JP5999786B2 - Ａｔｐまたはａｍｐの分析用デバイスおよび分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法に関する。
近年、大腸菌、サルモネラ菌等の微生物感染による食中毒の増加が問題となっている。この問題の大きな原因は、洗浄不良である。このため、食品加工場等では、洗浄度検査を行うことが必須となっている。
このような検査では、近年、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）またはＡＭＰ（アデノシン一リン酸）の測定により、洗浄度を分析する方法が実用化されている。ＡＴＰおよびＡＭＰは、あらゆる生物においてエネルギー代謝に必須の成分として知られている。このため、ＡＴＰまたはＡＭＰの量は、そこに存在する微生物および食品由来の量に相関すると考えられる。そこで、目的領域におけるＡＴＰまたはＡＭＰを測定することで、前記領域に残存する微生物や食品残渣の程度を分析できるため、これによって、洗浄度を評価することができる。
ＡＭＰを検出するためのツールとして、例えば、ＡＭＰに特異的に結合するＤＮＡアプタマーとペルオキシダーゼ活性を生起するＤＮＡ（以下、ＤＮＡｚｙｍｅ）とを連結した核酸素子が報告されている（非特許文献１）。この核酸素子は、ＡＭＰ非存在下では、アプタマーとＤＮＡｚｙｍｅとが自己会合して、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を阻害し、ＡＭＰ存在下、ＡＭＰと前記アプタマーとが結合することによって、前記自己会合が解除され、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能が生起されるよう、その構造が制御されている。このため、ＡＭＰが存在すれば、触媒能が生起されたＤＮＡｚｙｍｅにより、例えば、ペルオキシダーゼ反応が生じるため、前記反応を測定することによって、間接的にＡＭＰ量を測定することができる。また、ＡＭＰが存在しない場合には、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能は生起されないため、前記ペルオキシダーゼ反応は起こらない。しかしながら、このような核酸素子については、実用化のために、感度や操作の容易性等について、さらなる向上が求められている。
Carsten Tellerら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００９， ８１， ９１１４−９１１９
そこで、本発明は、ＡＴＰまたはＡＭＰを検出するための新たな核酸センサを提供することを目的とする。
本発明の分析用核酸センサは、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析用核酸センサであり、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）と、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する結合核酸分子（Ａ）とを有する下記（Ｉ）、（II）、（II’）または（III）の核酸素子を含むことを特徴とする。
（Ｉ）第１鎖と第２鎖とから構成される二本鎖の核酸素子であり、
前記第１鎖（ｓｓ１）は、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結しており、
前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成配列（ＳＡ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結しており、
前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記ＡＴＰまたはＡＭＰと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
（II）一本鎖の核酸素子であり、
前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）、ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結しており、
前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記ＡＴＰまたはＡＭＰと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
（II’）一本鎖の核酸素子であり、
前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）、ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結しており、
前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記ＡＴＰまたはＡＭＰと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
（III）一本鎖の核酸素子であり、
前記触媒核酸分子（Ｄ）、介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結しており、
前記介在配列（Ｉ）は、前記触媒核酸分子（Ｄ）および前記結合核酸分子（Ａ）と非相補的であり、
ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
本発明の分析用デバイスは、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサが、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明の分析方法は、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析方法であり、前記本発明のＡＴＰまたはＡＭＰの分析用核酸センサに、ＡＴＰまたはＡＭＰを含む試料を接触させる工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のＡＴＰまたはＡＭＰを検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の分析方法は、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに、ＡＴＰまたはＡＭＰを含む試料を接触させる工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のＡＴＰまたはＡＭＰを検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の核酸センサによれば、前記結合核酸分子（Ａ）とＡＴＰまたはＡＭＰとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能のＯＮ−ＯＦＦをスイッチでき、且つ、その感度に優れる。このため、前記触媒核酸分子の触媒機能を検出することで、ＡＴＰまたはＡＭＰの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である。
図１は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の一例を示す模式図である。 図２は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の他の例を示す模式図である。 図３は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の他の例を示す模式図である。 図４は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の他の例を示す模式図である。 図５は、実施例１における吸光度測定の結果を示すグラフである。 図６は、実施例２における吸光度測定の結果を示すグラフである。 図７は、実施例３における吸光度測定の結果を示すグラフである。 図８は、実施例４における吸光度測定の結果を示すグラフである。
（核酸センサおよびそれを用いた分析方法）
本発明のＡＴＰまたはＡＭＰの分析用核酸センサは、前述のように、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）と、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する結合核酸分子（Ａ）とを有する前記（Ｉ）、（II）、（II’）または（III）の核酸素子を含むことを特徴とする。
前記結合核酸分子（Ａ）は、特に制限されず、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する核酸分子であればよい。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ＡＴＰおよびＡＭＰの一方に結合してもよいし、両方に結合してもよい。本発明において、「ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する」とは、例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰの他、ＡＴＰまたはＡＴＰの断片およびＡＴＰ誘導体、ＡＭＰ誘導体のいずれに結合可能でもよい。
前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、一本鎖である。前記結合核酸分子（Ａ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１８塩基長であり、好ましくは２０塩基長であり、より好ましくは２４塩基長であり、上限は、例えば、１２０塩基長であり、好ましくは６０塩基長であり、より好ましくは２６塩基長である。
前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）または（ａ４）のポリヌクレオチドを含むものがあげられる。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、前記ポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。前記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）または（ａ３）のポリヌクレオチドを含む前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、結合ＤＮＡ分子ということもできる。
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
配列番号１ CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG
（ａ２）前記（ａ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合するポリヌクレオチド
（ａ３）前記（ａ１）の前記塩基配列との同一性が５０％以上の塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合可能なポリヌクレオチド
（ａ４）前記（ａ１）の前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合可能なポリヌクレオチド
