WO2006132022A1 - メチルシトシンの簡便検出法 - Google Patents

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WO2006132022A1
WO2006132022A1 PCT/JP2006/306359 JP2006306359W WO2006132022A1 WO 2006132022 A1 WO2006132022 A1 WO 2006132022A1 JP 2006306359 W JP2006306359 W JP 2006306359W WO 2006132022 A1 WO2006132022 A1 WO 2006132022A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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methylcytosine
detecting
probe
cytosine
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/306359
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akimitsu Okamoto
Kazuki Tainaka
Kazuo Tanaka
Taku Kamei
Original Assignee
Kyoto University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University filed Critical Kyoto University
Priority to JP2007520033A priority Critical patent/JP5167485B2/ja
Publication of WO2006132022A1 publication Critical patent/WO2006132022A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a methylcytosine detection method for determining whether a target base in a DNA sample is force cytosine, which is cytosine, and a probe, kit, nucleic acid chip, and methylcytosine detection apparatus used therefor.
  • Epigenetics consists of DNA methylation that physiologically modifies the genome, chromatin, which is a complex of DNA and protein, and post-translational modification of many proteins that make up chromatin. Control gene expression in an integrated manner!
  • chromatin structural conversion by histone modification plays an important role in the induction of transcription.
  • acetylation with a histone acetylenic enzyme triggers chromatin remodeling and initiates transcription with basic transcription factors and RNA polymerase.
  • histone methyl and phosphoric acid causes transcriptional control, silencing, and chromatin condensation.
  • CpG dinucleotides in the genome are subjected to a methyl cysteine at the 5th position of the cytosine.
  • Methylated CpG is found in heterochromatin and transposons that contain many repetitive sequences, and is thought to suppress the activation of viruses and transposons.
  • methylpeptide and histone modification of CpG are coordinated with each other.
  • the CG-rich region (CpG island) in the promoter region of many genes is not subject to methyl candy.
  • Another exception is the imprinted gene, the female inactivated X chromosome, which is CpG Island Catholic.
  • the CpG island catalyzer is also used in the promoter region of tumor suppressor genes in cancer cells. Therefore, cytosine methylation can be used as a marker for cancer development, recurrence, and metastasis, and there is a need for a simple detection method for the ability of cytosine in genes to detect whether or not S-methylation is present. .
  • Patent Documents 1 and 2 a DNA sample is treated with bisulfite and methylated, and Teaches how to determine whether or not cytosine catalyzed by performing PCR using a primer that preferentially amplifies methyl isocytosine over uracil and detecting the presence or absence of amplification ing.
  • this method changes the cytosine that occupies the majority instead of methylcytosine, the conversion efficiency of all cytosines affects the determination result, and the determination accuracy is lowered accordingly.
  • Patent Document 3 determines the DNA methyl babies ratio by contacting an antibody that specifically binds to 5-methylcytosine with single-stranded DNA and measuring the amount of antibody bound to the DNA strand. Teaches how to However, this method requires preparation of antibodies and amplification of DNA samples by PCR.
  • Non-Patent Document 1 describes whether or not there is a mismatch in double-stranded DNA by oxidizing a double-stranded DNA sample with potassium permanganate and hydroxylamine and then treating with piperidine. Teaching that can be detected. This method requires hydroxylamine (see Figures 2 and 3). However, this method can only detect the presence of mismatches and cannot distinguish between cytosine and methinorecytosine in DNA samples.
  • Patent Document 1 Special Table 2004—527241
  • Patent Document 2 Special Table 2004-500892
  • Patent Document 3 Special Table 2004-347508
  • Non-Patent Literature 1 Chinh Bui et al., Chemical cleavage reactions of DNA on solid suppo rt: application in mutation detection, BMC Chemical Biology, 2003, Vol. 3 Disclosure of the invention
  • the present invention provides a simple method capable of determining whether a target base in a DNA sample is force methylcytosine, which is cytosine, and a probe, kit, nucleic acid chip, and methylcytosine detection apparatus used therefor. Is an issue.
  • a specific reaction to methylcytosine or cytosine is induced, and if the presence or absence of the reaction is detected, the target base is cytosine. Whether it is lucitosin can be determined. However, such a reaction is caused equally to the base of each nucleotide in the DNA sample, and cannot be caused only by the target base in question whether force cytosine is a force methylcytosine.
  • Methylcytosine can be distinguished from methylcytosine by the presence or absence of acid, because methylcytosine is more susceptible to acid than carbon in cytosine.
  • a labeling method there is a method in which the oxidation reaction product is further oxidized to produce an aldehyde, and this aldehyde is labeled with an enzyme via, for example, an imino group. According to this method, enzyme labeling is carried out only when the base cysteine cytosine in question is used.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following method for detecting methylcytosine and the like.
  • Item 1 A method for detecting methylation of cytosine in a DNA sample, comprising:
  • a method for detecting methylcytosine comprising a second step of inducing a specific reaction to cytosine or methylcytosine forming a noresid structure or a mismatch, and detecting methyl candy by the presence or absence of this reaction.
  • the first step is a step of hybridizing the DNA sample and the guide probe so that the target cytosine or methylcytosine forms a bulge structure.
  • Item 2 The method for detecting methylcytosine according to Item 1, wherein the second step is a step of inducing a specific reaction to the cytosine or methylcytosine forming a bulge structure, and detecting methyl candy by the presence or absence of this reaction.
  • Item 3 The method for detecting methylcytosine according to Item 1, wherein a specific reaction to methylcytosine is induced in the second step.
  • the second step is cytosine or methylcytosine that forms a noresid structure or mismatch.
  • Item 4. The method for detecting methylcytosine according to Item 3, comprising a second step A in which an oxidant is allowed to act on and a second step B in which the presence or absence of an oxidation reaction product by the oxidant is detected.
  • Step 2B comprises a step of allowing a basic substance to act.
  • Item 6 The method for detecting methylcytosine according to Item 5, wherein the step 2B includes a step of detecting a fragment of the DNA sample after the step of applying a basic substance.
  • Item 7 The method for detecting methylcytosine according to Item 6, wherein a fragment of a DNA sample is detected by amplifying a region containing cytosine or methylcytosine that forms a bulge structure or mismatch.
  • Item 8 The method for detecting methylcytosine according to Item 5, wherein a nitrogen-containing substance is used as the basic substance.
  • Item 9 The method for detecting methylcytosine according to Item 3, further comprising a step of removing a single-stranded portion of the hybridized product by exonuclease treatment after the first step.
  • Item 10 The method for detecting methylcytosine according to Item 9, wherein the step 2B includes a step of labeling the oxidation reaction product generated in the step 2A and a step of detecting the labeling substance.
  • Item 11 The method for detecting methylcytosine according to Item 10, wherein the second step B includes a step of further performing a second oxidation treatment on the oxidation reaction product by the oxidizing agent.
  • Item 12 The method for detecting methylcytosine according to Item 10, wherein the labeling enzyme is labeled with a labeling enzyme.
  • Item 13 The method for detecting methylcytosine according to Item 4, wherein the acid base reactant of the target base in Step 2B is an acid base reactant of the 5-position carbon atom of the pyrimidine ring.
  • the step 2A is a step of forming an osmium-containing bicyclic group represented by the formula (5) by causing an oxidizing agent to act on cytosine or methylcytosine that forms a bulge structure or mismatch.
  • Item 5 The method for detecting methylcytosine according to Item 4, wherein the step 2B is a step of detecting the presence or absence of the osmium-containing heterocyclic group. [0014] [Chemical 1]
  • R1 and R2 are the same or different and represent a hydrogen atom, an alkyl group, or a substituted alkyl group
  • Step 2B includes a step of labeling the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) with a labeling substance and a step of detecting the labeled osmium-containing heterocyclic group.
  • the guide probe used in the first step is a guide probe to which a fluorescent substance is bound, and
  • Step 2B includes a step of labeling the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) with a fluorescent material that causes fluorescence resonance energy transfer with respect to the fluorescent material, and whether or not there is fluorescence resonance energy transfer. Including the step of measuring,
  • Item 15 The method for detecting methylcytosine according to Item 14.
  • the guide probe used in the first step is a guide probe to which a fluorescent substance that is quenched by the presence of the osmium-containing complex ring group represented by the formula (5) is bound, and the step 2B includes the step It is a step of measuring the presence or absence of quenching of the fluorescent material,
  • Item 15 The method for detecting methylcytosine according to Item 14.
  • Item 18 The method for detecting methylcytosine according to claim 1, wherein the reaction specific to the target base in the second step is a reaction specific to cytosine.
  • Item 19 The method for detecting methylcytosine according to Item 18, wherein the second step includes a second C step in which the target base is treated with bisulfite and a second D step in which uracil produced in the second C step is detected.
  • the guide product is obtained from the hybrid product obtained in the first step.
  • Item 4. The method for detecting methylcytosine according to Item 3, comprising a 2E step of cross-linking the lobe and methylcytosine in the DNA sample, and a 2F step of detecting the presence or absence of cross-linking between the guide probe and the DNA sample.
  • Item 21 The method for detecting methylcytosine according to Item 1, wherein the length of the guide probe is 20 to: the length of the LOO base.
  • Item 22 The method for detecting methylcytosine according to Item 5, wherein the length of the guide probe is 40 to: LOO base.
  • Item 23 The method for detecting methylcytosine according to Item 1, wherein the guide probe is bound to a solid phase carrier.
  • Item 24 A probe for detecting methylcytosine complementary to a region excluding nucleotides having a target base group to detect whether it is force cytosine that is cytosine in a DNA sample.
  • Item 25 A probe for detecting methylcytosine that hybridizes with a DNA sample, and that mismatches only with the target base to be detected as a force cytosine that is a cytosine of a DNA sample.
  • Item 26 A hybrid product of the probe according to Item 24 or 25 and a DNA sample.
  • Item 27 A kit for detecting methinorecytosine, comprising the probe according to item 24 or 25 and a reagent capable of oxidizing methylcytosine.
  • Item 28 The kit for detecting methylcytosine according to item 27, comprising a basic substance capable of cleaving a bond between a nucleotide having an oxidized methylcytosine and a nucleotide adjacent thereto.
  • Item 29 An exonuclease that specifically degrades single-stranded DNA and NH NH—
  • Item 28 A kit for detecting methylcytosine according to Item 27, comprising the labeled enzyme and a chromogenic substrate for the labeled enzyme.
  • Item 30 The kit for detecting methylcytosine according to Item 27, comprising an exonuclease that specifically degrades single-stranded DNA and a labeling substance of the following formula (1) or (2):
  • R represents a labeling substance
  • R represents a labeling substance
  • Item 31 The methylcytosine detection kit according to Item 27, comprising osmate and biviridine as a reagent capable of acidifying methylcytosine.
  • Probe for detecting methylcytosine The kit for detecting methylcytosine according to claim 31, which is formed by binding a fluorescent substance.
  • Item 33 Probe for detecting methylcytosine
  • Item 34 A methylcytosine detection kit comprising the probe according to item 24 or 25 and bisulfite.
  • Item 35 A methylcytosine detection kit comprising the probe according to item 24 or 25, wherein a group capable of specifically binding to methylcytosine is bound.
  • Item 36 A nucleic acid chip in which one or more probes according to item 24 or 25 are immobilized on a substrate.
  • a methylcytosine detection apparatus comprising the nucleic acid chip according to item 36 and an apparatus capable of detecting a color pattern on the chip.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the procedure of a first method of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the procedure of a second method of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of electrophoresis performed in Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of electrophoresis performed in Example 2.
  • FIG. 5 shows the results of electrophoresis performed in Example 3.
  • FIG. 6 shows the results of electrophoresis performed in Example 4.
  • FIG. 7 shows the results of electrophoresis performed in Example 5.
  • FIG. 8 shows the results of electrophoresis performed in Example 6.
  • FIG. 9 shows changes in fluorescence intensity in real-time PCR performed in Example 7.
  • A shows that methylcytosine can be detected by using a bulge-forming probe
  • B shows that methylcytosine can be detected by treatment with acid.
  • FIG. 10 is a graph comparing the amount of amplification product of real-time PCR performed in Example 7.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of rectangular wave voltammetry measurement performed in Example 8.
  • FIG. 12 shows the results of fluorescence intensity measurement performed in Example 9.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of fluorescence intensity measurement performed in Example 10.
  • FIG. 14 shows the results of electrophoresis performed in Example 11.
  • a method for detecting methyl cysteine of cytosine in a DNA sample comprising a first step of hybridizing a DNA sample and a guide probe so that cytosine or methyl cytosine as a target base forms a bulge structure or mismatch, and bulge A second step of inducing a reaction specific to the target base that forms a structure or mismatch and detecting methylation based on the presence or absence of this reaction.
  • the "bulge structure of the target base” refers to a target base (cytosine) that jumps out of the double strand without forming a base pair in a double-stranded nucleic acid formed by a DNA sample and a probe. Or bulges that also contain nucleotide forces including methylcytosine!
  • the second step is, but not limited to, cytosine or methyl that forms a bulge structure or mismatch. It may include a 2A step of oxidizing cytosine and a 2B step of detecting the presence or absence of the target base acid (specifically, the presence or absence of carbon atom acid). In step 2B, if an oxidation reaction product is detected, it can be determined that the target base is katylcytosine.
  • the determination method in the 2B step it is classified into the first and second methods.
  • the first step is common to both methods.
  • the second step induces a reaction specific to cytosine
  • the second step is not limited thereto, but the second step of treating the target base with bisulfite and the target base And a second step of detecting whether there is a change to uracil.
  • the second step when the target is uracil, it can be determined that the target base is cytosine. This method is the third method.
  • the guide product and the methyl cytosine in the DNA sample are cross-linked to the noidized product obtained in the first step, and the guide A second step of detecting the presence or absence of cross-linking between the probe and the DNA sample.
  • step 2F when the guide probe and the DNA sample are cross-linked, it can be determined that the target basic force is S-methylcytosine. This method is the fourth method.
  • the DNA sample may be a biological sample such as blood, urine, sputum, semen, hair, skin, etc., or it may be isolated from a biological sample, but the isolated DNA should be used. Is preferred.
  • each nucleotide in order to induce a reaction specific to the target base in the DNA sample, it is necessary for the acid reagent etc. to approach the target base, but each nucleotide usually has a helical structure of double-stranded DNA. Because it is buried inside, the oxidant is inaccessible.
  • the target base in question whether it is a cytosine that is a cytosine, a base having a nucleotide without protruding to the outside without forming a base pair.
  • Create strand DNA for this purpose, for example, DNA samples A DNA sample is hybridized with a guide probe complementary to the region excluding the nucleotide having the target base, that is, the region on both sides adjacent to the region excluding the nucleotide having the target base.
  • This guide probe is a balsi-producing probe for forming a “bulge” of a nucleotide having a target base, which jumps out of double-stranded DNA.
  • the probe is complementary to the regions on both sides.
  • thymine is susceptible to acid oxidation because it has a methyl group at the 5-position carbon of the pyrimidin ring. Therefore, since it is necessary to avoid false detection of thymine, the probe should be complementary to the regions on both sides.
  • it is designed so that only the target base does not form a base pair, so that even if thymine is present adjacent to the target base, it may be oxidized and cause false detection of methylcytosine. Absent
  • double-stranded DNA is prepared so that only the target base is mismatched.
  • Methylcytosine isolated by mismatch is susceptible to acid oxidization, as is the case with basil structures.
  • a DNA probe should be hybridized with a guide probe that only matches the target base with the DNA sample.
  • This guide probe is a mismatch generating probe for forming a loose structure that also has mismatch base pairing force in double-stranded DNA. All base pairs except for mismatched base pairs are complementary between the mismatch generating probe and the DNA sample.
  • the preferred length of the guide probe varies depending on the method, and usually 20 to about LOO base is preferred, and about 20 to 50 base is more preferred. Among them, in the first method, 40 to: about 50 to 80 bases are preferred, and the degree of LOO base is preferred. In addition, if this length is long, a double strand can be formed stably and can be synthesized by an automatic DNA synthesizer. In the first method, as will be described later, nucleic acid amplification such as PCR may be performed on the double-stranded formation region with the probe, so that a probe long enough to bind the PCR primer is required. .
  • the target base should be designed so that the base or mismatch of the target base can be formed near the center of the double strand.
  • the guide probe may be any DNA, RNA, peptide nucleic acid (PNA), modified nucleic acid, or the like as long as it is complementary to the above region so that it can hybridize.
  • PNA peptide nucleic acid
  • modified nucleic acids include phosphorothioate-modified nucleic acids, morpholino-modified nucleic acids, 2'-O-alkyl nucleic acids, 2'-N-alkyl nucleic acids, 2'-S-alkyl nucleic acids, 2'-halogen nucleic acids, and the like.
  • nucleotides having a modified base such as 2-aminoadenine and 5-alkyluridine are arranged in the probe sequence, or the end or the inside of the probe is arranged. It can also be modified with amines, polyamines or the like, or a dideoxynucleotide can be added to the end of the probe.
  • the nucleic acid probe is preferably fixed to a bead-shaped or flat-shaped carrier, and accordingly, different treatments are sequentially performed on the DNA sample bound to the probe, or DNA between the treatments.
  • the sample can be washed.
  • the probe can be reused.
  • a carrier material include polystyrene, gold, glass, magnetic iron oxide fine particles, and zinc sulfate fine particles having quantum dot properties.
  • the conditions for hybridization are not particularly limited. Depending on the type of DNA sample and the length of the probe, for example, after treatment with a hybridization solution such as sodium phosphate buffer at pH 7 at room temperature to 100 ° C for about 5 minutes to 1 hour, pH 7 The conditions include washing with sodium phosphate buffer at about 5-25 ° C for about 1-5 minutes.
