CN113226519A - 使用电泳制备核酸文库 - Google Patents

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Abstract

本文描述了使用电泳执行化学或酶促反应的方法和系统。还提供了使用电泳由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的设备、系统和方法。施加一个或多个电场导致分子迁移通过电泳凝胶基质。

Description

使用电泳制备核酸文库
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月12日提交的美国临时申请第62/873,603号的优先权的权益，该临时申请中的内容全文以引用方式并入本文以用于任何目的。
说明书
技术领域
本申请涉及使用电泳将核酸分子处理成核酸文库的方法和系统。本申请还涉及使用电泳制备文库的方法、设备和系统。
背景技术
可以期望由双链核酸靶分子(例如，双链DNA(dsDNA))生成片段化和带标签的核酸(例如，DNA)分子的文库的多种方法和应用。通常，目的是由较大的靶核酸分子生成较小的核酸分子(例如，核酸或DNA片段)以用作测序反应中的模板。当采用大核酸分子时，制备用于测序的文库充满挑战性：在通过多个不同的物理过程(诸如细胞裂解、离心、移液、样本转移和涡旋)来进行过度处理和操作时，大分子易断并且易受损(诸如产生脱碱基位点或切口)。此类损伤导致靶核酸测序产生错误。
本文描述了使用电泳执行混合和分离的多个步骤来制备用于测序(例如，片段标签化)的核酸文库的方法，该方法降低了对核酸造成物理损伤的风险。这些方法也可容易地应用于执行其他过程，诸如样本制备、样本提取、生化反应、产物纯化和核酸片段尺寸选择。
发明内容
本申请涉及使用凝胶电泳混合和分离用于酶促反应的底物、试剂和产物的方法和设备。本申请还涉及使用凝胶电泳利用转座体复合物将核酸(诸如DNA)片段化和加标签的方法、系统和设备。本文所述的方法、系统和设备涉及使用凝胶电泳利用转座体复合物将DNA片段化和加标签的方法和组合物。本文所示的方法、系统和设备可用于例如生成带标签的核酸(例如，DNA)片段的文库以用于例如下一代测序方法等。在一些实施方案中，本申请涉及由靶DNA制备DNA片段用于基因组学、亚基因组学、转录组学或元基因组学分析或RNA表达的分析，该靶DNA包括来自任何来源的任何感兴趣的双链DNA(包括由RNA制备的双链cDNA)。
根据本文的描述，在一个实施方案中，使用电泳执行酶促反应的方法包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；
第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该酶的第二酶辅因子，该第二酶辅因子具有与该第一酶辅因子的电荷相反的电荷；
反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该酶；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；以及
(b)在该对电极之间施加电场以驱使该第一酶辅因子从该第一部分进入该反应部分并且驱使该第二酶辅因子从该第二部分进入该反应部分，以形成包括该酶、该第一酶辅因子和该第二酶辅因子的活化的酶复合物。
在一些实施方案中，提供了由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，该方法包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
反应部分，该反应部分远离该第一端部并且包含转座体复合物，该转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，该多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；
(b)将靶双链核酸施加到该反应部分；
(c)在该对电极之间施加第一电场以驱使该第一转座酶辅因子从该第一部分进入该反应部分，以形成包括该转座酶、该多核苷酸转座酶衔接子和该第一转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(d)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
在一些实施方案中，提供了由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，该方法包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该转座酶；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；
(b)将靶双链核酸施加到该反应部分；
(c)在该对电极之间施加第一电场以驱使该第一转座酶辅因子从该第一部分进入该反应部分并且驱使该第二转座酶辅因子从该第二部分进入该反应部分，以形成包括该转座酶、该第一转座酶辅因子和该第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(d)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
在一些实施方案中，提供了由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，该方法包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，该第二部分包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
第三部分，该第三部分包含裂解试剂；
第四部分，该第四部分包含该转座酶；
反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间；和
第一对正负电极，该第一对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；和
第二对正负电极，该第二对正负电极布置在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧；
(b)将包含靶双链核酸的全细胞施加到该反应部分；
(c)施加第一电场以驱使裂解试剂进入和/或通过反应部分以裂解细胞，从而将靶双链核酸施加到样本部分；
(d)施加第二电场以驱使第一转座酶辅因子从第一部分进入反应部分，驱使第二转座酶辅因子从第二部分进入反应部分并且/或者驱使转座酶从转座酶部分进入反应部分，以形成包括该转座酶、该第一转座酶辅因子和该第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(e)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
在一些实施方案中，电泳设备包括电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该酶的第二酶辅因子，该第二酶辅因子具有与该第一酶辅因子的电荷相反的电荷；反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该酶；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。
在一些实施方案中，电泳设备包括电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；反应部分，该反应部分远离该第一端部并且包含转座体复合物，该转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，该多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。
在一些实施方案中，电泳设备包括电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；反应部分，该反应部分在该第一端部和该第二端部之间并且包含该转座酶；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。
在一些实施方案中，电泳设备包括电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；第三部分，该第三部分包含裂解试剂；第四部分，该第四部分包含该转座酶；反应部分，该反应部分在该第一端部和该第二端部之间；和第一对正负电极，该第一对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；和第二对正负电极，该第二对正负电极布置在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧。
另外的目的和优点将在下列描述中部分地示出，并且部分地将在描述中显而易见，或可通过实践获知。这些目的和优点将借助所附权利要求书中特别指出的元件和组合来实现和获得。
应当理解，上述一般描述和下述详细描述均仅作为示例和说明，并且不是对权利要求书的限制。
并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出了一个(多个)实施方案，并且其与说明书一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A示出了使用凝胶电泳执行化学反应的一般示意图。A、B：试剂；C：产物。
图1B示出了使用凝胶电泳执行酶促反应的一般示意图。E：酶；S：底物；C1、C2：酶辅因子；P：产物。
图2A示出了使用凝胶电泳制备带标签的核酸片段的方法的实施方案。Tn5：转座体复合物，其包括转座酶(例如，Tn5转座酶)和多核苷酸转座酶衔接子。
图2B示出了使用凝胶电泳制备带标签的核酸片段的方法的另一个实施方案。Tn5：转座酶(例如，Tn5转座酶)；Ad：多核苷酸转座酶衔接子。
图3A至图3C示出了使用凝胶电泳制备带标签的核酸片段的方法的另一个实施方案，该方法包括在凝胶基质中的多个反应部分并且执行多个连续步骤(t0-t5)。Tn5：转座酶(例如，Tn5转座酶)；Ad：多核苷酸转座酶衔接子；裂解试剂(Lysis rgt)：裂解试剂。
图4示出了使用放置在凝胶基质的不同部分中的具有不同电泳迁移率的多种试剂来执行多种生化反应的一般示意图。
具体实施方式
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述主题。
本公开涉及使用电泳执行化学和/或酶促过程的方法和系统，并且具体地涉及用于核酸(例如，DNA)测序的文库制备。
凝胶电泳系统使得分子能够在3D基质中的位置之间移动。施加电场以使分子以相交的轨迹移动通过3D基质。不同的分子以不同的电泳迁移率迁移通过电场。本文所述的方法通过将试剂预定位成使得试剂以在连续的时间间隔和位置间隔相交的轨迹移动，从而能够在3D基质中的不同位置处进行多个反应，因此能够完成多步骤过程，例如，核酸文库制备、样本提取、生化反应、产物纯化和尺寸选择，所有这些过程都在凝胶内完成。
在一个实施方案中，具有已知的电泳迁移率的两个分子可被定位在凝胶基质内并且经受相同的电场，使得它们以不同的方向和速度迁移，但是仍在某个点处相交。如图1A所示，两种试剂A和B在t0时刻从其起始位置以相反但面向彼此的方向迁移，最终在一段时间后(t2时刻)它们在电场中混合并且在此处反应形成产物C。在时刻(t3)的随后间隔，未反应的分子A和B继续以相反的方向迁移，但分子C由于其迁移率，会保持在其形成的位置处或以与A和B的迁移率不同的迁移率移动，从而与未反应的分子分离并且从未反应的分子中纯化出来。
转座酶介导的文库制备
本文所示的方法和组合物为制备用于测序的文库提供了若干优点。片段化核酸文库通常由用于下一代测序(NGS)应用的基因组核酸形成。本公开提供了用于转座文库制备的方法、设备和系统。用于对核酸样本测序的当前方案通常采用将DNA或RNA转化成模板的文库的样本制备过程。在标准文库制备方法中，每个模板在插入序列的任一末端包含衔接子，并且常常需要多个步骤来修饰DNA或RNA以及纯化修饰反应后的期望产物。通过使用转座酶介导的片段化和加标签，可使在准备用于簇的形成和测序的溶液中将DNA转化成衔接子修饰的模板所需的步骤数量最小化。该过程在本文中称为“片段标签化”，其通常涉及通过转座体复合物修饰DNA，该转座体复合物包括与包括转座子末端序列的衔接子复合的转座酶。片段标签化导致DNA的片段化和衔接子与双重片段的两条链的5'末端的连接同时发生。扩增该带标签的片段，任选地(例如，通过杂交探针)捕获感兴趣的扩增子，并且对该带标签的片段进行测序。