前記（ａ２）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（ａ２）のポリヌクレオチドが、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合すればよい。前記置換された塩基の数は、前記塩基配列（ａ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、前記塩基配列（ａ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、前記塩基配列（ａ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは２個または１個、特に好ましくは１個である。
前記（ａ３）において、前記同一性は、前記塩基配列（ａ１）に対して、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
前記（ａ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより塩基配列を同定できる条件をいう。１×ＳＳＣは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。
前記結合核酸分子（Ａ）は、これらの例示には限定されず、前述のように、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する核酸分子であればよい。
前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ヌクレオチド残基を含む分子であり、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＲＮＡでもよいし、前者と後者とを含むキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）でもよい。
前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基（非人工塩基）および非天然塩基（人工塩基）のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、触媒機能を生起する核酸分子であればよい。前記触媒機能は、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応であればよい。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性（以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という）等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性があげられる。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、後述するようなＤＮＡの場合、ＤＮＡエンザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができ、また、後述するようなＲＮＡの場合、ＲＮＡエンザイムまたはＲＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができる。
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、Ｇ−カルテット（またはＧ−ｔｅｔｒａｄという）の構造を形成する核酸が好ましく、より好ましくはグアニン四重鎖（またはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘという）の構造を形成する核酸である。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄは、例えば、グアニンが四量体となった面の構造であり、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、例えば、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄが複数面重なった構造をいう。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄおよび前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、例えば、反復してＧリッチの構造モチーフを有する核酸において、形成される。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄは、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型があげられるが、パラレル型が好ましい。前記核酸素子において、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸素子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合していない状態で、前記ステムが形成されることにより、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄの形成が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを形成することが好ましい。
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましく、具体的には、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを形成し且つ前記ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましい。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを有する核酸は、例えば、前記ポルフィリンと結合して複合体を形成することによって、前述のような酸化還元反応の触媒機能を生起することが知られている。前記核酸素子において、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合していない状態で、前記ステムが形成されることにより、前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記ポルフィリンと結合することが好ましい。具体的には、前記核酸素子において、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合していない状態で、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄの形成が阻害され且つこれにより前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合することにより、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを形成し且つ前記ポルフィリンと結合することが好ましい。
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、一本鎖である。前記触媒核酸分子（Ｄ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１１塩基長であり、好ましくは１３塩基長であり、より好ましくは１５塩基長であり、上限は、例えば、６０塩基長であり、好ましくは３６塩基長であり、より好ましくは１８塩基長である。
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、ペルオキシダーゼ活性を有するＤＮＡとして、下記論文（１）〜（４）等に開示されているＤＮＡｚｙｍｅが例示できる。
（１）Travascioら， Chem. Biol., 1998年, vol.5， p.505-517
（２）Chengら, Biochimistry, 2009年, vol.48, p.7817-7823
（３）Tellerら， Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.9114-9119
（４）Taoら, Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.2144-2149
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、具体例として、下記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）または（ｄ４）のポリヌクレオチドを含むものがあげられる。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記ポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。前記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）または（ｄ４）のポリヌクレオチドを含む前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、触媒ＤＮＡ分子、ＤＮＡｚｙｍｅということもできる。
（ｄ１）配列番号１１〜３１および６６〜８５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２）前記（ｄ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
（ｄ３）前記（ｄ１）の前記塩基配列との同一性が５０％以上の塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
（ｄ４）前記（ｄ１）の前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
ＥＡＤ２（配列番号１１）
CTGGGAGGGAGGGAGGGA
ｃ−Ｍｙｃ（配列番号１２）
TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５２７ （配列番号１３）
TGAGGGGAGGGAGGGCGGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５７９（配列番号１４）
TGAGGGGTGGGAGGGAGGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５８０（配列番号１５）
TGAGGGGTGGGAGGGACGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５８３（配列番号１６）
TGAGGGGTGGGAGGGTGGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５８４（配列番号１７）
TGAGGGGTGGGAGGGTCGGGAA
ｎｅｃｏ０５８４（配列番号１８）
GGGTGGGAGGGTCGGG
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５８６（配列番号１９）
TGAGGGGTGGGAGGGGTGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５８８（配列番号２０）
TGAGGGGTGGGAGGGGCGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０６０５（配列番号２１）
TGAGGGGTGGGTGGGCAGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０６０８（配列番号２２）
TGAGGGGTGGGTGGGCCGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０６２７（配列番号２３）
TGAGGGGTGGGCGGGAGGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０６３２（配列番号２４）
TGAGGGGTGGGCGGGTCGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０７０６（配列番号２５）
TGAGGGGCGGGAGGGATGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０７１１（配列番号２６）
TGAGGGGCGGGAGGGTGGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０７１２（配列番号２７）
TGAGGGGCGGGAGGGTCGGGAA
ｍ＿ＥＡＤ２−００３２（配列番号２８）
CTGGGTGGGCGGGCGGGA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０５２０（配列番号２９）
TGAGGGGAGGGAGGGTCGGGAA
ｍ＿ｃ−Ｍｙｃ−０７１４（配列番号３０）
TGAGGGGCGGGAGGGGTGGGAA
ｍ＿ＴＡ−０４２０（配列番号３１）
GGGCGGGAGGGAGGG
配列番号６６ GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG
配列番号６７ GTGGGTAGGGCGGGTTGG
配列番号６８ GGTTGGTGTGGTTGG
配列番号６９ GGGGTTGGGGTGTGGGGTTGGGG
配列番号７０ AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
配列番号７１ GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGG
配列番号７２ GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG
配列番号７３ GTGGGTAGGGCGGTTGG
配列番号７４ CGAGGTGGGTGGGTGGGA
配列番号７５ CTGGGTGGGTGGGTGGGA
配列番号７６ CTGGGAGGGAGGGAGGGA
配列番号７７ CTGGGCGGGCGGGCGGGA
配列番号７８ CTGGGTTGGGTTGGGTTGGGA
配列番号７９ CTGGGGTGGGGTGGGGTGGGGA
配列番号８０ GGGCGGGCCGGGGGCGGG
配列番号８１ TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA
配列番号８２ CGGGCGGGCGCGAGGGAGGGG
配列番号８３ GGGAGGGAGAGGGGGCGGG
配列番号８４ GGGCGGGCGCGGGCGGG
配列番号８５ GGGTAGGGCGGGTTGGG
前記（ｄ２）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（ｄ２）のポリヌクレオチドが、前記酸化還元反応の触媒機能を生起すればよい。前記置換された塩基の数は、前記塩基配列（ｄ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、前記塩基配列（ｄ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、前記塩基配列（ｄ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは２個または１個、特に好ましくは１個である。
前記（ｄ３）において、前記同一性は、前記塩基配列（ｄ１）に対して、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
前記（ｄ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、前述と同様である。
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記（ｄ１）〜（ｄ４）の例示には限定されず、前述のように、前記触媒機能を生起する核酸分子であればよい。
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、ヌクレオチド残基を含む分子であり、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、前述と同様である。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＲＮＡでもよいし、前者と後者とを含むキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）でもよい。
前記ヌクレオチドは、前記結合核酸分子（Ａ）における例示を援用できる。また、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
本発明において、前記核酸素子は、前述のように、前記（Ｉ）、（II）、（II’）および（III）があげられる。以下に、これらの３つの形態について説明するが、特に示さない限り、各形態は、それぞれの説明を援用できる。
前記核酸素子（Ｉ）は、前述のように、第１鎖と第２鎖とから構成される二本鎖の核酸素子である。前記第２鎖は、ブロック鎖ともいう。前記第１鎖（ｓｓ１）は、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結しており、前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成配列（ＳＡ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結している。前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的である。そして、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このステム形成で、前記触媒核酸分子がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記ＡＴＰまたはＡＭＰと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
前記核酸素子（Ｉ）は、このように、ＡＴＰまたはＡＭＰが非存在の場合、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。前記核酸素子（Ｉ）は、具体的には、例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する。本発明において、「相補的」とは、例えば、アライメントする２つの領域間が、完全に相補であってもよいし、ステム形成可能な程度に相補であってもよい（以下、同様）。また、本発明において、「非相補的」とは、例えば、アライメントする２つの領域間が、完全に非相補であってもよいし、内部ループを形成可能な程度に非相補であってもよい（以下、同様）。
前記ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下における前記核酸素子（Ｉ）の状態を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、前記第１鎖（ｓｓ１）と前記第２鎖（ｓｓ２）の向きが逆となっている形態を示す。図１において、矢印は、５’側から３’側への方向を示す（以下、同様）。
図１において、上側の鎖が、前記第１鎖（ｓｓ１）であり、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記ループ形成配列（Ｌ１）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）を示し、下側の鎖が、前記第２鎖（ｓｓ２）であり、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）、Ｌ２は、前記ループ形成配列（Ｌ２）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）を示す。図１に示すように、ＡＴＰまたはＡＭＰが非存在下では、前記第１鎖（ｓｓ１）と前記第２鎖（ｓｓ２）との間で、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。具体的には、前記結合核酸分子（Ａ）の、ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）との間でステムが形成され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の、前記ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）との間でステムが形成され、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）との間で内部ループが形成される。そして、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在すると、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、これによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒活性が生起される。
前記核酸素子（Ｉ）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図１（Ａ）に示すように、前記第１鎖（ｓｓ１）は、例えば、５’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結し、前記第２鎖（ｓｓ２）は、３’側から、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結していることが好ましい。この場合、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）の３’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。また、図１（Ｂ）に示すように、前記第１鎖（ｓｓ１）は、例えば、３’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結し、前記第２鎖（ｓｓ２）は、５’側から、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結してもよい。この場合、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）の５’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）の３’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。前記核酸素子（Ｉ）は、このように内部ループを形成することによって、優れた感度の検出が可能になると推測されるが、本発明は、この推測には制限されない。
前記核酸素子（Ｉ）において、前記内部ループの長さは、特に制限されない。前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）は、それぞれ、例えば、０〜３０塩基長であり、好ましくは１〜３０塩基長であり、より好ましくは１〜１５塩基長であり、さらに好ましくは、１〜６塩基長である。また、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、１〜１０塩基、好ましくは１または２塩基、より好ましくは１塩基である。また、前記核酸素子（Ｉ）は、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ループ形成配列（Ｌ２）のいずれか一方のみを有してもよい。前記核酸素子（Ｉ）は、このように内部ループを形成することによって、優れた感度の検出が可能になると推測されるが、本発明は、この推測には制限されない。
