JPH10309195A - 核酸塩基配列を増幅するための方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 検査試料中に存在する微量の塩基配列の検出
法の提供。 【解決手段】 標的核酸塩基配列の増幅塩基配列を増幅
する方法であって、(a) 複数の対の増幅プローブの各対
の構成要素プローブが互いに相補的であり、プローブの
各対の少なくとも１つの同一のハイブリッド形成構成要
素が前記増幅塩基配列の一部分とも相補的である、複数
の対の増幅プローブと前記増幅塩基配列とを接触させる
こと、(b) 前記増幅プローブの前記ハイブリッド形成構
成要素を前記増幅塩基配列の異なる部分とハイブリッド
形成させ、このとき前記増幅プローブを隣接的な前記増
幅塩基配列と仕方で結合させること、(c) 前記のハイブ
リッド形成した増幅プローブを互いに結合させて増幅生
成物を生成させること、(d) 前記標的塩基配列から前記
増幅生成物を分離すること、並びに(e) 段階 (a)〜(d)
を繰り返すことを包含する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】ここ20年間に亘る分子生物学
の分野における進歩により、患者又は他の被験者から採
取された検査試料中の特定の核酸塩基配列を検出するこ
とが可能になった。このような検査試料には、血清、
尿、大便、組織、唾液、脳脊髄液、羊水、及びその他の
体液が含まれる。特定の核酸の塩基配列の検出は、人間
における病原菌による疾患及びウィルス性関連疾患の存
在を識別するだけでなく、遺伝子異常又は遺伝病を識別
するために使用される。特定の遺伝子の存在は、癌及び
腫瘍遺伝子検査並びに法医学に使用される遺伝子情報を
得るためだけでなく、移植拒絶反応の原因となる抗原を
コードする遺伝子の存在のような他の関連的な遺伝子情
報を得るためにも使用される。特定の遺伝子の塩基配列
を検出するための最も一般的な技術は、核酸ハイブリッ
ド形成(nucleic acid hybridization)として知られる現
象を利用する。ハイブリッド形成とは、非共有結合によ
って二本鎖核酸（デュプレックス）を形成する、特定タ
イプの、相補的塩基配列による一本鎖ヌクレオチド塩基
配列の組換え又はアニーリングを意味する。通常は二本
鎖である最初のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分子鎖が組
換えする場合には、その組換えプロセスは再生（renatu
ration）と呼ばれる。分子混合が生じる場合には、その
プロセスはハイブリッド形成と呼ばれる。ハイブリッド
形成は、二本鎖型及び一本鎖型でともに自然界に頻繁に
見出されるＲＮＡ（リボ核酸）の場合にも起こる。ＤＮ
Ａ：ＤＮＡ及びＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドだけでな
く、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドもハイブリッド形成に
よって形成され得る。典型的なハイブリッド形成技術で
は、標的核酸塩基配列の一本鎖形にアニーリング又はハ
イブリッド形成することによって、興味の対象である遺
伝子又は核酸の塩基配列を捜し出すために、一本鎖のプ
ローブ塩基配列が使用される。自然界に発生するＤＮＡ
が典型的にそうであるように、検査試料中の核酸が二本
鎖である場合には、そのＤＮＡは、あらゆる形の組換え
が起こり得る前に、変性されなければならず、即ち一本
鎖にされなければならない。標的塩基配列とは、その標
的塩基配列に特に特徴的な、探索されるべき核酸塩基配
列の選択部分である。プローブは、探し求められる遺伝
子の標的ヌクレオチド塩基配列に対して相補的である一
本鎖ヌクレオチド塩基配列であるように選ばれる。この
オリゴヌクレオチドのプローブは検出可能な標識でマー
クされ、検査試料からの変性核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）
と接触させられる。最近まで、水素（³Ｈ）、リン（³²
Ｐ）又はヨウ素（¹²⁵Ｉ）のような放射性同位体が、プ
ローブ標識として主として使用されてきた。しかし、こ
れらのような放射性化合物は、放射性材料の不安定性に
起因する高額の使用コストはもちろん、評価分析プロト
コルの中に大規模な安全予防策を組み入れる必要性と、
並びに、高価な装置及び特殊な廃棄物処理の必要性とを
含む多くの欠点を有している。その結果として、放射性
同位体標識の欠点を有しない、それに代わる標識法を開
発する努力が、近年になって益々増加してきている。従
って現在では、放射性標識に加えて、非同位体標識が付
けられたプローブが使用されるが、臨床環境では非放射
性標識が好ましい。

【従来の技術】検査試料内に存在する微量の標的塩基配
列の検出を改善する努力の中では、最近、(1) 信号を増
幅する、即ち、プローブ検出システムの感度を高めるこ
と、及び(2) 現在使用可能な放射性及び非放射性の方法
を用いて容易に検出が可能な十分量の標的核酸塩基配列
が存在するように、標的核酸塩基配列自体を増幅させる
ことという方面で開発が行われて来ている。一般に、標
的核酸塩基配列の増幅は、所与のＤＮＡ又はＲＮＡ標的
核酸塩基配列の反復的な再生即ち複製を含む。少量の所
与の既存の標的核酸塩基配列から核酸塩基配列の複数の
コピーを作り出す再生又は複製のために、現在では２つ
の方法が常套的に使用される。その第１の方法は、その
標的核酸塩基配列を適当な宿主系でクローン化すること
を含む。この方法は、後でその宿主を形質転換するため
に使用する適当なベクターの中に所望の核酸を挿入する
伝統的なクローニング技術を用いる。その宿主を培養す
ると、そのベクターが複製され、さらに所望の標的核酸
塩基配列のコピーを産生する。そのベクターの中に挿入
される標的核酸塩基配列は、天然のものであっても合成
されたものであってもよい。言い換えれば、米国特許第
4,293,652号明細書に開示されるように、所望の標的核
酸塩基配列は試験管内で合成され、その後で、連続的に
挿入する前に増殖されたベクターの中に該塩基配列を挿
入することが可能である。米国特許第4,683,195号及び
第4,683,202号明細書は、検査試料からの標的ＤＮＡ又
はＲＮＡの量を増幅させるための第２の方法を開示して
いる。特にこの方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
と呼ばれている。ＰＣＲ増幅法は、増幅されるべきＤＮ
Ａ断片の側面に配置する２つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用する。これらのプライマーは標的核酸塩基
配列の対向鎖上でその相補的な塩基配列へとアニール
し、そのアニールされたプライマーの（標的塩基配列に
対して相補的な）伸長生成物が、ＤＮＡポリメラーゼの
存在中で形成される。ポリメラーゼによるＤＮＡ合成が
プライマー間の領域を貫いて進行し、側面にプライマー
が配置された標的ＤＮＡ断片の量を効果的に２倍にする
ように、プライマーが配向される。選択されたアッセイ
において測定可能な信号を得るのに十分な量の標的核酸
塩基配列が生成されるまで、ＤＮＡの熱変性サイクル、
相補的な塩基配列へのプライマーのアニーリング、及び
ＤＮＡポリメラーゼによるアニールされたプライマーの
伸長が繰り返される。伸長生成物もプライマーに対して
相補的であり且つプライマーを結合することが可能であ
るため、連続的なサイクルの各々は先行のサイクルで合
成されたＤＮＡの量を本質的に２倍にし、標的核酸塩基
配列を指数的に蓄積する。ＰＣＲ増幅システムの欠点の
１つは、増幅を達成するために酵素の使用を必要とする
ということである。酵素は、望ましくないヌクレアーゼ
汚染物質が存在することに加えて、その比較的短い貯蔵
寿命及び品質に固有のロット差を示す。ＤＮＡ及びＲＮ
Ａの両方を効率的に増幅することが可能であり、並びに
酵素増幅法の使用に限定されない増幅システムをもつこ
とが有利であろう。発明の要約 本発明は、検査試料中に存在するかもしれない標的核酸
塩基配列を検出するための方法に係る。この方法は増幅
法と検出法をともに使用し得る。増幅は複数の対の核酸
増幅プローブを使用することによって実現され、各対の
増幅プローブの構成要素プローブは、鋳型として働く標