当采用大核酸分子时，通过片段标签化制备用于测序的文库可能具有挑战性：在通过多个不同的物理和化学过程(诸如细胞裂解、离心、移液、样本转移、涡旋和其他材料操作)来进行过度处理和操作时，大分子易断并且易受损(诸如产生脱碱基位点或切口)。
本申请提供了在3D基质内使用凝胶电泳执行文库制备的方法。施加电场以使分子以相交的轨迹移动通过3D基质，从而执行混合步骤和分离步骤。通过基于凝胶基质中的试剂的电泳迁移率执行样本提取和文库制备的操作，可降低对核酸造成物理损伤的风险。由于核酸物理嵌入凝胶基质内并且受其保护，同样减少了损伤。此外，在进一步操作DNA后，可基于不同的迁移率实现对带标签的DNA片段和试剂的纯化。
在一些实施方案中，提供了使用电泳执行酶促反应的方法，该方法包括：(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该酶的第二酶辅因子，该第二酶辅因子具有与该第一酶辅因子的电荷相反的电荷；反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该酶；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；以及(b)在该对电极之间施加电场以驱使该第一酶辅因子从该第一部分进入该反应部分并且驱使该第二酶辅因子从该第二部分进入该反应部分，以形成包括该酶、该第一酶辅因子和该第二酶辅因子的活化的酶复合物。
在另外的实施方案中，在第一酶辅因子为金属离子时，第二酶辅因子为多核苷酸。在另外的实施方案中，该方法还包括在步骤(c)之前将用于活化的酶复合物的底物施加到反应部分，并且施加电场包括使活化的酶复合物与反应部分中的底物反应以形成反应产物。在另外的实施方案中，施加电场包括使未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子迁移出反应部分，以将未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子与反应部分中的反应产物分离。
在一些实施方案中，第一电极为正电极并且第一酶辅因子为带正电的，并且第二电极为负电极并且第二酶辅因子为带负电的。
在一些实施方案中，底物是靶双链核酸。在另外的实施方案中，靶双链核酸是双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂交体。
在一些实施方案中，酶是转座酶。在一些实施方案中，酶是Tn5转座酶。在另外的实施方案中，第一酶辅因子包括Mg2+。在一些实施方案中，Mg2+的浓度在毫摩尔每升的范围内。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为0.5mM至10mM。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为1mM至10mM。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为1mM至5mM。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为2mM。在一些实施方案中，Mg2+阳离子被提供为Mg(OAc)2。在一些实施方案中，Mg2+阳离子被提供为MgCl2。
在另外的实施方案中，第二酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子。在另外的实施方案中，第二酶辅因子为两种多核苷酸转座酶衔接子的混合物，并且每种衔接子包括相同的双链转座子末端序列和不同的单链标签区域。
在一些实施方案中，可施加更复杂的电场，诸如交替电场的大小或方向或提供彼此成90度的不同电场。在此类实施方案中，单个反应物的更复杂的轨迹是可能的。在此类情况下，可根据其已知或预期的迁移率将反应物放置在基质内的预定位置，使得反应物可通过交替电泳场并在凝胶基质上的位置之间以选定的轨迹移动分子来混合和/或分离。在一些实施方案中，可将一种或多种试剂(诸如酶)固定在3D基质中的固体载体(反应部分内的小珠)上，从而防止其在电场中移动，而其他试剂根据其在电场中的迁移率而自由移动。
在一些实施方案中，该方法包括改变电泳凝胶基质上的电场的大小或方向。在一些实施方案中，该方法包括改变电泳凝胶基质上的电场的大小或方向。在一些实施方案中，电泳系统包括沿宽度和长度的附加部分，每个部分包含不同试剂。在一些实施方案中，可在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧提供第二对正负电极以施加附加电场。由第一对电极和第二对电极生成的电场可在不同的方向上。由第一对电极和第二对电极生成的电场可彼此垂直。
图1A示出了根据一些实施方案的本文所述用于执行化学反应的电泳系统的示例性配置。在施加电场时，两种试剂A和B(诸如但不限于第一酶辅因子和第二酶辅因子)在t0时刻从其起始位置以相反但面向彼此的方向迁移，最终在一段时间后(t2时刻)它们在电场中混合并且在此处彼此反应或与第三种试剂反应形成产物C。在时刻(t3)的随后间隔，未反应的A和B继续以相反的方向迁移，但产物分子C由于其迁移率，会保持或以与A和B不同的迁移率移动，从而从未反应的试剂中纯化出来。
图1B示出了根据一些实施方案的本文所述用于执行酶促反应的电泳系统的示例性配置。第一酶辅因子C1和第二酶辅因子C2分别在邻近电泳凝胶基质的相对两端的第一部分和第二部分中提供。反应部分在第一部分和第二部分之间并且包含酶E。底物S也在该反应部分中提供。在施加电场时，第一酶辅因子C1和第二酶辅因子C2在t0时刻从其起始位置以相反但面向彼此的方向迁移。在t2时刻，第一酶辅因子和第二酶辅因子彼此反应并且与酶反应形成包括酶、第一酶辅因子和第二酶辅因子的活化的酶复合物(E+C1+C2)，该活化的酶复合物催化底物S反应形成产物P。在随后的t3时刻，未反应的C1和C2继续以相反的方向迁移，但产物P由于其迁移率，会保持或以与A和B不同的迁移率移动，从而从未反应的试剂中纯化出来。
在一些实施方案中，提供了由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；反应部分，该反应部分远离该第一端部并且包含转座体复合物，该转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，该多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；(b)将靶双链核酸施加到该反应部分；(c)在该对电极之间施加第一电场以驱使该第一转座酶辅因子从该第一部分进入该反应部分，以形成包括该转座酶、该多核苷酸转座酶衔接子和该第一转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及(d)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。在另外的实施方案中，转座体复合物固定在反应部分中的固体载体上。任选地，转座体复合物经由链霉亲和素-生物素相互作用而固定。在另外的实施方案中，该方法还包括在产生带标签的核酸片段后从固定载体释放转座体复合物。在另外的实施方案中，该方法还包括在驱使与从固体载体释放的转座体复合物结合的带标签的核酸片段进入收集部分的步骤之后改变第一电场的大小。
图2A示出了使用包含两个孔的电泳设备执行的方法的示例。在开始时，左侧的第一部分包含金属离子诸如Mg2+，并且中心的反应部分包含高分子量核酸(例如，DNA)和转座体复合物。在施加电场时(t1)，Mg2+向负电极移动，并且反应部分的内容物由于其尺寸而在凝胶基质中缺乏迁移率，从而保持在原位。在时刻(t2)的随后间隔，Mg2+到达反应部分形成活化的转座体复合物，然后该活化的复合物结合大DNA分子并将其片段化和加标签(标签化)，使其成为小文库模板。在反应完成时(t3)，Mg2+继续向负电极移动。可在反应部分中收集或进一步处理经标签化的片段。另选地，由于其尺寸大大减小，经标签化的片段现在可朝正电极迁移，从而分离并且任选地纯化该片段，该片段可从收集部分(未示出)收集。
在一些实施方案中，提供了由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法。该方法包括：(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该转座酶；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；(b)将靶双链核酸施加到该反应部分；(c)在该对电极之间施加第一电场以驱使该第一转座酶辅因子从该第一部分进入该反应部分并且驱使该第二转座酶辅因子从该第二部分进入该反应部分，以形成包括该转座酶、该第一转座酶辅因子和该第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及(d)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
在另外的实施方案中，金属离子为Mg2+，任选地为Mg(OAc)2或MgCl2的形式。在一些实施方案中，Mg2+的浓度在毫摩尔每升的范围内。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为0.5mM至10mM。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为1mM至10mM。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为1mM至5mM。在一些实施方案中，Mg2+的浓度为2mM。在一些实施方案中，Mg2+阳离子被提供为Mg(OAc)2。在一些实施方案中，Mg2+阳离子被提供为MgCl2。在步骤(b)中将靶核酸施加到反应部分时，转座酶或转座体复合物首先在不存在Mg2+的情况下与靶核酸结合。当在步骤(c)中施加电场时，当Mg2+迁移到反应部分中时，转座酶因结合到大靶核酸而不会迁移。
在一些实施方案中，单链标签区域包括引物序列、条形码序列、唯一分子标识符(UMI)序列、扩增标签、富集标签或纯化标签中的一者或多者。
在一些实施方案中，转座酶是Tn5、MuA或哈氏弧菌转座酶、或其活性突变体。在一些实施方案中，转座酶是Tn5转座酶。在一些实施方案中，Tn5转座酶是超高活性Tn5转座酶。在一些实施方案中，转座酶固定在反应部分内的固体载体上。在一些实施方案中，反应部分包括孔，并且固体载体是孔中的小珠颗粒或者固体载体是孔的表面。
在一些实施方案中，靶双链核酸是双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂交体。
在一些实施方案中，当在步骤(c)中施加第一电场时，靶双链核酸由于其大尺寸而在凝胶基质中缺乏迁移率，从而保持在反应部分内。在一些实施方案中，将在步骤(c)中施加的第一电场设定为靶双链核酸在电泳基质内基本上不具有电泳迁移率的值。
在一些实施方案中，电泳系统包括沿长度在第一部分和反应部分之间的收集部分。在另外的实施方案中，在步骤(c)中施加第一电场包括驱使带标签的核酸片段进入收集部分。在另外的实施方案中，该方法包括在步骤(d)之后增加第一电场的大小以驱使带标签的核酸片段进入收集部分。
在一些实施方案中，该方法包括改变电泳凝胶基质上的第一电场的大小或方向。在一些实施方案中，电泳系统包括：沿宽度和长度的附加部分，每个部分包含用于片段标签化的不同试剂；以及在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧的第二对正负电极。在一些实施方案中，该方法包括在第二对电极之间施加第二电场，其中该第二电场的方向与在步骤(c)中施加的第一电场的方向不同。在一些实施方案中，该方法包括在第二对电极之间施加第二电场，其中该第二电场的方向垂直于在步骤(c)中施加的第一电场的方向。
在一些实施方案中，电泳系统包括包含裂解试剂的第三部分，并且反应部分包含全细胞。在一些实施方案中，该方法还包括施加第三电场以驱使裂解试剂进入和/或通过反应部分以裂解细胞，从而将靶双链核酸施加到样本部分。
在一些实施方案中，施加靶双链核酸包括向反应部分添加生物样本。生物样本可为包括核酸(例如，DNA)并且可沉积到反应部分上以用于片段标签化的任何类型。例如，样本可包括处于纯化的多种状态的核酸，包括经纯化的核酸。然而，样本不需要完全纯化，并且可包括例如与蛋白质、其他核酸物质、其他细胞组分和/或任何其他污染物混合的DNA。在一些实施方案中，生物样本包括以与体内发现的比例大致相同的比例存在的DNA、蛋白质、其他核酸物质、其他细胞组分和/或任何其他污染物的混合物。
生物样本可包括例如粗制细胞裂解物或全细胞。例如，在本文示出的方法中施加于固体载体的粗制细胞裂解物不需要经受传统上用于从其他细胞组分分离核酸的一个或多个分离步骤。示例性分离步骤在Maniatis等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第2版，1989年和Short Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑中示出，这些文献据此以引用方式并入。