前記核酸素子（Ｉ）において、前記各ステムの長さは、特に制限されない。前記ステムの長さは、例えば、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さで調節できる。前記ステム形成配列（ＳＡ）の長さは、例えば、０〜６０塩基長であり、好ましくは０〜１０塩基長であり、より好ましくは、１〜６塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、例えば、０〜３０塩基長、１〜３０塩基長でありであり、好ましくは０〜１０塩基長、１〜１０塩基長でありであり、より好ましくは、１〜６塩基長である。
前記核酸素子（Ｉ）において、前記第１鎖（ｓｓ１）および前記第２鎖（ｓｓ２）の長さは、特に制限されない。前記第１鎖（ｓｓ１）の長さは、例えば、４０〜２００塩基長であり、好ましくは４２〜１００塩基長であり、より好ましくは、４５〜６０塩基長である。前記第２鎖（ｓｓ２）の長さは、例えば、４〜１２０塩基長であり、好ましくは５〜２５塩基長であり、より好ましくは、１０〜１５塩基長である。
前記核酸素子（Ｉ）の具体例を以下に示すが、本発明は、これには制限されない。まず、前記第１鎖（ｓｓ１）を、以下に例示する。下記配列において、５’側の下線部が、配列番号１のＡＭＰアプタマー（図１においてＡ）、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（図１においてＬ１）、３’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（図１においてＤ）である。
AMP.neco.D0.A0 （配列番号２）
5’-CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTTTTTTTGGGTGGGAGGGTCGGG-3’
つぎに、前記第１鎖（ｓｓ１）に対する第２鎖（ｓｓ２）を、以下に例示する。下記配列において、５’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＤＮＡｚｙｍｅの５’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＤ）であり、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（図１においてＬ２）であり、３’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＡＭＰアプタマーの３’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＡ）である。
AMP.neco.D5.A5 （配列番号３）
5’-CACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D5.A6 （配列番号４）
5’-CACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D5.A7 （配列番号５）
5’-CACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D5.A8 （配列番号６）
5’-CACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
AMP.neco.D6.A5 （配列番号７）
5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D6.A6 （配列番号８）
5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D6.A7 （配列番号９）
5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D6.A8 （配列番号１０）
5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
AMP.neco.D7.A5 （配列番号３２）
5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D7.A6 （配列番号３３）
5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D7.A7 （配列番号３４）
5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D7.A8 （配列番号３５）
5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
AMP.neco.D8.A5 （配列番号３６）
5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D8.A6 （配列番号３７）
5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D8.A7 （配列番号３８）
5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D8.A8 （配列番号３９）
5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
つぎに、前記核酸素子（II）は、前述のように、一本鎖の核酸素子であり、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）、ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結している。前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的である。
そして、前記核酸素子（II）は、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このような自己会合によるステム形成で、前記触媒核酸分子がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記ＡＴＰまたはＡＭＰと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、自己会合によるステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
前記核酸素子（II）は、前記核酸素子（Ｉ）と同様に、ＡＴＰまたはＡＭＰが非存在の場合、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。前記核酸素子（II）は、具体的には、例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する。
前記ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下における前記核酸素子（II）の状態を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、向きが逆となっている形態を示す。
図２において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記ループ形成配列（Ｌ１）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）、Ｌ２は、前記ループ形成配列（Ｌ２）、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）を示す。図２に示すように、ＡＴＰまたはＡＭＰが非存在下では、前記核酸素子（II）の自己アニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。具体的には、前記結合核酸分子（Ａ）の、ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）との間でステムが形成され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の、前記ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）との間でステムが形成され、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）との間で内部ループが形成される。そして、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在すると、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、これによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒活性が生起される。
前記核酸素子（II）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図２（Ｂ）に示すように、前記核酸素子（II）は、例えば、３’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）、前記ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結していることが好ましい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。また、図２（Ａ）に示すように、前記核酸素子（II）は、例えば、５’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）、前記ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結してもよい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。
前記核酸素子（II）において、前記内部ループの長さは、特に制限されない。前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）は、それぞれ、例えば、０〜３０塩基長であり、好ましくは１〜３０塩基長であり、より好ましくは、１〜１５塩基長であり、さらに好ましくは、１〜６塩基長である。また、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、１〜１０塩基、好ましくは１または２塩基、より好ましくは１塩基である。また、前記核酸素子（II）は、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ループ形成配列（Ｌ２）のいずれか一方のみを有してもよい。前記核酸素子（II）は、このように内部ループを形成することによって、優れた感度の検出が可能になると推測されるが、本発明は、この推測には制限されない。
前記核酸素子（II）において、前記各ステムの長さは、特に制限されない。前記ステムの長さは、例えば、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さで調節できる。前記ステム形成配列（ＳＡ）の長さは、例えば、０〜６０塩基長、１〜６０塩基長であり、好ましくは１〜１０塩基長であり、より好ましくは１〜７塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、例えば、０〜３０塩基長、１〜３０塩基長であり、好ましくは０〜１０塩基長、１〜１０塩基長であり、より好ましくは、０〜７塩基長、１〜７塩基長である。