的核酸塩基配列の所与の部分に対しても相補的である各
対の増幅プローブの少なくとも１つの同一のハイブリッ
ド形成構成要素（hybridizing member）と互いに相補的
である。各対の増幅プローブのハイブリッド形成構成要
素の核酸塩基配列は、標的核酸塩基配列の異なる部分に
対して相補的であるように選択され、ハイブリッド形成
増幅プローブは隣接的な仕方で、指定された長さの標的
塩基配列をカバーすることが重要である。ハイブリッド
形成増幅プローブは、そのプローブが互いに結合し得る
のに十分互いに隣接している標的塩基配列とハイブリッ
ド形成する。ハイブリッド形成増幅プローブが結合され
ると、完成された増幅生成物を変性によって分離するこ
とが可能であり、及びこのプロセスは残りのプローブに
よって又は新たなプローブの供給によって繰り返すこと
が可能である。連結された増幅生成物の熱変性サイク
ル、増幅プローブのその相補的塩基配列へのアニーリン
グ、及びアニールされたプローブの連結反応は、選択さ
れたアッセイにおいて測定可能な信号を生じさせるのに
十分な量の標的核酸塩基配列が生成されるまで繰り返さ
れる。３つ以上の対の増幅プローブを使用する場合に
は、特に２つ以上の検出プローブを使用してその増幅生
成物を検出してもよく、各々の検出プローブは、その増
幅生成物内の隣接した位置にある２つの増幅プローブ断
片の各々の部分に対して相補的である。適正に結合され
た増幅生成物は、増幅法において標的核酸塩基配列によ
って果たされるのと同一の仕方で鋳型として働く。不適
正に結合された生成物は、この方法において鋳型として
機能することが不可能である。検出プローブは、ハイブ
リッド形成される検出プローブとの間に相互作用を生起
させ得るのに十分互いに隣接している増幅生成物とハイ
ブリッド形成する。適正に結合された増幅生成物の量を
検出するのに使用する標識が、選択された検出プローブ
に担持されている。発明の詳細な説明 検査試料中に存在するかもしれない標的核酸塩基配列を
検出するための方法の１つが、本発明により提供され
る。本発明の方法は増幅法及び検出法の双方を使用し得
る。本明細書中で使用する用語は以下の定義を有する。
増幅プローブは、(1) 二本鎖の増幅塩基配列の１つの鎖
部分に対して相補的な、又は(2) 一本鎖の増幅塩基配列
部分に対して同一もしくは相補的な核酸塩基配列であ
る。増幅プローブは、プローブが互いに結合し得るのに
十分互いに隣接している増幅塩基配列とハイブリッド形
成する。各々の増幅プローブの長さは１つのヌクレオチ
ドの長さよりも大きい。増幅プローブは、他の増幅プロ
ーブと結合するために、一方の末端において又は両末端
において修飾されていてもされていなくてもよい。核酸
塩基配列は、(1) ホスフェート主鎖に関して、(2) ヌク
レオシドに関して、及び／又は(3) オリゴヌクレオチド
の糖部分に関して修飾されていてもよいデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチドである。核酸塩基配列
は標識を含むことが可能であり、ハイブリッド形成が依
然として起こり得る限りは、他の化学部分（chemical m
oieties）によって断続されてもよい。相補的とは、ハ
イブリッド形成を起こし得るのに十分な相補性を意味す
る。完全な相補性は必要とされない。複数の対の増幅プ
ローブの同一の構成要素とは、他の「同一の構成要素」
と共に、完全な増幅生成物を累積的に形成することが可
能な各プローブ対の構成要素を意味する。増幅プローブ
対の構成要素は、表示の構成要素が下側の鎖から生じる
場合には、プライム符号( ′) で表わされる。増幅生成
物とは、増幅塩基配列と隣接的にハイブリッド形成する
一連の増幅プローブとの連結反応から生成される、連結
された核酸塩基配列である。連結反応とは、２つ以上の
増幅プローブ又は検出プローブの結合を意味する。連結
反応は、それだけに限定されるわけではないが、化学反
応、光化学反応（例えば光結合）、熱付加環化反応、及
びレドックス反応を含む化学プロセスに加えて、例えば
リガーゼを利用する酵素法を含む。隣接的とは隣りの又
は近接のという意味である。隣接的にハイブリッド形成
されるプローブの場合には、そのプローブの末端は互い
に隣接する必要はないが、実際には、間隔を開けて離れ
ていてもよく、又はある程度重なり合っていてもよい。
標的塩基配列とは探索されるべき核酸塩基配列である。
増幅塩基配列は、増幅プローブの鋳型として働く、指定
された長さの標的塩基配列である。増幅塩基配列は標的
塩基配列の全長から成っていてもよく、又はそれを代表
する部分から成っていてもよい。鋳型塩基配列は、複数
の増幅プローブ又は複数の検出プローブとハイブリッド
形成する核酸塩基配列である。増幅法の第１サイクルで
は、増幅塩基配列は鋳型塩基配列として作用する。増幅
法の後続のサイクルにおいて及び検出法において、増幅
生成物も鋳型塩基配列として働く。増幅プローブ断片と
は、単一の増幅プローブによって生じた増幅生成物の断
片的部分である。ハイブリッド形成プローブは、鋳型塩
基配列にハイブリッド形成する増幅プローブ又は検出プ
ローブである。一般的に、一本鎖増幅塩基配列の増幅の
第１サイクルにおける幾つかの増幅プローブを除いて、
全ての増幅プローブ及び全ての検出プローブはハイブリ
ッド形成プローブである。検出プローブは、増幅生成物
の中に隣接して置かれた２つの増幅プローブ断片の各々
の部分に対して相補的である核酸塩基配列である。検出
プローブは、ハイブリッド形成される検出プローブとの
間で相互作用を生起し得るのに十分互いに隣接している
増幅生成物とハイブリッド形成する。検出生成物は、一
連の隣接的にハイブリッド形成された検出プローブから
生成された核酸塩基配列である。この検出生成物は連結
される必要はない。偽の増幅副産物又は副産物は、本来
の増幅塩基配列によっては得られない、増幅プローブの
連結反応の結果として生じる生成物である。標識とは、
同一の標識の付いたプローブを他のプローブから区別す
るために、検出プローブ又は増幅プローブに結合された
部分である。標識は信号発生標識である必要はないが、
例えば、測定されるべき生成物の分離手段及び／又は検
出可能な標識を後で結合するための手段を提供してもよ
い。検出可能な標識は、１つの基質（酵素の場合）、１
つの光源（蛍光化合物の場合）、もしくは光電子増倍管
（放射性もしくは化学発光化合物の場合）のような物質
との相互作用を通して、又は直接的に、検出が可能な信
号発生標識である。隣接標識(proximity label）とは、
そうした標識が一緒にされる場合に互いに相互反応して
検出可能な信号を発生させる、少なくとも２つの標識の
１つである。典型的には、第１及び第２の２つの隣接標
識が互いに隣接している条件の下で検出可能な信号を発
生するために、第１隣接標識が対応する第２隣接標識と
組み合わせて使用される。二本鎖増幅塩基配列を使用す
る、本発明の増幅法の具体例の１つが、図１に示されて
いる。図１に関しては、その増幅法は複数の対の増幅プ
ローブ［(B)(1)及び(B)(2)］を使用する。増殖プローブ
の長さは好ましくは10〜30ヌクレオチドであるが、１つ
のヌクレオチドより大きければ、どんな長さであっても
よい。各対の増幅プローブの構成要素は互いに相補的で
あるように選ばれ、プローブの各対の少なくとも１つの
同一の構成要素［(B)(1)又は(B)(2)］も、鋳型として作
用する増幅塩基配列［(A)(1)及び(A)(2)］の指定された
断片に対して相補的である。増幅プローブの各対のハイ
ブリッド形成構成要素の核酸塩基配列は、その増幅塩基
配列の異なる部分に対して相補的であるように選ばれ、
従って、ハイブリッド形成増幅プローブは、その増幅塩
基配列とハイブリッド形成する時に、隣接的な仕方
［(C)(1)及び(C)(2)］で本質的にその増幅塩基配列の全
体の長さをカバーする。増幅塩基配列が二本鎖である場
合には必ず、増幅プローブ の各対の両構成要素は、そ
の増幅塩基配列の相補鎖の対向部分に対して相補的であ
ろう、即ち、増幅プローブＡＰ₁、ＡＰ₂及びＡＰ₃［(B)
(1)］が増幅塩基配列ＡＳ′［(A)(2)］に対して相補的
であり、並びに、増幅プローブＡＰ_1′、ＡＰ_2′及びＡ
Ｐ_3′［(B)(2)］が増幅塩基配列ＡＳ［(A)(1)］に対し
て相補的である。ハイブリッド形成増幅プローブは、増