因此，在一些实施方案中，生物样本可包括例如血液、血浆、血清、淋巴、粘液、痰液、尿液、精液、脑脊液、支气管抽吸物、粪便和浸渍组织或它们的裂解产物或包括DNA的任何其他生物样本。
图2B示出了使用包含4个孔a)、b)、c)和d)以及一对电极的电泳系统的本文所述方法的示例。在该过程开始时，孔a)包含Mg2+，孔b)是空的，孔c)包含高分子量DNA和转座酶(例如，Tn5转座酶)，并且孔d)包含多核苷酸转座酶衔接子(例如，NexteraTM衔接子，Illumina)。在施加电场时(t1)，Mg2+向负电极移动，而小衔接子向正电极移动，并且c)中的内容物由于其尺寸而在凝胶基质中缺乏迁移率，从而保持在原位。在时刻(t2)的随后间隔，衔接子和Mg2+在孔c)处相交，形成包括转座酶、Mg2+和衔接子的活化的转座体复合物。然后该活化的转座体复合物结合大DNA分子并将其片段化和加标签(标签化)，使其成为小文库模板。在反应完成时(t3)，Mg2+继续向负电极移动。可在反应部分中收集或进一步处理经标签化的片段。另选地，由于其尺寸大大减小，经标签化的片段朝正电极迁移，从而分离并且任选地纯化该片段，该片段可在时刻(t4)的随后间隔从孔b)收集。
在一些实施方案中，可施加更复杂的电场，诸如交替电场的大小或方向或提供彼此成90度的不同电场。在此类实施方案中，单个反应物的更复杂的轨迹是可能的。在此类情况下，可根据其已知或预期的迁移率将反应物放置在基质内的预定位置，使得反应物可通过交替电泳场并在凝胶基质上的位置之间以选定的轨迹移动分子来混合和/或分离。
在一些实施方案中，提供了使用超过一个电场由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；并且包括第一部分、第二部分、第三部分和第四部分；第一对正负电极，该第一对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；和第二对正负电极，该第二对正负电极布置在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧。第一部分包含转座酶的第一转座酶辅因子。第一转座酶辅因子为金属离子。第二部分包含转座酶的第二转座酶辅因子。第二转座酶辅因子具有与第一转座酶辅因子相反的电荷。第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子。第三部分包含裂解试剂。第四部分包含转座酶。系统还包括在第一部分和第二部分之间的反应部分。
在一些实施方案中，该方法还包括(b)将包含靶双链核酸的全细胞施加到该反应部分；(c)施加第一电场以驱使裂解试剂进入和/或通过反应部分以裂解细胞，从而将靶双链核酸施加到样本部分；(d)施加第二电场以驱使第一转座酶辅因子从第一部分进入反应部分，驱使第二转座酶辅因子从第二部分进入反应部分并且/或者驱使转座酶从转座酶部分进入反应部分，以形成包括该转座酶、该第一转座酶辅因子和该第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及(e)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
在另外的实施方案中，第一电场和第二电场不同，并且步骤(c)在步骤(d)之前执行。在另外的实施方案中，第一电场和第二电场相同，并且步骤(c)与步骤(d)同时执行。在另外的实施方案中，该方法包括在产生带标签的核酸片段的文库之后施加一个或多个电场，以驱使裂解试剂、转座体复合物、转座酶、转座酶衔接子、金属离子和带标签的核酸片段中的一者或多者离开反应部分。在一些实施方案中，该方法还包括驱使带标签的核酸片段进入收集部分。在一些实施方案中，该方法还包括驱使裂解试剂、转座体复合物、金属离子和带标签的核酸片段离开反应部分并且进入单独的接收部分。
图3A至图3C示出了本文所述的方法的实施方案。电泳系统提供了Mg2+、转座酶(例如，Tn5转座酶)、衔接子和裂解试剂，它们在t0时刻开始时被放置在孔中。将样本(例如，具有靶高分子量DNA的细胞)装载到反应部分中。以控制的方式施加彼此成90度的两个交替电场，从而使试剂和底物开始移动通过凝胶基质。在时刻(t1)的随后间隔，裂解试剂到达反应部分并且与样本混合以裂解细胞。同时，其他试剂根据其向反应部分的迁移率而迁移。在时刻(t2)的随后间隔，裂解试剂远离反应部分迁移，留下纯化的高分子量DNA。在时刻(t3)的随后间隔，片段标签化试剂(转座酶(例如，Tn5转座酶)、Mg2+和衔接子)进入样本孔中形成活化的复合物，该活化的复合物随后结合靶DNA并将其片段化和加标签(标签化)。在时刻(t4)的随后间隔，片段标签化试剂进一步迁移，留下纯化的经标签化的文库模板。可在反应部分中收集或进一步处理经标签化的片段。另选地，在时刻(t5)的随后间隔，经标签化的文库模板进一步迁移至样本收集孔。
在一些实施方案中，转座体复合物结合靶核酸并且在主链中生成切口，在任一条链上各切口相距9个碱基。在其他实施方案中，转座体在切口之间产生7、8、9、10、11或12bps的缺口。在一些实施方案中，该方法还包括在核酸片段中填充缺口和连接切口。可使用任何已知的能够密封切口(并置的5'磷酸末端和3'OH)的连接酶。可在第二反应部分中提供该连接酶，该第二反应部分与用于片段标签化的反应部分相同或不同。
在一些实施方案中，在核酸片段中填充缺口和连接切口包括将带标签的片段与链置换聚合酶在其中带标签的片段中的缺口被填充的条件和充足时间下一起温育。在一些实施方案中，在核酸片段中填充缺口和连接切口包括将带标签的片段与非链置换聚合酶一起温育以在缺口上延伸，然后与连接酶在其中带标签的片段中的单链缺口被填充的条件和充足时间下一起温育。
在一些实施方案中，该方法还包括扩增所产生的核酸片段。由转座体介导的片段标签化产生的核酸片段可根据本领域已知的任何合适的扩增方法进行扩增。在一些实施方案中，扩增包括使用核酸扩增反应、链置换扩增、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应、转录介导的扩增或环介导的扩增中的一者或多者。
在一些实施方案中，经处理的核酸片段可被条形码化以保留来自靶核酸的测序信息的邻近性。如本文所用，术语“邻近性”是指基于共享信息的两个或更多个DNA片段之间的空间关系。信息的共享方面可以是相对于相邻空间关系、隔室空间关系和距离空间关系。关于这些关系的信息继而有利于来源于DNA片段的序列读段的层次组装或映射。在一些实施方案中，多核苷酸转座酶衔接子的单链标签区域还包括条形码序列。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使带标签的片段与结合固体载体的条形码序列接触，以将条形码序列信息转移到靶核酸片段上。在一些实施方案中，在片段保持与转座酶结合的同时添加条形码序列。靶核酸的邻近性信息通过识别条形码序列来确定。可容易地适于与本申请的方法一起使用的靶核酸的条形码片段的示例性制备描述于：例如US 2019/0040382；WO2014142850A1和WO 2014/108810中，这些专利中的每一篇专利全文均以引用方式并入本文。
当将全细胞施加到反应样本时，在片段标签化前执行核酸提取和处理，这需要使用附加的试剂。用于此类预处理的试剂的非限制性示例包括：裂解试剂；溶液，该溶液包含用于消化细菌、真菌或植物细胞壁的酶；蛋白酶溶液；以及包含DNA处理酶的溶液。在一些实施方案中，它们可被装载在凝胶基质的一个或多个不同位置处。在一些实施方案中，该系统可被配置成使得一系列试剂被连续地添加到和移除出单个位置。试剂的添加和移除可通过标准液体处理装置(诸如，由Beckman、Agilent、Tecan、Hamilton等出售的龙门式液体处理机器人)从容器的顶部添加和移除。在其他实施方案中，试剂的添加和移除可经由容器内的流体通道来实现。
在一些实施方案中，转座体复合物的转座酶在转座后从核酸片段中移除。在一些实施方案中，在转座之后以及在转座子的衔接子序列与互补的捕获序列进行后续的杂交之后，将转座酶从核酸片段中移除。在一些实施方案中，转座酶通过SDS处理移除。在一些实施方案中，转座酶通过蛋白酶处理移除。
在一些实施方案中，经处理的核酸片段可从电泳凝胶基质中转移出来用于分析或用于其他的文库制备过程，诸如，例如尺寸选择，诸如美国专利第8,361,298号和第8,361,299号中所述的过程，这两个专利据此全文以引用方式并入。
在一些实施方案中，可收集由转座体介导的片段标签化产生的经处理的核酸片段并且根据任何合适的测序方法进行测序，诸如直接测序，包括边合成边测序、边连接边测序、边杂交边测序、纳米孔测序等。在一些实施方案中，可在收集部分中选择性地收集期望尺寸或尺寸范围(例如，25至500个碱基对(bp)、或50至500bp、或50至350bp、或100至300bp、或约50、150、250或300bp)的片段。在施加电场时，经处理的核酸片段可进一步迁移出反应部分。由于不同尺寸的片段具有不同的迁移率，因此可从收集部分选择性地分离和收集期望尺寸或尺寸范围的片段。
在一些实施方案中，提供了用于执行多个顺序化学和/或酶促过程的方法。在一些实施方案中，可施加更复杂的电场，诸如交替电场的大小或方向或提供彼此成90度的不同电场。在此类实施方案中，单个反应物的更复杂的轨迹是可能的。在此类情况下，可根据其已知或预期的迁移率将反应物放置在基质内的预定位置，使得反应物可通过交替电泳场并在凝胶基质上的位置之间以选定的轨迹移动分子来混合和/或分离。在一些实施方案中，可将一种或多种试剂(诸如酶)固定在3D基质中的固体载体(反应部分内的小珠)上，从而防止其在电场中移动，而其他试剂根据其在电场中的迁移率而自由移动。
图4示出了使用凝胶电泳执行多种生化反应的方法的一般示意图。电泳设备包括沿宽度和长度的多个部分，每个部分包含不同试剂。两对正负电极被提供在第一端部或第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧，以施加彼此垂直的交替电场。试剂迁移到第一反应部分中以执行第一生化反应。通过改变电场的大小或方向，来自第一生化反应的产物迁移到第二反应部分中并且与试剂反应以执行第二生化反应。这些步骤可重复用于附加的反应部分中的后续的生化反应。
设备/系统
在一些实施方案中，提供了用于执行酶促反应的电泳系统。在一些实施方案中，该电泳系统包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该酶的第二酶辅因子，该第二酶辅因子具有与该第一酶辅因子的电荷相反的电荷；反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该酶；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。在另外的实施方案中，在反应部分中提供了酶的底物。
在一些实施方案中，提供了电泳设备，并且该设备包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；反应部分，该反应部分远离该第一端部并且包含转座体复合物，该转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，该多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。
在一些实施方案中，提供了电泳设备，并且该设备包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分，该第一部分邻近该第一端部；第二部分，该第二部分邻近该第二端部；反应部分，该反应部分在该第一端部和该第二端部之间；和一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。第一部分包含转座酶的第一转座酶辅因子。在一些实施方案中，第一转座酶辅因子为金属离子。第二部分包含转座酶的第二转座酶辅因子，并且该第二转座酶辅因子具有与第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷。在一些实施方案中，第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子。反应部分包含转座酶。在一些实施方案中，在反应部分中提供了靶核酸。
