバーストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ、ＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、ＦＩＶリバーストランスクリプターゼ、ＨＴＬＶ−１ ｒｅｘペプチド、Ｕ１Ａ、Ｕ２ＡＦ、トロンビン、エラスターゼ、ｓＰＬＡ２、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、抗ｇｐ−１０抗体、ＳＬＥモノクローナル抗体、抗インスリンレセプター、ＩｇＥ、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、トロンビン、テオフィリン、ＦＭＮ、ＡＭＰ、アルギニン、シトルリン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、ヘマトポルフィリン、キチン、コール酸（Ｈｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ａｄａｐｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｐｔａｍｅｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，８２０−８２５）。また、アプタマーの選択および応用に関するさらに詳細な説明は、Ｏｓｂｏｒｎｅ ＳＥ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．Ａｐｒ １；９７（２）：３４９−３７０に見いだすことができる。
プローブ部分とは、検出すべき標的分子と結合することができる領域である。標的分子が核酸である場合、プローブ部分はこの核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドである。例えば、本発明の複合体は、アプタマー部分の３’側にプローブ部分が連結され、プローブ部分と標的分子とがハイブリダイズしたときにアプタマー部分と指示タンパク質との結合が阻害されるように設計することができる。あるいは、標的分子の非存在下においてプローブ部分がアプタマー部分と指示タンパク質との結合を阻害し、プローブ部分と標的分子とがハイブリダイズしたときに、プローブ部分による阻害作用が軽減され、その結果アプタマー部分と指示タンパク質との結合が強まるように設計してもよい。また、本発明の複合体は、アプタマー部分の配列中にプローブ部分の配列が挿入され、プローブ部分と標的分子とがハイブリダイズしたときにアプタマー部分と指示タンパク質との結合が阻害されるように設計することができる。さらに、本発明の複合体は、アプタマー部分の５’側と３’側の両方にプローブ部分が存在するように設計し、アプタマー部分の５’側に標的塩基配列と相補的な塩基配列の一部を連結し、３’側に相補的な塩基配列の残りの部分を連結してもよい。
標的分子がタンパク質および小分子である場合、プローブ部分としてはこのタンパク質または小分子と結合しうるアプタマーを用いることができる。なお、ここでいうアプタマーは、指示タンパク質と結合するアプタマー部分としてではなく、本発明のアプタマー・プローブ複合体のプローブ部分として標的分子と結合するよう作用する。すなわち、この態様においては、本発明の複合体はターゲットの異なる２つのアプタマー配列を有する。
アプタマー部分とプローブ部分は共有結合により連結されている。好ましくは、アプタマー部分とプローブ部分は、１本の直線状または環状のポリヌクレオチドを形成している。本発明のアプタマー・プローブ複合体は、ＤＮＡ合成機で固相合成することにより容易に製造することができる。
指示タンパク質とは、その特性の変化により検出可能なシグナルを生ずるタンパク質である。指示タンパク質としては、例えば、酵素、蛍光タンパク質、レセプター、特定のレセプターと結合するリガンド等を用いることができる。好ましい指示タンパク質は酵素である。トロンビンは、活性の測定が容易であること、および活性を阻害するアプタマーが複数報告されていることから、本発明において指示タンパク質として用いるのに特に適している。さらに、ＳＥＬＥＸにより事実上あらゆる酵素に対してそれに結合するアプタマーを取得することが可能であるため、任意の酵素についてその活性を阻害するアプタマーを取得し、その配列に基づいて本発明のアプタマー・プローブ複合体を設計することにより、その酵素を指示タンパク質として用いることができる。
本発明のアプタマー・プローブ複合体は、プローブ部分が標的分子と結合したときにアプタマー部分と指示タンパク質との結合様式が変化し、このことにより、指示タンパク質の特性が変化することを特徴とする。この結合様式の変化は、アプタマー・プローブ複合体のアプタマー部分の構造の変化によるか、またはプローブ部分の構造による立体障害によるものと考えられる。しかし、本発明は結合様式の変化のメカニズムにより限定されるものではない。