  • a hybridization solution such as sodium phosphate buffer at pH 7 at room temperature to 100 ° C for about 5 minutes to 1 hour
  • pH 7 The conditions include washing with sodium phosphate buffer at about 5-25 ° C for about 1-5 minutes.
  • the hybridized product containing the target base is treated with an acidifying agent in the second step, and in the case of the target base katylcytosine, the carbon atom having a methyl group is oxidized (second 2A).
  • a typical methylcytosine is 5-methylcytosine. Compared with cytosine, 5-methylcytosine is more susceptible to oxidation of the 5-position carbon atom of the pyrimidine ring. Therefore, by comparing the oxidized products and detecting the presence or absence of oxidation products (step 2B), both Can be identified.
  • Representative examples of the structure of the 5-methylcytosine moiety of a DNA sample after an acid reaction include a dihydroxy-substituted pyrimidyl group represented by the following formula (3) or a formula (4) below. Poxy-substituted pyrimidyl group can be mentioned.
  • a known oxidant capable of oxidizing a carbon atom can be used without limitation.
  • an oxidizing agent capable of oxidizing a double bond between the 5-position carbon atom and the 6-position carbon atom of the pyrimidine ring for example, a permanganate such as potassium permanganate (KMnO).
  • Osmates such as osmium tetroxide (OsO), potassium osmate (K OsO),
  • Tungstates such as sodium tungstate (Na WO), sodium periodate (
  • Periodate such as NalO), hydrogen peroxide (H 2 O 2), t-butyl hydroperoxide (t
  • an oxidizing agent capable of reoxidizing the oxidizing agent capable of oxidizing the carbon-carbon double bond when it is in a reduced state can be used.
  • reoxidant N-methyl Lumorpholine N oxide (NMO), potassium ferricyanide (K Fe (CN)), etc.
  • Examples of those containing a double bond oxidizing agent and its reoxidizing agent include bipersulfates such as Oxone (manufactured by Dubon) ⁇ potassium bipersulfate (KHSO).
  • bipersulfates such as Oxone (manufactured by Dubon) ⁇ potassium bipersulfate (KHSO).
  • an oxidizing agent auxiliary such as vanadium oxide acetyl cetate, oxygen, hypochlorite such as sodium hypochlorite (NaO C1), and dimethyldioxysilane can also be used.
  • the oxidation treatment is performed by adding an aqueous oxidizer solution having a concentration (for example, 0.1 to 1000 mM) according to the type of oxidizer to the hybridized product, and performing it at a temperature of about 0 to 40 ° C for about 1 minute to 1 hour. Good.
  • the oxidation treatment is preferably carried out under basic conditions of about pH 7-9, which increases the acidification rate and makes it possible to more clearly distinguish between cytosine and methylcytosine. Also, within the above pH range, the double strand is kept stable.
  • a suitable condition may be selected according to the type of oxidant.
  • an acid activating agent such as ferricyanium potassium or methylmorpholine oxide can be used in combination with osmate.
  • the reaction rate is increased by adding about 10 to 500 mM of a compound capable of coordinating with an oxidizing agent such as pyridine, biviridine, or phenanthroline to the oxidation reaction solution.
  • a compound capable of coordinating with an oxidizing agent such as pyridine, biviridine, or phenanthroline
  • acidification treatment is performed by adding biviridine, it is necessary to treat with a sulfite such as Na 2 SO 4 in order to generate the dihydroxy-substituted pyrimidyl group represented by the formula (3).
  • the oxidation rate is remarkably increased.
  • cytosine and methylcytosine are obtained.
  • the amount of the reoxidant used varies depending on the type of the reoxidant and can usually be about 10 mM to 1 M, preferably about 10 to 10 OmM.
  • the first method will be described with reference to FIG.
  • the oxidized product of the target base contained in the hybridized product is treated with a basic substance.
  • the oxidized methyldeoxycytidylic acid is decomposed into oxidized methylcytosine and sugar, and the oxidized methyldeoxycytidylic acid and its sugar are decomposed.
  • the phosphodiester bond between adjacent nucleotides is hydrolyzed. Therefore
  • an oxidizing agent that causes such decomposition by treatment with a basic substance is used. If the oxidizing agent can oxidize the carbon atom of the base, such decomposition occurs by the basic substance treatment.
  • an oxidizing agent for example, those exemplified above can be used.
  • osmium tetroxide which is preferable to osmate, such as permanganate, bis osmium tetroxide, and osmium acid lithium, is more preferable.
  • a basic substance treatment is performed (Fig. La). Since methylcytosine is oxidized in the case of target cytosine cytosine, the region hybridized with the probe is cleaved at the nucleotide portion having the target base by the basic substance treatment. On the other hand, if the target base is cytosine, cytosine is not oxidized! Therefore, the region hybridized with the probe is not cleaved even by treatment with a basic substance.
  • the target base is oxidized, and thus the target base is cytosine. It can be determined whether it is a force methylcytosine. In other words, since specific cleavage occurs at the methylcytosine moiety by the basic substance treatment, the presence or absence of methylcytosine can be determined by measuring the size of the resulting DNA fragment.
  • a nitrogen-containing basic substance such as piperidine or arlin can be used.
  • piperidine is preferable in terms of reaction efficiency.
  • the treatment with a basic substance should be carried out by adding an aqueous solution of an appropriate concentration to the DNA sample according to the type, and 60 to: about 1 minute to 1 hour at about LOO ° C.
  • the presence or absence of the decomposition of the phosphodiester bond can be determined by detecting the size of a DNA fragment obtained by treatment with a basic substance containing a nucleotide having a target base.
  • nucleic acid amplification is performed on a region containing a nucleotide having a target base in a DNA sample after base treatment! ⁇
  • electrophoresis By detecting whether the entire DNA region has been amplified by electrophoresis or the like, It can be seen whether the phosphodiester bond between the nucleotide having the target base and the nucleotide adjacent thereto is broken.
  • PCR is performed using primers that can amplify the entire region hybridized with the probe, and the amplified product is removed. It can be subjected to electrophoresis (Figure lb).
  • the amplification efficiency for each PCR cycle can be monitored, so the presence or absence of amplification can be detected efficiently.
  • a nucleotide having a target base can also be obtained by measuring the weight of a DNA fragment by mass spectrometry or by examining the presence or absence of a phosphodiester bond by electrochemical analysis using a quartz crystal microbalance. It can be detected whether the phosphodiester bond between the nucleotide and the adjacent nucleotide is broken. Furthermore, whether or not the phosphodiester bond has been broken can also be detected by detecting the amount of response to the weight of the DNA fragment by surface plasmon resonance.
  • the presence or absence of the target base acid is determined by specifically detecting the target base oxidation product contained in the hybridized product.
  • the target base is usually allowed to hybridize with the probe by treatment with a single-stranded DNA-specific exonuclease before the target base is oxidized (before Step 2A) 1 It is desirable to remove the part of this chain. As a result, even if methylcytosine is present in a region that does not hybridize with the probe, erroneous detection due to this can be avoided.
  • the kind of exonuclease is not specifically limited, A well-known thing can be used. Such exonucleases are commercially available from, for example, USB.
  • the exonuclease treatment may be performed after the target base is treated with an acid.
  • the exonuclease treatment may be performed in the first method or the third method, which is not limited to the second method.
  • the target base contained in the hybridized product is oxidized to give a dihydroxy-substituted pyrimidyl group represented by the formula (3) or an epoxy-substituted pyrimidyl represented by the formula (4) There is a method of detecting these groups after forming the groups (hereinafter referred to as the method 2-2).
  • the target base contained in the hybridized product is treated with an osmate and bibilidyl compound, and is represented by the following formula (5).
  • Examples include a method for detecting the osmium-containing heterocyclic group (hereinafter referred to as the method 2-2).
  • the expression “second method” means that both the above-mentioned method 2-1 and method 2-2 are included.
  • the oxidation treatment is performed as described above (step 2B).
  • the oxidizing agent capable of oxidizing the carbon atom exemplified above can be used without limitation.
  • an oxidizing agent capable of oxidizing a carbon-carbon double bond such as potassium permanganate is preferable because of its high reaction rate.
  • the oxidized product is labeled.
  • a dihydroxy-substituted pyrimidyl group or an epoxy-substituted pyrimidyl group is generated by the above-mentioned acid treatment, so that, for example, by reacting compound (1),
  • the substituted pyrimidyl group or the epoxy-substituted pyrimidyl group is labeled with the labeling substance R.
  • the label may be an enzyme label, a fluorescent label, or a radiolabel.
  • R represents a labeling substance
  • the dihydroxy-substituted pyrimidyl group or the epoxy-substituted pyrimidyl group can be further converted into another functional group, and the labeling substance can be bound thereto.
  • FIG. 2a treatment with a single-stranded DNA-specific exonuclease removes the single-stranded portion that does not hybridize with the probe (Fig. 2a), and then performs acid treatment (Fig. 2b). .
  • a second oxidation treatment is further performed on the oxidized target base.
  • the kind of oxidizing agent is not particularly limited, and for example, those exemplified above can be used. Of these, periodate is preferred. This oxidation treatment may be performed at about 0 to 40 ° C. for about 1 minute to 1 hour. If the dihydroxy-substituted pyrimidyl group represented by the above formula (3) or the epoxy-substituted pyrimidyl group represented by the formula (4) is present in the DNA fragment, V, one of the hydroxyl groups or the epoxy group is present. Converted to aldehyde ( Figure 2c).
  • the aldehyde is detected using a labeling substance.
  • a functional group that reacts with the aldehyde to form an imino group can be used, and examples of such a functional group include NH NH and NH 2 O. ( Figure 2d).
  • the labeling substance may be misaligned, such as a labeling enzyme, a fluorescent substance, or a radioactive substance! Among them, the labeling enzyme is preferable in that the detection sensitivity is increased by the enzyme reaction.
  • the labeling enzyme is not particularly limited, and known labeling enzymes such as peroxidase such as horse radish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, and galactosidase can be used without limitation.
  • the chromogenic substrates for these enzymes are well known. In the case of labeling with HRP, a chromogenic substrate such as HPP A, orthophenol-diamine, or TMBZ may be used.
  • HPP A emits fluorescence, so the detection sensitivity is high.
  • a chromogenic substrate such as NBTZBCIP may be used.
  • galactosidase use a chromogenic substrate such as X-gal.
  • an aldehyde via an imino group for example, a pyridine-avidin reaction can be used.
  • a pyridine-avidin reaction can be used.
  • a terminal is made into piotin by reacting with a thiotin-conjugated piotin derivative.
  • the substrate develops color due to the enzymatic reaction, it can be seen that aldehyde was present in the base of the target nucleotide, and that the target nucleotide was oxidized, and that the target base was methylcytosine.
  • the hybridized product is treated with an osmate such as potassium osmate together with a biviridine compound represented by the formula (A), and an oxidation reaction product.
  • An osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) is formed.
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, an alkyl group, or a substituted alkyl group.
  • the alkyl group part of the alkyl group or substituted alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group, and a sec-butyl group.
  • a linear or branched alkyl group having 16 carbon atoms such as n-pentyl group, neopentyl group, n-xyl group, isohexyl group, and 3-methylpentyl group.
  • substituent of the substituted alkyl group include a halogen atom, a cyano group, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, and a lower alkyl group.
  • the “lower alkyl” is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include the groups exemplified above. Further, the number of substituents in the substituted alkyl group is preferably 1 or 2, and more preferably 1 or 2.
  • Bipyridyl Ligand 4 the compound represented by the following formula (hereinafter referred to as Bipyridyl Ligand 4) is designed so that a labeling substance can be easily attached. It is suitable.
  • Bipyridyl Ligand 4 can be synthesized according to a known method. Typical synthetic pathways include synthetic pathways represented by the following chemical formulas.
  • the amount of the osmate salt and the biviridine compound represented by the formula (A) is not particularly limited. Usually, the osmate salt is about 0.1 to 1000 mM, and the formula (A).
  • the bibilidine compound can be about 0.1 to 1000 mM, the osmate is about 1 to 100 mM, and the biviridine compound represented by the formula (A) is preferably about 10 to 100 mM! /.
  • an acid activating agent such as potassium ferricyanide or methylmorpholine oxide can be used in combination.
  • the amount used is usually about 0.1 to 100 mM, preferably about 0.1 to 50 mM.
  • the oxidation treatment should be performed at a temperature of about 0 to 40 ° C for about 30 seconds to 1 hour.
  • the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) is detected.
  • the osmium-containing heterocyclic group can be detected, for example, according to the following three detection methods. (Detection method 1)
  • Detection method 1 includes a step of labeling the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) with a labeling substance and a step of detecting the labeled osmium-containing heterocyclic group.
  • the label of the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) may be any of an enzyme label, a fluorescent label, an electrochemical label, or a radiolabel. Among them, anthraquinone labeling is There is an advantage in that it can be detected chemically and can be easily detected.
  • the labeling of the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) is performed according to a known method such as a post-modification method.
  • an anthraquinone-labeled osmium-containing heterocyclic group is obtained by reacting an oxidized product formed with an osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) with an anthraquinone derivative in which one NHS is bonded to anthraquinone.
  • anthraquinone-labeled osmium-containing heterocyclic group include a group represented by the formula (6).
  • AQ represents anthraquinone.
  • R2 is the same as above.
  • Detection of the labeled osmium-containing heterocyclic group is carried out by a known method according to the type of the labeling substance.
  • the labeling substance is anthraquinone
  • it can be detected using an electrochemical method such as square wave voltammetry measurement.
  • the first step is performed using a guide probe to which a fluorescent substance is bound, and then the following steps are performed:
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the detection method 2 when the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) is present, a fluorescent substance bound to the guide probe and a fluorescent substance bound to the osmium-containing heterocyclic group FRET occurs in the meantime, and changes are observed in the fluorescence wavelength region or fluorescence intensity of the fluorescent substance bound to the guide probe.
  • the osmium-containing complex represented by formula (5) In the absence of a ring group, no change is observed in the fluorescence wavelength region or fluorescence intensity of the fluorescent substance bound to the guide probe.
  • the binding position of the fluorescent substance is not particularly limited, but it may be a bulge generating probe that forms a bulge structure.
  • a fluorescent substance is bonded to a base forming a base pair with respect to a base adjacent to the target base of the DNA sample.
  • the fluorescent substance is bound to a base that mismatches with the target base.
  • Examples of combinations of fluorescent substances that cause FRET include HEX and fluorescein; TAMRA and fluorescein; Cy3 and Cy5, and the like.
  • the first step is performed using a guide probe to which a fluorescent substance that is quenched by the presence of the osmium-containing heterocyclic group represented by formula (5) is bound, and then the fluorescent substance is quenched. Measure the presence or absence of.
  • detection method 3 when an osmium-containing heterocyclic group is present, quenching of the fluorescent substance bound to the guide probe is observed.
  • the guide probe used in the first step is specifically a guide probe containing a base to which a group represented by the following formula (7) is bonded. Is illustrated.
  • the binding site of the group represented by formula (7) is appropriately set according to the type of base to which the group is bound.
  • Preferable examples of the bonding position of the group represented by formula (7) include a nitrogen atom or an oxygen atom bonded to the carbon at the 6-position of the purine ring when the base to be bonded is adenine or guanine.
  • the base to be bound is cytosine or thymine
  • a nitrogen atom or an oxygen atom bonded to the 4-position carbon of the pyrimidine ring, or the 5-position carbon of the pyrimidine ring is exemplified.
  • the bonding position of the group represented by the formula (7) is not particularly limited, but in the case of a bulge generating probe, the DNA sample It is preferable that a group represented by the formula (7) is bonded to a base forming a base pair with respect to a base adjacent to the target base. In the case of a mismatch generation probe, it is preferable that the group represented by the formula (7) is bonded to a base that mismatches with the target base.
  • the target base is treated with bisulfite in step 2C.
  • the target base is cytosine, it is changed to uracil. Therefore, in the second stage, it is detected whether or not it is uracil. If it is uracil, it can be determined that the target base is cytosine.
  • Bisulfite (acid sulfite, hydrogen sulfite) may be any of sodium salt, potassium salt, calcium salt and the like. This treatment may be performed at a concentration of about 0.1 to about LOM and a temperature of about 5 to 95 ° C. for about 0.5 to 60 minutes.
  • the method for detecting uracil is not limited thereto, but the hybridized product having the target base that has been treated with bisulfite is treated with uracil DNA glycosidase, and then treated with a basic substance.
  • a method for detecting whether or not a phosphodiester bond between a nucleotide having a base and a nucleotide adjacent thereto is broken has been mentioned.
  • the target base is changed to uracil
  • the N-glycoside bond between uracil and sugar is hydrolyzed by uracil DNA glycosidase treatment.
  • uracil DNA glycosidase treatment For example, it may be performed at 0 to 50 ° C for 1 to 30 minutes.
  • the basic substance treatment is as described in the first method.
  • whether or not the phosphodiester bond between the nucleotide having the target base and the nucleotide adjacent thereto is broken is determined, for example, for the region containing the nucleotide having the target base as described in the first method. It can be detected by nucleic acid amplification.
  • the target base can also be obtained by subjecting a hybridized product having a target base treated with bisulfite to nucleic acid amplification using a primer that amplifies only when the target base is uracil. It is possible to detect whether or not the force is changing to uracil.
  • nucleic acid amplification is performed using primers that can be amplified regardless of whether the target base is uracil or methylcytosine, and there is a slight difference in the size of the amplified product (difference between uracil and methylcytosine). It is also possible to detect whether it is force methylcytosine, which is uracil.
  • a bisulfite-treated hybridized product treated with uracil DNA glycosidase is amplified regardless of whether the target nucleotide is a nucleotide having no base or a nucleotide having methylcytosine.
  • hybridization is performed using a guide probe in which a group capable of specifically binding to methylcytosine is bound in the first step, and then obtained in the following steps: A 2E step of cross-linking the guide probe and methylcytosine in the DNA sample to the obtained nobleidized product;
  • the guide probe used in the first step is formed by binding a group capable of specifically binding to methylcytosine.