在一些实施方案中，提供了电泳设备，并且该设备包括：电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；第一部分；第二部分；第三部分和第四部分；反应部分；第一对正负电极，该第一对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；和第二对正负电极，该第二对正负电极布置在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧。第一部分包含转座酶的第一转座酶辅因子，并且该第一转座酶辅因子为金属离子。第二部分包含转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷。第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子。第三部分包含裂解试剂。在一些实施方案中，在反应部分中提供了包含靶核酸的全细胞。在一些实施方案中，该设备包括沿宽度和/或长度的附加部分，每个部分包含用于片段标签化的不同试剂。在一些实施方案中，该设备包括用于接收带标签的核酸片段的收集部分。在一些实施方案中，该设备包括用于接收未反应的试剂的一个或多个接收部分。
在一些实施方案中，第一部分、第二部分、第三部分、第四部分、反应部分和/或附加部分包括孔。孔可包含酶、靶核酸分子或任何其他底物或试剂。在一些实施方案中，反应部分包括孔，并且固体载体是孔中的小珠颗粒或者固体载体是孔的表面。
在一些实施方案中，电泳设备可包括具有电泳缓冲液的容器并且该容器被构造成在其中保持电泳凝胶基质。在一些实施方案中，电泳设备可包括本文所述的超过一个容器。
电泳凝胶基质可为琼脂、琼脂糖或聚丙烯酰胺。在一些实施方案中，电泳凝胶基质为琼脂糖。电泳缓冲液可具有介于pH 7和pH 9之间的pH，并且其可包括EDTA作为螯合剂。当靶核酸被片段化成长度在几百至几千bp范围内的尺寸时，反应部分中较高浓度的琼脂糖将有助于限制文库产物扩散出反应部分，同时允许有效地去除游离试剂/衔接子。
在一些实施方案中，电泳设备还可包括一对或多对正负电极。在一些实施方案中，该对正负电极与电泳凝胶基质直接接触。在一些实施方案中，电极中的一个或多个电极嵌入凝胶基质中。在一些实施方案中，该对正负电极不与电泳凝胶基质直接接触。在一些实施方案中，将电极中的一个或多个电极嵌入填充有与电泳凝胶基质流体连接的电泳缓冲液的室中。
在一些实施方案中，电泳设备还可包括屏障或超滤膜，其孔隙大小足够小以保留核酸片段。一种此类示例性膜为具有10kDa截留分子量的聚醚砜膜(
Figure BDA0003132963340000201
10kDa，购自EMD Millipore)。
在一些实施方案中，提供了电泳系统。在一些实施方案中，提供了由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的电泳系统。在一些实施方案中，电泳系统包括本文所述的电泳设备、电源和控制器，该控制器被配置成控制一个或多个电场的方向和/或大小以驱使试剂和/或带标签的核酸片段进入和/或通过反应部分、收集部分和/或接收部分。
当对电极施加电压时，可驱使试剂通过电泳凝胶基质并且进入和通过反应部分。逆转电压可将分子引向相反的方向。此外，当对电极对中的一个和/或另一个电极施加电压时，取决于其电泳迁移率，试剂被驱使到相应的反应部分或收集部分中的一个和/或另一个反应部分或收集部分中。
在一些实施方案中，可操作电场选择性地回收某些尺寸范围内的试剂和核酸片段。例如，脉冲场方法可用于洗脱长度为50-500kb的经处理的核酸片段，同时留下尺寸大于约2000kb的核酸片段。如果期望较大尺寸的片段不含较小尺寸的片段，则可首先在尺寸选择脉冲场条件下洗脱较小片段，随后可在其他脉冲场条件下或在连续场条件下回收较大片段。更多信息，请参见Jann Noolandi和Chantal Turmel，“Methods in MolecularBiology”，第12卷：“Pulsed-field gel electrophoresis,Protocols,Methods,andTheories”，Burmeister,Margit和Ulanovsky,Levy.Humana.编辑，第73-103页和第135-143页，其内容据此全文以引用方式并入。
此外，可选择凝胶浓度、电压和/或电泳持续时间，使得试剂组分有效移动和/或使得靶核酸保持在反应部分中。对于在琼脂糖凝胶中迁移如此缓慢的极高分子量核酸，此类条件可被满足。当处理较短的靶核酸(例如，约500bp片段尺寸)时，可使用更高浓度的凝胶、更低的电压和更优化的条件。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物均全文以引用方式并入。在本文术语有多个定义的情况下，除非另有说明，否则以本节中的定义为准。如在说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。除非另有说明，否则使用“或”或“和”表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式(诸如“包含”、“含有”和“具有”)的使用不是限制性的。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包括”和“包含”都将被解释为具有开放式含义。即，术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。当在过程的上下文中使用时，术语“包括”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
靶核酸
如本文所用，“靶核酸”是指经受转座的任何感兴趣的双链核酸，例如用于生成带标签的核酸片段(例如，5'和3'带标签或带双标签的线性ssDNA或dsDNA片段或带标签的环状ssDNA片段)的文库。“靶核酸”可源于任何体内或体外来源，包括源于一种或多种细胞、组织、器官或生物体(无论是活体还是非活体)或源于任何生物或环境来源(例如，水、空气、土壤)。例如，在一些实施方案中，该靶核酸包括或由真核和/或原核双链核酸组成，其来源于或源于人、动物、植物、真菌(例如，霉菌或酵母)、细菌、病毒、类病毒、支原体或其他微生物。在一些实施方案中，该靶核酸包括或由基因组DNA、亚基因组DNA、染色体DNA(例如，来自分离的染色体或染色体的一部分，例如，来自染色体的一个或多个基因或基因座)、线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒或其他附加体衍生的DNA(或其中包含的重组DNA)或双链cDNA组成，该双链cDNA通过使用RNA依赖性DNA聚合酶或逆转录酶逆转录RNA以生成第一链cDNA，然后延伸与第一链cDNA退火的引物以生成dsDNA来制备。在一些实施方案中，该靶核酸包括在核酸分子中或由核酸分子制备的多个dsDNA分子(例如，在基因组DNA或cDNA中或由基因组DNA或cDNA制备的多个dsDNA分子，该基因组DNA或cDNA由在生物来源(例如，细胞、组织、器官、生物体)或环境来源(例如，水、空气、土壤、唾液、痰、尿液、粪便)中或来自该生物来源或环境来源的RNA制备)。在一些实施方案中，该靶核酸来自体外来源。例如，在一些实施方案中，靶核酸包括或由dsDNA组成，该dsDNA由单链DNA(ssDNA)或由单链或双链RNA在体外制备(例如，使用本领域已知的方法，诸如使用合适的DNA依赖性和/或RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)进行引物延伸)。在一些实施方案中，靶核酸是包括dsDNA或由其组成的靶DNA，该dsDNA是使用本领域已知的任何方法由一个或多个双链或单链DNA或RNA分子的全部或一部分制备的，方法包括用于如下操作的方法：DNA或RNA扩增(例如，PCR或逆转录酶-PCR(RT-PCR)、转录介导的扩增方法，其中对一个或多个核酸分子的全部或一部分进行扩增)；将一个或多个核酸分子的全部或一部分分子克隆到随后在合适的宿主细胞中复制的质粒、F黏粒、BAC或其他载体中；或通过杂交捕获一个或多个核酸分子，诸如通过与阵列或微阵列上的DNA探针杂交(例如，通过“序列捕获”；例如，使用得自ROCHE NIMBLEGEN、AGILENT或FEBIT的试剂盒和/或阵列)。
在一些实施方案中，“靶核酸”或“靶DNA”意为在用于生成带标签的核酸片段(例如，5'和3'带标签或带双标签的线性ssDNA或dsDNA片段或带标签的环状ssDNA片段)的文库之前制备或修饰(例如，使用各种生物化学或分子生物学技术)的双链核酸。
转座体复合物、多核苷酸转座酶衔接子、标签和转座酶
基于转座子的技术可用于将核酸(例如，DNA)片段化，例如，如用于NEXTERATM XT和FLEX DNA样本制备试剂盒(Illumina,Inc.)的工作流程中所例示，其中靶核酸(诸如基因组DNA)用转座体复合物处理，该转座体复合物同时将靶标片段化和加标签(“片段标签化”)，从而产生在片段的末端处带独特衔接子序列标签的片段化核酸分子的群体。
转座反应是其中一个或多个转座子在随机位点或几乎随机位点处插入靶核酸中的反应。转座反应中的组分包括转座酶(或能够将如本文所述的核酸片段化和加标签的其他酶，诸如整合酶)和多核苷酸转座酶衔接子，该多核苷酸转座酶衔接子包括与该酶结合的双链转座子末端序列，以及连接到这两条转座子末端链中的一条或两条转座子末端链的标签。双链转座子末端序列的一条链在片段化位点转移到靶核酸的一条链(转移链)，并且互补的转座子末端序列链不共价结合到片段化的核酸(非转移链)，但保持与转移链杂交。多核苷酸转座酶衔接子可根据需要或期望包括具有一种或多种功能序列(例如，引物序列)的标签。
“转座体复合物”由至少一种转座酶和转座子识别序列构成。在一些此类体系中，转座酶结合转座子识别序列以形成能够催化转座反应的功能性复合物。在某些方面，转座子识别序列为双链转座子末端序列。转座酶或整合酶结合靶核酸中的转座酶识别位点并且将转座子识别序列插入到靶核酸中。在一些此类插入事件中，转座子识别序列(或末端序列)的一条链被转移到靶核酸中，也会导致切割事件。可容易地适于与本公开的转座酶一起使用的示例性转座程序和体系在例如PCT公布第WO2010/048605号、美国专利公布第2012/0301925号、美国专利公布第2012/13470087号或美国专利公布第2013/0143774号中有描述，这些专利中的每一篇均全文以引用方式并入本文。
可与本文提供的某些实施方案一起使用的示例性转座酶包括以下转座酶(或由以下转座酶编码)：Tn5转座酶(参见Reznikoff等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2000年，第266卷，第729-734页)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)(转座酶，通过Agilent来表征并用于SureSelect QXT产物)、MuA转座酶和包含R1和R2末端序列的Mu转座酶识别位点(Mizuuchi,K.，Cell，第35卷，第785页，1983年；Savilahti,H等人，EMBOJ.，第14卷：第4893页，1995年)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Tn552(Colegio,O等人，J.Bacteriol.，第183卷：第2384-2388页，2001年；Kirby,C.等人，Mol.Microbiol.，第43卷：第173-186页，2002年)、Tyl(Devine和Boeke，Nucleic Acids Res.，第22卷：第3765-3772页，1994年和PCT公布第WO95/23875号)、Transposon Tn7(Craig,N.L.，Science，第271卷：第1512页，1996年；Craig,N.L.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，第204卷：第27-48页，1996年)、Tn/O和IS10(Kleckner N.等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，第204卷：第49-82页，1996年)、Mariner转座酶(Lampe,D.J等人，EMBO J.，第15卷：第5470-5479页，1996年)、Tc1(Plasterk,R.H.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，第204卷：第125-143页，1996年)、PElement(Gloor,G.B.，Methods Mol.Biol.，第260卷：第97-114页，2004年)、Tn3(Ichikawa和Ohtsubo，J.Biol.Chem.，第265卷：第18829-18832页，1990年)、细菌插入序列(Ohtsubo和Sekine，Curr.Top.Microbiol.Immunol.第204卷：第1-26页，1996年)、逆转录病毒(Brown等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷：第2525-2529页，1989年)和酵母反转录转座子(Boeke和Corces，Ann.Rev.Microbiol.第43卷：第403-434页，1989年)。更多的示例包括IS5、Tn10、Tn903、IS911以及转座酶家族酶的工程化形式(Zhang等人，(2009)PLoS Genet.第5卷：第e1000689页Epub，10月16日；Wilson C.等人，(2007)J.Microbiol.Methods，第71卷：第332-335页)。
