JP5959026B2 - メラミンの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、メラミンの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法に関する。
メラミンは、窒素含有量の高い有機窒素化合物である。近年、見かけのタンパク質量を増加させるために、牛乳や粉ミルク等の加工品にメラミンが混入され、これが原因で、乳幼児に腎不全が多発するという問題が生じている。このような、メラミンが混入された食品の摂取ならびに流通を防止するために、食品中のメラミンの分析は、極めて重要視されている。日本の厚生労働省におけるメラニン濃度の基準値は、0.5ppmであるが、人体への影響等の点から、実質的には、500ppm程度のメラニン濃度が検出できればよいとされている。
現在、メラミンの分析には、フーリエ変換赤外分光分析法(FTIR)が使用されている。しかしながら、FTIR用の分析装置は、極めて高額な大型装置であるため、例えば、食品の輸入業者、販売会社、小売業者、消費者等が、容易に使用することができず、前記分析装置を有している検査機関に依頼せざるを得ないという問題がある。
そこで、新たな検出方法として、メラミンに結合する核酸分子(いわゆるアプタマー)を使用する方法の構築が試みられている(非特許文献1)。具体的には、前記核酸分子を固定化したナノゴールドコロイド粒子を使用し、触媒的共鳴散乱スペクトルを分析する方法が提案されている。この方法によれば、前記コロイド粒子に固定化された前記核酸分子間でメラミンが結合すると、前記コロイド粒子の触媒能が失活する。このため、前記触媒的共鳴散乱スペクトルにより、触媒能を有無や減少を分析することで、試料中のメラミンの有無および量を分析できると考えられている。しかしながら、この方法によっても、特殊な装置が必要であり、簡便な分析とは言い難い。
A Highly Sensitive Aptamer-Nanogold Catalytic Resonance Scattering Spectral Assay for Melamine. Aihui Liang, J Fluoresc (2011) 21:1907−1912
そこで、本発明は、メラミンを分析するための新たなセンサを提供することを目的とする。
本発明の分析用核酸センサは、メラミンの分析用核酸センサであり、触媒機能を生起する触媒核酸分子(D)およびメラミンに結合する結合核酸分子(A)を有する下記(x1)、(x2)、(x3)または(x4)のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
(x1)配列番号1〜14のいずれか一つの塩基配列からなり、nおよびmは、正の整数であるポリヌクレオチド
(x2)前記(x1)の前記塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加および/または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x3)前記(x1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x4)前記(x1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x1)配列番号1〜14のいずれか一つの塩基配列からなり、nおよびmは、正の整数であるポリヌクレオチド
(x2)前記(x1)の前記塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加および/または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x3)前記(x1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x4)前記(x1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
本発明の分析用デバイスは、メラミンの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサが、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明の分析用キットは、容器および核酸センサを含み、前記核酸センサは、前記本発明の核酸センサであることを特徴とする。
本発明の分析方法は、メラミンの分析方法であり、前記本発明のメラミンの分析用核酸センサに試料を接触させる工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の分析方法は、メラミンの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに試料を接触させる工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の核酸センサによれば、前記結合核酸分子(A)とメラミンとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能のON−OFFをスイッチできる。このため、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することで、メラミンの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、メラミンの分析において極めて有用な技術といえる。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である。
(核酸センサおよびそれを用いた分析方法)
本発明のメラミンの分析用核酸センサは、前述のように、触媒機能を生起する触媒核酸分子(D)およびメラミンに結合する結合核酸分子(A)を有する下記(x1)、(x2)、(x3)または(x4)のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
(x1)配列番号1〜14のいずれか一つの塩基配列からなり、nおよびmは、正の整数であるポリヌクレオチド
(x2)前記(x1)の前記塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加および/または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x3)前記(x1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x4)前記(x1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
本発明のメラミンの分析用核酸センサは、前述のように、触媒機能を生起する触媒核酸分子(D)およびメラミンに結合する結合核酸分子(A)を有する下記(x1)、(x2)、(x3)または(x4)のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
(x1)配列番号1〜14のいずれか一つの塩基配列からなり、nおよびmは、正の整数であるポリヌクレオチド
(x2)前記(x1)の前記塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加および/または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x3)前記(x1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
(x4)前記(x1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
配列番号1 GGGTGGGAGGGTCGGGccctCGC(T) n GCG
配列番号2 GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC(T) n GCG
配列番号3 GGGTGGGAGGGTCGGGccctttCGC(T) n GCG
配列番号4 GGGTGGGAGGGTCGGGcaccctCGC(T) n GCG
配列番号5 GGGTGGGAGGGTCGGGccctccCGC(T) n GCG
配列番号6 GGGTGGGAGGGTCGGGccctccCGC(T) n GCGg
配列番号7 GGGTGGGAGGGTCGGGcccGCGCG(T) n CGCGC
配列番号8 GGGTGGGAGGGTCGGGacccGCGCG(T) n CGCGC
配列番号9 GGGTGGGAGGGTCGGGcacccGCGCG(T) n CGCGC
配列番号10 GCGCG(T) n CGCGCcgcgcGGGTGGGAGGGTCGGG
配列番号11 GCGCG(T) n CGCGCacgcgcGGGTGGGAGGGTCGGG
配列番号12 GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC(T) m GGC(T) n GCC(T) m GCG
配列番号13 GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC(T) m AGGC(T) n GCC(T) m GCG
配列番号14 AGGGACGGGAAGAACGC(T) n GCGAAAATGTGGAGGGT
配列番号2 GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC(T) n GCG
配列番号3 GGGTGGGAGGGTCGGGccctttCGC(T) n GCG
配列番号4 GGGTGGGAGGGTCGGGcaccctCGC(T) n GCG
配列番号5 GGGTGGGAGGGTCGGGccctccCGC(T) n GCG
配列番号6 GGGTGGGAGGGTCGGGccctccCGC(T) n GCGg
配列番号7 GGGTGGGAGGGTCGGGcccGCGCG(T) n CGCGC
配列番号8 GGGTGGGAGGGTCGGGacccGCGCG(T) n CGCGC
配列番号9 GGGTGGGAGGGTCGGGcacccGCGCG(T) n CGCGC
配列番号10 GCGCG(T) n CGCGCcgcgcGGGTGGGAGGGTCGGG
配列番号11 GCGCG(T) n CGCGCacgcgcGGGTGGGAGGGTCGGG
配列番号12 GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC(T) m GGC(T) n GCC(T) m GCG