  • the “group capable of specifically binding to methylcytosine” bound to the guide probe is a methylcytosine that forms a noreci structure or mismatch when the guide probe and the DNA sample are hybridized.
  • a preferable example is a group represented by the following formula (8). In the formula (8), R2 is the same as described above.
  • the binding position of the “group capable of specifically binding to methylcytosine” is not particularly limited, but in the case of a bulge generating probe, It is preferable that a “group capable of specifically binding to methylcytosine” is bonded to a base that forms a base pair with a base adjacent to the target base of the DNA sample. In the case of a mismatch generating probe, it is preferable that a “group capable of specifically binding to methylcytosine” is bound to a base that mismatches with a target salt group.
  • the single-stranded DNA that has not hybridized with the probe is treated by treatment with a single-stranded DNA-specific exonuclease. You can remove the part.
  • the condition for cross-linking the guide probe and methylcytosine in the DNA sample is the type of “group capable of specifically binding to methylcytosine” bound to the guide probe. What is necessary is just to set suitably according to.
  • the group represented by the formula (8) is bonded.
  • Such treatment is desirably performed under pH conditions of about pH 6-7.
  • an acid activating agent such as ferricyanium potassium or methylmorpholine oxide is added at about 0.1 to 100 mM, preferably about 0.1 to 50 mM. The formation speed of can be increased.
  • the second step E may be performed simultaneously with the first step. That is, the fourth method can be carried out by simultaneously mixing a guide probe, a DNA sample, and other compounds necessary for forming a crosslink and reacting them under predetermined conditions.
  • Step 2F is conveniently performed by measuring the molecular weight of a DNA sample by mass spectrometry or gel electrophoresis.
  • the details are as follows. If the guide probe and the DNA sample are cross-linked, they exist in a combined state even under non-hybridizing conditions. On the other hand, if the guide probe and the DNA sample are not cross-linked, the two exist separately under conditions that prevent hybridization. Therefore, if the DNA sample is subjected to mass spectrometry or gel electrophoresis under conditions where hybridization cannot be performed and the weight or molecular weight of the DNA sample increases, the guide probe and test DNA are cross-linked. If there is no change in the weight or molecular weight, the guide probe and the DNA sample are cross-linked, and it is determined that they are not.
  • the first kit of the present invention is a kit used for the first or second method of the methylcytosine detection method of the present invention described above.
  • This kit includes the above-described guide probe and a reagent capable of oxidizing methylcytosine.
  • Reagents capable of acidifying methylcytosine are typically oxidizing agents capable of acidifying carbon atoms as described above, but precursors that change to such oxidizing agents are also included in reagents capable of acidifying methylcytosine. It is.
  • an exonuclease capable of specifically degrading single-stranded DNA and an NH NH-group or NH O- group at the end are provided. Having pio It is only necessary to have tin or avidin, a labeling enzyme bound to avidin or piotin, and a chromogenic substrate for this labeling enzyme.
  • the kit for the method 2-1 further comprises an exonuclease capable of specifically degrading single-stranded DNA and the compound of the above formula (1) or the compound of the formula (2). Also mentioned.
  • an osmate is used as an oxidizing agent, and further includes biviridine.
  • the second kit used in the third method described above includes a bulge generating probe and bisulfite. Furthermore, it is preferable to provide a set of PCR reagents.
  • the third kit provided for the fourth method described above includes the guide probe described above and a reagent for cross-linking the guide probe described above and the DNA sample.
  • nucleic acid chip having one or more types of guide probes immobilized on a substrate If a nucleic acid chip having one or more types of guide probes immobilized on a substrate is used, the presence or absence of cytosine methyl candy at various positions can be detected at once for various genes.
  • the probe is the probe described above, but different probes may be used so that a plurality of target bases can be determined!
  • the base material of the nucleic acid chip is not particularly limited, and known materials such as glass, silica, and gold can be used.
  • the spot diameter of the probe on the substrate is, for example, 50-2
  • the spot pitch can be set to about 100 to 500 ⁇ m.
  • the above-described method of the present invention may be performed on the probe group on the nucleic acid chip.
  • a microplate reader for example, a fluorescent amplification, absorption, fluorescence polarization, fluorescence lifetime, etc.
  • a microplate reader for example, a fluorescent amplification, absorption, fluorescence polarization, fluorescence lifetime, etc.
  • a microchip reader for example, a fluorescent amplification, absorption, fluorescence polarization, fluorescence lifetime, etc.
  • the size of each DNA fragment on the chip can be detected, and as a result, the target bases of a plurality of DNA samples can be detected. It can be determined at a time whether the force is cytosine methyl cytosine.
  • the color development pattern on the chip can be read using a microplate reader or the like in the same manner as described above, whereby the target bases of a plurality of DNA samples can be cytosine. It can be determined at a time whether the force is a methylcytosine.
  • PCR may be performed simultaneously on the probe group on the chip, and the PCR amplification product may be detected using a microplate reader or the like.
  • the methylcytosine detection device of the present invention is a device comprising the nucleic acid chip described above and a device capable of detecting a color pattern on the chip.
  • the color pattern detection device include a microplate reader, a microchip reader, a fluorescence microscope, and a fluorescence imager that can measure fluorescence, absorption, fluorescence polarization, fluorescence lifetime, and the like.
  • m C means 5-methylcytosine
  • the target DNA was first radiolabeled. That is, T4 polynucleotide kinase 2 L and [ ⁇ - 32 P] AT P 4 L were mixed with 4 ⁇ L of a 100 ⁇ aqueous solution of the target DNA fragment, and water was added to make a total of 20 ⁇ L.
  • the DNA sample containing methylcytosine is 13mer DNA (5'-GCGTTGCGTTGCG) (SEQ ID NO: 1)
  • the DNA sample containing methylcytosine is 13mer DNA (5, -GCGTTGnGT TGCG; n is m C) (SEQ ID NO: 2 ).
  • the nucleotide of nucleotide number 7 is cytosine
  • the DNA of SEQ ID NO: 2 is the basic methylcytosine nucleotide of nucleotide # 7.
  • reaction was terminated by adding 50 ⁇ L of 13-mercaptoethanol (1 M) dissolved in aqueous buffer solution pH 7.0.
  • the sample was purified by ethanol precipitation, 50 ⁇ L of 1 M piperidine was added, and the mixture was allowed to stand at 90 ° C for 60 minutes.
  • Example 1 the same procedure as in Example 1 was performed, except that 13-mer DNA (5′-CGCAAC £ CAACGC) (SEQ ID NO: 4) was used as the probe.
  • G underlined in SEQ ID NO: 4 is for forming a base pair with C of base number 7 of SEQ ID NO: 1 or m C of base number 7 of SEQ ID NO: 2 of the DNA sample. .
  • Fig. 1 shows the results of electrophoresis.
  • Lane 1 in Fig. 1 shows the result of hybridizing the probe (12mer) of SEQ ID NO: 3 to the DNA sample (13mer; m C) of SEQ ID NO: 1
  • Lane 2 shows the DNA sample (13mer; C of SEQ ID NO: 2).
  • Lane 3 shows the probe of SEQ ID NO: 4 (13mer) against the DNA sample of SEQ ID NO: 1 (13mer; m C). The result of hybridization is shown.
  • Lane 2 shows the result of hybridization of the probe (13mer) of SEQ ID NO: 4 to the DNA sample (13mer; C) of SEQ ID NO: 2.
  • 15mer DNA 5′-AAAAAGnGAAAAAA-3 ′; n represents m C) (SEQ ID NO: 5) was used, and in the same manner as in Example 1, these 5 ′ ends were radiolabeled and purified. .
  • CCTTTTTT-3 ') (SEQ ID NO: 6) (20 ⁇ L of 1.33 ⁇ aqueous solution) is dissolved in 300 mM sodium acetate buffer PH6.0, and water is added to the total 50 U strain to form a double strand at room temperature. I let you.
  • Acid-oxidation reaction was performed by incubating at 0 ° C for 3 minutes in the presence or absence of 2 46. After incubation for 3 minutes, 0.5 M sodium acetate buffer pH 7.0 and Herring Sperm DNA (lmg / mL) were added and ethanol precipitation was performed.
  • 15mer DNA 5′-AAAAAAGnGAAAAAA-3 ′; n represents m C) (SEQ ID NO: 5) and 15mer DNA (5′-AAAAAAGC G AAAAAA-3 ′) (SEQ ID NO: 7)
  • 14-mer bulge-forming DNA 5TTTTTTCCTTTTTT-3,) (SEQ ID NO: 6) and Furumatsu DNA
  • 5TTTTTCTCCTTTTTT-3 ′ 14-mer bulge-forming DNA
  • Oxidation not used and oxidation used at a concentration of lOOmM were performed. Others were carried out in the same manner as in Example 2 for labeling the DNA sample, forming double strands, oxidizing treatment, piperidine treatment, and electrophoresis.
  • cytosine can be clearly distinguished. Furthermore, the cleavage band detected when methylcytosine is the same size as when a single-stranded DNA sample without a probe was cleaved with piperidine, and by using a bulge-forming probe, the target methylcytosine was detected. It can be seen that the detection is accurate. On the other hand, when a full-match probe that does not form a bulge was used, it was not possible to further differentiate between methinoresitocin and cytosine.
  • 15mer DNA 5′-AAAAAAGnGAAAAAA-3 ′; n represents m C) (SEQ ID NO: 5) and 15mer DNA (5′-AAAAAAGC G AAAAAA-3 ′) (SEQ ID NO: 7)
  • 14mer bulge-forming DNA 5TTTTTTCCTTTTTT-3) (SEQ ID NO: 6) was used.
  • the oxidation treatment was performed by incubating at 0 ° C for 3 minutes in the presence of ImM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 7.7), 100 mM bipyridine, 5 mM K 2 OsO, and 10% MeCN. This
  • DNA samples were radiolabeled, double-stranded, oxidized, piperidine treated, and electrophoresed.
  • FIG. Figure 6 shows that in the range of pH 7.15 to 9.01, a darker cut band was detected only for methylcytosine than for pH 6.02 or 6.54, indicating that the detection sensitivity of methylcytosine is high.
  • 15mer DNA 5′-AAAAAGnGAAAAAA-3 ′; n represents m C) (SEQ ID NO: 5) and 15mer DNA (5′-AAAAAAGC G AAAAAA-3 ′) (SEQ ID NO: 7)
  • 14mer bulge-forming DNA 5TTTTTTCCTTTTTT-3) (SEQ ID NO: 6) was used.
  • the oxidation treatment was performed at 0 ° C for 3 minutes in the presence of ImM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 7.7), 100 mM pyridine, bibilidine or phenanthroline, 5 mM K OsO, 10% MeCN.
  • methylcytosine is often present in close proximity. Even in such a case, in order to show that a specific methylcytosine can be detected by the method of the present invention, an attempt was made to detect methylcytosine using a partial sequence of p53 as a DNA sample.
  • SEQ ID NOS: 9 and 10 are used when the first target base of base number 9 is cytosine and SEQ ID NOS: 11 and 12, SEQ ID NOS: 11 and 12, respectively, are the second target bases of base number 17 are cytosine and methyl cytosine, and 5′-ACAAACACGCACCT for detecting the first target base as a bulge-forming probe.
  • CAAAGCTGTTCCTCCCAGTA-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5'-ACAAACACCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTA-3' (SEQ ID NO: 14) for detecting the second target base were used, and full-match probe 5'-ACAAACACGC ACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCCC AGTA-3 '(SEQ ID NO: 15) was also used.
  • Oxidation treatment was performed using ImM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 7.7), 100 mM bipyridine, 5 mM K Os.
  • FIG. Figure 8 shows that the first and second target bases can be specifically detected. It can be seen that by using the di-forming probe, it was possible to detect the presence / absence of methyl ⁇ at each base.
  • DNA samples 5-GCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGCGCCTC ACAACCTCCGTCATGTGCTGTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 16) and 5′-GCTATCTGAGCAGC mC (SEQ ID NO: 17) were used. These sequences are partial sequences of p53. In this example, the DNA sample was not radiolabeled to detect the cleaved fragment by PCR.
  • a total of 50 ⁇ l was obtained by mixing 15 L of water. This mixture was incubated at 0 ° C. for 5 minutes to oxidize, and 3M sodium acetate ( ⁇ 6.0) 200 / ⁇ ⁇ was added to stop the oxidation reaction.
  • ImM cold ethanol was added to the obtained supernatant and allowed to stand overnight at -78 ° C, centrifuged at -9 ° C at 1500 rpm for 15 minutes, and the supernatant was discarded. 80% cold ethanol was added, centrifuged for 5 minutes, the supernatant was discarded, and then evaporated for 5 minutes.
  • PCR reaction solutions include HotStarTaq Master Mix 10 L, 5 L primer mix,
  • PCR conditions were 95 ° C for 15 minutes; 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute.
  • Fig. 10 shows the results of measuring the amount of amplification product converted using the calibration curve for the amplification curve power in real-time PCR. Only when the bulge-forming probe and methylcytosine and the hybridized product were treated with acid, the amplification product was weak.
  • 5,-TTTTTTCnCTTTTTT-3 (n is a funnel
  • the olsein is linked to the carbon at the 5-position of the pyrimidine ring of deoxyuridine via a linker, and indicates the base; SEQ ID NO: 26) was used.
  • the DNA sample thus treated was mixed with a mismatch forming probe in the presence of 0.9 M NaCl in 50 mM aqueous sodium phosphate (pH 8.0).
  • the aqueous solution after the incubation was excited at 495 nm and the fluorescence intensity was measured.
  • Fig. 12 shows the obtained results.
  • the DNA fragment of SEQ ID NO: 24 is targeted, the methylcytosine moiety is formed on the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) !, which means that the fluorescence intensity derived from fluorescein ( 520 nm) and HEX-derived fluorescence intensity (55 °) were also high.
  • the test DNA fragment of SEQ ID NO: 25 is used as a target, since the osmium-containing heterocyclic group represented by the formula (5) is not formed, the HEX-derived fluorescence intensity (550 °) is low. there were. From the above results, methylcytosine forming a bulge structure can also be detected by forming an osmium-containing heterocyclic group represented by formula (5) and detecting the group using FERT. It was confirmed that
  • DNA samples 5′-AAAAAAGnGAAAAAA-3 ′ (n represents m C; SEQ ID NO: 27), 5, -AAAAAAGCGAAAAAA-3, (SEQ ID NO: 28) were used.
  • 5'-TTTTTTCnCTTTTTT-3 '(n is a group represented by the formula (7) is bonded to the oxygen atom on the 6-position carbon of the purine ring of guanine.
  • the base is shown; SEQ ID NO: 29) was used.
  • the mixture was centrifuged for 15 minutes and the supernatant was discarded. After adding 150 M of 80% cooled ethanol and centrifuging, the supernatant was discarded again. After depressurizingly distilling for 5 minutes, the sample diluted with Loading Buffer so that it might become 2000 CPM / L was flowed by gel electrophoresis.