幅プローブの末端が連結されるのを可能にするのに十分
互いに隣接した増幅塩基配列とハイブリッド形成する。
そのプローブの連結反応をもたらすことが可能な１つの
タイプの反応は、その5′末端でリン酸化されているプ
ローブに対してリガーゼを酵素的に作用させることであ
る。連結反応の他の方法も可能である。一般的に、これ
らの方法は連結反応試薬の使用を必要とし、この試薬は
化学試薬でも、（リガーゼのような）酵素でも、光でも
又は熱であってもよい。１つの実施態様では、単一の化
学部分が増幅プローブの結合末端に取り付けられる。連
結反応は第２の部分の形成によって連結された増幅生成
物を生成するために連結反応試薬を使用することによっ
て行ってもよい。例えば、第１化学部分に結合された２
つの増幅プローブが鋳型にハイブリッド形成される場合
のように、第１化学部分の２つが非常に隣接している場
合には、連結反応試薬は第１化学部分の構造を変えるだ
けであるのが好ましい。このタイプの連結反応を実施す
るために第１化学部分を使用することの一具体例は、酸
化によってジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）の生成を達
成する連結反応においてスルフヒドリル基（−ＳＨ）を
使用することである。別の実施態様では、第１化学部分
が１つの増幅プローブの接続末端に取り付けられ、及
び、第２化学部分が、連結されるべき別の増幅プローブ
の対向する末端に取り付けられる。連結反応は第３化学
部分の形成によって生じ、場合によっては、この第３化
学部分は改変された第１又は第２化学部分とみなされて
もよい。連結反応は、ただ１つの化学部分を使用してそ
のプローブの接続末端を修飾する場合と同じ仕方で、連
結反応試薬を使用することによって行うことが可能であ
る。２つの異なった化学部分を使用する場合には、連結
反応試薬は第１又は第２化学部分のどちらとでも相互作
用することができるが、その２つの化学部分がハイブリ
ッド形成による場合のように非常に隣接しないと、この
連結反応試薬はどちらの化学部分の構造も改変しない。
光を連結反応試薬として使用する場合には、電気的に励
起された分子を生じるために、２つの第１化学部分の１
つだけがその光と相互作用する必要があり、その後で、
この励起された分子は、ペリ環状反応によってその対応
する化学部分と反応して、結合する第３化学部分を生成
させる。前記２つの化学部分がきわめて隣接した状態に
ある場合にだけ、この活性化学部分がその対応する化学
部分と反応するように、この活性化学部分が短寿命の励
起状態を有することが好ましい。又、例えば、求核試薬
（Ｎ：）が１つの増幅プローブの１つの接続末端に取り
付けられ、及び、連結されるべき別の増幅プローブの対
向末端に脱離基が取り付けられる場合には、連結反応試
薬が無くても連結反応を行うことが可能である。連結反
応は、修飾された求核試薬（−Ｎ−）の形成によって生
じる。この場合には、連結反応は、Ｎ：と選ばれた脱離
基との（例えば、ハイブリッド形成による）著しい接近
だけによって生じる。或いは、連結反応を促進するため
に、その脱離基は光又は酵素のような試薬によって活性
化されてもよい。このタイプの連結反応の一例は、Ｎ：
がスルフヒドリル基であり、及び脱離基がヨウドアセチ
ル基上のヨウ素である場合であろう。これは、Ｎ：がア
ミン基であり且つ脱離基が活性エステルである場合の、
ペプチド及びタンパク質の調製に使用されるタイプの化
学と同様である。ヒドロキシル基（第１化学部分）をリ
ン酸基（第２化学部分）に結合して、リン酸エステル結
合（第３の化学部分）を生じさせるために、連結反応試
薬として酵素リガーゼを使用することは、連結反応に必
要な２つの異なった化学部分の１つ（即ち、ヒドロキシ
ル基）が核酸プローブに内在的であるが故に、好ましい
連結反応方法である。リガーゼを用いてリン酸化された
プローブを結合する場合には、そのプローブの１つの末
端だけを修飾する必要がある。その個々の増幅プローブ
が連結されると、その結果得られた増幅生成物は、一本
鎖増幅塩基配列の場合にはその増幅生成物［(D)(1)又は
(D)(2)］の変性によって、また二本鎖増幅塩基配列の場
合にはその増幅生成物［(D)(1)及び(D)(2)］の変性によ
って分離され、即ち一本鎖にされる。そして、このプロ
セスは残りのプローブによって、又は増幅プローブの新
たな供給によって反復される。このプロセスの第１の反
復（第２サイクル）では、その増幅生成物自体が追加の
又は残余の増幅プローブのための鋳型塩基配列として働
く。例えば、一本鎖増幅塩基配列の増幅の第２サイクル
では、ＡＰ_1′、ＡＰ_2′及びＡＰ_3′［(D)(1)］から形
成される増幅生成物が、ＡＰ₁、ＡＰ₂及びＡＰ₃増幅プ
ローブ［(B)(1)］の鋳型として働く。二本鎖増幅塩基配
列の場合には、ＡＰ₁、ＡＰ₂及びＡＰ₃［(D)(2)］から
形成される増幅生成物も、ＡＰ_1′、ＡＰ_2′及びＡＰ
_3′増幅プローブ［(B)(2)］の鋳型として働く。その後
続のサイクルでは、(D)(1)及び(D)(2)増幅生成物の両方
が、一本鎖増幅塩基配列又は二本鎖増幅塩基配列のどち
らの増幅においても鋳型として働く。後続サイクルにお
いて鋳型として作用する追加の増幅生成物の反復的な生
成は、増幅生成物の指数的蓄積を可能にする。鋳型塩基
配列からの増幅生成物の変性、追加の又は残余の増幅プ
ローブの、鋳型塩基配列上のその相補的塩基配列へのア
ニーリング、及びそのアニールされた増幅プローブの連
結反応から成るサイクルは、選ばれたアッセイにおいて
測定可能な信号を生じさせるのに十分なだけの量の増幅
生成物が生成されるまで繰り返される。熱変性を使用す
る場合には、熱安定リガーゼを使用することが好まし
い。通常用いられる２段階法を使用して増幅生成物を直
接測定してもよい。この方法は、(1) 連結されていない
及び不完全にしか連結されていない残余の増幅プローブ
からの増幅生成物を（サイズに従って）分離するため
の、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
と、及びそれに続く、(2) 分離された核酸生成物を視覚
化するためのオートラジオグラフィーとを含む。１つ以
上の増幅プローブを³²Ｐのような放射性同位体で標識す
る場合に、この方法を使用することができる。本発明の
増幅法に固有の問題の１つは、上述の２段階アッセイ法
のようなサイズによる分離に基づくアッセイ結果に逆効
果をもたらすかもしれない偽の増幅副生成物を生成する
可能性があるということである。最初は、偽の増幅副生
成物は、鋳型塩基配列の介在しない増幅プローブの連結
反応の結果として生じる。平滑末端連結反応（blunt en
d ligation）としても公知なこのプロセスは、増幅塩基
配列の増幅のために過剰に与えられた増幅プローブが、
そのプローブが連結されるのを可能にするのに十分なだ
け互いに隣接して偶然に配列される場合には、溶液中で
起こり得る。偽の増幅副生成物が、相補的な対を成す増
幅プローブの両方の構成要素の連結反応から生成される
場合には、その副生成物はその副生成物自体を指数的に
再生することが可能である。偽の増幅副生成物は、分析
下の検査試料において標的塩基配列の存在を示さない。
偽の増幅副生成物の大半は、適正にそのプローブを配列
させる増幅鋳型による最初の関与がないために、非特異
的な仕方で配向される。本発明の検出法は、適正に結合
された連結生成物と非適正に結合された連結生成物とを
識別することが可能であり、従って、最終的なアッセイ
結果に対する偽の増幅生成物の影響を、完全には取り除
かないものの、最小化する。これは、本発明方法のよう
な識別方法が、正しく連結された偽の増幅生成物と、鋳
型から誘導された正しく結合された真の増幅生成物とを
依然として識別できないからである。しかし、偽の増幅
副生成物の有害な影響は、増幅プローブの対の数を増加
して使用することによって更に最小化することが可能で
ある。増幅プロセスで使用されるプローブの対の数を増
加させることは、偽の連結反応に適した仕方でそのプロ
ーブが偶然に配列する機会を統計学的に減少させる。例
えば、指数的に増大する偽の増幅副生成物だけを考慮す
るならば、３対のプローブを使用する増幅システムで
は、その偽の増幅副生成物の1/16だけが、形成された正
しい結合の生成物として計算される。４対のプローブを