在一些实施方案中，转座酶是Tn5、MuA或哈氏弧菌转座酶、或其活性突变体。在其他实施方案中，转座酶是Tn5转座酶或其活性突变体。在一些实施方案中，Tn5转座酶是超高活性Tn5转座酶(参见例如，Reznikoff等人，PCT公布第WO2001/009363号，美国专利第5,925,545号、第5,965,443号、第7,083,980号和第7,608,434号；以及Goryshin和Reznikoff，J.Biol.Chem.第273卷：第7367页，1998年)，或其活性突变体。在一些方面，Tn5转座酶是如PCT公布第WO2015/160895号中所述的Tn5转座酶，该专利以引用方式并入本文。在一些实施方案中，Tn5转座酶是融合蛋白质。在一些实施方案中，Tn5转座酶融合蛋白质包含融合的延长因子Ts(Tsf)标签。在一些实施方案中，Tn5转座酶是相对于野生型序列在氨基酸54、56和372处包含突变的超高活性Tn5转座酶。在一些实施方案中，超高活性Tn5转座酶是融合蛋白质，任选地，其中融合蛋白质是延长因子Ts(Tsf)。本文所述的方法还可包括转座酶的组合，而不仅仅是单一转座酶。在一些实施方案中，识别位点是Tn5型转座酶识别位点(Goryshin和Reznikoff，J.Biol.Chem.，第273卷：第7367页，1998年)。在一个实施方案中，使用与超高活性Tn5转座酶形成复合物的转座酶识别位点(例如，EZ-Tn5TM转座酶，EpicentreBiotechnologies,Madison,Wis.)。
在一些实施方案中，转座酶是二聚体(例如，Tn5转座酶二聚体)。在一些此类实施方案中，转座体复合物包括转座酶的两个分子的二聚体。在一些实施方案中，转座酶复合物包括具有第一单体和第二单体的转座酶(例如，Tn5转座酶)二聚体。每个单体包括第一转座子和第二转座子，其中该第一转座子包括第一衔接子序列(其中二聚体的每个单体中的衔接子序列相同或不同)和在其3'端的第一转座子末端序列，并且该第二转座子包括第二转座子末端序列，该第二转座子末端序列与该第一转座子末端序列至少部分互补。在一些实施方案中，转座体复合物是同源二聚体，其中转座酶的两个分子各自结合到具有相同的转座子末端序列和标签的多核苷酸衔接子序列(例如，每个单体结合到相同多核苷酸衔接子序列的分子，从而形成“同源二聚体”)。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法采用转座体复合物的两个群体。在一些实施方案中，每个群体中的转座酶是二聚体并且是相同的酶。在一些实施方案中，每个群体中的转座体复合物均为异源二聚体，其中该第一群体在两个单体的每个单体中具有第一多核苷酸转座酶衔接子，并且该第二群体在每个单体中具有第二多核苷酸衔接子(其不同于第一多核苷酸转座酶衔接子)。在一些实施方案中，每个异源二聚体中的转座子末端序列是相同的，但是多核苷酸转座酶衔接子包括不同标签。在一些实施方案中，每个群体包括不同标签序列。在一些实施方案中，第一群体包括具有包括A14引物序列的标签的衔接子，并且第二群体包括具有包括B15引物序列的标签的衔接子。
在一些实施方案中，多核苷酸转座酶衔接子是两种多核苷酸转座酶衔接子的混合物，每种多核苷酸转座酶衔接子包括相同的转座子末端序列和不同标签。当衔接子的混合物与Tn5转座酶二聚体混合时，产生三种转座体复合物的混合物：(a)第一转座体二聚体复合物，其包括转座酶和第一多核苷酸转座酶衔接子中的两个第一多核苷酸转座酶衔接子(第一同源二聚体)；(b)第二转座体二聚体复合物，其包括转座酶和第二多核苷酸转座酶衔接子中的两个第二多核苷酸转座酶衔接子(第二同源二聚体)；以及(c)第三转座体二聚体复合物，其包括转座酶和具有第一衔接子的一个单体和具有第二衔接子的一个单体(异源二聚体)。当用这三种复合物的混合物进行片段标签化时，产生的片段被相应地加标签，从而产生三个片段群体(在每个5'末端用第一衔接子加标签的一个群体；在每个5'末端用第二衔接子加标签的第二群体；以及在一个5'末端用第一衔接子加标签和在第二5'末端用第二衔接子加标签的第三群体)。
转座酶衔接子包括(a)包括双链转座子末端序列的3'部分和(b)标签。转座子末端序列被转座酶识别。转座酶与转座子末端序列结合生成转座体复合物。在片段标签化过程中，转座酶衔接子的转移链被转移到(退火到)双链核酸片段的5'末端。互补的非转移链不与所得的片段共价结合，而是与转移链杂交并且因此包括在产物片段中。
如本文所用，术语“标签”和“标签区域”是指多核苷酸转座酶衔接子的一部分，其表现出用于期望的预期目的或应用的序列。本文给出的一些实施方案包括包含多核苷酸转座酶衔接子的转座体复合物，该多核苷酸转座酶衔接子具有包括双链转座子末端序列的3'部分和标签区域。标签区域可包括用于任何期望目的的任何序列。在一些实施方案中，标签包括一种或多种功能序列，该一种或多种功能序列选自通用序列、引物序列、索引序列、捕获序列、条形码序列(用于例如，计数或纠错)、切割序列、测序相关序列、富集序列以及它们的组合。例如，在一些实施方案中，标签区域包括一个或多个限制性内切核酸酶识别位点。在一些实施方案中，标签包括引物序列。在其他实施方案中，标签包括引物序列和索引或条形码序列。引物序列也可以是通用序列。通用序列是两个或更多个核酸片段共有的核苷酸序列区域。任选地，该两个或更多个核酸片段还具有序列差异区域。可存在于多个核酸片段的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的单个通用引物来复制或扩增多个不同序列。
在一些实施方案中，标签区域包括一个或多个适合与用于簇扩增反应的引物杂交的区域。在一些实施方案中，标签区域包括一个或多个适合与用于测序反应的引物杂交的区域。应当理解，可将任何其他合适的特征结合到标签区域中。在一些实施方案中，标签区域包括具有介于5bp和200bp之间的长度的序列。在一些实施方案中，标签区域包括具有介于10bp和100bp之间的长度的序列。在一些实施方案中，标签区域包括具有介于20bp和50bp之间的长度的序列。在一些实施方案中，标签区域包括具有介于5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、150bp和200bp之间的长度的序列。本公开不限于可使用的标签的类型，并且技术人员将认识到可用于文库制备和下一代测序的另外的序列。
固定试剂
在一些实施方案中，可将试剂(诸如酶)固定在表面(诸如凝胶基质中的位置内或孔内的小珠)上，从而防止其在电场中移动，而其他试剂根据其在电场中的迁移率而自由移动。
当提及分子固定到固体载体时，术语“固定的”和“连接的”在本文中可互换使用，并且除非另外明确地或通过上下文指明，否则这些术语均旨在涵盖直接或间接、共价或非共价连接。在某些实施方案中，共价连接可为优选的。
试剂的固定可通过本领域已知的其他方法实现。在一些实施方案中，转座酶或转座体复合物使用共价或非共价结合配偶体(例如，亲和元件和亲和结合配偶体)固定在基底诸如小珠上。在一些此类实施方案中，亲和元件为生物素，并且固体载体包括链霉亲和素。例如，转座体复合物通过连接到该转座体复合物的生物素酰化接头固定在链霉亲和素包被的小珠上。在一些实施方案中，转座体复合物通过与多核苷酸转座酶衔接子(或当转座酶是二聚体时，与一种或两种多核苷酸转座酶衔接子)共价结合的生物素或其他亲和元件固定到小珠。
在一些实施方案中，转座酶和多核苷酸均固定到固体载体。在一些实施方案中，转座酶仅固定到固体载体，而衔接子多核苷酸可自由迁移。在一些实施方案中，转座体复合物固定到反应部分中的固体载体。在一些实施方案中，转座酶固定在反应部分中的固体载体上。在一些实施方案中，固体载体包括或为小珠。在一个实施方案中，小珠为顺磁性小珠。
如本文所用，亲和元件是可用于共价或非共价结合到亲和结合配偶体的部分。在一些方面，亲和元件在转座体复合物上，并且亲和结合配偶体在固体载体上。可容易地适于本公开一起使用的示例性亲和元件/结合配偶体组合描述于例如WO 2018/156519或美国专利公布第2018/0245069号中，这些专利中的每一篇均全文以引用方式并入本文。在其他实施方案中，亲和元件/结合配偶体组合包括或为FITC/抗FITC、地高辛/地高辛抗体或半抗原/抗体。其他合适的亲和对包括但不限于二硫代生物素-亲和素、亚氨基生物素-亲和素、生物素-亲和素、二硫代生物素-琥珀酰化亲和素、亚氨基生物素-琥珀酰化亲和素、生物素-链霉亲和素和生物素-琥珀酰化亲和素。
如本文所用，可切割的接头是具有通过可切割键连接在一起的两个功能头的分子。该两个功能头用于将接头连接到其他部分；在这种情况下，可切割的接头将第一转座子序列的5'末端连接到亲和元件。本文所用的可切割接头是可通过化学或物理手段切割的接头，该化学或物理手段例如光解、化学切割、热切割或酶切割。在一些实施方案中，切割可通过生物化学、化学、酶、亲核、还原敏感剂或其他手段进行。根据其切割条件和生物学应用分类的可切割接头的概述在以下文献中列出：Wagner等人，Bioorg.Med.Chem.第20卷，第571-582页(2012年)，其以引用方式并入本文；还可参见例如，美国专利公布第2012/0208705号和第2012/0208724号以及PCT公布WO 2012/061832，这些专利中的每一篇均全文以引用方式并入。
术语“固体表面”、“固体载体”和其他语法等同形式物是指适于或可被修饰成适于转座体复合物的附接的任何材料。如本领域技术人员将会理解的，可能的基底的数量很多。可能的基底包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟隆等)、多糖、尼龙或硝化纤维、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光纤束、小珠、顺磁性小珠和各种其他聚合物。
在本文所示的方法和设备中，转座体复合物固定到固体载体。在一个实施方案中，固体载体为小珠。合适的小珠组合物包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联葡聚糖(诸如琼脂糖凝胶)、纤维素、尼龙、交联胶束和特氟隆，以及本文概述的用于固体载体的任何其他材料。在某些实施方案中，微球体是磁性微球体或小珠，例如顺磁性颗粒、球体或小珠。小珠无需为球形的；可使用不规则的颗粒。另选地或除此之外，小珠可为多孔的。小珠尺寸在纳米(例如，100nm)至毫米(例如，1mm)的范围内，其中约0.2微米至约200微米的小珠是优选的，约0.5微米至约5微米的小珠是特别优选的，但在一些实施方案中可使用更小或更大的小珠。小珠可用亲和结合配偶体包被，例如，小珠可用链霉亲和素包被。在一些实施方案中，小珠是链霉亲和素包被的顺磁性小珠，例如Dynabeads MyOne链霉亲和素C1小珠(ThermoScientific，目录号65601)、链霉亲和素MagneSphere顺磁性颗粒(Promega目录号Z5481)、链霉亲和素磁性小珠(NEB目录号S1420S)和MaxBead链霉亲和素(Abnova目录号U0087)。固体载体也可以是载玻片，例如已经被修饰使得转座体复合物可被固定于其上的流通池或其他载玻片。
在本公开的一些实施方案中，固体载体由惰性基底或基质(例如，载玻片、聚合物小珠等)构成，该惰性基底或基质已例如通过施加包含反应性基团的中间材料层或涂层被官能化，该反应性基团允许共价连接到分子诸如多核苷酸。此类载体的示例包括但不限于负载在惰性基底诸如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶，尤其是如WO2005/065814和US2008/0280773中所述的聚丙烯酰胺水凝胶，这些专利的内容全文以引用方式并入本文。在WO2016/189331和US2014/0093916A1中描述了在固体表面上将DNA片段标签化(片段化并加标签)以构建片段标签化的DNA文库的方法，这些专利全文以引用方式并入本文。
扩增
应当理解，本文所述的或本领域通常已知的扩增方法中的任一种方法可与通用引物或靶标特异性引物一起用于扩增DNA片段。合适的扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如美国专利第8,003,354号中所述，该专利全文以引用方式并入本文。上述扩增方法可用于扩增一种或多种感兴趣核酸。例如，可利用PCR(包括多重PCR)、SDA、TMA、NASBA等扩增核酸片段。在一些实施方案中，在扩增反应中包括特异性针对感兴趣核酸的引物。