本発明の１つの好ましい態様においては、プローブ部分が標的分子に結合することにより、アプタマー部分と指示タンパク質との結合が強まる。指示タンパク質が酵素である場合には、アプタマー部分と酵素との結合が強まることにより、アプタマー部分による酵素活性の阻害が増加し、その結果酵素活性が低下する。また別の好ましい態様においては、プローブ部分が標的分子に結合することにより、アプタマー部分と指示タンパク質との結合が弱まる。指示タンパク質が酵素である場合には、アプタマー部分と酵素との結合が弱まることにより、アプタマー部分による酵素活性の阻害が軽減され、その結果酵素活性が高まる。すなわち、いずれの態様においても、指示タンパク質である酵素の活性を測定することによって、標的分子の存在を容易に検出することができる。
本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いて検出することのできる標的分子の１つの例は核酸である。この場合、アプタマー・プローブ複合体のプローブ部分はこの核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドである。標的核酸としては、検出が望まれるいずれの核酸を用いてもよく、例えば、細菌やウイルスの遺伝子、例えば、サルモネラ菌またはＳＡＲＳウイルスの遺伝子またはその一部、および細胞または組織中のＤＮＡおよびＲＮＡ、合成または単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ等が挙げられる。また、本発明のアプタマー・プローブ複合体は、ゲノム中の一塩基変異の検出にも有用である。
本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いて検出することのできる標的分子の別の例はタンパク質および小分子である。この場合、アプタマー・プローブ複合体のプローブ部分としては、このタンパク質または小分子と結合しうるアプタマーを用いることができる。標的タンパク質または小分子としては、検出が望まれるいずれのタンパク質または小分子を用いてもよい。種々のタンパク質および小分子について、それに特異的なアプタマーが同定されており、さらにＳＥＬＥＸにより事実上あらゆる分子に対してそれに結合するアプタマーを取得することが可能である。したがって、特異的なアプタマーを取得することができる限り、任意のタンパク質および小分子を本発明において標的分子として用いることができる。
標的分子の検出方法
別の観点においては、本発明は、上述の本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いて試料中の標的分子の存在を検出する方法を提供する。この方法は、標的分子の存在について調べるべき試料と本発明のアプタマー・プローブ複合体とを接触させ、指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出することを含む。
指示タンパク質が酵素である場合には、指示タンパク質の特性の変化は酵素活性の変化として容易に測定することができ、このことにより標的分子を検出することができる。酵素活性の変化は、分光学的手法または電気化学的手法により測定することができる。例えば、酵素としてトロンビンを用いる場合、基質としてＮ−ベンゾイル−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドを用い、遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度（４１０ｎｍ）を測定することによってトロンビンの活性を測定する。あるいは、血漿に終濃度が一定になるようにフィブリノーゲンとトロンビンを加え、トロンビンによるフィブリノーゲンの切断によって開始される血液凝固を測定することによってトロンビンの活性を測定することもできる。血液凝固の測定は様々な方法があり、分光学的方法による屈折率の変化の測定、血漿に金属球を添加し血液凝固に伴うその運動の停止を観察する方法、水晶振動子、表面プラズモン共鳴、干渉増幅反射法（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ；ＩＥＲ）などによる測定も可能である。また、酵素としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の、検出用の標識として用いられるいずれの酵素も用いることができる。
酵素反応の検出法としては、従来からよく使われている比色法など様々な方法が利用できるが、好ましくは測定系を単純化する事が可能で、微小化、集積化、量産化が可能な電気化学的測定法である。
指示タンパク質としてレセプターを用いる場合には、レセプターとそれに対するリガンドとの結合または解離の結果として放出される物質を分光学的方法で検出することができる。また、指示タンパク質として蛍光タンパク質を用いる場合には、その蛍光特性を観察すればよい。
本発明にしたがえば、標的分子と本発明のアプタマー・プローブ複合体とを混合することにより、標的分子とプローブ部分との結合を直接観察することができ、従来の方法で必要であった未結合成分の分離の操作を必要としない。したがって、極めて高感度かつ簡単な標的分子の検出を実現することができる。
標的分子検出用キット