使用する増幅システムでは、正しい結合の偽の増幅生成
物対形成される偽の増幅生成物全体の比は、1：352 と
なるだろう。正しく結合された副生成物の数は、追加の
プローブ対を含ませることによって劇的に減少する。例
えば５対のプローブを使用する場合には、正しい結合の
偽の増幅生成物対偽の増幅生成物全体の比は、1：13,84
2まで低下する。さらに、鋳型によって誘導された増幅
生成物の全長（full length）に達する偽の増幅生成物
の数も、増幅プローブ対の数が増加するにつれて減少す
るだろう。本発明の検出法によれば、少なくとも２つの
検出プローブが使用される。検出プローブは、正しく結
合された増幅生成物内の２つの増幅プローブ断片の継目
を繋ぐように設計される。従って、少なくとも３つの増
幅プローブ断片を有する増幅生成物を生成するために、
少なくとも３対の増幅プローブが本発明の増幅法で使用
されなければならない。検出プローブの長さは増幅プロ
ーブの長さに匹敵することが好ましい。検出可能な量の
増幅生成物を生成するのに十分なサイクリングの後で、
正しく結合された増幅生成物が本発明の検出法に従って
検出されてよい。その増殖法は２つの相補的な増幅生成
物を生成し、その両方又はどちらか一方が検出法に従っ
て検出されてよい。相補的な増幅生成物の１つの存在を
検出するために本発明の検出法を使用する１つの具体例
が、図２に示される。図２に関しては、本発明の検出法
は少なくとも２つの検出プローブ［(E)]を使用し、各々
の検出プローブは、増幅生成物の、隣接した位置にある
２つの増幅プローブ断片の各々の部分と相補的である。
ｎ対の増幅プローブを増幅法で使用する場合には、ｎ−
１個の検出プローブが検出法で使用される。本発明の検
出法では、増幅生成物［(D)(1)及び／又は(D)(2)］は、
増幅法の第１サイクルにおける増幅塩基配列によって並
びに後続のサイクルにおける増幅塩基配列及び増幅生成
物によって果たされるものと同様の仕方で鋳型として働
く。図２に示す検出法は、検出プローブ用の鋳型塩基配
列として、１つの増幅生成物［(D)(1)］だけを示してい
る。その検出プローブは、ハイブリッド形成されたプロ
ーブ間で相互作用を生起させ得るのに十分互いに隣接し
た［(F)]、指定された増幅生成物にハイブリッド形成す
る。その相互作用は、増幅プローブの連結反応に関して
前述したようなあらゆる仕方で検出プローブの末端を互
いに結合する連結反応であってもよい。連結された検出
生成物が形成される場合には［図２の(G)]、その連結さ
れた生成物は、その後で、変性によって増幅生成物鋳型
から分離されてもよい。しかし、この分離は必須なもの
ではない。正しく結合された増幅生成物の存在を求める
あらゆる検出手段が利用されてよい。１つの検出プロー
ブが³²Ｐで標識される場合には、連結された検出生成物
の存在をＰＡＧＥを用いてアッセイし、その後オートラ
ジオグラムを用いて解析することができる。２つの検出
プローブを使用する場合には、その２つの検出プローブ
の各々に標識を付けてもよい。２つの標識検出プローブ
を使用する１つの実施態様では、一方の検出プローブは
検出可能な標識に結合され、他方の検出プローブには、
対応する固定化された特定の結合相手にその後で結合す
る配位子のような検出生成物を溶液から取り出すための
手段が与えられる。図２に示される検出法では、その検
出プローブの１つが、固定化抗体［(H)]の使用によって
検出生成物の取出しを可能にする抗原に結合される。そ
の後で、検出生成物を不溶性の担体［(I)]上に捕獲する
ことによって、その検出生成物を溶液から取り出すこと
ができる。標識された検出生成物を溶液から取り出すこ
の方法も、その検出生成物が依然として増幅生成物にハ
イブリッド形成されている間に行ってよい。別の実施態
様では、第１検出プローブが第１隣接標識に結合され、
第２検出プローブが対応する第２隣接標識に結合され
る。その標識された検出プローブは、検出可能な信号を
生じるように、その２つの隣接標識が互いに相互作用す
るのを可能にするのに十分なだけ隣接してハイブリッド
形成する。例えば、その第１隣接標識は、第２酵素の基
質として働く生成物を生成する第１酵素であってよい。
その第２酵素は第２隣接標識として第２検出プローブに
結合されてよい。その２つの酵素標識された検出プロー
ブが隣接する場合には、第１酵素からの生成物がバルク
溶液の中へ逃散する前に、第２酵素がその生成物に作用
して検出され得る第２生成物を生成する。或いは、蛍光
化合物又は化学発光化合物のようなエネルギー供与体
を、第１隣接標識として使用してもよく、ローダミンの
ようなエネルギー受容体を第２隣接標識として利用して
もよい。標識された２つの検出プローブを隣接させる場
合には、エネルギー移動反応がその２つの隣接標識の間
で起こり、その結果、測定可能なエネルギー放出を生じ
る。形成された検出生成物の量を測定するための更に他
の方法は、当業者には明らかであろう。検出法は、検出
プローブを結合させるための鋳型として働く増幅生成物
の存在に依存して設計されている。しかし、単一の非連
結増幅プローブがその２つの検出プローブの双方の部分
に対して相補的である場合には、そうした単一の非連結
増殖プローブ（例えば、図２のＡＰ_2′）が単独で２つ
の検出プローブを結合することを可能にする。この現象
は「架橋（bridging）」効果と呼ぶことができる。従っ
て、検出プローブと非連結ＡＰ_2′プローブとの重なり
の度合いが最小化されるように、ＡＰ_2′プローブの長
さを制限することが好ましい。これは、非連結ＡＰ_2′
プローブが単独で２つの検出プローブを結合する「架
橋」を形成する傾向を減少させる。「架橋」効果による
検出生成物の形成を最小化するために、高温、低イオン
強度緩衝液、及び／又はホルムアミドや尿素のような変
性剤を、短い増幅プローブの代替物として連結反応に使
用してもよい。検出法は、増幅法と組み合わせて使用す
るために比較的単純である。検出法はさらに２つのプロ
ーブ試薬とハイブリッド形成のさらに１つのサイクルだ
けを必要とする。検出プローブのハイブリッド形成の後
に連結反応が続き、幾つかの事例では、選ばれた特定の
アッセイに応じて、適宜変性段階も続く。それに続く固
体担体上への固定化は急速であり、僅かしか実施時間を
必要としない。選ばれた特定のアッセイにおいて最大の
感度を達成するように選択された方法を適合させるため
に、多数のパラメータを調整することが可能な独特の能
力の故に、本発明は特に有利である。例えば、ＰＡＧＥ
及びそれに続くオートラジオグラフィーの２段階法と組
み合わせた本発明の増幅法を使用するアッセイの感度を
改善するために、増幅プローブの対の数を調整すること
が可能である。本発明の増幅法と組み合わせて検出法を
使用することによって、さらに操作用のパラメータを得
ることができる。増幅法と検出法の双方を同一の方法に
組み入れる場合には、偽の増幅副生成物が偶然生成する
ことの影響は、増幅プローブの対の数を増加して使用し
その検出方法の識別能力を利用することによって、著し
く最小化される。本発明の試薬（増幅プローブ及び検出
プローブ）は、当業者に公知の多数の利用可能な従来技
術のオリゴヌクレオチド合成方法のいずれか１つを使用
して、合成されてもよい。好ましい方法の１つは、市販
の試薬及び自動合成装置を使用する４段階法である。こ
の４段階法は、(1) ポリマー結合によって保護された出
発ヌクレオシド（塩基配列中の第１の核酸）の脱保護
と、(2) その脱保護された出発ヌクレオシドと、保護さ
れたヌクレオシドホスホラミジト(nucleoside phosphor
amidite)（塩基配列中の第２の核酸）との縮合と、(3)
そのヌクレオシドの未反応 5′−ヒドロキシル基のキャ
ップ形成(capping）と、それに続く、(4) 新たに形成さ
れたホスファイト結合の酸化とを含む。それに続いて、
部分的に合成されたポリマー結合オリゴヌクレオチド塩
基配列に更に核酸を付加するために、望ましいヌクレオ
チドが完成するまで、これらの４つの段階が繰り返され
る。そのプロセスの各々の反復において、最後に付加さ
れたヌクレオシドホスホラミジトがその次のサイクルに
おける出発ヌクレオシドとなる。最終的な合成オリゴヌ
クレオチド鎖をそのポリマーから抽出するために、得ら
れたオリゴヌクレオチドを、合成のためのアンカーとし
て働いたポリマーから先ず最初に分離しなければならな