配列番号13 GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC(T) m AGGC(T) n GCC(T) m GCG
配列番号14 AGGGACGGGAAGAACGC(T) n GCGAAAATGTGGAGGGT
前記配列番号1〜13の塩基配列において、下線部が、前記結合核酸分子(A)および前記触媒核酸分子(D)を示す。具体的に、配列番号1〜9、12および13の塩基配列において、例えば、5’側の下線が、前記触媒核酸分子(D)であり、3’側の下線が、前記結合核酸分子(A)である。配列番号10および11において、例えば、5’側の下線が、前記結合核酸分子(A)であり、3’側の下線が、前記触媒核酸分子(D)である。配列番号14の塩基配列において、下線部が、前記結合核酸分子(A)であり、その両端の配列が、二本鎖型の前記触媒核酸分子(D)である。
本発明の核酸センサは、例えば、さらに、前記結合核酸分子(A)と前記触媒核酸分子(D)とを連結するリンカー配列(L)を有してもよい。前記リンカー配列(L)は、例えば、0〜14塩基長であり、より好ましくは0〜10塩基長であり、さらに好ましくは0〜7塩基長である。前記配列番号1〜13の塩基配列は、例えば、下線領域の間が前記リンカー配列(L)であり、さらなるリンカー配列(L)を有してもよい。
前記結合核酸分子(A)は、メラミンに結合する核酸分子であればよく、その分子内でメラミンに結合することが好ましい。前記結合核酸分子(A)は、以下、メラミンアプタマーともいう。前記結合核酸分子(A)は、例えば、ステム形成領域SAとループ領域とステム形成領域SA’とから構成される。前記ステム形成領域SAと前記ステム形成領域SA’とは、互いに相補性を示す配列からなり、例えば、メラミン存在下で、自己アニーリングによりステムを形成する。
前記ステム形成領域SAと前記ステム形成領域SA’は、それぞれ、例えば、1〜10塩基長であり、より好ましくは2〜7塩基長であり、さらに好ましくは3〜5塩基長である。前記ステム形成領域SAと前記ステム形成領域SA’は、例えば、同じ塩基長でも、異なる塩基長でもよく、好ましくは前者であり、両者が完全に相補な配列であることが、より好ましい。
前記ループ領域は、例えば、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)のポリヌクレオチド(以下、ポリdT)であり、(T)nで表わすことができる。nは、正の整数である。nは、例えば、3〜100であり、好ましくは6〜70であり、より好ましくは6〜60または10〜60であり、さらに好ましくは6〜48または12〜48である。
前記結合核酸分子(A)は、例えば、ポリdTからなるループ領域の他に、さらに、ポリdTからなるインターナルループ領域を有してもよい。このような結合核酸分子(A)を、例えば、タンデム型ともいう。
前記結合核酸分子(A)の長さは、特に制限されないが、例えば、9〜120塩基長であり、より好ましくは20〜70塩基長であり、さらに好ましくは18〜54塩基長である。
前記結合核酸分子(A)は、具体例として、例えば、以下の配列があげられる。
CGC(T)nGCG (配列番号57)
Mel01 n=7
Mel02 n=8
Mel03 n=9
Mel04 n=10
Mel05 n=11
Mel06 n=12
GCGCG(T)nCGCGCG(配列番号58)
Mel07 n=7
Mel08 n=8
Mel09 n=9
Mel10 n=10
Mel11 n=11
Mel12 n=12
CGC(T)nGCG (配列番号57)
Mel01 n=7
Mel02 n=8
Mel03 n=9
Mel04 n=10
Mel05 n=11
Mel06 n=12
GCGCG(T)nCGCGCG(配列番号58)
Mel07 n=7
Mel08 n=8
Mel09 n=9
Mel10 n=10
Mel11 n=11
Mel12 n=12
前記触媒核酸分子(D)は、触媒機能を生起する核酸分子であればよい。前記触媒機能は、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応であればよい。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性(以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という)等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)活性があげられる。前記触媒核酸分子(D)は、後述するようなDNAの場合、DNAエンザイムまたはDNAzymeと呼ぶことができ、また、後述するようなRNAの場合、RNAエンザイムまたはRNAzymeと呼ぶことができる。
前記触媒核酸分子(D)は、G−カルテット(またはG−tetradという)の構造を形成する核酸が好ましく、より好ましくはグアニン四重鎖(またはG−quadruplexという)の構造を形成する核酸である。前記G−tetradは、例えば、グアニンが四量体となった面の構造であり、G−quadruplexは、例えば、前記G−tetradが複数面重なった構造をいう。前記G−tetradおよび前記G−quadruplexは、例えば、反復してGリッチの構造モチーフを有する核酸において、形成される。前記G−tetradは、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型があげられるが、パラレル型が好ましい。
前記触媒核酸分子(D)は、ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましく、具体的には、前記G−tetradを形成し且つ前記ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましい。前記G−tetradを有する核酸は、例えば、前記ポルフィリンと結合して複合体を形成することによって、前述のような酸化還元反応の触媒機能を生起することが知られている。前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子(D)は、例えば、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合していない状態で、前記リンカー配列(L)または前記結合核酸分子(A)との間でステムを形成することにより、前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記ポルフィリンと結合することが好ましい。具体的には、前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子(D)は、例えば、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合していない状態で、前記G−tetradの形成が阻害され且つこれにより前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合することにより、前記G−tetradを形成し且つ前記ポルフィリンと結合することが好ましい。
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、N−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
前記触媒核酸分子(D)は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子(D)が一本鎖の場合、例えば、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合していない状態で、前記触媒核酸分子(D)は、前記リンカー配列(L)または前記結合核酸分子(A)との間でステムを形成することにより、前記G−tetradの形成が阻害され、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記G−tetradを形成する。また、前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子(D)が二本鎖の場合、例えば、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合していない状態では、前記結合核酸分子(A)の構造が揺らいでいるため、前記触媒核酸分子(D)の前記G−tetradの形成が阻害され、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合することにより、前記G−tetradを形成する。前記触媒核酸分子(D)は、一本鎖の場合、例えば、15〜30塩基長であり、より好ましくは15〜24塩基長であり、さらに好ましくは15〜18塩基長である。二本鎖の場合、それぞれの鎖が、例えば、7〜21塩基長であり、より好ましくは7〜17塩基長であり、さらに好ましくは7〜14塩基長である。
前記二本鎖の触媒核酸分子(D)は、例えば、以下の配列の組合せがあげられる。
5’-AGGGACGGGAAGAA-3’ (配列番号59)
3’-TGGGAGGTGTAAAA-5’ (配列番号60)
5’-AGGGACGGGAAGAA-3’ (配列番号59)
3’-TGGGAGGTGTAAAA-5’ (配列番号60)
前記一本鎖の触媒核酸分子(D)は、例えば、以下の配列があげられる。
neco0584(配列番号61)
5’-GGGTGGGAGGGTCGGG-3’
neco0584(配列番号61)
5’-GGGTGGGAGGGTCGGG-3’
前記触媒核酸分子(D)は、前述のように、例えば、メラミン非存在下において、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合していない状態で、前記リンカー配列(L)との間でステムを形成することにより、触媒機能が阻害され、前記結合核酸分子(A)にメラミンが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記触媒機能が生起されることが好ましい。このため、前述のように、前記核酸センサは、さらに、前記触媒核酸分子(D)と前記結合核酸分子(A)との間に、これらを連結する前記リンカー配列(L)を有することが好ましい。前記リンカー配列(L)の塩基配列は、例えば、前記触媒核酸分子の配列に応じて設定できる。
本発明の核酸センサは、前述のように、前記触媒核酸分子(D)および前記結合核酸分子(A)を有する前記(x1)、(x2)、(x3)または(x4)のポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、例えば、メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチドである。