Abstract

　被験ＤＮＡ中の目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定できる簡便な方法を提供する。 　ＤＮＡ試料中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造又はミスマッチを形成するようＤＮＡ試料とガイドプローブとをハイブリダイズさせる第１工程と、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに特異的な反応を誘導し、この反応の有無によりメチル化を検出する第２工程とを含むメチルシトシン検出方法。

Description

明 細 書
メチルシトシンの簡便検出法
技術分野
[0001] 本発明は、 DNA試料中の目的塩基がシトシンである力メチルシトシンであるかを判 定するメチルシトシン検出方法、及びそれに用いるプローブ、キット、核酸チップ、及 びメチルシトシン検出装置に関する。
背景技術
[0002] ェピジエネテイクスは、ゲノムを生理的に修飾する DNAメチル化、 DNAとタンパク 質との複合体であるクロマチン、クロマチンを構成する多くのタンパク質の翻訳後修 飾から成立しており、統合的に遺伝子発現を制御して!/、る。
[0003] クロマチン中のヒストンの修飾にっ 、ては、転写誘導の際に、ヒストン修飾によるクロ マチン構造変換が重要な役割を果たす。例えば、ヒストンァセチルイ匕酵素によるァセ チル化が引き金となって、クロマチンのリモデリングが誘導され、基本転写因子と RN Aポリメラーゼによる転写が開始する。また、ヒストンのメチルイ匕やリン酸ィ匕は、転写の 制御、サイレンシング、クロマチン凝縮などを引き起こす。
[0004] また、多くの真核生物ではゲノム中の CpGジヌクレオチドの 60〜90%が、シトシン 5 位炭素原子のメチルイ匕を受けて 、る。メチル化 CpGは反復配列を多く含むヘテロク ロマチンやトランスポゾンに見られており、ウィルスやトランスポゾンの活性化を抑えて いると考えられる。また、 CpGのメチルイ匕とヒストン修飾とは、相互に協調している。
[0005] 例外的に、多くの遺伝子のプロモーター領域にある CGリッチな領域 (CpGアイラン ド)ではメチルイ匕を受けていない。さらにその例外として、インプリンティングされる遺 伝子、女性の不活化 X染色体では CpGアイランドカ チルイ匕されている。また、がん 細胞におけるがん抑制遺伝子のプロモーター領域でも CpGアイランドカ チルイ匕さ れている。従って、シトシンのメチル化は、癌の発生、再発、転移のマーカーとして使 用することができ、遺伝子中のシトシン力 Sメチルイ匕されている力否かの簡単な検出方 法が求められている。
[0006] 特許文献 1 , 2は、 DNA試料を重亜硫酸塩で処理してメチルイ匕されて 、な 、シトシ ンをゥラシルに変化させ、次いで、ゥラシルよりメチルイ匕シトシンを優先的に増幅する プライマーを用いて PCRを行い、増幅の有無を検出することによりシトシンカ チル 化されていたか否かを判定する方法を教えている。しかし、この方法は、メチルシトシ ンではなく大多数を占めるシトシンを変化させるため、全てのシトシンの変換効率が 判定結果に影響を与え、その分判定精度が低くなる。
[0007] また、特許文献 3は、 5—メチルシトシンと特異的に結合する抗体を 1本鎖 DNAと接 触させ、 DNA鎖に結合した抗体量を測定することにより、 DNAメチルイヒ率を決定す る方法を教えている。しかし、この方法は、抗体の作成や、 DNA試料の PCRによる 増幅などを行う必要があり、手間がかかる。
[0008] また、非特許文献 1は、 2本鎖 DNA試料を過マンガン酸カリウム及びヒドロキシルァ ミンで酸化し、次いでピぺリジン処理することにより、 2本鎖 DNAにミスマッチが存在 する力否かを検出できることを教えている。この方法はヒドロキシルァミンが必須であ る（図 2、 3参照）。し力し、この方法はミスマッチの存在を検出できるだけであり、 DN A試料中のシトシンとメチノレシトシンとを区別することはできな 、。
特許文献 1：特表 2004— 527241号
特許文献 2：特表 2004— 500892号
特許文献 3：特表 2004 - 347508号
非特干文献 1 : Chinh Bui et al., Chemical cleavage reactions of DNA on solid suppo rt: application in mutation detection , BMC Chemical Biology,2003,Vol.3 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、 DNA試料中の目的塩基がシトシンである力メチルシトシンであるかを判 定できる簡便な方法、及びそれに用いるプローブ、キット、核酸チップ、及びメチルシ トシン検出装置を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0010] 上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(0 メチルシトシンとシトシンとを区別するために、メチルシトシン，又はシトシンに特異 的な反応を誘導し、その反応の有無を検出すれば、 目的塩基がシトシンであるかメチ ルシトシンであるかを判定することができる。し力し、このような反応は、 DNA試料中 の各ヌクレオチドの塩基に対して等しく引き起こされ、シトシンである力メチルシトシン であるかが問題となる目的塩基にのみ反応を引き起こすことはできない。
GO そこで、 目的塩基を有するヌクレオチドを除きそれに隣接する両側の領域と相補 的なガイドプローブ（バルジ形成プローブ）と DNA試料とをハイブリダィズさせれば、 目的塩基を有するヌクレオチドのみ二重らせん力 外部に飛び出したバルジ構造を 形成し、 DNA試料中のその他のヌクレオチドは二重らせん構造中に埋没するため、 目的塩基にのみ反応を引き起こすことができる。
[0011] また、 目的塩基と対応する塩基とだけがミスマッチして 、るガイドプローブ (ミスマツ チ形成プローブ）と DNA試料とをハイブリダィズさせれば、 目的塩基を有するヌクレ ォチドを含む塩基対が二重らせん中で緩んだ構造をとり、 DNA試料中のその他のヌ クレオチドは二重らせん構造中に埋没するため、 目的塩基にのみ反応を引き起こす ことができる。
(iii) シトシンよりメチルシトシンの方が、メチル基が結合した炭素原子が酸ィ匕を受け 易いため、酸ィ匕の有無によりシトシンとメチルシトシンとを区別することができる。
[0012] 従って、メチルシトシンに特異的な反応として、 目的塩基にのみ酸化反応を誘導 し、酸化反応物の有無を検出することにより、そのヌクレオチドがシトシンである力メチ ルシトシンであるかを判定することができる。
(iv) 酸化された DNAを塩基性物質で処理すると、酸ィ匕されたメチルシトシンの塩基 と糖との間の N—グリコシド結合が分解されるとともに、その酸化メチルシトシンを有す るヌクレオチドと隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合も加水分解され る。従って、塩基性物質で処理した後に、 DNA断片の大きさを PCRなどで検出する ことにより、問題となる塩基がシトシンである力メチルシトシンであるかを判定すること ができる。
(v) また、 目的塩基の酸ィ匕反応物を標識することによつても、その塩基がシトシンで ある力メチルシトシンであるかを判定することができる。この場合、 DNA試料中のプロ ーブとハイブリダィズしない 1本鎖部分にメチルシトシンが存在すれば酸ィ匕されてァ ルデヒドが生成し、誤検出の原因となる。これを避けるためには、バルジ形成プロ一 ブと DNA試料とをハイブリダィズさせた後、酸化処理前に、ハイブリダィズ産物を 1本 鎖 DNA特異的なェキソヌクレアーゼで処理して 1本鎖部分を除去すればよい。
(vi) 標識方法として、上記酸化反応物をさらに酸化してアルデヒドを生成し、このァ ルデヒドを例えばイミノ基を介して酵素で標識する方法がある。この方法によれば、問 題となる塩基カ チルシトシンである場合にだけ酵素標識されることになる。
(vii) DNAを重亜硫酸塩で処理すると、シトシンはゥラシルに変化する力 メチルシト シンは変化しな 、。重亜硫酸塩処理された DNAをゥラシル DNAグリコシダーゼで処 理し、次いで塩基性物質処理を行うと、 目的塩基がゥラシルである場合は、ゥラシル と糖との間の N—グリコシド結合が分解されるとともに、ゥラシルを有していたヌクレオ チドと隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が加水分解される。従って 、生じる DNA断片の大きさを PCRなどで検出することにより、 目的塩基がシトシンで ある力メチルシトシンであるかを判定することができる。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記のメチルシトシン検出方 法などを提供する。
項 1. DNA試料中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、
目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造又はミスマッチを形成するよう D NA試料とガイドプローブとをハイブリダィズさせる第 1工程と、
ノ レジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに特異的な反応 を誘導し、この反応の有無によりメチルイ匕を検出する第 2工程とを含むメチルシトシン 検出方法。
項 2. 第 1工程が、 目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造を形成する よう DNA試料とガイドプローブとをハイブリダィズさせる工程であり、
第 2工程が、バルジ構造を形成する前記シトシン又はメチルシトシンに特異的な反 応を誘導し、この反応の有無によりメチルイ匕を検出する工程である項 1に記載のメチ ルシトシン検出方法。
項 3. 第 2工程にぉ 、てメチルシトシンに特異的な反応を誘導する項 1に記載のメチ ルシトシン検出方法。
項 4. 第 2工程が、ノ レジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシン に酸化剤を作用させる第 2A工程と、酸化剤による酸化反応物の有無を検出する第 2 B工程とを含む項 3に記載のメチルシトシン検出方法。
項 5. 第 2B工程が、塩基性物質を作用させる工程を含む項 4に記載のメチルシトシ ン検出方法。
項 6. 第 2B工程が、塩基性物質を作用させる工程の後、 DNA試料の断片を検出 する工程を含む項 5に記載のメチルシトシン検出方法。
項 7. バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンを含む領域 を増幅することにより、 DNA試料の断片を検出する項 6に記載のメチルシトシン検出 方法。
項 8. 塩基性物質として、窒素含有物質を用いる項 5に記載のメチルシトシン検出 方法。
項 9. 第 1工程の後、ェキソヌクレアーゼ処理によりハイブリダィズ産物の 1本鎖部分 を除去する工程を有する項 3に記載のメチルシトシン検出方法。
項 10. 第 2B工程が、第 2A工程で生成する酸化反応物を標識する工程と、標識物 質を検出する工程とを含む項 9に記載のメチルシトシン検出方法。
項 11. 前記第 2B工程が、酸化剤による酸化反応物に対してさらに第 2の酸化処理 を行なう工程を含む項 10に記載のメチルシトシン検出方法。
項 12. 標識酵素を用 、て標識する項 10に記載のメチルシトシン検出方法。
項 13. 第 2B工程における、目的塩基の酸ィ匕反応物がピリミジン環の 5位炭素原子 の酸ィ匕反応物である項 4に記載のメチルシトシン検出方法。
項 14. 第 2A工程が、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシト シンに酸化剤を作用させて、メチルシトシン部分に式（5)で示されるオスミウム含有複 素環基を形成させる工程であり、
第 2B工程が、前記オスミウム含有複素環基の有無を検出する工程である、項 4に 記載のメチルシトシン検出方法。 [0014] [化 1]
Figure imgf000007_0001
[0015] (式中、 R1及び R2は、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、又は置換アルキ ル基を示す）
項 15. 第 2B工程が、標識物質により式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を標 識する工程と、標識化された当該オスミウム含有複素環基を検出する工程とを含む 項 14に記載のメチルシトシン検出方法。
項 16. 第 1工程で使用されるガイドプローブが、蛍光物質が結合されたガイドプロ ーブであり、且つ
第 2B工程が、前記蛍光物質に対して蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる蛍光 物質を用いて、式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を標識する工程と、蛍光共 鳴エネルギー移動の有無を測定する工程とを含む、
項 14に記載のメチルシトシン検出方法。
項 17. 第 1工程で使用されるガイドプローブが、式（5)で示されるオスミウム含有複 素環基の存在によって消光する蛍光物質を結合させたガイドプローブであり、且つ 第 2B工程が、前記蛍光物質の消光の有無を測定する工程である、
項 14に記載のメチルシトシン検出方法。
項 18. 第 2工程における目的塩基に特異的な反応がシトシンに特異的な反応であ る請求項 1に記載のメチルシトシン検出方法。
項 19. 第 2工程が、目的塩基を重亜硫酸塩処理する第 2C工程と、第 2C工程で生 成するゥラシルを検出する第 2D工程とを含む項 18に記載のメチルシトシン検出方法 項 20. 第 2工程が、第 1工程で得られたノ、イブリダィズ産物において、前記ガイドプ ローブと DNA試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第 2E工程と、前記ガイド プローブと DNA試料とのクロスリンクの有無を検出する第 2F工程とを含む項 3に記 載のメチルシトシン検出方法。
項 21. ガイドプローブの長さが 20〜： LOO塩基の長さである項 1に記載のメチルシト シン検出方法。
項 22. ガイドプローブの長さが 40〜： LOO塩基である項 5に記載のメチルシトシン検 出方法。
項 23. ガイドプローブが固相担体に結合されたものである項 1に記載のメチルシト シン検出方法。
項 24. DNA試料のシトシンである力メチルシトシンであるかを検出するべき目的塩 基を有するヌクレオチドを除く領域と相補的なメチルシトシン検出用プローブ。
項 25. DNA試料とハイブリダィズするメチルシトシン検出用プローブであって、 DN A試料のシトシンである力メチルシトシンであるかを検出するべき目的塩基との間で のみミスマッチするメチルシトシン検出用プローブ。
項 26. 項 24又は 25に記載のプローブと DNA試料とのハイブリダィズ産物。
項 27. 項 24又は 25に記載のプローブと、メチルシトシンを酸ィ匕可能な試薬とを備 えるメチノレシトシン検出用キット。
項 28. 酸ィ匕されたメチルシトシンを有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチ ドとの間の結合を切断可能な塩基性物質を備える項 27に記載のメチルシトシン検出 用キット。
項 29. 1本鎖 DNAを特異的に分解するェキソヌクレアーゼと、末端に NH NH—
2 基、又は NH O—基を有するピオチン又はアビジンと、アビジン又はピオチンと結合
2
した標識酵素と、標識酵素の発色基質とを備える項 27に記載のメチルシトシン検出 用キット。
項 30. 1本鎖 DNAを特異的に分解するェキソヌクレアーゼと、下記式（1)又は（2) の標識物質とを備える項 27に記載のメチルシトシン検出用キット。
[化 2]
Figure imgf000009_0001
[0017] (式中、 Rは標識物質を示す。）
[0018] [化 3]
Figure imgf000009_0002
[0019] (式中、 Rは標識物質を示す。）
項 31. メチルシトシンを酸ィ匕可能な試薬として、オスミウム酸塩とビビリジンとを備え る項 27に記載のメチルシトシン検出用キット。
項 32.
メチルシトシン検出用プローブ力 蛍光物質が結合されてなるものである、請求項 3 1に記載のメチルシトシン検出用キット。
項 33. メチルシトシン検出用プローブ力 式（5)で示されるオスミウム含有複素環基 の存在によって消光する蛍光物質が結合されてなるものである、項 31に記載のメチ ルシトシン検出用キット。
項 34. 項 24又は 25に記載のプローブと、重亜硫酸塩とを備えるメチルシトシン検 出用キット。
項 35. メチルシトシンと特異的に結合可能な基を結合させた項 24又は 25に記載の プローブを備えるメチルシトシン検出用キット。
項 36. 項 24又は 25に記載のプローブの 1種以上が、基体上に固定された核酸チ ップ。
項 37. 項 36に記載の核酸チップと、チップ上の発色パターンを検出できる装置とを 備えるメチルシトシン検出装置。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]本発明の第 1の方法の手順を説明する図である。 [図 2]本発明の第 2の方法の手順を説明する図である。
[図 3]実施例 1及び比較例 1で行った電気泳動の結果を示す図である。
[図 4]実施例 2で行った電気泳動の結果を示す図である。
[図 5]実施例 3で行った電気泳動の結果を示す図である。
[図 6]実施例 4で行った電気泳動の結果を示す図である。
[図 7]実施例 5で行った電気泳動の結果を示す図である。
[図 8]実施例 6で行った電気泳動の結果を示す図である。
[図 9]実施例 7で行ったリアルタイム PCRでの蛍光強度の変化を示す図である。 (A) はバルジ生成プローブを用いることによりメチルシトシンを検出できたことを示しており 、 (B)は酸ィ匕処理することによりメチルシトシンを検出できたことを示している。
[図 10]実施例 7で行ったリアルタイム PCRの増幅産物量を比較したグラグである。
[図 11]実施例 8で行った矩形波ボルタンメトリー測定の結果を示す図である。
[図 12]実施例 9で行った蛍光強度の測定の結果を示す図である。
[図 13]実施例 10で行った蛍光強度の測定の結果を示す図である。
[図 14]実施例 11で行った電気泳動の結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明を詳細に説明する。
ωメチルシトシン枪出方法
DNA試料中のシトシンのメチルイ匕を検出する方法であって、目的とする塩基である シトシン又はメチルシトシンがバルジ構造又はミスマッチを形成するよう DNA試料と ガイドプローブとをハイブリダィズさせる第 1工程と、バルジ構造又はミスマッチを形成 する目的塩基に特異的な反応を誘導し、この反応の有無によりメチル化を検出する 第 2工程とを含む方法である。
[0022] 「目的塩基のバルジ構造」とは、 DNA試料とプローブとで形成される 2本鎖核酸に おいて、塩基対を形成せずに 2本鎖から外部に飛び出した、目的塩基 (シトシン又は メチルシトシン）を含むヌクレオチド力もなる膨らみを!、う。