い。そのオリゴヌクレオチドの分離は、室温で、新鮮な
濃アンモニアを用いて処理することによって実施し得
る。そのポリマーからオリゴヌクレオチド溶液をデカン
トした後、典型的には、密封されたチューブの中で長時
間、濃アンモニア溶液を加熱してそのヌクレオシド保護
基を除去する。その後、そのオリゴヌクレオチド溶液
を、 1−ブタノール及びエチルエーテルのような有機溶
剤を用いて抽出し、更に、合成されたオリゴヌクレオチ
ドの濃度を決定するために、その溶液の各々の光学密度
を 260nmで分光学的に測定する。それに続いて、調製用
電気泳動又はカラムクロマトグラフィー法という公知の
方法を使用して精製及び脱塩するために、オリゴヌクレ
オチド溶液を乾燥してもよい。リガーゼを用いてハイブ
リッド形成されたプローブを結合する場合には、増幅プ
ローブ及び検出プローブを、使用可能な公知の方法のい
ずれかを使用してリン酸化してもよい。好ましい方法の
１つは、ポリヌクレオチドキナーゼを触媒とするリンの
取り込みである。別の好ましい方法は、オリゴヌクレオ
チドをその担体から取り出す前に、そのオリゴヌクレオ
チドプローブが合成ポリマーに依然として固着されてい
る間に化学合成によって行うものである。又、リン酸化
のために放射性リンを使用することは、増幅生成物をそ
の後でオートラジオグラフィーによって即ち放射性標識
によって視覚化するための手段をも提供する。本発明の
プローブは又、他の標識を結合するために、公知の方法
に従って他の標識を与えてもよい。例えば、核酸プロー
ブは２段階法を用いてその 5′末端にフルオレセインで
標識してもよく、この方法ではアミノ基が合成の間に最
初に結合される。担体からのオリゴアミンの除去の後
に、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）の
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液を使用して、フ
ルオレセインをアミン修飾オリゴヌクレオチドに結合す
る。

【実施例】実施例 １ オリゴヌクレオチド塩基配列の調製 本発明の効果を実証するために、幾つかの異なった合成
増幅塩基配列を使用した。図３に示すように、合成増幅
塩基配列は、ＨＴＬＶ−Ｉの51塩基対Ｐｓｔ1断片の中
に含まれる。増幅プローブ及び検出プローブも、図３に
示した核酸塩基配列に対応するように合成された。全て
のオリゴヌクレオチド塩基配列（増幅プローブ、検出プ
ローブ、及び合成増幅塩基配列）は、後述するように、
数回の中間洗浄を伴う４段階法を使用して合成した。合
成は、市販の試薬を使用し、Applied Biosystems社（AB
I,Foster City，California）のModel 380 自動合成装
置を用いて行った。最初に、担体カラム内のポリマー結
合ジメトキシルトリチルによって保護されたヌクレオシ
ド（塩基配列中の第１核酸）から、ジクロロメタン中に
トリクロロ酢酸を３％含む溶液を１分間そのカラム中を
通過させることによって、その 5′−ジメトキシトリチ
ル保護基が除去された。その後で、そのポリマーをアセ
トニトリルで洗浄し、次いで乾燥アセトニトリルですす
いだ。その後、脱保護されたヌクレオシドを含むそのポ
リマーは、次の（縮合）段階に進む前に、アルゴン下に
置かれた。縮合段階は、最初にそのポリマーをアセトニ
トリル中のテトラゾールで処理することによって行っ
た。次に、ポリマーを結合した脱保護ヌクレオシドを、
アセトニトリル中で、保護されたシアノエチルヌクレオ
シドホスホラミジト（塩基配列中の第２核酸；ABI,Fost
er City,California）と反応した。この縮合反応を 2.0
分間実施し、その後で反応物を濾過によって取り出し
た。縮合後、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）中に無水酢
酸及び 2,6−ルチジンを含む、ＡＢＩ（Foster City,
California）から市販の混合物１部と、ＴＨＦ中の1−
メチルイミダゾール（ABI．Foster City,Californiaか
ら市販）１部とを混合することによって調製した溶液
を、該カラムの中を１分間に亘って通過させることによ
って、ヌクレオシドの未反応5'−ヒドロキシル基をキャ
ップした。キャップ形成溶液を取り出した後、そのポリ
マーを 1.5分間に亘って酸化溶液（Ｈ₂Ｏ中の 0.1ＭＩ₂
／2,6−ルチジン／ＴＨＦ，1：10：40）で処理した。こ
の後、アセトニトリルですすいだ。トリクロロ酢酸／塩
化メチレン脱保護からサイクルが再び始まり、所望のオ
リゴヌクレオチド塩基配列が得られるまでこのサイクル
を繰り返した。最終のポリマー結合オリゴヌクレオチド
鎖を新鮮な濃アンモニアを用いて室温で２時間処理し
た。そのポリマーから溶液をデカントした後、密閉チュ
ーブ中でその濃アンモニア溶液を60℃で16時間加熱し
た。オリゴヌクレオチド溶液の各々を 1−ブタノール及
びエチルエーテルを用いて抽出した。抽出された各々の
溶液の濃度を、260nm での吸収を測定することによって
分光学的に測定した。5.0 O.D.単位の合成オリゴヌクレ
オチドを含む各抽出溶液のアリコートを調製用電気泳動
に掛けるために濃縮し、15％ポリアクリルアミド 7モル
尿素ゲル中に載置した。電気泳動後、生成物バンドをU.
V.シャドウイングによって視覚化し、前記ゲルから切り
取り、溶離緩衝液（300mM酢酸ナトリウム（NaOAc），2.
5mM ＥＤＴＡ、100mM Tris-HCl，pH 8.0）を用いて抽出
し、その後、ＴＥＡＢ溶離液（重炭酸トリエチルアンモ
ニウム）を使用して、G-50 Sephadexョ（Pharmacia LKB
Biotech.Inc.,Piscataway.New Jersey）カラムで脱塩
し、精製オリゴヌクレオチドを得た。実施例 ２ ２対のプローブを用いた、５サイクルの増幅 ２対の増幅プローブ及び酵素による連結反応を使用す
る、５サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。 増幅塩基配列の量 反応Ｉ：各10fmolのＡＳ_1-2及びＡＳ_1-2′。 反応II：増幅塩基配列なし。 添加試薬：E.coli ＤＮＡリガーゼ緩衝液(ELB)が、500
mM Tris-HCl(pH 8.0)，40mM MgCl₂、10mM ＥＤＴＡ（エ
チレンジアミン四酢酸），50mM ＤＴＴ（ジチオスレイ
トール）、及び 500μｇ／mlのＢＳＡ（牛血清アルブミ
ン）を含むように、10x 濃度で調製された。リガーゼ／
ＮＡＤ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
試薬が、130μM ＮＤＡを含むようにＥＬＢ中で1x濃度
で調製され、その試薬の 2μlは1.6単位のE.coli Ligas
e（BoehringerMannheim Biochemicals, Indianapolis,
Indiana）を含んだ。この試薬を増幅サイクルの持続時
間の間は濡れた氷の上に保存した。ＥＤＴＡ／染料試薬
が、11.8mM ＥＤＴＡ，6.3M尿素，0.02％ブロモフェノ
ールブルー，及び0.02％キシレンシアノールを含むよう
に調製された。増幅プローブＡＰ_1′及びＡＰ₂を、約 7
00Ci／mmolの比活性を有するように（低温リンで）調整
されたγ−³²Ｐ−ＡＴＰ（アデノシン−5′−三リン
酸）と、ポリヌクレオチドキナーゼ（Bochringer Mannh
eim Biochemicals, Indianapolis, Indiana）とを用い
てリン酸化した。リン酸化のために放射性リンを使用す
ることは、２つの役割を、即ち(1) 連結反応に必要な増
幅プローブ末端をリン酸化して増幅生成物を形成するこ
と、及び(2) それに続く、オートラジオグラフィーによ
る増幅生成物の視覚化のための手段を提供することとい
う２つの役割を果たした。反応混合物の各々を、ゴム製
Ｏリング付きのスクリュートップ式 1.5mlポリプロピレ
ンマイクロチューブ（Sarstedt, Inc.,Princeton, New
Jersey）中容量13μｌで、ＥＬＢ中1.15x 濃度で開始
し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加えて、各1.