別の観点においては、本発明は、上述の本発明のアプタマー・プローブ複合体を含む、標的分子の存在を検出するためのキットを提供する。キットは、本発明のアプタマー・プローブ複合体に加えて、指示タンパク質、および指示タンパク質の特性を測定するための各種の試薬および溶液、ならびに使用の指針を含むことができる。本発明のアプタマー・プローブ複合体は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
標的分子検出用センサー
本発明のアプタマー・プローブ複合体は、標的分子検出用センサーの認識素子として用いるのに適している。標的分子検出用センサーでは、指示タンパク質の特性の変化を測定するために、電極や半導体チップに本発明のアプタマー・プローブ複合体を装着して用いることができる。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のアプタマー・プローブ複合体を固定化する。固定化方法としては、アビジン−ビオチンの結合を利用する方法、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーで包括固定する方法などがあり、その場合フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。例えば、指示タンパク質として酵素を用いる場合、アビジン−ビオチンの結合を用いてアプタマー・プローブ複合体をカーボン電極上に固定化した後、測定系に酵素を加え、次に試料を加えて酵素反応生成物を電気化学に測定することにより、試料中の標的分子の存在を検出することができる。
一例として、標的分子の検出は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極としてアプタマー・プローブ複合体を固定化した電極（例えばカーボン電極）を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。被検試料を添加してアプタマー・プローブ複合体と接触させた後、指示タンパク質である酵素を添加する。一定時間インキュベートした後、酵素の基質を添加し電極に一定の電圧を印加して、酵素反応生成物と電極との反応による電流の増加を測定する。標準濃度の標的分子溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中の標的分子の濃度を計算することができる。
アプタマー・プローブ複合体の構造の具体例
以下、図面を参照して本発明の種々の態様を説明する。これらの図に示されるアプタマー・プローブ複合体の構造は、単に本発明の原理および概念を説明するための模式図であって、本発明の複合体の立体構造、指示タンパク質との結合様式、およびそれらの変化のしかたを限定するものではない。
図１は、プローブ部分と標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより指示タンパク質との結合が強まるアプタマー・プローブ複合体の例を示す。このアプタマー・プローブ複合体は、アプタマー部分としてトロンビンアプタマーの配列を有し、その３’側にプローブ部分としてサルモネラｉｎｖＡの遺伝子の一部に相補的な配列を有するＤＮＡである（図１Ａ）。指示タンパク質はトロンビンであり、アプタマー部分はトロンビンに結合してその酵素活性を阻害する機能を有する。標的分子はサルモネラｉｎｖＡの遺伝子である。サルモネラｉｎｖＡ遺伝子が存在しない場合には、プローブ部分の配列の存在のために、アプタマー部分はトロンビンと強く結合することができず、トロンビンは酵素活性を示す（図１Ｂ）。サルモネラｉｎｖＡ遺伝子が存在すると、プローブ部分の配列はサルモネラｉｎｖＡの遺伝子とハイブリダイズして安定な二本鎖ＤＮＡを形成し、アプタマー部分とトロンビンとの結合が強まるため、トロンビンの酵素活性が阻害される（図１Ｃ）。実施例１に、図１のアプタマー・プローブ複合体を用いて、標的分子の存在下または非存在下におけるトロンビンの活性を測定した実験の方法および結果を示す。
図４は、プローブ部分と標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより指示タンパク質との結合が弱まるアプタマー・プローブ複合体の例を示す。このアプタマー・プローブ複合体は、アプタマー部分としてトロンビンアプタマーの配列を有し、その配列中にプローブ部分としてＳＡＲＳウイルス遺伝子の一部に相補的な配列を含むステム・ループ構造が挿入されている（図４Ｂ）。標的分子はＳＡＲＳウイルスの遺伝子である。ＳＡＲＳウイルス遺伝子が存在しない場合には、プローブ部分が安定なステム・ループ構造をとるため、アプタマー部分がトロンビンと結合して、トロンビンの酵素活性が阻害される。ＳＡＲＳウイルス遺伝子が存在すると、プローブ部分がＳＡＲＳウイルス遺伝子とハイブリダイズしてステム・ループ構造が破壊され、アプタマー部分とトロンビンとの結合に影響を及ぼすため、アプタマー部分はトロンビンと強く結合することができず、トロンビンは酵素活性を示す（図４Ｃ）。実施例２に、図４のアプタマー・プローブ複合体を用いて、標的分子の存在下または非存在下におけるトロンビンの活性を測定した実験の方法および結果を示す。