[0023] 第 2工程力 Sメチルシトシンに特異的な反応を誘導するものである場合、第 2工程は、 それには限定されな 、が、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチル シトシンを酸化処理する第 2A工程と、目的塩基の酸ィ匕の有無 (具体的には、炭素原 子の酸ィ匕の有無)を検出する第 2B工程とを含むものとすることができる。第 2B工程 では、酸化反応物が検出されれば目的塩基カ^チルシトシンであると判定することが できる。
[0024] さらに、第 2B工程における判定方法により、第 1及び第 2の二つの方法に分類され る。第 1工程は、両方法で共通である。
[0025] また、第 2工程がシトシンに特異的な反応を誘導するものである場合、第 2工程は、 それには限定されないが、目的塩基を重亜硫酸塩処理する第 2C工程と、目的塩基 のゥラシルへの変化の有無を検出する第 2D工程とを含むものとすることができる。第 2D工程では、ゥラシルになっている場合に目的塩基がシトシンであると判定すること ができる。この方法を第 3の方法とする。
[0026] そして更に、第 2工程は、第 1工程で得られたノヽイブリダィズ産物にぉ 、て、前記ガ イドプローブと DN A試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第 2E工程と、前記 ガイドプローブと DNA試料とのクロスリンクの有無を検出する第 2F工程とを含むもの とすることができる。第 2F工程では、前記ガイドプローブと DNA試料がクロスリンクさ れている場合に目的塩基力 Sメチルシトシンであると判定することができる。この方法を 第 4の方法とする。
DNA試料
DNA試料は、血液、尿、痰、精液、髪、皮膚などの生体サンプルそのものであって もよぐ生体サンプルから単離されたものであってもよいが、単離された DNAを用い ることが好ましい。
ハイブリダィゼーシヨン
前述したように、 DNA試料中の目的塩基に特異的な反応を誘導するためには、酸 ィ匕剤などが目的塩基に接近する必要があるが、通常各ヌクレオチドは 2本鎖 DNAの らせん構造中に埋没して 、て、酸化剤が接近できな 、。
[0027] 従って、本発明方法では、一つの選択肢として、シトシンであるカ チルシトシンで あるかが問題となる目的塩基のみ塩基対を形成せずにその塩基を有するヌクレオチ ドが外部に飛び出した 2本鎖 DNAを作製する。このためには、例えば、 DNA試料の 目的塩基を有するヌクレオチドを除く領域、即ち目的塩基を有するヌクレオチドを除 きそれに隣接する両側の領域と相補的なガイドプローブと DNA試料とをハイブリダィ ズさせる。このガイドプローブは、 2本鎖 DNAから飛び出した、 目的塩基を有するヌク レオチドの「バルジ」を形成するためのバルシ生成プローブである。
[0028] プローブは上記両側の領域に相補的である。メチルシトシンの他にチミンもピリミジ ン環の 5位炭素にメチル基を有するため酸ィ匕を受け易い。従って、チミンの誤検出を 避ける必要があるため、プローブは上記両側の領域に相補的なものとする。また、 目 的塩基のみ塩基対を作らないように設計され、これにより目的塩基に隣接してチミン が存在していても、それが酸ィ匕されてメチルシトシンの誤検出の原因となることがない
[0029] また本発明方法では、第 2の選択肢として、 目的塩基のみミスマッチするようにして 2本鎖 DNAを作製する。ミスマッチによって孤立したメチルシトシンは、バジル構造を 形成した場合と同様に、酸ィ匕を受け易い。 目的塩基のみでミスマッチさせるには、 D NA試料との間で目的塩基のみミスマッチするようなガイドプローブと DNA試料とを ハイブリダィズさせればよい。このガイドプローブは、 2本鎖 DNA中でミスマッチ塩基 対力もなる緩んだ構造を形成するためのミスマッチ生成プローブである。ミスマッチ生 成プローブと DNA試料との間では、ミスマッチ塩基対を除き全ての塩基対が相補的 である。
[0030] ガイドプローブの好適な長さは各方法で異なっており、通常、 20〜： LOO塩基程度が 好ましぐ 20〜50塩基程度がより好ましい。中でも、第 1の方法では 40〜： LOO塩基程 度が好ましぐ 50〜80塩基程度がより好ましい。また、この程度の長さであれば、安 定に 2本鎖を形成できるとともに、 DNA自動合成機で合成することができる。第 1の 方法では、後述するように、プローブとの 2本鎖形成領域に対して PCRなどの核酸増 幅を行う場合があるため、 PCRプライマーが結合できる程度の長さのプローブが必要 となる。
[0031] また、ガイドプローブを、どの位置にバルジ又はミスマッチを形成するように設計す るかは特に限定されない。好ましくは、 目的塩基のノ レジ又はミスマッチを 2本鎖の 中央付近に形成できるように設計すればよい。 [0032] ガイドプローブは、上記領域とハイブリダィズできるようにそれに相補的なものであ ればよぐ DNA、 RNA、ペプチド核酸（PNA)、修飾核酸などのいずれであってもよ い。 DNA試料として細胞抽出液のようにヌクレアーゼを含むものを用いる場合は、修 飾核酸プローブとすることによりヌクレアーゼによる分解を受け難くなる。修飾核酸と しては、ホスホロチォエート修飾核酸、モルホリノ修飾核酸、 2'— O—アルキル核酸、 2'— N—アルキル核酸、 2'— S—アルキル核酸、 2'—ハロゲン核酸などが挙げられる 。また、ハイブリダィゼーシヨンを安定ィ匕するため、プローブの配列中に 2—ァミノアデ ニン、 5—アルキ-ルゥリジンのような修飾塩基を有するヌクレオチドを配したり、プロ ーブの末端又は内部をァミン、ポリアミン等で修飾したり、プローブの末端にジデォキ シヌクレオチドを付加したりすることもできる。
[0033] また、核酸プローブは、ビーズ状又は平板状の担体に固定されて 、ることが好まし ぐこれにより、プローブに結合した DNA試料に対して順次異なる処理を行ったり、 処理間に DNA試料を洗浄することができる。また、プローブの再利用が可能となる。 このような担体材料として、例えば、ポリスチレン、金、ガラス、磁性を持つ酸化鉄微 粒子、量子ドット性を持つ硫ィ匕亜鉛微粒子などが挙げられる。
[0034] ハイブリダィゼーシヨンの条件は特に限定されない。 DNA試料の種類、プローブの 長さなどによって異なるが、例えば、 pH7のリン酸ナトリウム緩衝液などのハイブリダィ ゼーシヨン溶液を用いて室温〜 100°C程度で 5分間〜 1時間程度処理した後、 pH7 のリン酸ナトリウム緩衝液などを用いて 5〜25°C程度で 1〜5分間程度洗浄する条件 が挙げられる。
<第 1の方法 '第2の方法 >
酸化処理
第 1、第 2の方法では、第 2工程において目的塩基を含むハイブリダィズ産物を酸 ィ匕剤で処理し、 目的塩基カ^チルシトシンである場合は、メチル基を有する炭素原子 を酸化する（第 2A工程)。メチルシトシンとしては 5—メチルシトシンが代表的である。 5—メチルシトシンは、シトシンに比べて、ピリミジン環の 5位炭素原子が酸ィ匕され易い ため、酸化処理物を比較して、酸化反応物の有無を検出すること (第 2B工程）により 両者を識別できる。 [0035] DNA試料の 5—メチルシトシン部分の酸ィ匕反応後の構造の代表例としては、下記 の式（3)で示されるジヒドロキシ置換ピリミジル基、又は下記の式 (4)で示されるェポ キシ置換ピリミジル基が挙げられる。
[0036] [化 4]
Figure imgf000014_0001
[0037] [化 5]
Figure imgf000014_0002
[0038] 本発明方法では、炭素原子を酸ィ匕できる公知の酸化剤を制限なく使用できる。この ような酸化剤として、ピリミジン環の 5位炭素原子と 6位炭素原子との間の 2重結合を 酸化できる酸化剤、例えば、過マンガン酸カリウム (KMnO )のような過マンガン酸塩
4
；四酸化オスミウム（OsO )、オスミウム酸カリウム (K OsO )のようなオスミウム酸塩、
4 2 4
タングステン酸ナトリウム (Na WO )のようなタングステン酸塩、過ヨウ素酸ナトリウム（
2 4
NalO )のような過ヨウ素酸塩、過酸化水素（H O )、 tーブチルヒドロペルォキシド（t
4 2 2
— BuOOH)、過安息香酸及びその置換体 (m—クロ口過安息香酸 (mCPBA)、 3, 5—ジニトロ過安息香酸）、ヨウ素（I )、酸ィ匕レニウム (Re O )、過酢酸 (AcOOH)及
2 2 7
びその置換体、マンガンーサレン錯体などが挙げられる。
[0039] また、上記の炭素 炭素 2重結合を酸化できる酸化剤が還元状態になったときにこ れを再酸化する作用のある酸化剤も使用できる。このような再酸化剤として、 N—メチ ルモルホリン N ォキシド（NMO)、フェリシアン化カリウム（K Fe (CN) )等が挙げ
3 6
られる。 2重結合の酸化剤とその再酸化剤とを含むものとしてォキソン (Oxone) (デュ ボン社製） ·重過硫酸カリウム (KHSO )のような重過硫酸塩が挙げられる。
5
[0040] その他、酸化バナジウムァセチルァセトナート、酸素、次亜塩素酸ナトリウム（NaO C1)のような次亜塩素酸塩、ジメチルジォキシランなどの酸ィ匕補助剤も使用できる。
[0041] 酸化処理は、酸化剤の種類に応じた濃度 (例えば 0.1〜1000 mM)の酸化剤水溶液 をハイブリダィズ産物に添加して、温度 0〜40°C程度で 1分間〜 1時間程度行えばよ い。酸化処理は、 pH7〜9程度の塩基性条件下で行うことが好ましぐこれにより酸ィ匕 速度が高くなりシトシンとメチルシトシンとを一層明確に区別できるようになる。また上 記 pH範囲内であれば、 2本鎖が安定に保たれる。
[0042] 上記範囲内で、酸化剤の種類に応じて適した条件を選択すればよい。また、例え ばオスミウム酸塩にはフェリシアンィ匕カリウムやメチルモルホリンォキシド等の酸ィ匕活 性化剤を併用することができる。
[0043] また、酸化反応液に、ピリジン、ビビリジン、又はフエナンスロリンのような酸化剤に 配位できる化合物を 10〜500mM程度添加することにより反応速度が高くなる。なお 、ビビリジンを添加して酸ィ匕処理を行う場合、式（3)で示されるジヒドロキシ置換ピリミ ジル基を生成させるには、 Na SOのような亜硫酸塩で処理することが必要である。こ
2 3
のような亜硫酸塩による処理条件は公知である。
[0044] さらに、ピリジン、ビビリジン又はフエナンスロリンの存在下で、炭素 炭素 2重結合 を酸化できる酸化剤と再酸化剤とを併用するには、酸化速度が著しく高くなり、その 結果、シトシンとメチルシトシンとを一層明確に区別できるようになる。再酸化剤の使 用量は、その種類により異なる力 通常 10mM〜lM程度とすることができ、 10-10 OmM程度が好ましい。
第 1の方法
第 1の方法を図 1を参照しながら説明する。
[0045] 第 1の方法では、ハイブリダィズ産物に含まれる目的塩基の酸化処理物を塩基性 物質で処理する。これにより、酸化されたメチルデォキシシチジル酸が、酸化されたメ チルシトシンと糖とに分解されるとともに、酸化されたメチルデォキシシチジル酸とそ れに隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が加水分解される。従って
、第 1の方法では、塩基性物質処理によりこのような分解が生じるような酸化剤を用い る。塩基の炭素原子を酸化できる酸化剤であれば、塩基性物質処理によりこのような 分解が生じる。このような酸化剤として、例えば、上記例示したものを使用できる。中 でも、酸化反応効率の点で、過マンガン酸塩、四酸ィ匕オスミウム、オスミウム酸力リウ ムのようなオスミウム酸塩が好ましぐ四酸ィ匕オスミウムがより好ましい。
[0046] 酸化処理に続き、塩基性物質処理を行う（図 la)。 目的塩基カ チルシトシンであ ればメチルシトシンが酸ィ匕されるため、プローブとハイブリダィズした領域は塩基性物 質処理により目的塩基を有するヌクレオチドの部分で切断される。一方、 目的塩基が シトシンであればシトシンは酸化されな!、ため、プローブとハイブリダィズした領域は 塩基性物質処理によっても切断されない。従って、 目的塩基を有するヌクレオチドと それに隣接する両ヌクレオチドとの間の少なくとも 1つのホスホジエステル結合が分解 されたか否かを判定すれば、 目的塩基が酸化されたか否か、ひいては目的塩基がシ トシンである力メチルシトシンであるかを判定することができる。即ち、塩基性物質処 理によって、メチルシトシン部分で特異的な切断が生るため、生成する DNA断片の 大きさを測定することによって、メチルシトシンの有無が判定できる。
[0047] このような塩基性物質としては、例えばピぺリジン、ァ-リン等の窒素含有塩基性物 質を用いることができる。中でも、反応効率力 い点で、ピぺリジンが好ましい。
[0048] 塩基性物質による処理は、その種類に応じて適切な濃度の水溶液を DNA試料に 添加し、 60〜： LOO°C程度で 1分間〜 1時間程度行えばょ 、。
[0049] ホスホジエステル結合の分解の有無は、塩基性物質処理により得られる DNA断片 のうち目的塩基を有するヌクレオチドを含むものの大きさを検出することにより知ること ができる。
[0050] 例えば、塩基処理後の DNA試料の目的塩基を有するヌクレオチドを含む領域に 対して核酸増幅を行! \この DNA領域全体が増幅したか否かを電気泳動などで検 出することにより、 目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間 のホスホジエステル結合が分解されたカゝ否かが分かる。代表的には、プローブとハイ ブリダィズさせた領域全体を増幅できるプライマーを用いて PCRを行 ヽ、増幅産物を 電気泳動に供すればよい（図 lb)。特に、 Real Time PCRを行うときには、 PCRの サイクル毎の増幅効率をモニタリングすることができるため、増幅の有無を効率よく検 出できる。また、採取した細胞群の中でどの程度の細胞カ^チルイ匕されているかを定 量することができる。
[0051] また、質量分析により DNA断片の重さを測定したり、水晶発振子マイクロバランスを 用いた電気化学的分析により、ホスホジエステル結合の有無を調べることによつても 、 目的塩基を有するヌクレオチドヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間の ホスホジエステル結合が分解されたカゝ否かを検出することができる。さらに、表面ブラ ズモン共鳴による DNA断片の重量に対する応答量を検出することによつてもホスホ ジエステル結合が分解されたか否かを検出することができる。
[0052] 第 2の方法
第 2の方法では、ハイブリダィズ産物に含まれる目的塩基の酸化処理物を特異的 に検出することにより、 目的塩基の酸ィ匕の有無を判定する。
[0053] 第 2の方法では、通常目的塩基を酸化処理する前 (第 2A工程前）に、 1本鎖 DNA 特異的なェキソヌクレアーゼで処理することにより、プローブとハイブリダィズして ヽな い 1本鎖の部分を除去しておくことが望ましい。これにより、プローブとハイブリダィズ しない領域にメチルシトシンが存在していても、それによる誤検出を避けることができ る。ェキソヌクレアーゼの種類は特に限定されず、公知のものを使用することができる 。このようなェキソヌクレアーゼは、例えば USB社から市販されている。なお、ェキソ ヌクレアーゼ処理は、 目的塩基を酸ィ匕処理した後に行ってもよい。また、ェキソヌクレ ァーゼ処理は、第 2の方法だけでなぐ第 1の方法や第 3の方法において行ってもよ い。
[0054] 第 2の方法の具体的実施態様としては、ハイブリダィズ産物に含まれる目的塩基を 酸化処理して、式（3)で示されるジヒドロキシ置換ピリミジル基又は式 (4)で示される エポキシ置換ピリミジル基を形成させた後、これらの基を検出する方法 (以下、第 2-2 の方法と表記する）が挙げられる。また、第 2の方法の他の実施態様としては、ハイブ リダィズ産物に含まれる目的塩基に対して、オスミウム酸塩及びビビリジルイ匕合物を 用いて処理して、下記の式（5)で示されるオスミウム含有複素環基を形成させた後、 当該オスミウム含有複素環基を検出する方法 (以下、第 2-2の方法と表記する）が挙 げられる。なお、本明細書において「第 2の方法」と表記する場合には、上記第 2-1の 方法と第 2-2の方法の双方を包含する意を示す。
[0055] [化 6]
Figure imgf000018_0001
[0056] 以下、第 2の方法を上記第 2-1の方法と第 2-2の方法に分けて説明する。
1の
第 2-1の方法では、前述したようにして、酸化処理を行う（第 2B工程)。第 2-1の方 法では、上記例示した炭素原子を酸ィ匕できる酸化剤を制限なく使用できる。中でも、 反応速度が大きい点で、過マンガン酸カリウムのような炭素 炭素 2重結合を酸ィ匕で きる酸化剤が好ましい。
[0057] 次いで、酸化処理物を標識処理する。目的塩基カ チルシトシンであれば、前述の 酸ィ匕処理によりジヒドロキシ置換ピリミジル基又はエポキシ置換ピリミジル基が生成す るため、例えばィ匕合物（1)を作用させることにより、下記のようにしてジヒドロキシ置換 ピリミジル基又はエポキシ置換ピリミジル基が標識物質 Rで標識される。標識は、酵素 標識、蛍光標識、又は放射標識のいずれであってもよい。
[0058] [化 7]
Figure imgf000019_0001
[0061] 上記化合物（1)及び（2)において、 Rは標識物質を示す, [0062] また、ジヒドロキシ置換ピリミジル基又はエポキシ置換ピリミジル基をさらに別の官能 基に変換してそれを介して標識物質を結合させることもできる。この方法の 1例を図 2 を参照して説明する。図 2において、 1本鎖 DNA特異的なェキソヌクレアーゼで処理 して、プローブとハイブリダィズしていない 1本鎖の部分を除去した後（図 2a)、酸ィ匕処 理を行う（図 2b)。
[0063] 酸化処理した目的塩基に対して、さらに第 2の酸化処理を行う。酸化剤の種類は特 に限定されず、例えば上記例示したものを使用できる。中でも、過ヨウ素酸塩が好ま しい。この酸化処理は、 0〜40°C程度で 1分間〜 1時間程度行えばよい。 DNA断片 中に、前述の式（3)で示されるジヒドロキシ置換ピリミジル基、又は式 (4)で示される エポキシ置換ピリミジル基が存在して 、れば、 V、ずれか一方の水酸基又はエポキシ 基がアルデヒドに変換される（図 2c)。
[0064] 次 、で、標識物質を用いてこのアルデヒドを検出する。標識物質とアルデヒドとの結 合には、アルデヒドと反応してイミノ基を形成するような官能基を使用することができ、 このような官能基として、 NH NH 又は NH O などを挙げることができる（図 2d)。
2 2
[0065] 標識物質は、標識酵素、蛍光物質、放射性物質などの 、ずれであってもよ!/、。中で も、標識酵素は酵素反応により検出感度が高くなる点で好ましい。標識酵素は特に 限定されず、例えば西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP)のようなペルォキシダーゼ 、アルカリフォスファターゼ、ガラクトシダーゼなどの公知の標識酵素を制限なく使用 できる。これらの酵素の発色基質は周知である。 HRPで標識する場合は例えば HPP A、オルトフエ-レンジァミン、 TMBZのような発色基質を用いればよい。中でも HPP Aは蛍光を発するため検出感度が高くなる。またアルカリフォスファターゼで標識する 場合は、 NBTZBCIPのような発色基質を用いればよい。ガラクトシダーゼで標識す る場合は X— galのような発色基質を用いればょ 、。
[0066] アルデヒドをイミノ基を介して標識するにあたっては、例えばピオチン アビジン反 応を利用することができる。詳述すれば、 DNA側のアルデヒドと、 NH NH 又は N