5pmol の増幅プローブＡＰ₁，³²Ｐ−ＡＰ_1′，³²Ｐ−Ａ
Ｐ₂及びＡＰ_2′を含有させた。反応Ｉ及びIIを、次のよ
うな５つのサイクルの増幅に掛けた。 1．前記ポリプロピレンマイクロチューブを密封し、試
験管ラックに固定し、その後で、５分間、90℃の水浴の
中に入れた。 2．次いで、前記反応チューブを水浴から取り出し、室
温に５分間静置し、その後、そのチューブをエッペンド
ルフミクロ遠心機で短時間（数秒）遠心した。 3． 2.0μlのリガーゼ／ＮＡＤ試薬を各々のチューブに
加え、その内容物を軽い撹拌によって混合した。連結反
応を室温で５分間進行させて、増幅サイクルを完了させ
た。 4．前記ポリプロピレンマイクロチューブを再びエッペ
ンドルフミクロ遠心機で短時間遠心し、段階１〜３を４
回繰り返して５つのサイクルの増幅を完了させた。 最終サイクルの後、23μlのＥＤＴＡ／染料試薬を加え
ることによって、その反応を止めた。止められた反応混
合物を、その後、90℃で５分間インキュベーションし、
次に氷上で急冷した。増幅によって得られた生成物を、
当業者に公知の標準的な技術を用いて、変性作用のある
15％ポリアクリルアミドゲル（PAGE）上の試料を電気泳
動により移動させることによって分析し、及び放射性標
識された生成物をオートラジオグラフィーによって視覚
化した。反応効率は、UltroScan^TM XL レーザーデンシ
トメーター（Pharmacia LKB Biotech.Inc., Piscatawa
y, New Jersey）を用いてレーザーデンシトメトリーを
走査し信号を積分することによって測定される場合の、
残存している15マー非連結増幅プローブの量を、得られ
た30マー増幅生成物の量と比較することによって概算さ
れた。反応Ｉは、出発増幅塩基配列の10fmolという最初
の量から、 145fmolの30マー増幅生成物を生成し、理論
的に可能な32倍の増幅に対して14.5倍の増幅をもたら
し、即ち、サイクル当たり71％という平均効率をもたら
した。反応II、30マー増幅生成物は全く検出されなかっ
た（出発増幅塩基配列ＡＳ_1-2及びＡＳ_1-2′を含有しな
い対照である）。実施例 ３ ２対のプローブを用いる、10サイクルの増幅 ２対の増幅プローブ及び酵素による連結反応を使用す
る、10サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。増幅塩基配列の量 反応Ｉ：各 1fmolのＡＳ_1-2及びＡＳ_1-2′。 反応II：増幅塩基配列なし。 添加試薬：E.coli ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＥＬＢ），
リガーゼ／ＮＡＤ試薬、及びＥＤＴＡ／染料を実施例２
の場合と同様に調製した。増幅プローブＡＰ_1′及びＡ
Ｐ₂を、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナー
ゼ（Boehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,
Indiana）とを用いて、約 700Ci／mmolの比活性でリン
酸化した。反応混合物の各々を、スクリュートップ式ポ
リプロピレンマイクロチューブ中容量13μlで、ＥＬＢ
中1.15x 濃度で開始し、このとき、上記の増幅塩基配列
の量に加えて、各 2.0pmolの増幅プローブＡＰ₁，³²Ｐ
−ＡＰ_1′，³²Ｐ−ＡＰ_2′及びＡＰ_2′を含ませた。反
応Ｉ及びIIを、段階１〜３を９回繰り返したということ
を除いて、実施例２に記載した手順に従う10サイクルの
増幅に掛けた。最終サイクルの後、33μlのＥＤＴＡ／
染料試薬を加えることによって、その反応を止め、その
後90℃で５分間加熱し、氷上で急冷した。増幅によって
得られた生成物を、変性作用のある15％ＰＡＧＥ上の反
応混合物を泳動することによって分析し、及びオートラ
ジオグラフィーによって視覚化した（図４）。生成物の
収率は、走査レーザーデンシトメトリーからの積分信号
によって測定される場合の、得られた30マー増幅生成物
の相対強度を、残存している15マー非連結増幅プローブ
のものと比較することによって決定された（注：得られ
た２つの鎖ＡＳ_1-2及びＡＳ_1-2′の異なった塩基組成に
起因する２つの30マーバンドが存在した）。反応Ｉは、
出発増幅塩基配列 1fmolという最初の量から、 288fmol
の30マー増幅生成物を生成した。達成された 288倍の増
幅は、計算により76％の全平均効率を表わす。反応II
（増幅塩基配列を含有しない対照である）のオートラジ
オグラムは、１時間の照射後、検出可能な30マー増幅生
成物を全く示さなかった。しかし、一晩（16時間）照射
したオートラジオグラムは反応IIにおいて微量の30マー
生成物を示し、増幅塩基配列の非存在中での平滑末端連
結反応による生成物形成を示した。この生成物の量は、
レーザーデンシトメトリーを走査することにより約14fm
olと概算された。実施例 ４ ３対のプローブを用いた、５サイクルの増幅 ３対の増幅プローブ及び酵素による連結反応を使用す
る、５つのサイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価す
るために、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次
のように確定した。増幅塩基配列の量 反応Ｉ：各 5fmolのＡＳ_1-3及びＡＳ_1-3′。 反応II：増幅塩基配列なし。 添加試薬：E.coli ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＥＬＢ）及
びＥＤＴＡ／染料を実施例２の場合と同様に調製した。
リガーゼ／ＮＡＤ試薬を130 μM ＮＤＡを含むようにＥ
ＬＢ中で1x濃度で調製し、E.coli Ligase（ICN Biomcdi
cals, Inc.,CostaMesa.California）の濃度は25単位／
μlとした。この試薬は増幅サイクルの持続時間中濡れ
た氷の上に保存された。この実施例では、非放射性ホス
ホリル基を5′−末端に導入することによって増幅プロ
ーブＡＰ_1′，ＡＰ₂，ＡＰ_2′及びＡＰ₃をリン酸化し、
更に、ＰＡＧＥオートラジオグラフィーによって増幅後
に得られた生成物を視覚化するために使用される放射性
標識を、別の手段によって与えられた。この非放射性ホ
スホリル基を増幅プローブＡＰ_1′，ＡＰ₂，ＡＰ_2′及
びＡＰ₃に化学的に導入し、この間それらのプローブ
は、5'−Chemical Phosphorylating Reagent（Glen Res
earchCorpotation, Herndon, Vorginia）を使用するヌ
クレオチド脱保護前には、依然として合成樹脂上にあっ
た［Horn, T. ら、Tetraheron Let.,27, 4705(198
6)］。その後でオートラジオグラフィーによって増幅生
成物を視覚化するための手段を提供するために、増幅プ
ローブＡＰ₁及びＡＰ_3′を、約7000Ci／mmolの比活性で
放射性リンを使用するγ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレ
オチドキナーゼ（BoehringerMannheim Biochemicals, I
ndianapolis, Indiana）を用いて、リン酸化した。リン
酸化に続いて、所望の最終比活性 700Ci／mmolを達成す
るために、³²Ｐ−ＡＰ₁及び³²Ｐ−ＡＰ_3′プローブを、
非リン酸化ＡＰ₁及びＡＰ_3′プローブを用いて1：10の
比に希釈した。増幅塩基配列の非存在中でのランダム生
成物の平滑末端アセンブリへの増幅プローブ5′−末端
の参入を最小化するために、この方法で増幅プローブを
調製した。即ち、ＡＰ₁及びＡＰ_3′プローブの10分の1
だけがリン酸化され、従ってそれだけが連結反応事象に
関与することが可能となる。反応混合物の各々を、スク
リュートップ式ポリプロピレンマイクロチューブ中容量
8μlで、ＥＬＢ中1x濃度で開始し、このとき、上記の
増幅塩基配列の量に加えて、各1.0 pmolの増幅プローブ
³²Ｐ−ＡＰ₁，Ｐ−ＡＰ_1′，Ｐ−ＡＰ₂，Ｐ−ＡＰ_2′，
Ｐ−ＡＰ₃及び³²Ｐ−ＡＰ_3′を含有させた。反応Ｉ及び
IIを、実施例２で説明したように、５つのサイクルの増
幅に掛けた。最終増幅サイクルの後、18μlのＥＤＴＡ
／染料試薬を加えることによってその反応を止めた。そ
れに続き、この停止されて反応混合物を90℃で５分間加
熱し、その後で氷上で急冷した。次に、各々の反応チュ
ーブ内の内容物を、変性作用のある15％ＰＡＧＥ上で泳
動し、その反応生成物をオートラジオグラフィーによっ