其他合适的核酸扩增方法可包括寡核苷酸延伸和连接、滚环扩增(RCA)(Lizardi等人，Nat.Genet.第19卷：第225-232页(1998年)，其以引用方式并入本文)和寡核苷酸连接测定(OLA)(通常参见美国专利第7,582,420号、第5,185,243号、第5,679,524号和第5,573,907号；EP 0 320 308 B1；EP 0 336 731 B1；EP 0 439 182 B1；WO 90/01069；WO 89/12696；和WO 89/09835，所有这些专利均以引用方式并入)技术。应当理解，这些扩增方法可被设计成用于扩增核酸片段。例如，在一些实施方案中，扩增方法可包括连接探针扩增或含有特异性针对感兴趣核酸的引物的寡核苷酸连接测定(OLA)反应。在一些实施方案中，扩增方法可包括引物延伸-连接反应，该引物延伸-连接反应包含特异性针对感兴趣的核酸的引物。作为可被特别设计用于扩增感兴趣的核酸的引物延伸和连接引物的非限制性示例，扩增可包括用于GoldenGate测定(Illumina,Inc.,San Diego,CA)的引物，如美国专利第7,582,420号和第7,611,869号所示例，这两篇专利中的每一篇专利全文均以引用方式并入本文。
在本公开的方法中可使用的示例性等温扩增方法包括但不限于多重置换扩增(MDA)，由例如Dean等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)所示例的多重置换扩增(MDA)，或由例如美国专利第6,214,587号所示例的等温链置换核酸扩增，这两篇文献中的每篇文献全文以引用方式并入本文。可用于本公开的其他非基于PCR的方法包括：例如链置换扩增(SDA)，其描述于例如Walker等人，Molecular Methods for Virus Detection，Academic Press,Inc.，1995年，美国专利第5,455,166号和第5,130,238号，以及Walker等人，Nucl.Acids Res，第20卷：第1691-1696页(1992年)；或超支化链置换扩增，其描述于例如Lage等人，Genome Research，第13卷，第294-307页(2003年)中，这些文献中的每篇文献均全文以引用方式并入本文。等温扩增方法可与链置换Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段5'->3'exo-一起用于基因组DNA的随机引物扩增。这些聚合酶的使用利用了它们的高持续合成能力和链置换活性。高持续合成能力允许聚合酶产生长度为10kb-20kb的片段。如上所述，可使用具有低持续合成能力和链置换活性的聚合酶(诸如Klenow聚合酶)在等温条件下产生较小的片段。对扩增反应、条件和组分的附加描述在美国专利第7,670,810号的公开内容中有详细阐述，该专利全文以引用方式并入本文。
可用于本公开的另一种核酸扩增方法是带标签的PCR，其使用具有恒定5'区，接着是随机3'区的二结构域引物的群体，如例如Grothues等人，Nucleic Acids Res，第21卷第5期：第1321-1322页(1993年)中所述，该专利全文以引用方式并入本文。基于来自随机合成的3'区的单独杂交，进行第一轮扩增以允许大量启动热变性的DNA。由于3'区的性质，设想启动位点在整个基因组中是随机的。然后，可移除未结合的引物，并且可使用与恒定5'区互补的引物进行进一步的复制。
制备测序片段–扩增带标签的片段
在一些方面，提供了由靶核酸制备测序片段的方法，该方法包括：提供包括如本文所述的其上固定本文所述的转座体复合物的固体载体；在将靶核酸片段化并且将第一转座子连接到该片段的5'末端的条件下使该固体载体与靶核酸接触，从而使该片段固定在该固体载体上。在一些方面，该方法还包括扩增片段化的核酸。在一些实施方案中，片段化条件是适于通过使用转座体复合物将靶核酸片段化和加标签来进行片段标签化的条件。
在本文所述方法的一些实施方案中，在片段化和加标签后，该方法还包括从带5'标签的靶片段中移除转座酶以提供未复合的带5'标签的靶片段。转座酶的移除可在化学条件下完成，诸如使用变性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)处理。此类方法还可包括生成带5'标签的靶片段的完全双链形式。生成完全双链体可包括从带5'标签的靶片段中移除经退火的(但未连接的)第二转座子并且延伸带5'标签的靶片段以生成完全双链的带5'标签的靶片段。该生成可例如通过将未复合的带5'标签的靶片段加热到足以选择性地使第二转座子变性的温度而使该片段的剩余双链体区域保持完整来完成。延伸可在存在dNTP和合适的聚合酶下完成。另选地，该生成可通过在存在单个核苷酸(dNTP)和聚合酶的情况下温育未复合的带5'标签的靶片段而在一个反应中完成。在一些实施方案中，该温育包括在足以使经退火的第二转座子变性并且延伸剩余的双链体的一个或多个温度下加热。在其他实施方案中，聚合酶是链置换聚合酶，其用于移除第二转座子并且延伸剩余的双链体以生成完全双链的带5'标签的靶片段。合适的聚合酶包括KAPA HiFi、Pfu和类似的酶。合适的聚合酶包括链置换聚合酶，诸如Bst、Bsu Vent、Klenow和类似的酶。
在一些方面，该方法还包括扩增完全双链的带5'标签的靶片段。扩增可通过任何合适的扩增方法进行，诸如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)或多重置换扩增(MDA)。在一些实施方案中，通过PCR进行扩增。在一些实施方案中，通过在存在聚合酶的情况下与dNTP反应而在一个反应步骤中进行扩增和延伸。
在一些实施方案中，扩增用于将一个或多个二级衔接子序列添加到完全双链的带5'标签的靶片段以形成测序片段。该扩增通过将在每个末端包括引物序列的完全双链的带5'标签的靶片段与二级衔接子载体、单个核苷酸和聚合酶在足以扩增该靶片段并且掺入该二级衔接子载体(或其互补序列)的条件下一起温育来完成，其中该二级衔接子载体包括该引物序列的互补序列和二级衔接子序列。
在一些实施方案中，二级衔接子载体包括引物序列、索引序列、条形码序列、纯化标签或它们的组合。在一些实施方案中，二级衔接子载体包括引物序列。在一些实施方案中，二级衔接子载体包括索引序列。在一些实施方案中，二级衔接子载体包括索引序列和引物序列。
在一些实施方案中，完全双链的带5'标签的靶片段在每个末端包括不同引物序列。在此类实施方案中，每个二级衔接子载体包括双引物序列中的一个引物序列的互补序列。在一些实施方案中，双引物序列为A14引物序列和B15引物序列。
在一些实施方案中，通过扩增添加多个二级衔接子。在一些实施方案中，二级衔接子载体各自包括双引物序列中的一个引物序列。在一些实施方案中，二级衔接子载体各自包括多个索引序列中的一个索引序列。在一些实施方案中，二级衔接子载体包括具有P5引物序列的二级衔接子和具有P7引物序列的二级衔接子。
在一些方面，带标签的片段包括带同型标签和异型标签的片段，例如，在任一端具有相同标签的一些片段(带同型标签的片段)，以及在一端具有第一标签并且在另一端具有第二标签的一些片段(带异型标签的片段)。在一些方面，使用“抑制PCR”扩增混合物用于富集带异型标签的片段。在其他方面，使用“叉状”衔接子完成扩增以安装不同于第一标签的另一个标签。一旦产生带异型标签的片段的群体，就可执行进一步的扩增和测序。
在一些实施方案中，测序片段沉积在流通池上。在一些实施方案中，测序片段与接枝到流通池或表面的互补引物杂交。在一些实施方案中，测序片段的序列通过阵列测序或下一代测序方法(诸如边合成边测序)进行检测。
P5和P7引物在由Illumina,Inc.销售的商业流通池的表面上使用，用于在各种Illumina平台上测序。引物序列在美国专利公布第2011/0059865A1号中有所描述，该专利公布全文以引用方式并入本文。P5和P7引物(其可以是在5'末端封端的炔烃)的示例包括如下引物：
P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO:1)
P7：CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT(SEQ ID NO:2)
以及它们的衍生物。在一些示例中，P7序列包括在G*位置处的经修饰的鸟嘌呤，例如8-氧代-鸟嘌呤。在其他示例中，*表示G*与相邻的3'A之间的键为硫代磷酸酯键。在一些示例中，P5和/或P7引物包括非天然接头。任选地，P5和P7引物中的一者或两者可包括polyT尾。poly T尾通常位于上文所示序列的5'末端处，例如介于5'碱基和末端炔烃单元之间，但在一些情况下可位于3'末端处。poly T序列可包含任何数量(例如2个至20个)的T核苷酸。虽然P5和P7引物作为示例提供，但应当理解，任何合适的扩增引物都可用于本文提出的示例中。
在一些实施方案中，该方法的扩增步骤包括PCR或等温扩增。在一些实施方案中，该方法的扩增步骤包括PCR。
测序方法
本文提供的一些方法包括分析核酸的方法。此类方法包括制备靶核酸的模板核酸的文库，从模板核酸的文库获得序列数据，以及组装靶核酸的序列表示。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于下一代测序工作流程，包括但不限于边合成边测序(SBS)。可容易地适于与通过本公开的方法产生的核酸文库一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台描述于：例如Bentley等人，Nature，第456卷：第53-59页(2008年)，WO 04/018497、US7,057,026、WO 91/06678、WO 07/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US 7,315,019、US7,405,281和US 2008/0108082，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。
一些SBS实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物时释放的质子。例如，基于释放质子的检测的测序可使用可从Ion Torrent公司(Guilford，CT，Life Technologies子公司)商购获得的电检测器和相关技术或在US 2009/0026082 A1；US 2009/0127589 A1；US2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1中所述的测序方法和系统，这些专利中的每一篇专利均以引用方式并入本文。
另一种有用的测序技术是纳米孔测序(参见例如Deamer等人，TrendsBiotechnol.第18卷，第147-151页(2000年)；Deamer等人，Acc.Chem.Res.第35卷，第817-825页(2002年)；Li等人，Nat.Mater.第2卷，第611-615页(2003年)，这些文献的公开内容以引用方式并入本文)。本文所述的方法不限于所使用的任何特定类型的测序仪器。
以下编号的项目为本文的实施方案提供了额外的支持和描述。
项目1.一种使用电泳执行酶促反应的方法，包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；
第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该酶的第二酶辅因子，该第二酶辅因子具有与该第一酶辅因子的电荷相反的电荷；
反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该酶；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；以及
(b)在该对电极之间施加电场以驱使该第一酶辅因子从该第一部分进入该反应部分并且驱使该第二酶辅因子从该第二部分进入该反应部分，以形成包括该酶、该第一酶辅因子和该第二酶辅因子的活化的酶复合物。
项目2.根据项目1所述的方法，其中在该第一酶辅因子为金属离子时，该第二酶辅因子为多核苷酸。
项目3.根据项目1所述的方法，还包括在步骤(c)之前将用于该活化的酶复合物的底物施加到该反应部分，并且其中施加该电场包括使该活化的酶复合物与该反应部分中的该底物反应以形成反应产物。
项目4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中施加该电场包括使未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子迁移出该反应部分，以将该未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子与该反应部分中的该反应产物分离。