2
H O を結合させたピオチン誘導体とを反応させて、末端をピオチンとする。これに
2
対してアビジンを結合させた標識物質を作用させて、 5〜40°C程度で 1分間〜 1時間 程度反応させることによりピオチン アビジン結合を形成すればょ 、。ピオチンとアビ ジンとの位置関係を逆にすることもできる。これにより、イミノ基及びピオチン一ァビジ ン結合を介してアルデヒドを標識することができる。
[0067] 例えば標識酵素を使用する場合、その存在は発色基質との反応により検出できる。
酵素反応により基質が発色すれば、 目的ヌクレオチドの塩基にアルデヒドが存在して いたこと、ひいては、 目的ヌクレオチドが酸ィ匕されたこと、及び目的塩基がメチルシト シンであることが分かる。
第 2-2の方法
第 2-2の方法では、まず、ハイブリダィズ産物に対して、オスミウム酸カリウムのような オスミウム酸塩と共に式 (A)で示されるビビリジンィ匕合物を作用させて処理を行!、、 酸化反応物である式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を形成させる。
[0068] [化 9]
Figure imgf000021_0001
[0069] [化 10]
Figure imgf000021_0002
[0070] 式（5)及び (A)にお!/、て、 R1及び R2は、同一又は異なって、水素原子、アルキル 基、又は置換アルキル基を示す。アルキル基、又は置換アルキル基のアルキル基部 分としては、具体的には、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基，イソプロピル基、 n— ブチル基、イソブチル基、 tert—ブチル基、 sec—ブチル基、 n—ペンチル基、ネオ ペンチル基、 n キシル基、イソへキシル基、 3—メチルペンチル基等の直鎖状又 は分岐鎖状の炭素数 1 6のアルキル基が例示される。置換アルキル基の置換基と しては、例えばハロゲン原子、シァノ基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、低級ァ ルコキシ基、低級アルカノィルォキシ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキル アミノ基、力ルバモイル基、低級アルキルアミノカルボ-ル基、ジ低級アルキルアミノ カルボ-ル基、低級アルコキシカルボ-ルァミノ基、 （N—ァミノ低級アルキル）ァミノ カルボ-ル基、低級アルキルスルホンアミド基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級 アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級ァ ルカノィルァミノ基等が挙げられる。ここで、「低級アルキル」とは、直鎖状又は分岐鎖 状の炭素数 1〜6のアルキル基であり、その具体例は、前記で例示した基が挙げられ る。また、置換アルキル基の置換基の数は、 1又は 2以上であればよぐ好ましくは 1 又は 2である。
[0071] 特に、式 (A)で示されるビビリジンィ匕合物の中でも、以下の式で示される化合物（以 下、 Bipyridyl Ligand 4と表記する）は、簡便に標識物質を結合できるように設計され ており、好適である。
[0072] [化 11]
Figure imgf000022_0001
Bipyridylし igand 4
[0073] Bipyridyl Ligand 4の合成は、公知の方法に従って行うことができる力 代表的な合 成経路としては、以下の化学式に示す合成経路が例示される。
[0074] [化 12]
Figure imgf000023_0001
Bipyridyl Ligand 4
[0075] オスミウム酸塩と式 (A)で示されるビビリジンィ匕合物の使用量としては、特に制限さ れないが、通常、オスミウム酸塩を 0.1〜1000mM程度、及び式 (A)で示されるビビリ ジン化合物を 0.1〜1000mM程度とすることができ、オスミウム酸塩を l〜100mM程度 、及び式 (A)で示されるビビリジン化合物を 10〜100mM程度が好まし!/、。
[0076] また、オスミウム酸塩及びビビリジンに加えて、フェリシアン化カリウムやメチルモル ホリンォキシド等の酸ィ匕活性化剤を併用することができる。これらの酸ィ匕活性剤を併 用する場合、その使用量は、通常 0.1〜100mM程度、好ましくは 0.1〜50mM程度に 設定することができる。
[0077] 上記酸化処理は、温度 0〜40°C程度で 30秒〜 1時間程度行えばょ 、。また、上記酸 化処理は、 pH7〜9程度の塩基性条件下で行うことが好ましぐこれにより酸化速度 が高くなりシトシンとメチルシトシンとを一層明確に区別できるようになる。また上記 pH 範囲内であれば、 2本鎖が安定に保たれる。
[0078] 次いで、式（5)で示されるオスミウム含有複素環基の検出を行う。当該オスミウム含 有複素環基は、例えば、以下の 3つの検出方法に従って検出することができる。 (検出方法 1)
検出方法 1は、標識物質により式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を標識す る工程と、標識化された当該オスミウム含有複素環基を検出する工程とを行う。式 (5) で示されるオスミウム含有複素環基の標識は、酵素標識、蛍光標識、電気化学的標 識、又は放射標識のいずれであってもよい。中でも、アントラキノンによる標識は、電 気化学的に検出可能であり、簡便な検出ができる点で利点がある。式 (5)で示される オスミウム含有複素環基の標識は、ポスト修飾法等の公知の方法に従って実施され る。例えば、式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基が形成された酸化処理物と、 アントラキノンに一 NHSを結合させたアントラキノン誘導体とを反応させることにより、 アントラキノン標識オスミウム含有複素環基を得ることができる。当該アントラキノン標 識オスミウム含有複素環基としては、具体的には、式 (6)で示される基が例示される。
[0079] [化 13]
Figure imgf000024_0001
[0080] (式中、 AQとはアントラキノンを示す。 R2は前記と同じ。 )
標識化された当該オスミウム含有複素環基の検出は、標識物質の種類に応じた公 知の方法で実施される。例えば、標識物質がアントラキノンの場合であれば、矩形波 ボルタンメトリー（Square wave voltammetry)測定等の電気化学的な手法を用いて検 出することができる。
[0081] (検出方法 2)
検出方法 2では、蛍光物質を結合させたガイドプローブを使用して第 1工程を実施 した上で、以下の工程：
当該蛍光物質に対して FRET (蛍光共鳴エネルギー移動)を生じさせる蛍光物質を用 V、て式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を標識する工程と、
FRET (蛍光共鳴エネルギー移動）の有無を測定する工程と、
を行う。
[0082] 当該検出方法 2において、式（5)で示されるオスミウム含有複素環基が存在する場 合には、ガイドプローブに結合した蛍光物質と、オスミウム含有複素環基に結合した 蛍光物質との間に FRETが生じて、ガイドプローブに結合した蛍光物質の蛍光波長 領域又は蛍光強度に変化が認められる。一方、式 (5)で示されるオスミウム含有複素 環基が存在しな ヽ場合には、ガイドプローブに結合した蛍光物質の蛍光波長領域又 は蛍光強度に変化は認められな 、。
[0083] 当該検出方法 2を採用する場合に使用されるガイドプローブにおいて、蛍光物質の 結合位置にっ 、ては特に限定されな 、が、バルジ構造を形成させるバルジ生成プロ ーブの場合であれば、 DNA試料の目的塩基に隣接する塩基に対して、塩基対を形 成する塩基に蛍光物質が結合されていることが好ましい。また、ミスマッチを形成させ るミスマッチ生成プローブの場合であれば、目的塩基に対してミスマッチする塩基に 蛍光物質が結合されて 、ることが好ま 、。
[0084] FRETが生じる蛍光物質の組み合わせとしては、例えば、 HEXとフルォレセイン； T AMRAとフルォレセイン； Cy3と Cy5等が例示される。
[0085] (検出方法 3)
検出方法 3では、式（5)で示されるオスミウム含有複素環基の存在によって消光す る蛍光物質を結合させたガイドプローブを使用して第 1工程を実施した上で、当該蛍 光物質の消光の有無を測定する。当該検出方法 3では、オスミウム含有複素環基が 存在する場合には、ガイドプローブに結合させた蛍光物質の消光が認められる。
[0086] 検出方法 3を採用する場合に、第 1工程で使用されるガイドプローブとしては、具体 的には、下記の式（7)で示される基が結合して 、る塩基を含むガイドプローブが例示 される。当該ガイドプローブにおいて、式（7)で示される基の結合部位については、 該基が結合する塩基の種類に応じて適宜設定される。式 (7)で示される基の結合部 位の好適な例としては、結合対象となる塩基がアデニン又はグァニンの場合にはプリ ン環の 6位の炭素に結合している窒素原子又は酸素原子が挙げられ;結合対象とな る塩基がシトシン又はチミンの場合にはピリミジン環の 4位の炭素に結合している窒 素原子又は酸素原子、或いはピリミジン環の 5位の炭素が挙げられる。
[0087] [化 14]
Figure imgf000026_0001
[0088] また、当該検出方法 3を採用する場合に使用されるガイドプローブにおいて、式（7 )で示される基の結合位置については特に限定されないが、バルジ生成プローブの 場合であれば、 DNA試料の目的塩基に隣接する塩基に対して、塩基対を形成する 塩基に式（7)で示される基が結合されていることが好ましい。また、ミスマッチ生成プ ローブの場合であれば、目的塩基に対してミスマッチする塩基に式（7)で示される基 が結合されて 、ることが好ま 、。
[0089] <第 3の方法 >
第 3の方法では、第 2C工程において、目的塩基を重亜硫酸塩で処理する。この処 理により、目的塩基がシトシンであればそれがゥラシルに変化する。従って、第 2Dェ 程では、ゥラシルになっているか否かを検出する。ゥラシルになっている場合は目的 塩基がシトシンであると判定することができる。
[0090] 重亜硫酸塩 (酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシゥ ム塩などのいずれであってもよい。またこの処理は、濃度 0. 1〜： LOM程度、温度 5〜 95°C程度で、 0. 5〜60分間程度行えばよい。
[0091] ゥラシルの検出方法としては、それには限定されないが、重亜硫酸塩処理された目 的塩基を有するハイブリダィズ産物を、ゥラシル DNAグリコシダーゼで処理し、次い で塩基性物質で処理した後、目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレ ォチドとの間のホスホジエステル結合が分解されたカゝ否かを検出する方法が挙げら れる。
[0092] 目的塩基がゥラシルに変化して 、る場合、ゥラシル DNAグリコシダーゼ処理により ゥラシルと糖との間の N—グリコシド結合が加水分解される。次いで、塩基性物質処 理することにより、目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接する両ヌクレオチドとの 間のホスホジエステル結合が分解される。ゥラシル DNAグリコシダーゼ処理は、例え ば 0〜50°C程度で 1〜30分間程度行えばよい。塩基性物質処理については、第 1 の方法で説明した通りである。
[0093] また、 目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間のホスホ ジエステル結合が分解されたか否かは、第 1の方法について説明した通り、例えば目 的塩基を有するヌクレオチドを含む領域に対する核酸増幅などにより検出することが できる。
[0094] また、重亜硫酸塩処理された目的塩基を有するハイブリダィズ産物に対して、 目的 塩基がゥラシルである場合にのみ増幅するようなプライマーを用いた核酸増幅を行う ことによつても、 目的塩基がゥラシルに変化している力否かを検出することができる。 また、 目的塩基がゥラシルであってもメチルシトシンであっても増幅させることができる ようなプライマーを用いて核酸増幅を行い、増幅産物の大きさの僅かな差異 (ゥラシル とメチルシトシンとの差)を検出することによつても、それがゥラシルである力メチルシト シンであるかを検出することができる。
[0095] さらに、重亜硫酸塩処理されたハイブリダィズ産物をゥラシル DNAグリコシダーゼ 処理したものに対して、 目的のヌクレオチドが塩基を有さないヌクレオチドであっても メチルシトシンを有するヌクレオチドであっても増幅させることができるようなプライマ 一を用いて核酸増幅を行 、、増幅産物の大きさの僅かな差異 (メチルシトシンの大き さの差異）を検出することによつても、 目的塩基がゥラシルである力メチルシトシンであ るカゝを検出することができる。
[0096] <第 4の方法 >
第 4の方法は、第 1工程において、メチルシトシンと特異的に結合可能な基が結合 したガイドプローブを使用してハイブリダィゼーシヨンを行った上で、以下の工程： 第 1工程で得られたノヽイブリダィズ産物にぉ 、て、前記ガイドプローブと DNA試料中 のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第 2E工程と、
前記ガイドプローブと DNA試料とのクロスリンクの有無を検出する第 2F工程と、 を実施する。
[0097] 第 4の方法において、ガイドプローブと DNA試料とのクロスリンクが検出されると、 目的塩基カ チルシトシンであると判定される。一方、ガイドプローブと DNA試料との クロスリンクが検出さればければ、 目的塩基がシトシンであると判定される。
[0098] 検出方法 4を採用する場合に、第 1工程で使用されるガイドプローブは、メチルシト シンに対して特異的に結合可能な基が結合されてなるものである。当該ガイドプロ一 ブに結合している「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」は、当該ガイドプ ローブと DNA試料がハイブリダィズした状態で、ノ レジ構造又はミスマッチを形成し ているメチルシトシンと結合可能である限り、特に限定されるものではないが、好適な 一例として、下記の式 (8)で示される基が例示される。式 (8)中、 R2は前記と同様で ある。
[0099] [化 15]
Figure imgf000028_0001
[0100] (式 (8)中、 R2は前記と同じ。）
また、第 4の方法を採用する場合に使用されるガイドプローブにおいて、「メチルシト シンに対して特異的に結合可能な基」の結合位置については特に限定されないが、 バルジ生成プローブの場合であれば、 DNA試料の目的塩基に隣接する塩基に対し て、塩基対を形成する塩基に「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」が結 合されていることが好ましい。また、ミスマッチ生成プローブの場合であれば、 目的塩 基に対してミスマッチする塩基に「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」が 結合されて ヽることが好ま 、。
[0101] 第 4の方法において、第 2E工程の前に、第 2の方法と同様に、 1本鎖 DNA特異的 なェキソヌクレアーゼで処理することにより、プローブとハイブリダィズしていない 1本 鎖の部分を除去してぉ 、てもよ 、。
[0102] 第 2E工程において、ガイドプローブと DNA試料中のメチルシトシンとをクロスリンク させる条件は、ガイドプローブに結合して 、る「メチルシトシンに対して特異的に結合 可能な基」の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、式 (8)で示される基が結 合して ヽるガイドプローブを使用する場合には、オスミウム酸塩を 0.1〜 1 OOOmM程度 、好ましくは l〜100mM程度の存在下で、 0〜40°C程度で 30秒〜 1時間程度処理す ればよい。かかる処理は、 pH6〜7程度の pH条件下で実施することが望ましい。更 に、かかる処理では、フェリシアンィ匕カリウムやメチルモルホリンォキシド等の酸ィ匕活 性化剤を、 0.1〜100mM程度、好ましくは 0.1〜50mM程度添加して実施することによ り、前記クロスリンクの形成速度を高めることができる。
[0103] なお、第 2E工程は、第 1工程と同時に実施してもよい。即ち、ガイドプローブ、 DN A試料、その他クロスリンク形成に必要な化合物を同時に混合し、所定の条件で反応 させることにより、第 4の方法を実施することもできる。
[0104] 第 2F工程は、簡便には、 DNA試料の質量分析又はゲル電気泳動による分子量の 測定を行うことによって実施される。詳述すれば、以下の通りである。ガイドプローブと DNA試料とがクロスリンクしていれば、ハイブリダィズできない条件下でも、両者が結 合した状態で存在する。一方、ガイドプローブと DNA試料とがクロスリンクしていなけ れば、ハイブリダィズできない条件下では、両者は分離して存在する。従って、ハイブ リダィズできない条件下で、 DNA試料の質量分析又はゲル電気泳動を行い、 DNA 試料の重量又は分子量が増加して 、れば、ガイドプローブと被験 DNAとがクロスリン クしており、 DNA試料の重量又は分子量に変動がなければ、ガイドプローブと DNA 試料はクロスリンクして 、な 、と判定される。
[0105] (Π)メチルシ卜シン檢出用キット
本発明の第 1のキットは、上記説明した本発明のメチルシトシン検出方法の内、第 1 又は第 2の方法に供するキットである。このキットは、上記説明したガイドプローブとメ チルシトシンを酸ィ匕できる試薬とを備える。メチルシトシンを酸ィ匕できる試薬は、代表 的には前述した炭素原子を酸ィ匕できる酸化剤であるが、このような酸化剤に変化する 前駆体もメチルシトシンを酸ィ匕できる試薬に含まれる。
[0106] また、第 1の方法に供するものである場合は、さらに上記説明した塩基性物質を備 えていればよい。さらに、 PCR試薬のセットを備えることが好ましい。
[0107] また、第 2-1の方法に供するものである場合は、さらに、 1本鎖 DNAを特異的に分 解できるェキソヌクレアーゼと、末端に NH NH—基、又は NH O—基を有するピオ チン又はアビジンと、アビジン又はピオチンと結合した標識酵素と、この標識酵素の 発色基質とを備えていればよい。また、第 2-1の方法に供するキットとして、さらに、 1 本鎖 DNAを特異的に分解できるェキソヌクレアーゼと、前述の式（1)の化合物、又 は式（2)の化合物を備えるものも挙げられる。
[0108] また、第 2-2の方法に供するものである場合は、酸化剤としてオスミウム酸塩が使用 され、更にビビリジンを含むものが挙げられる。
[0109] また、上記説明した第 3の方法に供する第 2のキットは、バルジ生成プローブと、重 亜硫酸塩とを備える。さら〖こ、 PCR試薬のセットを備えることが好ましい。
[0110] また、上記説明した第 4の方法に供する第 3のキットは、上記説明したガイドプロ一 ブと、上記説明したガイドプローブと DNA試料とのクロスリンクさせるための試薬とを 備える。
[0111] (τπ)メチルシ卜シン檢 用核酸チップ
基体上に、 1種以上のガイドプローブが固定された核酸チップを用いれば、様々な 遺伝子について様々な位置のシトシンのメチルイ匕の有無を、一度に検出することが できる。