前記(x1)のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14のいずれか一つの塩基配列からなり、nおよびmは、正の整数である。前記nは、例えば、前述の数値があげられ、6〜48が好ましい。配列番号12および13のヌクレオチドは、2つの前記(T)mが、内部ループを形成することから、それぞれのmは、例えば、2〜31であり、好ましくは2〜24であり、より好ましくは3〜17であり、さらに好ましくは4〜10である。
前記(x2)のポリヌクレオチドは、前記(x1)の前記塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加および/または挿入された塩基配列からなる。前記(x2)において、「1または複数」は、特に制限されない。前記置換された塩基の数は、前記塩基配列(x1)において、例えば、1〜5個であり、好ましくは1〜4個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個または2個、特に好ましくは1個である。前記付加または挿入された塩基の数は、前記塩基配列(x1)において、例えば、1〜5個であり、好ましくは1〜4個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個または2個、特に好ましくは1個である。前記欠失された塩基の数は、前記塩基配列(x1)において、例えば、1〜5個であり、好ましくは1〜4個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは2個または1個、特に好ましくは1個である。
前記(x3)のポリヌクレオチドは、前記(x1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなる。前記(x3)において、前記同一性は、前記塩基配列(x1)に対して、例えば、70%以上、好ましくは80%以上、85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、特に好ましくは99%以上である。前記同一性は、例えば、BLAST等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
前記(x4)のポリヌクレオチドは、前記(x1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなる。前記(x4)において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、例えば、0.7〜1mol/LのNaCl存在下、60〜68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍のSSC溶液を用い、65〜68℃で洗浄することにより塩基配列を同定できる条件をいう。1×SSCは、150mmol/LのNaCl、15mmol/Lのクエン酸ナトリウムからなる。
前記核酸センサは、例えば、前記(x1)〜(x4)のいずれかのポリヌクレオチドからなるセンサでもよいし、前記ポリヌクレオチドを含むセンサでもよい。後者の場合、例えば、さらに、前記ポリヌクレオチドの5’末端に連結した5’末端付加配列を有してもよく、また、前記ポリヌクレオチドの3’末端に連結した3’末端付加配列を有してもよく、前記5’末端付加配列および前記3’末端付加配列の両方を有してもよい。前記5’末端付加配列は、例えば、0〜22塩基長であり、より好ましくは0〜18塩基長であり、さらに好ましくは0〜14塩基長であり、前記3’末端付加配列は、例えば、0〜18塩基長であり、より好ましくは0〜10塩基長であり、さらに好ましくは0〜7塩基長である。後述するように、前記核酸センサを固定化した使用する場合、例えば、固定化用のリンカー配列として、前記5’末端付加配列または前記3’末端付加配列を有してもよい。前記固定化用のリンカー配列は、例えば、ポリdT等があげられる。前記固定化用のリンカー配列の長さは、特に制限されず、例えば、0〜120塩基長であり、より好ましくは6〜80塩基長である。
前記核酸センサの具体例としては、例えば、(X1)、(X2)、(X3)または(X4)のポリヌクレオチドを含むセンサがあげられる。これらのポリヌクレオチドは、例えば、メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され、メラミン存在下、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起されるポリヌクレオチドである。
前記(X1)のポリヌクレオチドは、前記(x1)の塩基配列を含む、配列番号15〜56のいずれか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。これらの配列を、下記表1〜4に示す。
前記表1の各(X1)ポリヌクレオチドは、配列番号1または2の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号1または2の塩基配列の5’末端に0〜5塩基(0、1、5塩基)の付加配列、3’末端に0〜12塩基(0、6、12、16塩基)の付加配列を有している。
前記表2の(X1)ポリヌクレオチドは、配列番号3、4、5、7、8または9の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号3、4、5、7、8または9の塩基配列の5’末端に0〜3塩基(0、1、3塩基)の付加配列、3’末端に0〜6(0、6塩基)の付加配列を有している。
前記表3の(X1)ポリヌクレオチドは、配列番号10または11の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号10または11の塩基配列の5’末端に5または6塩基の付加配列を有している。
前記表4の(X1)ポリヌクレオチドのうち、配列番号48または47の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号12または13の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号12または13の塩基配列の5’末端に1塩基の付加配列を有している。前記表4の(X1)ポリヌクレオチドのうち、配列番号40、49、50および51の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、前記配列番号14の塩基からなるポリヌクレオチドである。
前記(X2)のポリヌクレオチドは、前記(X1)の前記塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加および/または挿入された塩基配列からなる。前記(X2)において、「1または複数」は、特に制限されず、例えば、前記(x2)の例示を援用できる。具体例として、前記表1において、前記配列番号39の塩基からなるポリヌクレオチドは、前記配列番号2の塩基配列における5’末端のCをTに置換した配列を含み、具体的には、配列番号38の塩基配列における3’側下線部の5’末端のCがTに置換した配列からなる。
前記(X3)のポリヌクレオチドは、前記(X1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなる。前記同一性は、例えば、前記(x3)の例示を援用できる。
前記(X4)のポリヌクレオチドは、前記(X1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなる。前記「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」は、例えば、前記(x4)の例示を援用できる。
本発明の核酸センサの大きさは、特に制限されず、例えば、15〜130塩基長であり、より好ましくは20〜110塩基長であり、さらに好ましくは30〜90塩基長である。
本発明の核酸センサの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記核酸センサは、例えば、前記ヌクレオチド残基を含む分子であり、前記ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、前記ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。前記核酸センサは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸センサは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むDNAでもよいし、リボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むRNAでもよいし、前者と後者とを含むキメラ(DNA/RNA)でもよい。前記核酸センサは、好ましくはDNAであり、例えば、DNAセンサということもできる。
前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基(非人工塩基)および非天然塩基(人工塩基)のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、A、C、G、T、Uおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、2’−フルオロピリミジン、2’−O−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、2’−フルオロウラシル、2’−アミノウラシル、2’−O−メチルウラシル、2’−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、2’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記結合核酸分子(A)は、例えば、PNA(ペプチド核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid)等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