前記核酸素子（II）の長さは、特に制限されない。前記核酸素子（II）の長さは、例えば、４０〜１２０塩基長であり、好ましくは４５〜１００塩基長であり、より好ましくは、５０〜８０塩基長である。
前記核酸素子（II）の具体例を以下に示すが、本発明は、これには制限されない。下記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＡ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）、５’側の下線部が、配列番号１１（ＥＡＤ２）のＤＮＡｚｙｍｅ（Ｄ）、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）、３’側の下線部が、配列番号１のＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.D3.A2 （配列番号４０）
5’-ggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D3.A3 （配列番号４１）
5’-aggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D3.A4 （配列番号４２）
5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D3.A5 （配列番号４３）
5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A2 （配列番号４４）
5’-ggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A3 （配列番号４５）
5’-aggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A4 （配列番号４６）
5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A5 （配列番号４７）
5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A2 （配列番号４８）
5’-ggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A3 （配列番号４９）
5’-aggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A4 （配列番号５０）
5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A5 （配列番号５１）
5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCTGGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
下記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が前記ステム形成配列（ＳＡ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）、５’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（Ｄ）、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）、３’側の下線部が、配列番号１のＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.neco.D3.A2 （配列番号５２）
5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A3 （配列番号５３）
5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A4 （配列番号５４）
5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A5 （配列番号５５）
5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A2 （配列番号５６）
5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A3 （配列番号５７）
5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A4 （配列番号５８）
5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A5 （配列番号５９）
5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A2 （配列番号６０）
5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A3 （配列番号６１）
5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A4 （配列番号６２）
5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A5 （配列番号６３）
5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D6.A2 （配列番号６４）
5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGccacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
つぎに、前記核酸素子（II’）は、前記核酸素子（II）に対して、前記結合核酸分子（Ａ）と前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ステム形成配列（ＳＡ）と前記ステム形成配列（ＳＤ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、それぞれ入れ替わった位置関係にある一本鎖の核酸素子である。なお、前記核酸素子（II’）は、特に説明しない限り、前記核酸素子（II）の記載を援用できる。
前記核酸素子（II’）は、前述のように、前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）、ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結している。前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的である。
そして、前記核酸素子（II’）は、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このような自己会合によるステム形成で、前記触媒核酸分子がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記ＡＴＰまたはＡＭＰと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、自己会合によるステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
前記核酸素子（II’）は、前記核酸素子（II）と同様に、ＡＴＰまたはＡＭＰが非存在の場合、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。前記核酸素子（II’）は、具体的には、例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する。
前記ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下における前記核酸素子（II’）の状態を、図３の模式図に示す。図３（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、向きが逆となっている形態を示す。
図３において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記ループ形成配列（Ｌ１）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）、Ｌ２は、前記ループ形成配列（Ｌ２）、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）を示す。図３に示すように、ＡＴＰまたはＡＭＰが非存在下では、前記核酸素子（II’）の自己アニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。具体的には、前記結合核酸分子（Ａ）の、ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）との間でステムが形成され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の、前記ループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）との間でステムが形成され、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）との間で内部ループが形成される。そして、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在すると、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、これによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒活性が生起される。
前記核酸素子（II’）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図３（Ｂ）に示すように、前記核酸素子（II’）は、例えば、３’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結していることが好ましい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。また、図３（Ａ）に示すように、前記核酸素子（II’）は、例えば、５’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結してもよい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。
つぎに、前記核酸素子（III）は、前述のように、一本鎖の核酸素子であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結しており、前記介在配列（Ｉ）は、前記触媒核酸分子（Ｄ）および前記結合核酸分子（Ａ）と非相補的である。そして、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、他方、ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。
前記核酸素子（III）は、前記核酸素子（Ｉ）、（II）および（II’）と同様に、ＡＴＰまたはＡＭＰが非存在の場合、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在の場合、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。