[0112] プローブは、上記説明したプローブであるが、複数の目的塩基を判定できるように 互、に異なるプローブを用いればよ!、。
[0113] この核酸チップの基体の材料は特に限定されず、例えばガラス、シリカ、金などの 公知の材料を用いることができる。基体上へのプローブのスポット径は例えば 50〜2
00 μ m程度とすることができ、スポットピッチは例えば 100〜500 μ m程度とすること ができる。
[0114] この核酸チップ上のプローブ群に対して、上記説明した本発明方法の各操作を行 えばよい。
[0115] 第 1の方法では、核酸チップ上のプローブ群に対して、同時に PCRを行い、 PCR 増幅産物を例えば、蛍光、吸収、蛍光偏光、蛍光寿命などを測定できるマイクロプレ 一トリーダー（例えば、 Berthold社の Mithras LB940などの市販品）、マイクロチップリ ーダ一、蛍光顕微鏡、蛍光イメージヤーなどにより検出すればよい。これにより、チッ プ上の各 DNA断片の大きさを検出でき、ひいては複数の DNA試料の目的塩基が シトシンである力メチルシトシンであるかを一度に判定することができる。
[0116] また、第 2の方法では、チップ上の発色パターンを、上記と同様にしてマイクロプレ 一トリーダー等を用いて読み取ることができ、これにより、複数の DNA試料の目的塩 基がシトシンである力メチルシトシンであるかを一度に判定することができる。
[0117] 第 3の方法では、チップ上のプローブ群に対して、同時に PCRを行い、 PCR増幅 産物をマイクロプレートリーダーなどにより検出すればよい。
[0118] (IV)メチルシトシン検出装置
本発明のメチルシトシン検出装置は、上記説明した核酸チップと、チップ上の発色 ノ ターンを検出できる装置とを備える装置である。発色パターンの検出装置としては 、蛍光、吸収、蛍光偏光、蛍光寿命などを測定できるマイクロプレートリーダー、マイ クロチップリーダー、蛍光顕微鏡、蛍光イメージヤーなどが挙げられる。
実施例
[0119] 以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され ない。なお、以下の実施例及び比較例において、表記「mC」は 5—メチルシトシンを意 味する。
実施例 1 (第 1の方法）
ここでは、 PCRを行わずに DNA断片の大きさを電気泳動により検出するために、先 ず、標的 DNAを放射標識した。即ち、 T4 polynucleotide kinase 2 L及び [ γ - 32P]AT P 4 Lを、標的 DNA断片の 100 μ Μ水溶液の 4 μ Lと混合させ、水を加えて total 20 μ Lにした。メチルシトシンを含む DNA試料は、 13mer DNA(5'-GCGTTGCGTTGCG) (配列番号 1)であり、メチルシトシンを含む DNA試料は 13merDNA(5，- GCGTTGnGT TGCG ;nは mCを示す)（配列番号 2)である。配列番号 1の DNAは塩基番号 7のヌクレ ォチドの塩基がシトシンであり、配列番号 2の DNAは塩基番号 7のヌクレオチドの塩 基力メチルシトシンである。
[0120] この混合液を 37°Cで 40分間静置して、 5'末端の標識化を行った。反応溶液を 15% p olyacrylamide / 7 M ureaゲル電気泳動に供して、標的 DNA断片を精製した。
[0121] 次いで、ラベル化を行った DNA 10 μ Lとプローブとなる 12merの DNA (5'- CGCAAC CAACGC) (配列番号 3)の 1.33 μ Μ水溶液の 20 μ Lを 300 mM酢酸ナトリウム緩衝液 p H6.0に溶解させ、水を加えて total 50 Lにし、室温中で二本鎖を形成させた。
[0122] 次いで、この二本鎖に 5 mM力コジル酸緩衝液 pH 6.0に溶解させた 3.2 mMの KMn 0水溶液の 50 Lをカ卩ぇ酸ィ匕反応を開始させた。 3分間静置後、 1.5 M酢酸ナトリウ
4
ム緩衝液 pH 7.0に溶解させた 13 -mercaptoethanol (1 M)を 50 μ L添カ卩し反応を終了 させた。
[0123] 反応後サンプルをエタノール沈澱により精製し、続 、て 1 M piperidine 50 μ Lを加え て 90°Cで 60分間静置した。
[0124] その後、真空乾燥し、水を加えた反応サンプルを、 LSCを用いて放射線量を一定に なるように調製した後、 15% polyacrylamide / 7 M ureaゲル電気泳動で解析した。切 断バンドの確認は Maxam- Gilbert G+A reactionを行ったレーンと比較することにより 決定した。
[0125] i . m
実施例 1において、プローブとして、 13merの DNA (5'- CGCAAC£CAACGC) (配列 番号 4)を用いた他は、実施例 1と同様の操作を行った。
[0126] 配列番号 4の下線を付した Gは、 DNA試料の配列番号 1の塩基番号 7の C、又は配 列番号 2の塩基番号 7の mCと塩基対を形成させるためのものである。
[0127] 電気泳動の結果を図 1に示す。図 1のレーン 1は配列番号 1の DNA試料 (13mer ;mC) に対して配列番号 3のプローブ (12mer)をハイブリダィズさせた結果を示し、レーン 2 は配列番号 2の DNA試料 (13mer;C)に対して配列番号 3のプローブ (12mer)をノヽイブリ ダイズさせた結果を示し、レーン 3は配列番号 1の DNA試料（13mer ;mC)に対して配 列番号 4のプローブ (13mer)をハイブリダィズさせた結果を示し、レーン 2は配列番号 2の DNA試料（13mer;C)に対して配列番号 4のプローブ (13mer)をハイブリダィズさせ た結果を示す。
[0128] レーン 1とレーン 2とを比較すると、メチルシトシン (mC)を有する DNA試料に対して バルジを形成できるプローブを用いた場合はピペリジン処理により DNA試料が切断さ れて 、るが、シトシン（C)を有する DNA試料に対してバルジを形成できるプローブを 用いた場合はピペリジン処理により DNA試料が切断されな力つたことが分かる。
[0129] また、レーン 3、 4力ら、バルジを形成できな 、プローブを用いた場合は、 DNA試料 がメチルシトシン (mC)を有する場合もシトシン (C)を有する場合も、ピぺリジン処理に よっては DNA試料が切断されなかったことが分かる。
[0130] 実窗列 2 (再酸化剤の ί并用)
DNA試料として、 15mer DNA(5'- AAAAAAGnGAAAAAA- 3' ;nは mCを示す）（配列 番号 5)を用い、実施例 1と同様にして、これらの 5'末端を放射標識し、精製した。
[0131] 次!、で、ラベル化を行った DNA 10 μ Lとプローブとなる 14merの DNA (5'- TTTTTT
CCTTTTTT- 3') (配列番号 6)の 1.33 μ Μ水溶液の 20 μ Lを 300 mM酢酸ナトリウム緩 衝液 PH6.0に溶解させ、水を加えて total 50 Uこし、室温中で二本鎖を形成させた。
[0132] 次いで、この二本鎖を、 ImM EDTA,100mM Tris- HCl(pH7.7),100mMビピリジン、 5 mM K OsO , 10% MeCN,及び濃度 10〜100mMのへキサシァノ鉄錯体 [Fe(IIlXCN) ]3—
2 4 6 の存在下又は非存在下で、 0°Cで 3分間インキュベートすることにより酸ィ匕反応を行つ た。 3分間のインキュベートの後、 0.5 M酢酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0と Herring Sperm DNA (lmg/mL)をカ卩え、エタノール沈殿操作を行った。
[0133] その後は、実施例 1と同様にして、ピぺリジン処理、及び電気泳動を行った。
[0134] 結果を図 4に示す。図 4から K OsOに [Fe(III)(CN) ] を併用することにより、酸ィ匕速
2 4 6
度が向上して、メチルシトシンの検出が容易になったことが分かる。
[0135] ¾施例 3 (苒酴化剤の併用)
DNA試料として、 15mer DNA(5'-AAAAAAGnGAAAAAA-3' ;nは mCを示す）（配列 番号 5)、及び 15mer DNA(5 ' -AAAAAAGC G AAAAAA-3 ' ) (配列番号 7)を用い、プ ローブとして、 14merのバルジ形成 DNA (5し TTTTTTCCTTTTTT- 3，）（配列番号 6)、 及びフルマツチ DNA(5'- TTTTTTC£CTTTTTT- 3') (配列番号 8)を用いた。
[0136] また、酸化処理時の [Fe(IIlXCN) ] の影響を検討するために、 [Fe(III)(CN) ] を使
6 6 用しない酸化と、濃度 lOOmMで使用した酸化との双方を行った。その他は、実施例 2 と同様にして、 DNA試料の標識、二本鎖形成、酸化処理、ピぺリジン処理、及び電気 泳動を行った。
[0137] また、メチルシトシン検出のポジティブコントロールとして、プローブを用いない 1本 鎖の DNA試料に対して、実施例 2と同様にして、酸化処理、ピぺリジン処理、及び電 気泳動を行った。 [0138] 結果を図 5に示す。図 5から、バルジ形成プローブを用いたときは、特に [Fe(IIlXCN) ]3_を併用したときに、メチルシトシンの濃い切断バンドが検出され、シトシンとメチル
6
シトシンとを明確に区別できたことが分かる。また、メチルシトシンであるときに検出さ れる切断バンドは、プローブを用いない 1本鎖 DNA試料をピペリジンで切断したときと 同じ大きさであり、バルジ形成プローブの使用により、 目的とするメチルシトシンを正 確に検出していることが分かる。一方、バルジを形成しないフルマツチプローブを用 Vヽたときは、メチノレシトシンとシトシンとを区另 IJできなかった。
[0139] 実施例 4 (酸化処理に及ぼす ΌΗの影響)
DNA試料として、 15mer DNA(5'-AAAAAAGnGAAAAAA-3' ;nは mCを示す）（配列 番号 5)、及び 15mer DNA(5 ' -AAAAAAGC G AAAAAA-3 ' ) (配列番号 7)を用い、プ ローブとして、 14merのバルジ形成 DNA (5し TTTTTTCCTTTTTT- 3，）（配列番号 6) を用いた。
[0140] また、酸化処理は、 ImM EDTA,100mM Tris- HCl(pH7.7),100mMビピリジン、 5mM K OsO , 10% MeCNの存在下で、 0°Cで 3分間インキュベートすることにより行った。こ
2 4
こでは、再酸化剤の [FeOllXCN) ] を併用しな力つた。その他は、実施例 1と同様にし
6
て、 DNA試料の放射標識、 2本鎖形成、酸化処理、ピぺリジン処理、及び電気泳動を 行った。
[0141] 結果を図 6に示す。図 6力ら、 pH7.15〜9.01の範囲では、 pH6.02又は 6.54の場合 に比べて、メチルシトシンの場合にのみより濃い切断バンドが検出され、メチルシトシ ンの検出感度が高いことが分かる。
実施例 5 (酸化処理時の酸化剤の西 の枪討）
DNA試料として、 15mer DNA(5'- AAAAAAGnGAAAAAA- 3' ;nは mCを示す）（配列 番号 5)、及び 15mer DNA(5 ' -AAAAAAGC G AAAAAA-3 ' ) (配列番号 7)を用い、プ ローブとして、 14merのバルジ形成 DNA (5し TTTTTTCCTTTTTT- 3，）（配列番号 6) を用いた。
[0142] また、酸化処理は、 ImM EDTA,100mM Tris- HCl(pH7.7),100mMピリジン、ビビリジ ン又はフエナンスロリン、 5mM K OsO , 10% MeCNの存在下で、 0°Cで 3分間インキュ
2 4
ペートすることにより行った。ここでは、再酸化剤の [Fe(III)(CN) ] を併用しな力 た。 その他は、実施例 1と同様にして、 DNA試料の放射標識、 2本鎖形成、酸化処理、ピ ペリジン処理、及び電気泳動を行った。
[0143] 結果を図 7に示す。図 7力ゝら、ピリジン、ビビリジン又はフエナンスロリンのいずれを 用いる場合でも、メチノレシトシンとシトシンとを区別できるが、特にビビリジンを用いる 場合には、メチルシトシンでのみ切断バンドが検出され、メチルシトシンとシトシンとを より明確に区別できたことが分かる。
[0144] 実施例 6 (実在する遣伝子におけるメチルシトシンの検出)
実在する遺伝子では、メチルシトシンが近接して存在する場合が多い。このような場 合でも、本発明方法により特定のメチルシトシンを検出できることを示すために、 DNA 試料として p53の部分配列を用いて、メチルシトシンの検出を試みた。
[0145] DNA試料として、 5'— TACTGGGA£GGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT— 3' ( 配列番号 9)、 5'-TACTGGGAnGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT-3' は"1 Cを示す;配列番号 10)、 5 -TACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTG T-3' (配列番号 11)、及び 5'- TACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGnGTGTTTG T-3' (nは mCを示す;配列番号 12)を用いた。配列番号 9及び 10は、それぞれ塩基番 号 9の第 1の目的塩基がシトシン及びメチルシトシンであり、配列番号 11及び 12は、 それぞれ塩基番号 17の第 2の目的塩基がシトシン及びメチルシトシンである。また、 バルジ形成プローブとして、第 1の目的塩基を検出ための 5'-ACAAACACGCACCT CAAAGCTGTTCCTCCCAGTA -3' (配列番号 13)、及び第 2の目的塩基を検出た めの 5'- ACAAACACCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTA -3' (配列番号 14)を 用いた。さらに、ネガティブコントロールとしてフルマツチプローブ 5'-ACAAACACGC ACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTA -3' (配列番号 15)も用いた。
[0146] 酸化処理は、 ImM EDTA,100mM Tris- HCl(pH7.7),100mMビピリジン、 5mM K Os
2
Ο , 10% MeCNの存在下で、 0°Cで 5分間インキュベートすることにより行った。ここで
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は、再酸化剤の [FedllXCN) ]3—を併用しな力つた。その他は、実施例 1と同様にして、
6
被験 DNAの放射標識、 2本鎖形成、酸化処理、ピぺリジン処理、及び電気泳動を行 つた o
[0147] 結果を図 8に示す。図 8から、第 1及び第 2の目的塩基を特異的に検出できるバル ジ形成プローブを用いることにより、各塩基のメチルイ匕の有無を検出できたことが分 かる。
[0148] 実施例 7 (リアルタイム PCRによるメチルシトシンの定量)
DNA試料として、 5 -GCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGCGCCTC ACAACCTCCGTCATGTGCTGTGA-3' (配列番号 16)、 5'- GCTATCTGAGCAGC mCを示す;配列番号 17)を用いた。これらの配列は p53の部分配列である。本実施例 では、 PCRで切断断片を検出するため、 DNA試料は放射標識しなかった。
[0149] また、バルジ形成プローブとして、 5'- TCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGG CCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGC- --PS-3' (配列番号 18)を用い た。このプローブは、 3'末端がポリスチレンビーズに結合している。
[0150] 先ず、ガイドプローブ少量、 10nM DNA試料を 10 μ L、 10mM 1M Tris-HCl(pH7.7) 10 μ L、 milliQ水 30 μ Lを混合して合計 50 μしとした。ガイドプローブに対して DNA試 料は大過剰存在している。この混合液を 90°Cで 5分間インキュベートすることにより 2 本鎖を形成し、次いで終夜冷却した。
[0151] 次いで、 20mM K OsO水溶液 25 μ L、 1Mビビリジンの MeCN溶液 10 μ L、 milliQ
2 4
水 15 Lを混合して合計 50 μしとした。この混合液を 0°Cで 5分間インキュベートして 酸化処理し、 3M 酢酸ナトリウム (ρΗ6.0)200 /ζ ίを添加して酸化反応を停止した。
[0152] 次いで、以下のようにして 1本鎖 DNAを回収し、精製した。即ち、ボルテックス、遠心 、上清廃棄、反応停止液 (3Μ 酢酸ナトリウム (ρΗ6.0)) 200 μ L添加からなる操作を 2 回繰り返し、さらにボルテックス、遠心、上清廃棄を 1回行った。上清を廃棄して得ら れたプローブ付きビーズに 7Μ尿素 50 μ Lを添加し、 55°Cで 20分間インキュベートし、 上清を回収する操作を 2回繰り返した。次いで、得られた上清に ImM冷エタノールを 添カ卩して— 78°Cで終夜静置し、 -9°Cの下 1500rpmで 15分間遠心し、上清を廃棄した 後、 150 Lの 80%冷エタノールを添加し、 5分間遠心し、上清を廃棄した後、 5分間ェ バポレートした。
[0153] このようにして得られた精製 1本鎖 DNAに 1Mピぺリジン 50 μ Lを加え、 90°Cで 20分 間インキュベートした後、 40分間エバポレートした。さらに milliQ水 20 Lを添カ卩して、 20分間エバポレートする操作を 2回繰り返した。
[0154] ピぺリジン処理した DNAをリアルタイム PCRに供した。また、ネガティブコントロール として、酸化処理を行わなかったサンプルにつ ヽてもリアルタイム PCRに供した。
[0155] PCR反応溶液としては、 HotStarTaq Master Mix 10 L、 5 L プライマー混合物、
5 X 104希釈 SYBRI GREEN 6 μ Lの合計 20 μ Lの混合液を用いた。プライマーとして は 5'- TCACAGCACATGACGGAGGT- 3' (配列番号 19)、及び 5し GCTATCTGAGC
AGCGCTCAT- 3' (配列番号 20)を用いた。
[0156] PCR条件は、 95°Cで 15分間； 94°Cで 30秒、 50°Cで 30秒、 72°Cで 1分間のサイクルを
40サイクル;その後 40°Cに冷却する条件とした。リアルタイム PCR装置としてはロシュ' ダイァグノスティックス株式会社 · LightCyclerを用 、た。
[0157] 結果を図 9に示す。バルジ形成プローブとメチルシトシン含有 DNAとをハイブリダィ ズさせた場合のみ、増幅速度が遅力つた（図 9 (A) )。また、酸ィ匕処理を行うことにより 増幅速度が遅くなつた (図 9 (B) )。
[0158] また、リアルタイム PCRでの増幅曲線力も検量線を用いて換算された増幅産物量を 測定した結果を図 10に示す。バルジ形成プローブとメチルシトシンとのノ、イブリダイ ズ産物を酸ィ匕処理した場合のみ、増幅産物が少な力つた。