本発明の核酸センサは、例えば、メラミンの非存在において、前記触媒核酸分子(D)が部分的に前記リンカー配列とステムを形成し、これによって、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このステム形成で、前記触媒核酸分子(D)がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子(D)が、触媒機能を生起する構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、メラミンの存在下、前記メラミンと前記結合核酸分子(A)との結合により、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子(D)が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。前記核酸センサは、このように、メラミンが非存在の場合、例えば、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が阻害され(スイッチOFF)、メラミンが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能が生起される(スイッチON)。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
本発明の核酸センサは、例えば、遊離状態で使用してもよいし、固定化した状態で使用してもよい。後者の場合、例えば、前記核酸センサを前記基材に固定化し、デバイスとして使用できる。前記基材は、例えば、プレート、シート、フィルム、スワブ等の基板;ウェルプレート、チューブ等の容器;ビーズ、粒子、フィルター等があげられる。前記核酸センサは、例えば、5’末端および3’末端のいずれを固定化してもよい。
前記固定化方法は、特に制限されず、例えば、化学的結合による連結が例示できる。具体例としては、例えば、前記担体および前記核酸センサのいずれか一方に、ストレプトアビジンまたはアビジンを結合させ、他方に、ビオチンを結合させ、前者と後者との結合を利用して固定化する方法があげられる。
前記固定化方法は、例えば、この他に、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許5,424,186号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法は、例えば、前記基材上で前記核酸センサを合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許5,807,522号明細書、特表平10−503841号公報等を参照できる。
前記核酸センサは、例えば、前記基材に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。前者の場合、例えば、前記核酸センサの末端において、前記核酸センサを前記基材に固定化することが好ましい。後者の場合、例えば、前記核酸センサを、固定化用のリンカー配列を介して、前記基材に固定化してもよい。前記核酸センサの前記基材への配置は、例えば、後述する本発明の分析用デバイスを参照できる。
本発明の核酸センサの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のメラミンの分析方法に使用できる。
本発明の分析方法は、前述のように、メラミンの分析方法であり、前記本発明の核酸センサに、試料を接触させる接触工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、メラミンを含む試料、およびメラミンを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。被検体が、例えば、液体の場合、前記被検体をそのまま試料として使用してもよいし、溶媒に混合した希釈液を試料として使用してもよい。被検体が、例えば、固体、粉末等の場合は、溶媒に混合した混合液、または、溶媒に懸濁した懸濁液等を、試料として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記被検体の具体例は、例えば、原乳、加工乳、粉ミルク等があげられる。
本発明の核酸センサを遊離状態で使用する際は、例えば、前記容器内で、前記核酸センサと前記試料とを接触させることが好ましい。また、本発明の核酸センサを前記基材に固定化した状態で使用する際は、例えば、前記基材上の前記核酸センサに、前記試料を接触させることができる。
前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能により生成されるシグナルを検出することが好ましい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルおよび電気化学的シグナル等があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色シグナル、発光シグナル、蛍光シグナル等があげられる。
前記シグナルは、例えば、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能により、基質から生成されることが好ましい。そこで、前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能に応じた基質の存在下で、行うことが好ましい。
前記基質は、例えば、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光が消失する生成物を生成する基質、また、前記触媒機能によって、異なる発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質等があげられる。このような基質によれば、例えば、発色、発光もしくは蛍光の有無、または、発色、発光もしくは蛍光の変化や強度等をシグナルとして、目視で確認することにより、前記触媒機能を検出できる。また、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等をシグナルとして、光学的な手法で測定することにより、前記触媒機能を検出することもできる。前記触媒機能は、例えば、前述のような酸化還元反応の触媒機能があげられる。
また、前記触媒核酸分子(D)が、前記酸化還元反応の触媒機能を有する場合、例えば、電子の授受が可能な基質があげられる。この場合、前記触媒核酸分子(D)により、例えば、前記基質から生成物が生成され、その過程において、電子の授受が生じる。この電子授受は、例えば、電極への印加により、電気シグナルとして、電気化学的に検出できる。前記電気シグナルの検出は、例えば、電流等のような、前記電気シグナルの強度を測定することにより行える。
前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)、1,2-Phenylenediamine(OPD)、2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt(ABTS)、3,3’-Diaminobenzidine(DAB)、3,3’-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate(DAB4HCl)、3-Amino-9-ethylcarbazole(AEC)、4-Chloro-1-naphthol(4C1N)、2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic Acid、2,4-Dichlorophenol、4-Aminoantipyrine、4-Aminoantipyrine Hydrochloride、ルミノール等があげられる。
前記検出工程において、前記基質は、例えば、前記核酸センサに前記試料を接触させる前に、予め、前記核酸センサに供給してもよいし、前記試料の接触と同時または前記試料を接触させた後、前記核酸センサに供給してもよい。前記基質は、例えば、液体に混合した基質液として、前記核酸センサに供給することが好ましい。前記基質を混合する液体は、例えば、Tris−HCl等の緩衝液が好ましい。前記基質液における前記基質の濃度は、特に制限されず、例えば、0.1〜5mmol/Lであり、好ましくは0.5〜2mmol/Lである。また、前記基質液のpHは、例えば、6〜9であり、好ましくは6.8〜9である。
前記検出工程において、前記触媒核酸分子(D)による反応条件は、特に制限されない。温度は、例えば、15〜37℃であり、時間は、例えば、10〜900秒である。
また、前記検出工程において、前記基質の他に、例えば、ポルフィリンを共存させてもよい。公知のDNAzymeには、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することによって、さらに高い酸化還元活性を示すものがある。そこで、本発明においても、例えば、ポルフィリンを共存させて、前記触媒核酸分子(D)とポルフィリンとの複合体として、酸化還元活性を検出してもよい。前記ポルフィリンの供給は、特に制限されず、前記基質と同様に行うことができる。
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、N−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
本発明の分析方法において、前記接触工程と前記検出工程との間に、さらに、洗浄工程を有してもよい。前記洗浄工程は、例えば、前記核酸センサと前記試料とを接触させた後、前記核酸センサを洗浄液で洗浄する工程である。前記洗浄工程によって、例えば、前記試料中に含まれる夾雑物を除去でき、さらに精度に優れる分析が可能となる。前記洗浄液は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられる。前記核酸センサは、例えば、前記洗浄工程が容易に行えることから、前述のような基材に固定化されていることが好ましい。
(分析用デバイスおよびそれを用いた分析方法)
本発明の分析用デバイスは、メラミンの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサは、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明の分析用デバイスは、メラミンの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサは、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明の分析用デバイスは、前記本発明の核酸センサを使用することが特徴であって、その他の構成に関しては何ら制限されない。特に説明しない限り、本発明の分析用デバイスは、例えば、前記本発明の核酸センサの説明を援用できる。