项目5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中该第一电极为正电极并且该第一酶辅因子为带正电的，并且该第二电极为负电极并且该第二酶辅因子为带负电的。
项目6.根据项目3至5中任一项所述的方法，其中该底物是靶双链核酸。
项目7.根据项目6所述的方法，其中该靶双链核酸是双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂交体。
项目8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中该酶是转座酶，任选地其中该转座酶是Tn5转座酶。
项目9.根据项目8所述的方法，其中该第一酶辅因子包括Mg2+，任选地为Mg(OAc)2或MgCl2的形式。
项目10.根据项目8或项目9所述的方法，其中该第二酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子。
项目11.根据项目10所述的方法，其中该第二酶辅因子为两种多核苷酸转座酶衔接子的混合物，其中每种衔接子包括相同的双链转座子末端序列和不同的单链标签区域。
项目12.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，该方法包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
反应部分，该反应部分远离该第一端部并且包含转座体复合物，该转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，该多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；
(b)将靶双链核酸施加到该反应部分；
(c)在该对电极之间施加第一电场以驱使该第一转座酶辅因子从该第一部分进入该反应部分，以形成包括该转座酶、该多核苷酸转座酶衔接子和该第一转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(d)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
项目13.根据项目12所述的方法，其中该转座体复合物任选地经由链霉亲和素-生物素相互作用而固定在该反应部分中的固体载体上。
项目14.根据项目13所述的方法，包括在产生该带标签的核酸片段后从该固定载体释放该转座体复合物。
项目15.根据项目14所述的方法，还包括在驱使与从该固体载体释放的该转座体复合物结合的该带标签的核酸片段进入收集部分的步骤之后改变第一电场的大小。
项目16.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，该方法包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该转座酶；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；
(b)将靶双链核酸施加到该反应部分；
(c)在该对电极之间施加第一电场以驱使该第一转座酶辅因子从该第一部分进入该反应部分并且驱使该第二转座酶辅因子从该第二部分进入该反应部分，以形成包括该转座酶、该第一转座酶辅因子和该第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(d)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
项目17.根据项目12至16中任一项所述的方法，其中该金属离子为Mg2+，任选地为Mg(OAc)2或MgCl2的形式。
项目18.根据项目12至17中任一项所述的方法，其中该单链标签区域包括引物序列、条形码序列、唯一分子标识符(UMI)序列、扩增标签、富集标签或纯化标签中的一者或多者。
项目19.根据项目12至18中任一项所述的方法，其中该转座酶是Tn5转座酶。
项目20.根据项目16至19中任一项所述的方法，其中该转座酶固定在该反应部分内的固体载体上，任选地其中该反应部分包括孔，并且该固体载体是小珠颗粒或者该孔的表面。
项目21.根据项目12至20中任一项所述的方法，其中该靶双链核酸是双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂交体。
项目22.根据项目12至21中任一项所述的方法，其中将在步骤(c)中施加的该第一电场设定为该靶双链核酸在该电泳基质内基本上不具有电泳迁移率的值。
项目23.根据项目12至22中任一项所述的方法，其中该电泳系统包括沿该长度在该第一部分和该反应部分之间的收集部分。
项目24.根据项目23所述的方法，其中在步骤(c)中施加该第一电场包括驱使该带标签的核酸片段进入该收集部分。
项目25.根据项目23所述的方法，包括在步骤(d)之后增加该第一电场的大小以驱使该带标签的核酸片段进入该收集部分。
项目26.根据项目12至25中任一项所述的方法，包括改变该电泳凝胶基质上的该第一电场的大小或方向。
项目27.根据项目12至26中任一项所述的方法，其中该电泳系统包括：沿该宽度和该长度的附加部分，每个部分包含用于片段标签化的不同试剂；以及在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的该宽度的相对两侧的第二对正负电极。
项目28.根据项目27所述的方法，包括在第二对电极之间施加第二电场，其中该第二电场的方向垂直于在步骤(c)中施加的该第一电场的方向。
项目29.根据项目12至28中任一项所述的方法，其中施加靶双链核酸包括向该反应部分添加生物样本。
项目30.根据项目29所述的方法，其中该生物样本包括细胞裂解物。
项目31.根据项目29所述的方法，其中该生物样本包括全细胞。
项目32.根据项目12至31中任一项所述的方法，其中该电泳系统包括包含裂解试剂的第三部分，并且该反应部分包含全细胞，并且该方法还包括施加第三电场以驱使该裂解试剂进入和/或通过该反应部分以裂解该细胞，从而将该靶双链核酸施加到该样本部分。
项目33.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，该方法包括：
(a)提供电泳系统，该电泳系统包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，该第二部分包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
第三部分，该第三部分包含裂解试剂；
第四部分，该第四部分包含该转座酶；
反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间；和
第一对正负电极，该第一对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；和
第二对正负电极，该第二对正负电极布置在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的宽度的相对两侧；
(b)将包含靶双链核酸的全细胞施加到该反应部分；
(c)施加第一电场以驱使该裂解试剂进入和/或通过该反应部分以裂解该细胞，从而将该靶双链核酸施加到该样本部分；
(d)施加第二电场以驱使该第一转座酶辅因子从该第一部分进入该反应部分，驱使该第二转座酶辅因子从该第二部分进入该反应部分并且/或者驱使该转座酶从该转座酶部分进入该反应部分，以形成包括该转座酶、该第一转座酶辅因子和该第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(e)在足以片段化该靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将这些核酸片段加标签的条件下，在该反应部分中将该靶双链核酸与该活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
项目34.根据项目33所述的方法，其中该第一电场和该第二电场不同，并且步骤(c)在步骤(d)之前执行。
项目35.根据项目33所述的方法，其中该第一电场和该第二电场相同，并且步骤(c)与步骤(d)同时执行。
项目36.根据项目33至35中任一项所述的方法，包括在产生该带标签的核酸片段的文库之后施加一个或多个电场，以驱使该裂解试剂、该转座体复合物、该转座酶、该转座酶衔接子、该金属离子和该带标签的核酸片段中的一者或多者离开该反应部分。
项目37.根据项目36所述的方法，包括驱使该带标签的核酸片段进入收集部分。
项目38.根据项目36所述的方法，包括驱使该裂解试剂、该转座体复合物、该金属离子和该带标签的核酸片段离开该反应部分并且进入单独的接收部分。
项目39.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；
第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该酶的第二酶辅因子，该第二酶辅因子具有与该第一酶辅因子的电荷相反的电荷；
反应部分，该反应部分在该第一部分和该第二部分之间并且包含该酶；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。
项目40.根据项目39所述的设备，其中在该反应部分中提供了该酶的底物。
项目41.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
反应部分，该反应部分远离该第一端部并且包含转座体复合物，该转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，该多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。
项目42.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
反应部分，该反应部分在该第一端部和该第二端部之间并且包含该转座酶；和
一对正负电极，该对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处。
项目43.根据项目41或项目42所述的设备，其中在该反应部分中提供了靶核酸。
项目44.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，该电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于该第一端部和该第二端部之间的长度；
第一部分，该第一部分邻近该第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中该第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，该第二部分邻近该第二端部并且包含该转座酶的第二转座酶辅因子，该第二转座酶辅因子具有与该第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中该第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
第三部分，该第三部分包含裂解试剂；
第四部分，该第四部分包含该转座酶；
反应部分，该反应部分在该第一端部和该第二端部之间；和
第一对正负电极，该第一对正负电极分别布置在该第一端部和该第二端部处；和
第二对正负电极，该第二对正负电极布置在该第一端部或该第二端部中的一个端部处的该宽度的相对两侧。
项目45.根据项目44所述的设备，其中在该反应部分中提供了包含靶核酸的全细胞。
项目46.根据项目41至45中任一项所述的设备，包括沿该宽度和/或该长度的附加部分，每个附加部分包含用于片段标签化的不同试剂。
项目47.根据项目41至46中任一项所述的设备，包括用于接收该带标签的核酸片段的收集部分。
项目48.根据项目41至47中任一项所述的设备，包括接收未反应的试剂的一个或多个接收部分。
项目49.根据项目41至48中任一项所述的设备，其中该对正电极和负电极与该电泳凝胶基质直接接触，任选地嵌入该凝胶基质中。
项目50.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的系统，包括：
根据项目41至49中任一项所述的设备；
电源；
控制器，该控制器被配置成控制该第一电场和该第二电场的方向和/或大小，以驱使该试剂和/或该带标签的核酸片段进入和/或通过该反应部分、该收集部分和/或该接收部分。
在整个本申请中，已引用了各种公布、专利和/或专利申请。这些出版物的公开内容全文据此以引用方式并入本申请中。