て視覚化した。その収率は、レーザーデンシトメトリー
を走査することによって定量する場合の、残存する15マ
ー増幅プローブ対45マー連結増幅生成物の比から概算さ
れた。反応Ｉは、出発増幅塩基配列 5fmolから、64.5fm
olの45マー増幅生成物を生成し、12.9倍の増幅をもたら
し、即ち、サイクル当たり67％という平均効率をもたら
した。反応IIは、夜通しのオートラジオグラフィーの後
でさえ、45マー増幅生成物を全く示さなかった。実施例 ５ ３対のプローブを用いた、10サイクルの増幅 ３対の増幅プローブ及び酵素により連結反応を使用す
る、10サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。増幅塩基配列の量 反応Ｉ：各 2fmolのＡＳ_1-3及びＡＳ_1-3′。 反応II：増幅塩基配列なし。 添加試薬：E.coli ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＥＬＢ）及
びＥＤＴＡ／染料を実施例２の場合と同様に調製した。
リガーゼ／ＮＡＤ試薬を、130 μM ＮＤＡを含むように
ＥＬＢ中で1x濃度で調製し、E.coli Ligse（New Engl
and Biolabs Inc.,Beverly, Massachusetts）の濃度を
１単位／μlとし、この試薬は増幅サイクルの持続時間
中濡れた氷の上に保存された。すべての増幅プローブを
実施例４で説明した通りにリン酸化した。反応混合物の
各々を、スクリュートップ式ポリプロピレンマイクロチ
ューブ中容量 8μlで、ＥＬＢ中1x濃度で開始し、この
とき、上記の増幅塩基配列の量に加えて、各1.0 pmolの
増幅プローブ³²Ｐ−ＡＰ₁，Ｐ−ＡＰ_1′，Ｐ−ＡＰ₂，
Ｐ−ＡＰ_2′，Ｐ−ＡＰ₃及び³²Ｐ−ＡＰ_3′を含ませ
た。両方の反応を実施例３で説明した通りに10サイクル
の増幅を掛けた。最後のサイクルの後で28μlのＥＤＴ
Ａ／染料試薬を加えることによってその反応を止め、そ
の後90℃で５分間加熱し、更に、氷上で急冷した。反応
混合物を、変性作用のある15％ＰＡＧＥ上を泳動させ、
それに続いて、オートラジオグラフィーによって視覚化
した（図５）。反応Ｉは、前述の走査レーザーデンシト
メトリー技術によって測定されるように、244 fmolの45
マー増幅生成物を生成した。この 122倍の増幅はサイク
ル当たり62％の全平均効率に相当する。夜通しのオート
ラジオグラフィーは反応IIからの微量の45マー増幅生成
物を示した。隣接するレーンが反応IIからの45マー増幅
生成物のデンシトメトリー測定を妨害したけれども、そ
の45マー生成物の量は視覚的に約0.4 fmolと概算され
た。これは、２対のプローブを使用する10サイクルの増
幅から得られた約14fmolの30マー平滑末端生成物（図
３）とは非常に対照的である。従って、増幅法における
３つのプローブの使用は、２つのプローブの使用に比べ
て、ＳＮ比（signal to noise ratio）において約35倍
の利益を与えた。実施例 ６ １つの標識された検出プローブを使用する検出法 １つの標識された検出プローブと連結された検出生成物
を生成するための検出プローブの酵素的連結反応とを使
用する本発明の検出システムを実証するために、２つの
反応を実施した。可変的な反応物を次のように確定し
た。増幅生成物の量 反応Ｉ：10.0fmolのＡＳ_1-3′。 反応II：1000fmolのＡＰ_2′ 添加試薬：リガーゼ／ＮＡＤ試薬を実施例５の場合と同
様に調製した。ＥＤＴＡ／染料試薬を、20 mM ＥＤＴ
Ａ，6.1M尿素，0.02％ブロモフェノールブルー，及び0.
02％キシレンシアノールを含むように調製した。検出プ
ローブＤＰ₂を、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Boehringer Mannheim Biochemicals, Indi
anapolis, Indiana)を用いて、約7000Ci／mmolの比活性
にリン酸化した。反応Ｉ及び反応IIの双方を、容量23μ
lで、ＥＬＢ中1.09x 濃度で開始し、このとき検出プロ
ーブＤＰ₁及び³²Ｐ−ＤＰ₂の各々を100 fmolずつその２
つの反応混合物に加えた。その反応混合物を、90℃で５
分間インキュベーションし、 その後、室温で15分間ア
ニーリングした。 2.0μlのリガーゼ／ＮＡＤ試薬を各
ポリプロピレンマイクロチューブに加え、その内容物を
軽い撹拌によって混合した。連結反応を室温で５分間進
行させて検出生成物の生成を完了させた。25μlのＥＤ
ＴＡ／染料試薬を加えることによって反応を止めた。次
いで、停止させた反応混合物を90℃で５分間加熱し、氷
上で急冷した。その後、その放射性生成物を、変性作用
のある15％ＰＡＧＥ上で反応混合物を泳動することによ
って分離し、その放射性生成物をオートラジオグラフィ
ーによって視覚化した（図６）。反応Ｉは、予想された
30マー検出生成物を生成した。反応IIでは、連結された
物質の徴候は無かった。実施例 ７ フルオレセインを用いたプローブの標識化 増幅プローブＡＰ₁の5′末端を、２段階法を用いてフル
オレセインで標識し、このとき合成の最終サイクルに
5′−Amino−Modifier C6（Glen Research Corporatio
n, Herndon, Virginia）を使用して、合成の間に最初に
１つのアミン基を結合させた［B.A.Connoly, Nicleic A
cid Res.,15, 3131(1987)］。その5′−アミノ修飾剤は
β−シアノエチルホスホラミジトであり、これは（例え
ば1H−テトラゾールによって）活性化されると、ヌクレ
オシドホスホラミジトとオリゴヌクレオチドとの結合と
同様の仕方でオリゴヌクレオチドの5′末端と結合す
る。第１アミン基はモノメトキシトリチル基で保護さ
れ、その後で、このモノメトキシトリチル基は、トリク
ロロ酢酸を使用する脱保護サイクルの中で取り除かれ
る。（実施例１で説明したように）結合、酸化、脱保
護、及び担体からのオリゴアミンの除去の後で、フルオ
レセインを後述のようにして結合させた。4.0 O.D.単位
の粗オリゴヌクレオチドを、SpeedVacョ Evaporator（Sa
vant Insruments, Inc.,Farmingdale,New York)で蒸発
乾固した。その後、80％エタノール50μlをその残留物
に加え、次いでその試料を再び蒸発させた。その粗オリ
ゴアミン残留物を、pH 9.5に調整された100 mM炭酸水素
ナトリウム／炭酸ナトリウム(NaHCO₃／Na₂CO₃）緩衝液2
5μlに溶解した。これに、濃度10.0mg／mlでＦＩＴＣ(A
ldrich Chemical Company,Inc., Milwaukee,Wisconsin)
のＤＭＳＯ溶液25μlを加えた。得られた混合物を数秒
間激しく撹拌し、その後で数秒間遠心し、更に、室温で
15分間、暗所で反応させた。フルオレセインで標識され
たオリゴヌクレオチドの収率を最大にするために、更に
25μlの NaHCO₃／Na₂CO₃（pH 9.5）緩衝液と更に25μl
のＦＩＴＣのＤＭＳＯ溶液（10mg／ml）とを加えること
によって、繰り返しＦＩＴＣと反応させた。反応を室温
で15分間行った。最終処理においては15分間ではなくて
1.5時間その反応を進行させたことを除けば同じ仕方
で、この反応を更に２回繰り返した。フルオレセインで
標識した生成物を、22μlの3M NaOAc及び 900μlの 100
％エタノールを加えることによって沈澱させ、その後で
−20℃で20分間冷却し、それに続いて 4℃で20分間遠心
し、最後に上清をデカントした。次に、その沈澱生成物
を 150μlの80％エタノールで洗浄し、真空下で短時間
乾燥し、更に、50μlの試料載置用（変性）緩衝液（6.3
M 尿素，0.02％ブロモフェノールブルー，及び0.02％キ
シレンシアノール）中に再懸濁した。その混合物を５分
間煮沸することによって変性させ、その後で氷浴で急冷
し、更に、15％の調製用ポリアクリルアミドゲル上で泳
動した。そのフルオレセイン標識生成物を長波 長の紫
外線下の蛍光によって視覚化し、そのゲルから切り取
り、更に、300mM NaOAc ，2.5mM ＥＤＴＡ及び100mM Tr
is-HClをpH 8.0で含む溶離緩衝液を使用して、室温で
36時間溶離した。その精製された生成物を、10mM ＴＥ
ＡＢを溶離剤として使用するG50/50 Sephadexョ カラム
（Sigma Chemical Company.St.Louis，Missouri）上に
その上清を流すことによって脱塩した。（260nmでのU.