図７は、プローブ部分と標的小分子との結合により指示タンパク質との結合が強まるアプタマー・プローブ複合体の例を示す。このアプタマー・プローブ複合体は、アプタマー部分としてトロンビンアプタマーの配列を有し、その配列中にプローブ部分としてアデノシンと結合しうるＡＴＰアプタマーの配列が挿入されている（図７Ｂ）。ここでは、ＡＴＰアプタマーは、指示タンパク質と結合するアプタマー部分としてではなく、本発明のアプタマー・プローブ複合体のプローブ部分として標的分子と結合するよう作用する点に注意すべきである。標的分子はアデノシンである。アデノシンが存在しない場合には、プローブ部分の配列の存在のために、アプタマー部分はトロンビンと強く結合することができず、トロンビンは酵素活性を示す（図７Ｂ）。アデノシンが存在すると、プローブ部分のＡＴＰアプタマー配列がアデノシンと結合して、安定な複合体を形成する。このため、アプタマー部分とトロンビンとの結合が強まり、トロンビンの酵素活性が阻害される（図７Ｃ）。実施例３に、図７のアプタマー・プローブ複合体を用いて、標的分子の存在下または非存在下におけるトロンビンの活性を測定した実験の方法および結果を示す。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−４３１３２３号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

以下、サルモネラ菌の侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）遺伝子、ＳＡＲＳウイルス遺伝子、およびアデノシンの検出を例として実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
既知のトロンビンアプタマーの配列に基づいて、トロンビン−ｉｎｖＡアプタマーを合成した。標的ＤＮＡとしてはサルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子の配列を用いた。このアプタマー・プローブ複合体の構造の概略は図１に示される。

終濃度１μＭの２７ｍｅｒ ｉｎｖＡまたは２７ｍｅｒ対照ＤＮＡの存在下および非存在下において、終濃度１μＭのトロンビン−ｉｎｖＡアプタマーを終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ＝８．０中で９５度で３分間加熱し、９５度から室温まで３０分かけてゆっくり冷却した。その後、終濃度１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液（和光純薬工業）および、終濃度５４ｎＭトロンビン（和光純薬工業）にトロンビン−ｉｎｖＡアプタマーを混ぜた溶液を３７度で５分間インキュベートした。５分後フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、溶液が固まる時間を自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定した。なおバッファーの終濃度は５０ｍＭ Ｔｈｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，７５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ＝８．０である。
結果を図２に示す。トロンビン−ｉｎｖＡアプタマーを加えた場合の凝固時間はトロンビンアプタマーを加えた場合と比較すると短くなった。すなわち、トロンビンアプタマーの３‘端に２７ｍｅｒのｉｎｖＡ配列の相補的塩基配列を付加するとアプタマーによるトロンビンの阻害能が低下することが示唆された。トロンビン−ｉｎｖＡアプタマーに対照ＤＮＡを加えた場合は凝固時間はほとんど変わらないのに対して、２７ｍｅｒ ｉｎｖＡ配列を加えると凝固時間の延長が観察された。このことは、２７ｍｅｒ ｉｎｖＡ配列が存在すると、アプタマーによるトロンビンの阻害能が回復することを示す。
次に、トロンビン−ｉｎｖＡアプタマーによる標的ＤＮＡの定量を行った。終濃度０．１〜５μＭの２７ｍｅｒ ｉｎｖＡまたは２７ｍｅｒ対照ＤＮＡの存在下および非存在下において、終濃度１μＭのトロンビン−ｉｎｖＡアプタマーを終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ＝８．０中で、９５度で３分間加熱し、９５度から室温まで３０分かけてゆっくり冷却した。その後、終濃度１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液（和光純薬工業）および、終濃度５４ｎＭトロンビン（和光純薬工業）とトロンビン−ｉｎｖＡアプタマーを混ぜた溶液を３７度で５分間インキュベートし、フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、溶液が固まる時間を自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定した。なおバッファーの終濃度は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，７５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ＝８．０である。