本発明の分析用デバイスにおいて、前記核酸センサの配置方法は、特に制限されない。前記分析用デバイスにおいて、前記核酸センサは、例えば、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前記核酸センサの配置に関しては、例えば、前記本発明の核酸センサの説明を援用できる。
前記基材における前記核酸センサの配置部位は、特に制限されず、例えば、前記検出部に配置されている形態があげられる。
本発明の分析用デバイスは、例えば、さらに、試薬部を有してもよい。前記試薬部は、例えば、前記検出部に配置してもよい。前記試薬部は、例えば、予め試薬が配置されてもよいし、使用時に試薬を供給してもよい。前記試薬としては、例えば、前述のような基質、前記ポルフィリン等があげられる。
本発明の分析用デバイスにおいて、前記検出部は、前述のように、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出する検出部である。前記検出部は、例えば、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部であることが好ましい。前記シグナルは、前述のように、例えば、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能による、基質からのシグナルがあげられる。前記シグナルは、例えば、前述のような、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルがあげられる。前記検出部は、例えば、外部から前記検出部において発生するシグナルが検出されることから、被検出部ということもできる。
前記シグナルが光学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、光学的シグナルの検出部であり、吸光度、反射率、蛍光強度等の検出部が例示できる。
前記シグナルが前記電気化学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、電極系を有する。この場合、前記検出部は、例えば、前記基材の表面に、前記電極系を配置することによって形成できる。前記電極の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法、スクリーン印刷法、メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記基材に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置は、例えば、他の部材を介した配置があげられる。
前記電極系は、例えば、作用極および対極を含んでもよいし、作用極、対極および参照極を含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極、銀電極、金電極、カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀/塩化銀の電極があげられる。前記銀/塩化銀の電極は、例えば、銀電極への塩化銀電極の積層により形成できる。
本発明の分析用デバイスが、前記電極系を有する場合、前記核酸センサは、例えば、前記電極系に配置すること好ましく、前記電極の中でも前記作用極に配置することが好ましい。本発明の分析用デバイスが、前記電極系と前記試薬部とを有する場合、例えば、前記電極系の上に、前記試薬部を配置することが好ましい。
本発明の分析用デバイスは、例えば、複数の検出部を備えてもよい。この場合、前記分析用デバイスは、例えば、前記基材の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に、前述のような検出部を備えることが好ましい。本発明の分析用デバイスにおいて、1つの検出部に配置する核酸センサの数は、特に制限されない。
前記基材は、特に制限されない。前記基材は、例えば、表面が絶縁性の基板が好ましい。前記基材は、例えば、絶縁材料からなる基板でもよいし、表面に絶縁材料からなる絶縁層を有する基材でもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック、絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等があげられる。
本発明の分析方法は、前述のように、メラミンの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
本発明の分析方法は、前記本発明の核酸センサを備える前記分析用デバイスを使用することが特徴であって、その他の条件は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、例えば、前記本発明の核酸センサにおける分析方法の説明を援用できる。
(分析用試薬)
本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸センサを含むことを特徴とする。本発明の分析用試薬は、前記核酸センサを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸センサを含むことを特徴とする。本発明の分析用試薬は、前記核酸センサを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の分析用試薬は、前記核酸センサの他に、例えば、前記基質、前記ポルフィリン、前記緩衝液、および/または前記基材等の構成成分を含んでもよい。
本発明の分析用試薬は、例えば、分析用キットでもよい。この場合、例えば、前記核酸センサと、前述したその他の構成成分とを含み、それぞれ別個に収容されてもよい。前記核酸センサは、例えば、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
(実施例1)
核酸センサについて、固定化用の付加配列の長さの影響を確認した。具体的には、遊離状態の核酸センサを用い、固定化用の付加配列の長さを変化させ、遊離状態におけるメラミンの検出能を確認した。下記配列は、左側が5’末端であり、右側が3’末端とした(以下、同様)。
核酸センサについて、固定化用の付加配列の長さの影響を確認した。具体的には、遊離状態の核酸センサを用い、固定化用の付加配列の長さを変化させ、遊離状態におけるメラミンの検出能を確認した。下記配列は、左側が5’末端であり、右側が3’末端とした(以下、同様)。
(1)核酸センサ
結合核酸分子(A)として、メラミンアプタマーであるMel06(配列番号57、n=12)を有し、触媒核酸分子(D)として、DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を有する、下記表5の核酸センサを作製した。前記表5の配列において、3’末端側のポリdT配列は、固定化用の付加配列である。前記配列において、5’側の下線部がDNAzymeであり、3’側の下線部がメラミンアプタマーである。これらの核酸センサの二次構造を、図1に示す。図1は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
結合核酸分子(A)として、メラミンアプタマーであるMel06(配列番号57、n=12)を有し、触媒核酸分子(D)として、DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を有する、下記表5の核酸センサを作製した。前記表5の配列において、3’末端側のポリdT配列は、固定化用の付加配列である。前記配列において、5’側の下線部がDNAzymeであり、3’側の下線部がメラミンアプタマーである。これらの核酸センサの二次構造を、図1に示す。図1は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
(2)比色分析
マイクロウェルプレートのウェル内に、下記組成となるように、各種成分を添加した。
(ウェル内の組成)
1μmol/L 核酸センサ
3μmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
マイクロウェルプレートのウェル内に、下記組成となるように、各種成分を添加した。
(ウェル内の組成)
1μmol/L 核酸センサ
3μmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
つぎに、前記ウェルに5μmol/Lとなるようにメラミンを添加し、さらに、基質として、20mmol/LとなるようにABTS(2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)および0.5mmol/LとなるようにH2O2を添加した。この反応液を、25℃で60秒反応させ、吸光度の測定(波長415nm)を行った。測定は、測定装置(商品名TECAN infinite F200 plate reader、TECAN社)を使用した。
ポジティブコントロール(PC)として、前記核酸センサに代えて、前記DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を使用し、同様に測定した。また、ネガティブコントロール(NC)として、前記核酸センサを除いた反応液(without oligo)についても、同様に測定した。
これらの結果を図2に示す。図2は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図2に示すように、前記固定化用の付加配列の長さを変化させても、メラミンを検出可能であることが確認された。また、3’側に付加配列を有する核酸センサは、付加配列を有さない核酸センサよりも、優れたS/N比を示した。
(実施例2)
遊離状態の核酸センサについて、メラミンの検出能を確認した。
遊離状態の核酸センサについて、メラミンの検出能を確認した。
(1)核酸センサ
結合核酸分子(A)として、メラミンアプタマーであるMel04(配列番号57、n=10)、Mel05(配列番号57、n=11)、Mel06(配列番号57、n=12)、Mel11(配列番号58、n=11)、Mel12(配列番号58、n=12)を有し、触媒核酸分子(D)として、DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を有する、下記表6の核酸センサを作製した。前記表6の配列において、3’末端側のポリdT配列は、固定化用の付加配列である。前記配列において、5’側の下線部がDNAzymeであり、3’側の下線部がメラミンアプタマーである。これらの核酸センサの二次構造を、図3に示す。図3は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