前記ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下における前記核酸素子（III）の状態を、図４の模式図に示す。図４において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｉは、前記介在配列（Ｉ）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）を示す。図４（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、向きが逆となっている形態を示す。
前記核酸素子（III）について、ＡＴＰまたはＡＭＰの非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、ＡＴＰまたはＡＭＰの存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるのは、例えば、以下の理由が推測される。なお、本発明は、これらの推測には制限されない。前記核酸素子（III）は、ＡＴＰまたはＡＭＰ非存在下において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の一部と前記結合核酸分子（Ａ）の一部とが相互作用し、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、非Ｇカルテット構造を形成していると推測される。そして、ＡＴＰまたはＡＭＰが存在すると、前記核酸素子（III）のメインフォームが、前記結合核酸素子（Ａ）の本来の構造、すなわちＡＴＰまたはＡＭＰに結合する三次元構造に傾き、全体の構造変化が生じ、結果として、前記触媒核酸分子（Ｄ）がＧカルテット構造を形成し、その触媒機能が生起されると考えられる。
前記核酸素子（III）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図４（Ａ）に示すように、前記核酸素子（III）は、例えば、５’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結していることが好ましい。また、図４（Ｂ）に示すように、前記核酸素子（III）は、例えば、３’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結してもよい。
前記核酸素子（III）において、前記介在配列（Ｉ）の長さは、特に制限されない。前記介在配列（Ｉ）の長さは、例えば、例えば、０〜３０塩基長、１〜３０塩基長であり、好ましくは、０〜２５塩基長、１〜２５塩基長であり、より好ましくは、０〜２０塩基長、１〜２０塩基長であり、さらに好ましくは、０〜１０塩基長、１〜１０塩基長であり、特に好ましくは、０〜８塩基長、１〜８塩基長である。
前記核酸素子（III）の長さは、特に制限されない。前記核酸素子（III）の長さは、例えば、３０〜１２０塩基長であり、好ましくは３５〜８０塩基長であり、より好ましくは、４０〜６０塩基長である。
前記核酸素子（III）の具体例を以下に示すが、本発明は、これには制限されない。下記AMP.neco.D0.A0において、５’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（図４においてＤ）であり、３’側の下線部が、配列番号１のＡＴＰまたはＡＭＰアプタマー（図４においてＡ）であり、両者間のポリｄＴが介在配列（図４においてＩ）である。
AMP.neco.D0.A0 （配列番号６５）
5’-GGGTGGGAGGGTCGGGTTTTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
前記核酸素子（Ｉ）、（II）、（II’）および（III）において、各領域は、例えば、それぞれ、直接的な連結でも、間接的な連結でもよい。前記直接的な連結の場合、例えば、各領域がホスホジエステル結合により連結する。また、前記間接的な連結の場合、例えば、介在リンカーを介して、各領域が連結する。前記介在リンカーは、例えば、前述のようなヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドで構成される核酸分子があげられる。前記介在リンカーは、例えば、一本鎖が好ましい。
本発明の核酸センサは、例えば、前記核酸素子のみからなるセンサでもよいし、さらに他の構成要素を含むセンサでもよい。本発明の核酸センサは、例えば、ＳＡを検出するためのデバイスということもできる。前記他の構成要素は、例えば、前記核酸素子を配置する基材があげられる。前記基材は、例えば、基板、ビーズ、チューブ等の容器等があげられる。前記他の構成要素は、この他に、例えば、リンカーがあげられる。前記リンカーは、例えば、前記核酸素子を前記基材に固定化する際、前記核酸素子と前記基材との連結に使用できる。前記核酸センサの前記基材への配置は、例えば、後述する本発明の分析用デバイスを参照できる。
前記核酸素子において、前記リンカーとの連結部位は、特に制限されず、例えば、前記核酸素子のいずれかの末端が好ましい。前記二本鎖の核酸素子（Ｉ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）および前記触媒核酸分子（Ｄ）を有する前記第１鎖（ｓｓ１）のいずれかの末端、および／または、前記第２鎖（ｓｓ２）のいずれかの末端が好ましい。前記一本鎖の核酸素子（II）、（II’）および（III）は、例えば、いずれかの末端が好ましい。この場合、前記リンカーは、末端リンカーともいう。前記リンカーは、例えば、前述のようなヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドで構成される核酸分子があげられる。前記末端リンカーは、例えば、一本鎖が好ましい。
本発明の核酸センサは、例えば、前記核酸素子を遊離状態で使用してもよいし、前記核酸素子を固定化した状態で使用してもよい。後者の場合、例えば、前記基材に固定化し、デバイスとして使用できる。
本発明の核酸センサの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のＡＴＰまたはＡＭＰの分析方法に使用できる。
本発明の分析方法は、前述のように、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析方法であり、前記本発明の核酸センサに、ＡＴＰまたはＡＭＰを含む試料を接触させる接触工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のＡＴＰまたはＡＭＰを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰを含む試料、ＡＴＰまたはＡＭＰを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。
本発明の核酸センサとして、前記核酸素子を遊離状態で使用する際は、例えば、チューブ等の容器内で、前記核酸素子と前記試料とを接触させることが好ましい。また、本発明の核酸センサとして、前記核酸素子を前記基材に配置した状態で使用する際は、例えば、前記基材上の前記核酸素子に、前記試料を接触させることができる。
前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出することが好ましい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルおよび電気化学的シグナル等があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色シグナル、発光シグナル、蛍光シグナル等があげられる。
前記シグナルは、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により、基質から生成されることが好ましい。そこで、前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に応じた基質の存在下で、行うことが好ましい。
前記基質は、例えば、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質、発色、発光もしくは蛍光の基質であり、且つ、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光が消失する生成物を生成する基質、また、前記触媒機能によって、異なる発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質等があげられる。このような基質によれば、例えば、発色、発光もしくは蛍光の有無、または、発色、発光もしくは蛍光の変化や強度等をシグナルとして、目視で確認することにより、前記触媒機能を検出できる。また、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等をシグナルとして、光学的な手法で測定することにより、前記触媒機能を検出することもできる。前記触媒機能は、例えば、前述のような酸化還元反応の触媒機能があげられる。
また、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、前記酸化還元反応の触媒機能を有する場合、例えば、電子の授受が可能な基質があげられる。この場合、前記触媒核酸分子（Ｄ）により、例えば、前記基質から生成物が生成され、その過程において、電子の授受が生じる。この電子授受は、例えば、電極への印加により、電気シグナルとして、電気化学的に検出できる。前記電気シグナルの検出は、例えば、電流等のような、前記電気シグナルの強度を測定することにより行える。
前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、１，２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ （ＤＡＢ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＡＢ４ＨＣｌ）、３−Ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ（４Ｃ１Ｎ）、２，４，６−Ｔｒｉｂｒｏｍｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ、２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ルミノール等があげられる。
前記検出工程において、前記基質は、例えば、前記核酸センサに前記試料を接触させる前に、予め、前記核酸センサに供給してもよいし、前記試料の接触と同時または前記試料を接触させた後、前記核酸センサに供給してもよい。前記基質は、例えば、液体に混合した基質液として、前記核酸センサに供給することが好ましい。前記基質を混合する液体は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液が好ましい。前記基質液における前記基質の濃度は、特に制限されず、例えば、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。また、前記基質液のｐＨは、例えば、６〜９であり、好ましくは６．８〜９である。
前記検出工程において、前記触媒核酸分子（Ｄ）による反応条件は、特に制限されない。温度は、例えば、１５〜３７℃であり、時間は、例えば、１０〜９００秒である。
また、前記検出工程において、前記基質の他に、例えば、ポルフィリンを共存させてもよい。公知のＤＮＡｚｙｍｅには、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することによって、さらに高い酸化還元活性を示すものがある。そこで、本発明においても、例えば、ポルフィリンを共存させて、前記触媒核酸分子（Ｄ）とポルフィリンとの複合体として、酸化還元活性を検出してもよい。前記ポルフェリンの供給は、特に制限されず、前記基質と同様に行うことができる。