[0159] これらの結果、リアルタイム PCRを行うことにより、メチルシトシン化度を定量できるこ とが分かる。
[0160] ¾施例 8 (オスミウム含有複泰環 の形成によるメチルシトシンの檢出 ί)
DNA試料として、 5，- GGGGCAGnGCCTCAC- 3，（nは mCを示す;配列番号 21)、 5， - GGGGCAGCGCCTCAC-3 ' (配列番号 22)を用いた。これらの配列は p53の部分 配列である。
[0161] また、バルジ形成プローブとして、 5 ' - GTGAGGCCTGCCCC- (CH ) - SH- 3 ' (配列
2 6
番号 23)を用いた。このプローブは、 3'末端に基- (CH ) -SHが結合している。
2 6
[0162] 先ず、 10 μ Μバルジ形成プローブの 1 μ Lを、洗浄した金電極表面上に滴下し、 3 時間、室温で固定化した。次いで、得られた金電極表面を少量の MilliQ水（500〜10 00 μ L程度）で洗浄後、 10mMの MCHを 1 μ L滴下し、 0.5時間室温で、該金電極表面 のマスキングを行った。次に、少量の MilliQ水（500〜1000 μ L程度）で洗浄後、 10 μ M DNA試料を 1 μ L滴下し、 1時間室温でインキュベートして、電極表面上でバルジ 構造を有する 2本鎖を形成させた。その後、電極表面上に残っている 1本鎖のバルジ 形成プローブを埋めるため、保護 DNAとして 5 ' - GGGGCAGGCCTCAC- 3 'を 10 μ Μ で 1 μ L滴下し、 0.5時間室温でインキュベートして、電極表面上に 2本鎖 DNA又はバ ルジ構造を有する 2本鎖 DNAのみになるようにした。
[0163] また、別途、 20 mM K OsO水溶液を 25 μ L、 1M Bipyridyl Ligand 4 in MeOHを 10
2 4
μ L、 lOmM EDTAを 10 μ L、 1M Tris- HCl(pH 7.7)緩衝液を 10 μ K [Fe(CN) ]
3 6 水溶液を 10 μ L、及び MilliQ水を 45 μ L混合して、反応液を調製した。この反応液 1 μ Lを前記処理後の電極表面上に滴下し、室温で 30分間反応させた (式（5)で示され るオスミウム含有複素環基の形成）。次いで、少量の MilliQ水（500〜1000 L程度） で洗浄後、 5mMアントラキノン- NHS溶液（溶媒： H Ο/Ν,Ν- Dimethylformamide= 90/1
2
0(容量比)）を 1 μ L滴下し、ポスト修飾を室温で 12時間行った (式 (6)で示されるアント ラキノン標識オスミウム含有複素環基の形成)。
[0164] 次いで、少量の MilliQ水（500〜1000 L程度）で洗浄後、 1M NaCl水溶液中で、電 気化学測定装置 ALS660Aを用いて矩形波ボルタンメトリー（Square wave voltammetr y)測定を行った。
[0165] 得られた結果を図 11に示す。配列番号 21の DNA試料を対象とした場合には、メチ ルシトシン部分が式 (6)で示されるアントラキノン標識オスミウム含有複素環基に変換 されていることに起因して、 -0.66 Vでのピークトップでは、 0.737 Aと高い電流量を 示した。これに対して、配列番号 22の DNA試料を対象とした場合には、式 (6)で示さ れるアントラキノン標識オスミウム含有複素環基が形成されていないので、 -0.66 Vで のピークトップでは、 0.450 μ Αの電流量しか示さなかった。以上の結果から、バルジ 構造を形成しているメチルシトシンの検出は、式（5)で示されるオスミウム含有複素環 基を形成させ、該基を検出することによって可能になることが確認された。
[0166] 実施例 9 (オスミウム含有複素環某の形成によるメチルシトシンの検出 2)
DNA試料として、 5，-AAAAAAGnGAAAAAA-3，（nは mCを示す;配列番号 24)、 5，- AAAAAAGCGAAAAAA-3，（配列番号 25)を用いた。
[0167] また、ミスマッチ开成プローブとして、 5， - TTTTTTCnCTTTTTT- 3，（nは介してフノレ ォレセインがリンカ一を介してデォキシゥリジンのピリミジン環の 5位の炭素にリンカ一 を介して結合して 、る塩基を示す；配列番号 26)を用 、た。
[0168] 先ず、 1 M Tris-HCl (pH 7.7)、 10 mM EDTA、 100 mM Bipyridyl Ligand 4、 5 mM K
OsO、及び 100 mM Fe (CN)の存在下で、 10 M DNA試料を 37°Cで 2時間インキ
2 4 3 6
ュペートした (式（5)で示されるオスミウム含有複素環基の形成)。次いで、 HPLC(0.1 M TEAA/acetonitrile from 5% to 30% for 50 min)により DNA試料を精製した。 50 mM リン酸ナトリウム水溶液 (pH 8.0)中に、上記処理後の DNA試料を添カ卩し、更に HEX-N HS(1 mg/mL in DMSO)を 10 μ L加え、全量を 100 μ Lにした後、 37°Cで（5)時間イン キュペートした (HEX含有オスミウム含有複素環基の形成)。再度、 HPLCにより、斯く して処理された DNA試料を精製した。斯くして処理された DNA試料を、 50 mMリン酸 ナトリウム水溶液 (pH 8.0)中 0.9 M NaCl存在下で、ミスマッチ形成プローブと混合した 。インキュベート後の水溶液について、 495nmで励起し、蛍光強度を測定した。
[0169] 得られた結果を図 12に示す。配列番号 24の DNA断片を対象とした場合には、メチ ルシトシン部分が式（5)で示されるオスミウム含有複素環基に形成されて!、ること〖こ 起因して、フルォレセイン由来の蛍光強度（520 nm)と共に HEX由来の蛍光強度（55 0 應)も高い値を示した。一方、配列番号 25の被験 DNA断片を対象とした場合には 、式（5)で示されるオスミウム含有複素環基が形成されていないので、 HEX由来の蛍 光強度 (550 應）は低い値であった。以上の結果から、バルジ構造を形成しているメ チルシトシンの検出は、式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を形成させ、該基 を FERTを利用して検出することによつても可能になることが確認された。
[0170] 実施例 10 (オスミウム含有複素環某の形成によるメチルシトシンの検出— 3)
DNA試料として、 5' -AAAAAAGnGAAAAAA-3' (nは mCを示す;配列番号 27)、 5， -AAAAAAGCGAAAAAA-3，（配列番号 28)を用いた。
[0171] また、ミスマッチ开成プローブとして、 5 ' -TTTTTTCnCTTTTTT-3 ' (nは、式（7)で 表される基がグァニンのプリン環の 6位の炭素上の酸素原子に結合している塩基を 示す；配列番号 29)を用いた。
[0172] 先ず、 1 M Tris-HCl (pH 7.7)、 10 mM EDTA、 100 mMビピリジル、 5 mM K OsO
2 4、 及び 100 mM Fe (CN)の存在下で、 10 M DNA試料を 37°Cで 2時間インキュベート した (式（5)で示されるオスミウム含有複素環基の形成)。インキュベート後の反応液 をゲルろ過スピンカラムに供してろ液を回収し、得られたろ液を濃縮した。次いで、 50 mMリン酸ナトリウム水溶液 (pH 8.0)中に、得られたろ液を添カ卩し、更に 1 μ Μミスマツ チ形成プローブを加え、全量を 100 Lにした後、 37°Cで 3時間インキュベートした。ィ ンキュペート後の水溶液について、 380 nm又は 390 nmで励起し、蛍光強度を測定し た。また、配列番号 27の DNA試料を使用し、オスミウム含有複素環基の形成を行うェ 程を削除して、上記と同様の方法で実験を行い、蛍光強度を測定した（図 13中、 Mと 表記する）。また、配列番号 28の DNA試料の 1本鎖の場合に呈する蛍光強度につい ても測定した（図 13中、 SSと表記する)。
[0173] 得られた結果を図 13に示す。配列番号 27の DNA試料を使用した場合（図 13中、 MOSと表記する）には、メチルシトシン部分が式（5)で示されるオスミウム含有複素 環基に形成されていることに起因して、式（7)で示される基由来の蛍光が減弱されて いることが確認された。一方、。配列番号 28の DNA試料を使用した場合（図 13中、 C と表記する）には、式（5)で示されるオスミウム含有複素環基が形成されていないこと に起因して、式（7)で示される基由来の蛍光の減弱は認められな力つた。以上の結 果から、ミスマッチを形成しているメチルシトシンの検出は、式（5)で示されるォスミゥ ム含有複素環基を形成させ、該基を利用した蛍光物質の消光を検出することによつ ても可能になることが確認された。
[0174] ¾施例 ί ί (オスミウム含有複泰環 の形成によるメチルシトシンの檢出 3)
DNA試料として、 5'- GGTGGGGGCAGnGCCTCACA- 3' (nは mCを示す;配列番号 3 0)、 5'- GGTGGGGGCAG£GCCTCACA- 3' (配列番号 31)を用いた。本 DNA試料の 5'は32 Pにより放射標識されて 、る。
[0175] また、ミスマッチ形成プローブとして、 5 -TGTGAGGCYCTGCCCCCACC-3' (Yは 、式（8)で表される基がアデニンのプリン環の 6位の炭素上の窒素原子に結合して 、 る塩基を示す；配列番号 32)を用いた。
[0176] 先ず、 5 μ Μミスマッチ形成プローブ、 5 mM四酸化オスミウムカリウム塩、 1 mM ED TA、 100 mM Tris- HC1、及び 100 mMフェリシアン化カリウム (pH 7.0)の存在下で、 10 μ M DNA試料を 50°Cで 10分間インキュベートした（DNA試料とミスマッチ形成プロ一 ブとのハイブリダィズ及びクロスリンクの形成）。その後、 1 mg/mL Salmon Sperm DNA を 10 L、 3 M酢酸ナトリウム (pH 5.0)水溶液を 15 μ L、更に冷却エタノールを 900 μ Μ加え、十分撹拌した後に- 20°Cで 30分間放置した。次いで、 15分間冷却遠心を行 い、上澄みを廃棄後、 80%冷却エタノールを 150 M加えて遠心後、再び上澄みを廃 棄した。 5分間減圧留去した後、 2000 CPM/ Lになるように Loading Bufferで希釈し たサンプルをゲル電気泳動で流した。
得られた結果を図 14に示す。配列番号 29の DNA試料を使用した場合には、配列 番号 29の DNA試料単独のバンドに加えて、 DNA試料とミスマッチ形成プローブとの 複合物に相当するバンドが検出された。一方、配列番号 30の DNA試料を使用した場 合には、 DNA試料とミスマッチ形成プローブとのクロスリンクが認められず、配列番号 30の DNA試料のバンドのみが観察された。以上の結果から、ミスマッチを形成してい るメチルシトシンの検出は、ミスマッチ形成プローブと当該メチルシトシンとをクロスリン クさせることによつても検出できることが明ら力となった。

Claims

請求の範囲
[1] DNA試料中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、
目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造又はミスマッチを形成するよう D NA試料とガイドプローブとをハイブリダィズさせる第 1工程と、
ノ レジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに特異的な反応 を誘導し、この反応の有無によりメチルイ匕を検出する第 2工程とを含むメチルシトシン 検出方法。
[2] 第 1工程が、 目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造を形成するよう D
NA試料とガイドプローブとをノヽイブリダィズさせる工程であり、
第 2工程が、バルジ構造を形成する前記シトシン又はメチルシトシンに特異的な反 応を誘導し、この反応の有無によりメチルイ匕を検出する工程である請求項 1に記載の メチルシトシン検出方法。
[3] 第 2工程にぉ 、てメチルシトシンに特異的な反応を誘導する請求項 1に記載のメチ ルシトシン検出方法。
[4] 第 2工程が、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに酸 ィ匕剤を作用させる第 2A工程と、酸化剤による酸化反応物の有無を検出する第 2Bェ 程とを含む請求項 3に記載のメチルシトシン検出方法。
[5] 第 2B工程が、塩基性物質を作用させる工程を含む請求項 4に記載のメチルシトシ ン検出方法。
[6] 第 2B工程が、塩基性物質を作用させる工程の後、 DNA試料の断片を検出するェ 程を含む請求項 5に記載のメチルシトシン検出方法。
[7] ノ レジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンを含む領域を増 幅することにより、 DNA試料の断片を検出する請求項 6に記載のメチルシトシン検出 方法。
[8] 塩基性物質として、窒素含有物質を用いる請求項 5に記載のメチルシトシン検出方 法。
[9] 第 1工程の後、ェキソヌクレアーゼ処理によりハイブリダィズ産物の 1本鎖部分を除 去する工程を有する請求項 3に記載のメチルシトシン検出方法。
[10] 第 2B工程が、第 2A工程で生成する酸化反応物を標識する工程と、標識物質を検 出する工程とを含む請求項 9に記載のメチルシトシン検出方法。
[11] 前記第 2B工程が、酸化剤による酸化反応物に対してさらに第 2の酸化処理を行な う工程を含む請求項 10に記載のメチルシトシン検出方法。
[12] 標識酵素を用いて標識する請求項 10に記載のメチルシトシン検出方法。
[13] 第 2B工程における、目的塩基の酸ィ匕反応物がピリミジン環の 5位炭素原子の酸ィ匕 反応物である請求項 4に記載のメチルシトシン検出方法。
[14] 第 2A工程が、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに 酸化剤を作用させて、メチルシトシン部分に式（5)で示されるオスミウム含有複素環 基を形成させる工程であり、
第 2B工程が、前記オスミウム含有複素環基の有無を検出する工程である、請求項
4に記載のメチルシトシン検出方法。
[化 1]
Figure imgf000043_0001
(式中、 R1及び R2は、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、又は置換アルキ ル基を示す）
[15] 第 2B工程が、標識物質により式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を標識する 工程と、標識化された当該オスミウム含有複素環基を検出する工程とを含む請求項 1 4に記載のメチルシトシン検出方法。
[16] 第 1工程で使用されるガイドプローブが、蛍光物質が結合されたガイドプローブであ り、且つ
第 2B工程が、前記蛍光物質に対して蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる蛍光 物質を用いて、式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基を標識する工程と、蛍光共 鳴エネルギー移動の有無を測定する工程とを含む、
請求項 14に記載のメチルシトシン検出方法。
[17] 第 1工程で使用されるガイドプローブが、式 (5)で示されるオスミウム含有複素環基 の存在によって消光する蛍光物質を結合させたガイドプローブであり、且つ
第 2B工程が、前記蛍光物質の消光の有無を測定する工程である、
請求項 14に記載のメチルシトシン検出方法。
[18] 第 2工程における目的塩基に特異的な反応がシトシンに特異的な反応である請求項
1に記載のメチルシトシン検出方法。
[19] 第 2工程が、 目的塩基を重亜硫酸塩処理する第 2C工程と、第 2C工程で生成するゥ ラシルを検出する第 2D工程とを含む請求項 18に記載のメチルシトシン検出方法。
[20] 第 2工程が、第 1工程で得られたハイブリダィズ産物にお!、て、前記ガイドプローブ と DNA試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第 2E工程と、前記ガイドプロ一 ブと DNA試料とのクロスリンクの有無を検出する第 2F工程とを含む請求項 3に記載 のメチルシトシン検出方法。
[21] ガイドプローブの長さが 20〜： LOO塩基の長さである請求項 1に記載のメチルシトシ ン検出方法。
[22] ガイドプローブの長さが 40〜： LOO塩基である請求項 5に記載のメチルシトシン検出 方法。
[23] ガイドプローブが固相担体に結合されたものである請求項 1に記載のメチルシトシン 検出方法。
[24] DNA試料のシトシンである力メチルシトシンであるかを検出するべき目的塩基を有す るヌクレオチドを除く領域と相補的なメチルシトシン検出用プローブ。
[25] DNA試料とハイブリダィズするメチルシトシン検出用プローブであって、 DNA試料 のシトシンである力メチルシトシンであるかを検出するべき目的塩基との間でのみミス マッチするメチルシトシン検出用プローブ。
[26] 請求項 24又は 25に記載のプローブと DNA試料とのハイブリダィズ産物。
[27] 請求項 24又は 25に記載のプローブと、メチルシトシンを酸ィ匕可能な試薬とを備えるメ チルシトシン検出用キット。
[28] 酸ィ匕されたメチルシトシンを有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間 の結合を切断可能な塩基性物質を備える請求項 27に記載のメチルシトシン検出用 キット。
[29] 1本鎖 DNAを特異的に分解するェキソヌクレアーゼと、末端に NH NH—基、又は
2
NH O—基を有するピオチン又はアビジンと、アビジン又はピオチンと結合した標識
2
酵素と、標識酵素の発色基質とを備える請求項 27に記載のメチルシトシン検出用キ ッ卜。
[30] 1本鎖 DNAを特異的に分解するェキソヌクレアーゼと、下記式（1)又は（2)の標識 物質とを備える請求項 27に記載のメチルシトシン検出用キット。
[化 2]
Figure imgf000045_0001
(式中、 Rは標識物質を示す。）
[化 3]
Figure imgf000045_0002
(式中、 Rは標識物質を示す。）
[31] メチルシトシンを酸ィ匕可能な試薬として、オスミウム酸塩とビビリジンとを備える請求項
27に記載のメチルシトシン検出用キット。
[32] メチルシトシン検出用プローブ力 蛍光物質が結合されてなるものである、請求項 3
1に記載のメチルシトシン検出用キット。
[33] メチルシトシン検出用プローブ力 式（5)で示されるオスミウム含有複素環基の存在 によって消光する蛍光物質が結合されてなるものである、請求項 31に記載のメチル シトシン検出用キット。
[34] 請求項 24又は 25に記載のプローブと、重亜硫酸塩とを備えるメチルシトシン検出用 キット。
[35] メチルシトシンと特異的に結合可能な基を結合させた請求項 24又は 25に記載のプ ローブを備えるメチルシトシン検出用キット。
[36] 請求項 24又は 25に記載のプローブの 1種以上力 基体上に固定された核酸チップ
[37] 請求項 36に記載の核酸チップと、チップ上の発色パターンを検出できる装置とを備 えるメチルシトシン検出装置。
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