結合核酸分子(A)として、メラミンアプタマーであるMel04(配列番号57、n=10)、Mel05(配列番号57、n=11)、Mel06(配列番号57、n=12)、Mel11(配列番号58、n=11)、Mel12(配列番号58、n=12)を有し、触媒核酸分子(D)として、DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を有する、下記表6の核酸センサを作製した。前記表6の配列において、3’末端側のポリdT配列は、固定化用の付加配列である。前記配列において、5’側の下線部がDNAzymeであり、3’側の下線部がメラミンアプタマーである。これらの核酸センサの二次構造を、図3に示す。図3は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
(2)比色分析
前記実施例1と同様にして、各核酸センサについて、吸光度の測定を行った。これらの結果を図4に示す。図4は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図4に示すように、実施例の全ての核酸センサについて、ノンパラメトリックの両側T検定で、メラミンを含む反応液は、メラミン未添加の反応液に対して、その吸光度が有意差を示した。中でも、N1Mel06_I1_A0_D5_T06は、ターゲット添加の場合、ターゲット未添加に対して、2.8倍の高い吸光度を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、メラミンの有無および濃度を測定可能であり、具体的には、5mmol/Lのメラミンであっても検出可能であることが確認された。
前記実施例1と同様にして、各核酸センサについて、吸光度の測定を行った。これらの結果を図4に示す。図4は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図4に示すように、実施例の全ての核酸センサについて、ノンパラメトリックの両側T検定で、メラミンを含む反応液は、メラミン未添加の反応液に対して、その吸光度が有意差を示した。中でも、N1Mel06_I1_A0_D5_T06は、ターゲット添加の場合、ターゲット未添加に対して、2.8倍の高い吸光度を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、メラミンの有無および濃度を測定可能であり、具体的には、5mmol/Lのメラミンであっても検出可能であることが確認された。
(実施例3)
遊離状態の核酸センサについて、メラミンの検出能を確認した。
遊離状態の核酸センサについて、メラミンの検出能を確認した。
(1)核酸センサ
結合核酸分子(A)として、メラミンアプタマーであるMel07(配列番号58、n=7)、Mel08(配列番号58、n=8)、Mel09(配列番号58、n=9)、およびMel10(配列番号58、n=10)を有し、触媒核酸分子(D)として、DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を有する、核酸センサを作製した。下記配列において、5’側の下線部がメラミンアプタマーであり、3’側の下線部がDNAzymeである。
結合核酸分子(A)として、メラミンアプタマーであるMel07(配列番号58、n=7)、Mel08(配列番号58、n=8)、Mel09(配列番号58、n=9)、およびMel10(配列番号58、n=10)を有し、触媒核酸分子(D)として、DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を有する、核酸センサを作製した。下記配列において、5’側の下線部がメラミンアプタマーであり、3’側の下線部がDNAzymeである。
(2)化学発光分析
エッペンドルフチューブに、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、25℃で60秒反応させた後、前記反応液について、相対化学発光強度(RLU)を測定した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした(以下、同様)。測定は、測定装置(商品名TECAN infinite、TECAN社)を使用した。基質は、ルミノール誘導体であるL−012(和光純薬社)を使用した。
エッペンドルフチューブに、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、25℃で60秒反応させた後、前記反応液について、相対化学発光強度(RLU)を測定した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした(以下、同様)。測定は、測定装置(商品名TECAN infinite、TECAN社)を使用した。基質は、ルミノール誘導体であるL−012(和光純薬社)を使用した。
(試薬1)
400nmol/L 核酸センサ
200nmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
5mmol/L メラミン
(試薬3)
25μmol/L L−012
25μmol/L H2O2
400nmol/L 核酸センサ
200nmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
5mmol/L メラミン
(試薬3)
25μmol/L L−012
25μmol/L H2O2
ポジティブコントロール(PC)として、前記核酸センサに代えて、前記DNAzymeであるneco0584(配列番号61)を使用し、同様に測定した。また、ネガティブコントロール(NC)として、前記核酸センサを除いた反応液についても、同様に測定した。PCおよびNCは、以下の実施例でも同様とした。
これらの結果を図5に示す。図5は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。図5に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、メラミンを含む反応液は、メラミン未添加の反応液に対して、その発光強度が有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、発光強度測定によって、メラミンの有無および濃度を測定可能であることがわかった。
下記実施例4から実施例9における核酸センサを、表8に示す。
(実施例4)
前記実施例1の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00(配列番号15)について、推定二次構造を、図6(A)に示す。図6(A)において、左図は、メラミン非存在下での非活性型の推定二次構造であり、右図は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
前記実施例1の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00(配列番号15)について、推定二次構造を、図6(A)に示す。図6(A)において、左図は、メラミン非存在下での非活性型の推定二次構造であり、右図は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
このN1Mel06_I1_A0_D3_T00に対して、内部ループの21番目のdT(T21)と22番目のdC(C22)との間に、さらに、dCを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)を作製した。N1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cについて、推定二次構造を、図6(B)に示す。図6(B)において、左図は、メラミン非存在下での非活性型の推定二次構造であり、右図は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。また、dCに代えてdTを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3_T00_T(配列番号39)も作製した。N1Mel06_I1_A0_D3_T00_Tについて、推定二次構造を、図6(C)に示す。図6(C)は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
前記核酸センサについて、前記実施例3と同様にして、相対化学発光強度(RLU)を測定した。これらの結果を図7に示す。図7は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。図7に示すように、いずれのセンサもメラミンを検出できた。なかでも、さらにdCを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)は、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)が、より一層向上した。具体的には、N1Mel06_I1_A0_D3_T00(配列番号15)のS/Nが、3.2であるに対して、N1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)のS/Nは、さらに6.5にまで向上した。
(実施例5)
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)の改変センサを作製した。具体的には、図6(B)のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、5’末端のdTを削除したN1Mel06_I1_A0_D3C_1(配列番号41)、21番目のdT(T21)と22番目のdC(C22)の間にdCを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3C_C(配列番号42)を作製した。これらの推定二次構造を、図8(A)、(B)にそれぞれ示す。図8(A)、(B)は、それぞれ、メラミン非存在下での非活性型推定二次構造である。
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)の改変センサを作製した。具体的には、図6(B)のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、5’末端のdTを削除したN1Mel06_I1_A0_D3C_1(配列番号41)、21番目のdT(T21)と22番目のdC(C22)の間にdCを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3C_C(配列番号42)を作製した。これらの推定二次構造を、図8(A)、(B)にそれぞれ示す。図8(A)、(B)は、それぞれ、メラミン非存在下での非活性型推定二次構造である。