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
本発明の核酸センサによれば、前述のようにＡＴＰまたはＡＭＰを検出できる。また、本発明の核酸センサによれば、例えば、前述のように、ＡＴＰまたはＡＭＰの検出から、間接的に、対象物に残存する微生物が食品残渣等の汚れを検出できる。
（分析用デバイスおよびそれを用いた分析方法）
本発明の分析用デバイスは、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサは、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明の分析用デバイスは、前記本発明の核酸センサを使用することが特徴であって、その他の構成に関しては何ら制限されない。特に説明しない限り、本発明の分析用デバイスは、例えば、前記本発明の核酸センサの説明を援用できる。
本発明の分析用デバイスにおいて、前記核酸センサの配置方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸センサにおける前記核酸素子が、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前者の場合、前記核酸素子は、例えば、前記基材に、直接的に固定化されてもよいし、間接的に固定化されてもよい。前記固定化は、例えば、化学的結合による連結が例示できる。前記間接的な固定化は、例えば、前記核酸素子が、リンカーを介して、前記基材に固定化される形態があげられる。前記リンカーは、例えば、前述の末端リンカーがあげられる。前記核酸素子の配置に関しては、例えば、前記本発明の核酸センサにおける説明を援用できる。
前記核酸素子の固定化は、この他に、例えば、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法としては、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許５，４２４，１８６号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法としては、例えば、前記基材上で前記核酸素子を合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許５，８０７，５２２号明細書、特表平１０−５０３８４１号公報等を参照できる。
前記基材における前記核酸素子の配置部位は、特に制限されず、例えば、前記検出部に配置されている形態があげられる。
本発明の分析用デバイスは、例えば、さらに、試薬部を有してもよい。前記試薬部は、例えば、前記検出部に配置してもよい。前記試薬部は、例えば、予め試薬が配置されてもよいし、使用時に試薬を供給してもよい。前記試薬としては、例えば、前述のような基質、前記ポルフィリン等があげられる。
本発明の分析用デバイスにおいて、前記検出部は、前述のように、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部である。前記検出部は、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能として、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部であることが好ましい。前記シグナルは、前述のように、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能による、基質からのシグナルがあげられる。前記シグナルは、例えば、前述のような、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルがあげられる。
前記シグナルが光学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、光学的シグナルの検出部であり、吸光度、反射率、蛍光強度等の検出部が例示できる。
前記シグナルが前記電気化学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、電極系を有する。この場合、前記検出部は、例えば、前記基材の表面に、前記電極系を配置することによって形成できる。前記電極の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法、スクリーン印刷法、メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記基材に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置は、例えば、他の部材を介した配置があげられる。
前記電極系は、例えば、作用極および対極を含んでもよいし、作用極、対極および参照極を含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極、銀電極、金電極、カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀／塩化銀の電極があげられる。前記銀／塩化銀の電極は、例えば、銀電極への塩化銀電極の積層により形成できる。
本発明の分析用デバイスが、前記電極系を有する場合、前記核酸素子は、例えば、前記電極系に配置すること好ましく、前記電極の中でも前記作用極に配置することが好ましい。本発明の分析用デバイスが、前記電極系と前記試薬部とを有する場合、例えば、前記電極系の上に、前記試薬部を配置することが好ましい。
本発明の分析用デバイスは、例えば、複数の検出部を備えてもよい。この場合、前記分析用デバイスは、例えば、前記基材の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に、前述のような検出部を備えることが好ましい。本発明の分析用デバイスにおいて、１つの検出部に配置する核酸センサの数は、特に制限されない。
前記基材は、特に制限されない。前記基材は、例えば、表面が絶縁性の基板が好ましい。前記基材は、例えば、絶縁材料からなる基板でもよいし、表面に絶縁材料からなる絶縁層を有する基材でもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック、絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等があげられる。
本発明の分析方法は、前述のように、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のＡＴＰまたはＡＭＰを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
本発明の分析方法は、前記本発明の核酸センサを備える前記分析用デバイスを使用することが特徴であって、その他の条件は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、例えば、前記本発明の核酸センサにおける分析方法の説明を援用できる。
（分析用試薬）
本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸センサを含むことを特徴とする。本発明の分析用試薬は、前記核酸センサを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の分析用試薬は、例えば、前記核酸センサの他に、例えば、前記基質、前記ポルフェリン、前記緩衝液、および／または前記基材等の構成成分を含んでもよい。
また、本発明の分析用試薬は、例えば、分析用キットであってもよい。この場合、例えば、前記核酸センサと、前述したその他の構成成分とを含み、それぞれ別個に収容されてもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
（実施例１） 結合核酸分子（Ａ）としてＡＭＰアプタマー、触媒核酸分子（Ｄ）としてＥＡＤ２と備える一本鎖の前記核酸素子（II）を作製し、核酸センサとしての性能を確認した。
前記核酸素子として、下記配列のＤＮＡを合成した（図２参照）。前記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＡ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）であり、５’側の下線部が、配列番号１１のＥＡＤ２（Ｄ）であり、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）であり、３’側の下線部が、配列番号１のＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.D4.A4 （配列番号４６）
5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A5 （配列番号４７）
5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A4 （配列番号５０）
5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
エッペンドルフチューブに、下記組成の反応液１００μＬを調製し、２５℃で６０秒反応させた後、前記反応液について、吸光度の測定（波長４１５ｎｍ）を行った。測定は、吸光度測定装置（商品名ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ、ＴＥＣＡＮ社）を使用した。前記反応液において、前記ＤＮＡｚｙｍｅバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とした。基質は、ＡＢＴＳ（2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)を使用した。
Figure 0005999786
同時に、ネガティブコントロールとして、前記核酸センサを除いた反応液（ＮＣ）についても、同様に反応を行った。また、ポジティブコントロールとして、前記核酸センサに代えて、前記配列番号１１のＥＡＤ２を使用した反応液（ＰＣ）についても、同様に反応を行った。
ＥＡＤ２（配列番号１１） CTGGGAGGGAGGGAGGGA
これらの結果を図５に示す。図５は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図５に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰを含む反応液の吸光度は、ＡＭＰ無添加の反応液の吸光度に対して、有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、ＡＭＰの有無および濃度を測定可能であると言え、具体的には１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰであっても検出可能であると言える。
（実施例２）
前記実施例１における核酸素子ＡＭＰ．Ｄ４．Ａ５（配列番号４７）を核酸センサとして使用し、ＡＭＰ濃度を変化させて、測定を行った。
反応液におけるＡＭＰ濃度を、所定濃度（０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ）とし、反応時間を１７０秒とした以外は、前記実施例１と同様にして反応を行い、吸光度の測定を行った。ネガティブコントロール（ＮＣ）およびポジティブコントロール（ＰＣ）も、ＡＭＰ濃度以外は、前記実施例１と同様とした。