結果を図３に示す。トロンビン−ｉｎｖＡアプタマーに対照ＤＮＡを加えても凝固時間は変わらないのに対し、標的ＤＮＡを加えると終濃度１μＭまでは標的ＤＮＡの濃度に依存して凝固時間が上昇し、それ以上では飽和していた。すなわち、終濃度１μＭのトロンビン−ｉｎｖＡアプタマーを用いて、トロンビンの酵素活性を測定することにより、１００ｎＭ以上の標的ＤＮＡを検出できることが示された。
［実施例２］
以下の配列を有するトロンビン−ＳＡＲＳアプタマーを合成した。標的ＤＮＡとしてはＳＡＲＳウイルス遺伝子の配列を用いた。このアプタマー・プローブ複合体の構造の概略は図４および図５Ａに示される。

終濃度１μＭの１５ｍｅｒ標的ＤＮＡまたは１５ｍｅｒ対照ＤＮＡの存在下および非存在下において、終濃度１μＭのトロンビン−ＳＡＲＳアプタマーを終濃度５０ｍＭのＴｈｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ＝８．０のバッファー中で、９５度で３分間加熱し、９５度から室温まで３０分かけてゆっくり冷却した。その後、終濃度１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液および、濃度５４ｎＭトロンビン（和光純薬工業）とトロンビン−ＳＡＲＳアプタマーを混ぜた溶液を３７度で５分間インキュベートし、フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、溶液が固まる時間を自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定した。なおバッファーの終濃度は５０ｍＭ Ｔｈｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，７５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ＝８．０である。
結果を図５Ｂに示す。トロンビン−ＳＡＲＳアプタマーに１５ｍｅｒ対照ＤＮＡを加えても凝固時間は変わらないのに対し、１５ｍｅｒ標的ＤＮＡを加えると凝固時間が短くなった。すなわち、標的ＤＮＡ存在下においてトロンビン−ＳＡＲＳアプタマーによるトロンビンの阻害能が低下することが示唆された。
次に、トロンビン−ＳＡＲＳアプタマーによる標的ＤＮＡの定量を行った。終濃度０．１〜５μＭの１５ｍｅｒ標的ＤＮＡまたは１５ｍｅｒ対照ＤＮＡの存在下および非存在下において、終濃度１μＭのトロンビン−ＳＡＲＳアプタマーを終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ＝８．０中で、９５度で３分間加熱し、９５度から室温まで３０分かけてゆっくり冷却した。その後、終濃度１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液（和光純薬工業）および、濃度５４ｎＭトロンビン（和光純薬工業）とトロンビン−ＳＡＲＳアプタマーを混ぜた溶液を３７度で５分間インキュベートした。５分後フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、溶液が固まる時間を自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定した。なおバッファーの終濃度は５０ｍＭ Ｔｈｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，７５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ＝８．０である。
結果を図６に示す。トロンビン−ＳＡＲＳアプタマーに１５ｍｅｒ対照ＤＮＡを加えても凝固時間は変わらないのに対し、標的ＤＮＡを加えると終濃度１μＭまでは標的ＤＮＡの濃度に依存して、凝固時間が減少し、それ以上では飽和していた。すなわち、終濃度１μＭのトロンビン−ＳＡＲＳアプタマーを用いて、トロンビンの酵素活性を測定することにより、２００ｎＭ以上の標的ＤＮＡを検出できることが示された。
［実施例３］
以下の配列を有するトロンビン−ＡＴＰアプタマーを合成した。標的分子としてはアデノシンを用いた。このアプタマー・プローブ複合体の構造の概略は図７に示される。

終濃度１μＭのトロンビン−ＡＴＰアプタマーを終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ｐＨ＝８．０中で、９５度で３分間加熱し、９５度から室温まで３０分かけてゆっくり冷却した。その後、終濃度１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液（和光純薬工）および、濃度５４ｎＭトロンビン（和光純薬工業）とトロンビン−ＡＴＰアプタマーと終濃度１ｍＭアデノシン（和光純薬工業）を混ぜた溶液を３７度で５分間インキュベートした。５分後フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、溶液が固まる時間を自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定した。なおバッファーの終濃度は５０ｍＭ Ｔｈｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，７５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ＝８．０である。