また、図8(B)のN1Mel06_I1_A0_D3C_Cの3’末端に、dGを付加したN1Mel06_I1_A0_D3C_CG(配列番号43)を作製した。この推定二次構造を、図8(C)に示す。図8(C)は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
また、結合核酸分子(A)として、メラミンアプタマーであるMel06(配列番号57、n=12)を有し、触媒核酸分子(D)として、下記二本鎖DNAzyme(dsG)を有する、核酸センサMel06_dsG(配列番号40)を作製した。下記配列において、下線部がdsGに該当する。この核酸センサの推定二次構造を、図8(D)に示す。図8(D)は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
dsG
5’-AGGGACGGGAAGAA-3’ (配列番号59)
3’-TGGGAGGTATAAAA-5’ (配列番号60)
Mel06_dsG (配列番号40)
AGGGACGGGAAGAACGCTTTTTTTTTTTTGCGAAAATGTGGAGGGT
5’-AGGGACGGGAAGAA-3’ (配列番号59)
3’-TGGGAGGTATAAAA-5’ (配列番号60)
Mel06_dsG (配列番号40)
AGGGACGGGAAGAACGCTTTTTTTTTTTTGCGAAAATGTGGAGGGT
前記核酸センサについて、前記実施例3と同様にして、相対化学発光強度(RLU)を測定した。これらの結果を図9に示す。図9は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、図9の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)を求めた。これらの結果を下記表9に示す。図9および表9に示すように、いずれのセンサもメラミンを検出できた。中でも、5’末端にdGを付加したセンサN1Mel06_I1_A0_D3C_CGは、優れたS/Nを示した。
(実施例6)
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)の改変センサを作製した。具体的には、図6(B)の左図に示す、活性型のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、12塩基長のポリdTを、24塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H24(配列番号44)、30塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H30(配列番号52)、36塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H36(配列番号53)、42塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H42(配列番号54)、48塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H48(配列番号46)を作製した。これらの推定二次構造を、図10にそれぞれ示す。図10は、それぞれ、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)の改変センサを作製した。具体的には、図6(B)の左図に示す、活性型のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、12塩基長のポリdTを、24塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H24(配列番号44)、30塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H30(配列番号52)、36塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H36(配列番号53)、42塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H42(配列番号54)、48塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H48(配列番号46)を作製した。これらの推定二次構造を、図10にそれぞれ示す。図10は、それぞれ、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
前記核酸センサについて、前記実施例4と同様にして、相対化学発光強度(RLU)を測定した。これらの結果を図11に示す。図11は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、図11の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)を求めた。これらの結果を下記表10に示す。このように、メラミンアプタマーにおけるポリdTの塩基長を20塩基長以上に増加させることで、さらに感度が向上することがわかった。また、N1Mel06_I1_A0_D3_T00_C(配列番号38)について、メラミンの終濃度を300μmol/Lに低減させて同様に測定を行ったところ、S/Nが1.4であった。この結果から、低濃度のメラミンであっても、検出可能であることがわかった。
(実施例7)
前記実施例5のセンサMel06_dsG(配列番号40)およびN1Mel06_I1_A0_D3C_CG(配列番号43)の改変センサを作製した。具体的には、図11に示す、Mel06_dsGおよびN1Mel06_I1_A0_D3C_CGの活性型の推定二次構造において、12塩基長のポリdTを、30塩基長、36塩基長、42塩基長に変更した下記センサを作製した。これらの推定二次構造を、図12にそれぞれ示す。図12は、それぞれ、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
Mel06_dsG_H30 (配列番号49)
Mel06_dsG_H36 (配列番号50)
Mel06_dsG_H42 (配列番号51)
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H30 (配列番号52)
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H36 (配列番号53)
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H42 (配列番号54)
前記実施例5のセンサMel06_dsG(配列番号40)およびN1Mel06_I1_A0_D3C_CG(配列番号43)の改変センサを作製した。具体的には、図11に示す、Mel06_dsGおよびN1Mel06_I1_A0_D3C_CGの活性型の推定二次構造において、12塩基長のポリdTを、30塩基長、36塩基長、42塩基長に変更した下記センサを作製した。これらの推定二次構造を、図12にそれぞれ示す。図12は、それぞれ、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
Mel06_dsG_H30 (配列番号49)
Mel06_dsG_H36 (配列番号50)
Mel06_dsG_H42 (配列番号51)
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H30 (配列番号52)
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H36 (配列番号53)
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H42 (配列番号54)
前記核酸センサについて、前記実施例3と同様にして、相対化学発光強度(RLU)を測定した。これらの結果を図13に示す。図13は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、図13の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)を求めた。これらの結果を下記表11に示す。このように、メラミンアプタマーにおけるポリdTの塩基長を30塩基長以上に増加させることで、さらに感度が向上することがわかった。
(実施例8)
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの改変センサを作製した。具体的には、図6(B)の左図に示す、活性型のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、メラニンアプタマーとDNAzymeとの間に、さらに、ポリdTの内部ループを追加して、ポリdTを含むメラニンアプタマーがタンデムとなるセンサN1Mel06_I1_A0_D3C_sAT(配列番号47)およびN1Mel06_I1_A0_D3C_sGC(配列番号48)を作製した。これらの推定二次構造を、図14に示す。図14は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの改変センサを作製した。具体的には、図6(B)の左図に示す、活性型のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、メラニンアプタマーとDNAzymeとの間に、さらに、ポリdTの内部ループを追加して、ポリdTを含むメラニンアプタマーがタンデムとなるセンサN1Mel06_I1_A0_D3C_sAT(配列番号47)およびN1Mel06_I1_A0_D3C_sGC(配列番号48)を作製した。これらの推定二次構造を、図14に示す。図14は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
前記核酸センサについて、前記実施例3と同様にして、相対化学発光強度(RLU)を測定した。これらの結果を図15に示す。図15は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、図15の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)を求めた。これらの結果を下記表12に示す。このように、センサにおいてメラミンアプタマーをタンデムとすることによっても、メラニン検出が可能であることがわかった。