これらの結果を図６に示す。図６は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図６のＮＣ、ＡＭＰ．Ｄ４．Ａ５およびＰＣにおいて、それぞれ５つのバーは、左から、ＡＭＰ濃度が、０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌの結果を示す。図６に示すように、ＤＮＡｚｙｍｅであるＥＡＤ２のみを使用したネガティブコントロール（ＮＣ）では、ＡＭＰの濃度に依存的な吸光度の増加は確認されなかった。これに対して、実施例の核酸センサを使用した場合、ＡＭＰ濃度に依存して、吸光度の増加が確認された。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定により、ＡＭＰの濃度を測定可能であると言える。
（実施例３） 結合核酸分子（Ａ）としてＡＭＰアプタマー、触媒核酸分子（Ｄ）としてｎｅｃｏ０５８４を備える一本鎖の前記核酸素子（II）を作製し、核酸センサとしての性能を確認した。
前記核酸素子として、下記配列のＤＮＡを合成した（図２参照）。前記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＡ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）であり、５’側の下線部が、配列番号１８のｎｅｃｏ０５８４（Ｄ）であり、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）であり、３’側の下線部が、配列番号１のＡＴＰまたはＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.neco.D3.A3 （配列番号５３）
5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A4 （配列番号５４）
5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A5 （配列番号５５）
5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A5 （配列番号６３）
5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
前記核酸センサを使用した以外は、前記実施例と同様にして反応を行い、吸光度を測定した。同時に、ネガティブコントロールとして、前記核酸センサを除いた反応液（ＮＣ）についても、同様に反応を行った。また、ポジティブコントロールとして、前記核酸センサに代えて、前記配列番号１８のｎｅｃｏ０５４８を使用した反応液（ＰＣ）についても、同様に反応を行った。
ｎｅｃｏ０５８４（配列番号１８） GGGTGGGAGGGTCGGG
これらの結果を図７に示す。図７は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図７に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰを含む反応液の吸光度は、ＡＭＰ無添加の反応液の吸光度に対して、有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、ＡＭＰの有無および濃度を測定可能であると言え、具体的には１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰであっても検出可能であると言える。
（実施例４） 結合核酸分子（Ａ）としてＡＴＰまたはＡＭＰアプタマー、触媒核酸分子（Ｄ）としてＤＮＡｚｙｍｅとを備える二本鎖の前記核酸素子（Ｉ）を作製し、核酸センサとしての性能を確認した。
前記第１鎖核酸（ｓｓ１）として、下記配列のＤＮＡを合成した（図１参照）。下記配列において、５’側の下線部が、配列番号１のＡＭＰアプタマー（Ａ）、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）、３’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（Ｄ）とした。
AMP.neco.D0.A0 （配列番号２）
5’-CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTTTTTTTGGGTGGGAGGGTCGGG-3’
つぎに、前記第１鎖（ｓｓ１）に対する第２鎖（ｓｓ２）として、下記配列のＤＮＡを合成した（図１参照）。下記配列において、５’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＤＮＡｚｙｍｅの５’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＤ）であり、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（図１においてＬ２）であり、３’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＡＭＰアプタマーの３’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＡ）とした。
AMP.neco.D7.A8 （配列番号３５）
5’-CTCCTTCCTTTTTTTTCCCACCC-3’
エッペンドルフチューブに、下記組成の反応液１００μＬを調製し、２５℃で６０秒反応させた後、前記反応液について、吸光度の測定（波長４１５ｎｍ）を行った。測定は、吸光度測定装置（商品名ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ、ＴＥＣＡＮ社）を使用した。前記反応液において、前記ＤＮＡｚｙｍｅバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とした。基質は、ＡＢＴＳを使用した。
Figure 0005999786
同時に、ポジティブコントロールとして、前記核酸センサに代えて、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅを使用した反応液（ＰＣ）について、同様に反応を行った。また、ネガティブコントロールとして、核酸センサを除いた反応液（ＮＣ）についても、同様に反応を行った。
ｎｅｃｏ０５８４（配列番号１８） GGGTGGGAGGGTCGGG
これらの結果を図８に示す。図８は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図８に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰを含む反応液の吸光度は、ＡＭＰ無添加の反応液の吸光度に対して、有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、ＡＭＰの有無および濃度を測定可能であると言え、具体的には１μｍｏｌ／ＬのＡＭＰであっても検出可能であると言える。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
本発明によれば、前記結合核酸分子（Ａ）とＡＴＰまたはＡＭＰとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能のＯＮ−ＯＦＦをスイッチでき、且つ、その感度に優れる。このため、前記触媒核酸分子の触媒機能を検出することで、ＡＴＰまたはＡＭＰの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。

Claims (11)

  1. 触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）と、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する結合核酸分子（Ａ）とを有する核酸素子を含み、
    前記核酸素子は、配列番号４７の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、
    前記触媒核酸分子（Ｄ）が、下記（ｄ１）、（ｄ２）または（ｄ３）のポリヌクレオチドであり、前記結合核酸分子（Ａ）が、下記（ａ１）、（ａ２）または（ａ３）のポリヌクレオチドである、ポリヌクレオチドであることを特徴とする、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析用核酸センサ。
    （ｄ１）配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｄ２）前記（ｄ１）の前記塩基配列において、１または２個の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
    （ｄ３）前記（ｄ１）の前記塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つ、酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
    （ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ａ２）前記（ａ１）の前記塩基配列において、１または２個の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合するポリヌクレオチド
    （ａ３）前記（ａ１）の前記塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合可能なポリヌクレオチド
  2. 基材、核酸センサおよび検出部を含み、
    前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、
    前記核酸センサは、請求項１記載の核酸センサであり、
    前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とするＡＴＰまたはＡＭＰの分析用デバイス。
  3. 前記核酸センサが、リンカーを介して、前記基材に連結されている、請求項２記載の分析用デバイス。
  4. 前記核酸センサが、前記検出部に配置されている、請求項２または３記載の分析用デバイス。
  5. 前記検出部は、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
  6. 前記シグナルが、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルである、請求項５記載の分析用デバイス。
  7. さらに、試薬部を有し、
    前記試薬部が、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
  8. 請求項１記載のＡＴＰまたはＡＭＰの分析用核酸センサに試料を接触させる接触工程、および、
    前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のＡＴＰまたはＡＭＰを検出する検出工程を含むことを特徴とする、ＡＴＰまたはＡＭＰの分析方法。
  9. 前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項８記載の分析方法。
  10. 請求項２〜７のいずれか一項に記載の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、
    前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のＡＴＰまたはＡＭＰを検出する検出工程を含むことを特徴とするＡＴＰまたはＡＭＰの分析方法。
  11. 前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項１０記載の分析方法。
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