結果を図８に示す。トロンビン又はトロンビンアプタマーに終濃度１ｍＭのアデノシンを加えても凝固時間は変化しないのに対し、トロンビン−ＡＴＰアプタマーに終濃度１ｍＭのアデノシンを加えると凝固時間の延長が観察された。すなわち、アデノシン存在下においてトロンビン−ＡＴＰアプタマーによるトロンビンの阻害能が上昇することが示唆された。
次に、トロンビン−ＡＴＰアプタマーによるアデノシンの定量を行った。終濃度１μＭのトロンビン−ＡＴＰアプタマーを終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ｐＨ＝８．０中で、９５度で３分間加熱し、９５度から室温まで３０分かけてゆっくり冷却した。その後、終濃度１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液（和光純薬工業）および、濃度５４ｎＭトロンビン（和光純薬工業）とトロンビン−ＡＴＰアプタマーと終濃度０．０１〜５ｍＭアデノシン、またはシチジン（和光純薬工業）を混ぜた溶液を３７度で５分間インキュベートした。その後フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、溶液が固まる時間を自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定した。なおバッファーの終濃度は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，７５ｍＭ ＮａＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ｐＨ＝８．０である。
結果を図９に示す。トロンビン−ＡＴＰアプタマーにシチジンを加えても凝固時間は変わらないのに対し、アデノシンを加えると終濃度１ｍＭまではアデノシンの濃度に依存して、凝固時間が上昇し、それ以上では飽和していた。すなわち、終濃度１μＭのトロンビン−ＡＴＰアプタマーを用いて、トロンビンの酵素活性を測定することにより、５０μＭ以上のアデノシンを検出できることが示された。
［実施例４］
トロンビンアプタマーの５’端、３’端それぞれに１８ｍｅｒのサルモネラが有するｉｎｖＡ遺伝子の一部と相補的塩基配列を持つトロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーを合成した。プローブ配列は両端に付加した配列のＴｍ値が同じになるように設計した（Ｔｍ値は５８度）。トロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマー、３６ｍｅｒの標的塩基配列を有するＤＮＡ（ｉｎｖＡＤＮＡ）、対照として用いた３６ｍｅｒＤＮＡ（コントロールＤＮＡ）の配列以下に示す。

トロンビンは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に調製したバッファーに溶解し適度の濃度に希釈して活性の測定に用いた。トロンビンの基質として終濃度２００μＭのＮ−ベンゾイル−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドを用い、遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度（４１０ｎｍ）を測定することによってトロンビンの活性を測定した。終濃度１μＭのトロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーに０．１〜１μＭの３６ｍｅｒのｉｎｖＡ配列を有するＤＮＡを加え９５度で３分インキュベートした後に３０分かけて室温まで冷却し、ｉｎｖＡＤＮＡ存在下でのアプタマーによるトロンビンの阻害能を測定した。またコントロールとして３６ｍｅｒのコントロールＤＮＡをｉｎｖＡＤＮＡの代わりに加え、同様にしてトロンビンの活性を測定した。また終濃度１μＭのトロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマー、終濃度１μＭのｉｎｖＡＤＮＡに０．１、１μＭのｉｎｖＡＤＮＡの相補鎖を加え、同様に熱処理して、トロンビンの酵素活性を測定した。
結果を図１０に示す。０．１μＭ以上の濃度のｉｎｖＡ配列を加えることによりトロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーによるトロンビンの酵素活性の阻害が軽減された。またｉｎｖＡ配列の相補鎖を加えることによりトロンビンの酵素活性の阻害軽減効果が低下した。これらの結果より、プローブ配列にｉｎｖＡ配列がアニーリングすることによりトロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーによるトロンビンの酵素活性の阻害が軽減されることが示唆された。
トロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーに対して１，０．５，０．１倍量の３６ｍｅｒ ｉｎｖＡＤＮＡを混ぜ上記と同様に熱処理後、１１％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動して、どのような複合体を形成しているかを確認した。電気泳動の結果、トロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーに３６ｍｅｒ ｉｎｖＡＤＮＡを加えることによりトロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーのバンドが薄くなり、かつ複数のバンドが確認された。この結果より、トロンビン−ｉｎｖＡ−３’５’−アプタマーが３６ｍｅｒ ｉｎｖＡＤＮＡとハイブリダイセーションし、いくつかの複合体を形成していることが示唆された。
産業上の利用性
本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いることにより、特定のタンパク質の特性を指標として、核酸、タンパク質、小分子等の標的分子を高感度かつ簡便に検出することができる。

Claims (9)

1. 標的分子の存在を検出するためのアプタマー・プローブ複合体であって、
   前記複合体は、トロンビンと結合してトロンビンの酵素活性を阻害することができるアプタマー部分と、
   前記標的分子と結合することができるプローブ部分とを含み、
   ここで、標的分子は核酸であり、アプタマー・プローブ複合体のプローブ部分は前記核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドであり、プローブ部分はアプタマー部分の３’側に位置しており、
   プローブ部分が標的分子と結合していないときには、前記アプタマー部分はトロンビンに結合せず、トロンビンはその活性を示し、プローブ部分が標的分子に結合しているときは，前記アプタマー部分はトロンビンに結合し、トロンビンの酵素活性を阻害する、
   ことを特徴とするアプタマー・プローブ複合体。
2. 標的分子の存在を検出するためのアプタマー・プローブ複合体であって、
   前記複合体は、トロンビンと結合してトロンビンの酵素活性を阻害することができるアプタマー部分と、
   前記標的分子と結合することができるプローブ部分とを含み、
   ここで、標的分子は核酸であり、アプタマー・プローブ複合体のプローブ部分は前記核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドであり、プローブ部分はステムループ構造を形成するようにアプタマー部分中に挿入されており、
   プローブ部分が標的分子と結合していないときには、前記アプタマー部分はトロンビンに結合してトロンビンの酵素活性を阻害し、プローブ部分が標的分子に結合しているときは，前記アプタマー部分はトロンビンに結合せず、トロンビンはその活性を示す、
   ことを特徴とするアプタマー・プローブ複合体。
3. 標的分子の存在を検出するためのアプタマー・プローブ複合体であって、
   前記複合体は、トロンビンと結合してトロンビンの酵素活性を阻害することができるアプタマー部分と、
   前記標的分子と結合することができるプローブ部分とを含み、
   ここで、標的分子はタンパク質または小分子であり、アプタマー・プローブ複合体のプローブ部分は前記タンパク質または小分子と結合しうるアプタマーであり、プローブ部分はトロンビンアプタマー配列中に挿入されており、
   プローブ部分が標的分子と結合していないときには、前記アプタマー部分はトロンビンに結合せず、トロンビンはその活性を示し、プローブ部分が標的分子に結合しているときは，前記アプタマー部分はトロンビンに結合し、トロンビンの酵素活性を阻害する、
   ことを特徴とするアプタマー・プローブ複合体。
4. 標的分子が、サルモネラ菌またはＳＡＲＳウイルスの遺伝子またはその一部である、請求項１または２に記載の複合体。
5. 請求項１−３のいずれかに記載のアプタマー・プローブ複合体を含む、標的分子の存在を検出するためのキット。
6. 試料中の標的分子の存在を検出する方法であって、
   請求項１−３のいずれかに記載のアプタマー・プローブ複合体を用意し；
   前記試料と前記複合体とを接触させ、
   指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出する、
   ことを含む方法。
7. トロンビンの酵素活性の変化を分光学的手法により測定する、請求項６記載の方法。
8. トロンビンの酵素活性の変化を電気化学的手法により測定する、請求項６記載の方法。
9. 試料中の標的分子の存在を検出する方法であって、
   請求項１または２に記載のアプタマー・プローブ複合体を用意し；
   前記試料と前記複合体とを接触させ、
   指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出することを含み、
   ここで、標的分子が、サルモネラ菌またはＳＡＲＳウイルスの遺伝子またはその一部である、前記方法。
   
   

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