(実施例9)
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cを使用して、メラミンの比色分析および化学発光分析を行った。
前記実施例4の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cを使用して、メラミンの比色分析および化学発光分析を行った。
(1)比色分析
エッペンドルフチューブに、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、25℃で5分間反応させた後、前記反応液の着色を目視観察した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした。前記反応液におけるメラミンの終濃度は、0、12.5、37.5、125、375、625ppm(0、100μmol/L、300μmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L)とした。基質は、ABTSを使用した。
エッペンドルフチューブに、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、25℃で5分間反応させた後、前記反応液の着色を目視観察した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした。前記反応液におけるメラミンの終濃度は、0、12.5、37.5、125、375、625ppm(0、100μmol/L、300μmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L)とした。基質は、ABTSを使用した。
(試薬1)
1μmol/L 核酸センサ
3μmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
所定濃度 メラミン
(試薬3)
1mmol/L ABTS
0.5mmol/L H2O2
1μmol/L 核酸センサ
3μmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
所定濃度 メラミン
(試薬3)
1mmol/L ABTS
0.5mmol/L H2O2
ネガティブコントロール(NC)として、前記核酸センサを未添加とした前記試薬1を使用し、同様にして目視観察を行った。
これらの結果を図16に示す。図16は、前記反応液の発色を示す結果である。図16は、反応液の着色を示す写真であって、色が黒い程、青色への発色が強いことを示す。図16に示すように、375ppm以上のメラミン濃度の反応液において、強い発色が確認できた。前述のように、メラミンは500ppmが検出できればよいことから、実施例の核酸センサによれば、目視観察のみでメラミンを検出できることがわかった。
(2)化学発光分析
反応容器内において、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、その反応液100μLについて、25℃の条件下、経時的な相対化学発光強度(RLU)を測定した。前記測定は、ルミノメーター(商品名ルミテスターPD−20、キッコーマン)を使用した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした。前記反応液におけるメラミンの終濃度は、0、125、625ppm(0、1mmol/L、5mmol/L)とした。
反応容器内において、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、その反応液100μLについて、25℃の条件下、経時的な相対化学発光強度(RLU)を測定した。前記測定は、ルミノメーター(商品名ルミテスターPD−20、キッコーマン)を使用した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした。前記反応液におけるメラミンの終濃度は、0、125、625ppm(0、1mmol/L、5mmol/L)とした。
(試薬1)
500nmol/L 核酸センサ
250nmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
所定濃度 メラミン
(試薬3)
25μmol/L L−012
25μmol/L H2O2
500nmol/L 核酸センサ
250nmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
所定濃度 メラミン
(試薬3)
25μmol/L L−012
25μmol/L H2O2
反応開始から30秒後における前記反応液の発光強度(RLU)を、下記表13に示す。表13に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、メラミン濃度125ppmの反応液についても、メラミン濃度0ppmの反応液に対して有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、発光強度測定によって、125ppmのメラミン濃度であっても検出可能であることがわかった。
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
この出願は、2012年7月27日に出願された日本出願特願2012−167766を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明の核酸センサによれば、前記結合核酸分子(A)とメラミンとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能のON−OFFをスイッチできる。このため、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することで、メラミンの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、メラミンの分析において極めて有用な技術といえる。
Claims (19)
- 触媒機能を生起する触媒核酸分子(D)およびメラミンに結合する結合核酸分子(A)を有する下記(x1)のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、メラミン分析用核酸センサ。
(x1)配列番号1〜13のいずれか一つの塩基配列からなり、nおよびmは、正の整数であるポリヌクレオチド - 配列番号1〜13のいずれか一つの塩基配列において、(T)nのnが、6〜48であり、(T)mのmが、2〜31である、請求項1記載の核酸センサ。
- 前記(x1)のポリヌクレオチドの5’末端に連結した5’末端付加配列を有する、請求項1または2記載の核酸センサ。
- 前記5’末端付加配列が、0〜22塩基長である、請求項3記載の核酸センサ。
- さらに、前記(x1)のポリヌクレオチドの3’末端に連結した3’末端付加配列を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸センサ。
- 前記3’末端付加配列が、7〜18塩基長である、請求項5記載の核酸センサ。
- 前記核酸センサが、下記(X1)のポリヌクレオチドを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸センサ。
(X1)配列番号15〜39、41〜48および52〜56のいずれか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチド - 基材、核酸センサおよび検出部を含み、
前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、
前記核酸センサは、請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸センサであり、
前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とするメラミンの分析用デバイス。 - 前記核酸センサが、リンカーを介して、前記基材に連結されている、請求項8記載の分析用デバイス。
- 前記核酸センサが、前記検出部に配置されている、請求項8または9記載の分析用デバイス。
- 前記検出部は、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部である、請求項8から10のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
- 前記シグナルが、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルである、請求項11記載の分析用デバイス。
- さらに、試薬部を有し、
前記試薬部が、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能に対する基質を含む、請求項8から12のいずれか一項に記載の分析用デバイス。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸センサを含むことを特徴とするメラミンの分析用試薬。
- さらに、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能に対する基質を含む、請求項14記載の分析用試薬。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のメラミンの分析用核酸センサに試料を接触させる接触工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とする、メラミンの分析方法。
- 前記触媒核酸分子(D)の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項16記載の分析方法。
- 請求項8から13のいずれか一項に記載の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子(D)の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とするメラミンの分析方法。
- 前記触媒核酸分子(D)の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項18記載の分析方法。
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