V.吸収によって測定される）オリゴヌクレオチドを含む
画分を集めて、蒸発させ、及びTris-HCl／ＥＤＴＡ（10
mM Tris-HCl，0.1mM ＥＤＴＡ，pH 8.0）中に再懸濁し
た。得られた溶液の濃度をU.V.吸収によって決定し、そ
のオリゴヌクレオチド上のフルオレセインの存在を495n
m でのU.V.吸収によって確認した。実施例 ８ ２つの標識された検出プローブを使用する検出法 ２つの標識された検出プローブと連結された検出生成物
を生成するための検出プローブの酵素的連結反応とを使
用する、本発明の検出システムを実証するために、４つ
の反応を行った。（例えば、「Ag」がフルオレセインで
あり及び「Ab」が抗フルオレセイン抗体である図２を参
照のこと）。その可変的な反応物を次のように確定し
た。増殖生成物の量 反応Ｉ：10fmolのＡＳ_1-2′。 反応II： 1fmolのＡＳ_1-2′。 反応III：ＡＳ_1-2′なし（対照）。 反応IV：1000fmolのＤＰ_1′。 添加試薬：リガーゼ／ＮＡＤ試薬を、130μM ＮＡＤを
含むようにＥＬＢ中1x濃度で調製し、このとき 2μlの
その試薬は 2.0単位のE.coli Ligase（New England Bio
labs,Inc., Beverly, Massachusetts）を含んだ。ＥＤ
ＴＡ／染料試薬を実施例６と同様に調製した。1xのＳＳ
ＰＥ及びＡＴＣ［アルカリ処理カゼイン；Livesay,J.H.
及びDonald,R.A., Clin. Chim. Acta, 123 193(1982)］
0.01％を含む捕獲緩衝液（capture butter）を、 8.7ｇ
のNaCl，1.38ｇの一塩基性 NaH₂PO₄・H₂O， 370mgのＥ
ＤＴＡ及び 100mgのＡＴＣを 800mlの H₂O 中に溶解す
ることによって調製した。その溶液を5N NaOH でpH 6.8
に調整し、その後容量を１ｌとした。増幅プローブＡＰ
₂を、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼ
（Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis,
Indiana)を用いて、約7000Ci／mmolの比活性にリン酸化
した。増幅プローブＡＰ₁を、実施例７に記載した方法
を用いて、その5′末端上にフルオレセインで標識し
た。磁性ヒツジ抗フルオレセイン微小球状体をAdvanced
Magnetics,Inc., Cambridge,Mass.から得た。この実施
例では、Ｆ１−ＡＰ₁及び³²Ｐ−ＡＰ₂はＡＳ_1-2′の測
定のために使用される検出プライマーとして働く。ＤＰ
_1′は潜在的な「架橋」として働く。各反応を 8μlの出
発容量で二重に行い、このときそれらの反応混合物は、
各々 100fmolのＦ１−ＡＰ₁及び³²Ｐ−ＡＰ₂を含み、並
びにＥＬＢ中1.25x であるという点で同一であった。そ
れらの反応混合物のすべてを90℃で５分間インキュベー
ションすることによって変性し、その後、その核酸塩基
配列を室温で５分間アニーリングした。ハイブリッド形
成された検出プローブを連結するために、2.0μlのリカ
ーゼ／ＮＡＤ試薬を各ポリプロピレンマイクロチューブ
に加えて、その内容物を軽く撹拌して混合した。室温で
５分間、連結反応を進行させた。その後で、300μlの捕
獲緩衝剤を加えることによってその連結反応を止めた。
抗フルオレセイン抗体で被覆した磁性微小球状体（ビー
ズ）を75×12mm試験管の中に入れ、このとき各々の試験
管にはそのビーズ50μlを含有させた。次に、500μlの
捕獲緩衝剤を加え及び数秒間その溶液を撹拌することに
よって、該ビーズを２回洗浄し、その後、該ビーズを含
む洗浄溶液をCorning Magnetic Separator Unit（Ciba-
Corning Diagnostics, Medfield, Massachusetts）内に
室温で５分間放置することによって該ビーズを清澄させ
た。次いで、その試験管内に該ビーズを残したままその
洗浄溶液の水性部分をピペットで除去した。反応を停止
させた反応混合物の各々を、該ビーズを含む試験管の１
つの中にピペット注入し、そのビーズは、間欠的に撹拌
されながら50℃で約15分間、フルオレセイン標識生成物
を捕獲した。フルオレセイン標識生成物を含むビーズを
その上清から分離し、その後で、前記抗フルオレセイン
抗体被覆ビーズを洗浄したのと同じ仕方で２回洗浄し
た。次いで、フルオレセイン標識生成物を含む洗浄され
たビーズを 300μlの捕獲緩衝液の中に懸濁させ及びそ
の懸濁液をポリプロピレンマイクロチューブの中にピペ
ット注入することによって、該ビーズをポリプロピレン
マイクロチューブに移した。その試料はBeckman LS-680
0 液体シンチレーションカウンターを使用して１分間計
数された。その結果を表１に示す。

【表１】 表 １ 反 応 可変的内容物 平均 CPM 標準偏差 Ｉ 10fmolのAS_1-2′ 12,065 ± 767 II 1fmolのAS_1-2′ 1,158 ± 28 III AS_1-2′なし（対照） 63 ± 23 IV 1000fmolのDP_1′ 134 ± 28 データから分かるように、存在する増幅生成物の量に呼
応した直線的応答がこのアッセイから得られた。潜在的
な「架橋」の存在（反応IV）は幾らかの信号を生成した
が、その信号の量は、検出プローブのための標的として
1.0 fmolの増幅生成物を使用して得られる信号（反応I
I）と比較して極微であった。本発明の開示内容を理解
した後には、本発明の思想及び範囲から逸脱しない様々
な他の実施例並びに前述の説明及び実施例の変更が当業
者には明らかであろうし、またそのような実施例又は変
更のすべてが添付の請求の範囲内に含まれることを意図
するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の増幅法を使用する、二本鎖の
標的塩基配列の増幅を示す図である。

【図２】図２は、固定化抗体を使用する検出生成物の分
離を行なえるように抗原を検出プローブ標識として使用
する、本発明の検出生成物の実施態様の１つを説明する
図である。

【図３】図３は、実施例２〜８で使用される合成ヌクレ
オチド塩基配列の図である。

【図４】図４は、２対の増幅プローブを使用する30マー
増幅塩基配列の10サイクルの増幅から得られた生成物を
示すオートラジオグラムである。

【図５】図５は、３対の増幅プローグを使用する45マー
増幅塩基配列の10サイクルの増幅から得られた生成物を
示すオートラジオグラムである。

【図６】図６は、45マーの増幅生成物を検出するため
に、１つの非標識検出プローブと組み合わされた、放射
性標識を有する１つの検出プローブを使用して得られた
検出生成物を示すオートラジオグラムである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的核酸塩基配列の増幅塩基配列を増幅
   する方法であって、 (a) 複数の対の増幅プローブの各対の構成要素プローブ
   が互いに相補的であり、プローブの各対の少なくとも１
   つの同一のハイブリッド形成構成要素が前記増幅塩基配
   列の一部分とも相補的である、複数の対の増幅プローブ
   と前記増幅塩基配列とを接触させること、 (b) 前記増幅プローブの前記ハイブリッド形成構成要素
   を前記増幅塩基配列の異なる部分とハイブリッド形成さ
   せ、このとき前記増幅プローブを隣接的な仕方で前記増
   幅塩基配列と結合させること、 (c) 前記のハイブリッド形成した増幅プローブを互いに
   結合させて増幅生成物を生成させること、 (d) 前記標的塩基配列から前記増幅生成物を分離するこ
   と、並びに (e) 段階 (a)〜(d) を繰り返すことを包含する方法。
2. 【請求項２】 前記のハイブリッド形成した増幅プロー
   ブを酵素の作用によって互いに結合する請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 前記酵素がリガーゼである請求項２に記
   載の方法。
4. 【請求項４】 前記のハイブリッド形成した増幅プロー
   ブを化学反応によって互いに結合する請求項１に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 少なくとも３つの対の増幅プローブを使
   用する請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 複数の対の核酸増幅プローブを含む、増
   幅塩基配列の増幅に使用するための試薬であって、増幅
   プローブの各対の構成要素プローブが互いに相補的であ
   り、増幅プローブの各対の少なくとも１つの同一のハイ
   ブリッド形成構成要素が前記増幅塩基配列の所与の部分
   とも相補的であり、かつ増幅プローブの各対の核酸塩基
   配列が前記増幅塩基配列の異なる部分に相補的にである
   ように選択され、更に前記増幅プローブが、それらプロ
   ーブが互いに結合し得るのに十分相互に隣接するように
   隣接的な仕方で前記増幅塩基配列とハイブリッド形成す
   ることが可能である試薬。