上述书面说明书被认为足以使得本领域的技术人员能够实践实施方案。上述详细描述和实施例详述了某些实施方案，并且描述了发明人所设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中可能描述得多么详尽，该实施方案都可以多种方式实践，并且应当根据所附权利要求及所附权利要求的任何等同条款来解释。
如本文所用，术语“约”是指数值，包括例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。说明书或权利要求书中的每个数字可被认为是由术语“约”修饰的。术语“约”通常是指本领域的普通技术人员认为与所述值等同(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所述范围的+/-5％-10％)。当术语诸如“至少”和“约”在数值或范围的列表之前时，该术语修饰列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入到最近有效数字的数值。

Claims (27)

1.一种使用电泳执行酶促反应的方法，包括：
(a)提供电泳系统，所述电泳系统包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分邻近所述第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；
第二部分，所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述酶的第二酶辅因子，所述第二酶辅因子具有与所述第一酶辅因子的电荷相反的电荷；
反应部分，所述反应部分在所述第一部分和所述第二部分之间并且包含所述酶；和
一对正负电极，所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处；以及
(b)在所述一对电极之间施加电场以驱使所述第一酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分并且驱使所述第二酶辅因子从所述第二部分进入所述反应部分，以形成包括所述酶、所述第一酶辅因子和所述第二酶辅因子的活化的酶复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一酶辅因子为金属离子时，所述第二酶辅因子为多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括在步骤(c)之前将用于所述活化的酶复合物的底物施加到所述反应部分，并且其中施加所述电场包括使所述活化的酶复合物与所述反应部分中的所述底物反应以形成反应产物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中施加所述电场包括使未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子迁移出所述反应部分，以将所述未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子与所述反应部分中的所述反应产物分离。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一电极为正电极并且所述第一酶辅因子为带正电的，并且所述第二电极为负电极并且所述第二酶辅因子为带负电的。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述底物是靶双链核酸，任选地其中所述靶双链核酸是双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂交体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是转座酶，任选地其中所述转座酶是Tn5转座酶，并且任选地其中所述第一酶辅因子包括Mg2+，任选地为Mg(OAc)2或MgCl2的形式，并且任选地所述第二酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子。
8.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，所述方法包括：
(a)提供电泳系统，所述电泳系统包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分邻近所述第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中所述第一转座酶辅因子为金属离子；
反应部分，所述反应部分远离所述第一端部并且包含转座体复合物，所述转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，所述多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和
一对正负电极，所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处；
(b)将靶双链核酸施加到所述反应部分；
(c)在所述一对电极之间施加第一电场以驱使所述第一转座酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分，以形成包括所述转座酶、所述多核苷酸转座酶衔接子和所述第一转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(d)在足以片段化所述靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将所述核酸片段加标签的条件下，在所述反应部分中将所述靶双链核酸与所述活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述转座体复合物任选地经由链霉亲和素-生物素相互作用而固定在所述反应部分中的固体载体上。
10.根据权利要求9所述的方法，包括在产生所述带标签的核酸片段后从所述固定载体释放所述转座体复合物。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括在驱使与从所述固体载体释放的所述转座体复合物结合的所述带标签的核酸片段进入收集部分的步骤之后改变第一电场的大小。
12.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，所述方法包括：
(a)提供电泳系统，所述电泳系统包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分邻近所述第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中所述第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述转座酶的第二转座酶辅因子，所述第二转座酶辅因子具有与所述第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中所述第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
反应部分，所述反应部分在所述第一部分和所述第二部分之间并且包含所述转座酶；和
一对正负电极，所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处；
(b)将靶双链核酸施加到所述反应部分；
(c)在所述一对电极之间施加第一电场以驱使所述第一转座酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分并且驱使所述第二转座酶辅因子从所述第二部分进入所述反应部分，以形成包括所述转座酶、所述第一转座酶辅因子和所述第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(d)在足以片段化所述靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将所述核酸片段加标签的条件下，在所述反应部分中将所述靶双链核酸与所述活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述单链标签区域包括引物序列、条形码序列、唯一分子标识符(UMI)序列、扩增标签、富集标签或纯化标签中的一者或多者。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述转座酶固定在所述反应部分内的固体载体上，任选地其中所述反应部分包括孔，并且所述固体载体是小珠颗粒或者所述孔的表面。
15.根据权利要求12所述的方法，其中将在步骤(c)中施加的所述第一电场设定为所述靶双链核酸在所述电泳基质内基本上不具有电泳迁移率的值。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述电泳系统包括沿所述长度在所述第一部分和所述反应部分之间的收集部分。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤(c)中施加所述第一电场包括驱使所述带标签的核酸片段进入所述收集部分。
18.根据权利要求12所述的方法，包括改变所述电泳凝胶基质上的所述第一电场的大小或方向。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述电泳系统包括：沿所述宽度和所述长度的附加部分，每个部分包含用于片段标签化的不同试剂；以及在所述第一端部或所述第二端部中的一个端部处的所述宽度的相对两侧的第二对正负电极。
20.根据权利要求19所述的方法，包括在所述第二对电极之间施加第二电场，其中所述第二电场的方向垂直于在步骤(c)中施加的所述第一电场的方向。
21.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法，所述方法包括：
(a)提供电泳系统，所述电泳系统包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中所述第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，所述第二部分包含所述转座酶的第二转座酶辅因子，所述第二转座酶辅因子具有与所述第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中所述第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
第三部分，所述第三部分包含裂解试剂；
第四部分，所述第四部分包含所述转座酶；
反应部分，所述反应部分在所述第一部分和所述第二部分之间；和
第一对正负电极，所述第一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处；和
第二对正负电极，所述第二对正负电极布置在所述第一端部或所述第二端部中的一个端部处的所述宽度的相对两侧；
(b)将包含靶双链核酸的全细胞施加到所述反应部分；
(c)施加第一电场以驱使所述裂解试剂进入和/或通过所述反应部分以裂解所述细胞，从而将所述靶双链核酸施加到所述样本部分；
(d)施加第二电场以驱使所述第一转座酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分，驱使所述第二转座酶辅因子从所述第二部分进入所述反应部分并且/或者驱使所述转座酶从所述转座酶部分进入所述反应部分，以形成包括所述转座酶、所述第一转座酶辅因子和所述第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物；以及
(e)在足以片段化所述靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将所述核酸片段加标签的条件下，在所述反应部分中将所述靶双链核酸与所述活化的转座体复合物一起温育，从而产生带标签的核酸片段的文库。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一电场和所述第二电场不同，并且步骤(c)在步骤(d)之前执行；或者
其中所述第一电场和所述第二电场相同，并且步骤(c)与步骤(d)同时执行。
23.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分邻近所述第一端部并且包含酶的第一酶辅因子；
第二部分，所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述酶的第二酶辅因子，所述第二酶辅因子具有与所述第一酶辅因子的电荷相反的电荷；
反应部分，所述反应部分在所述第一部分和所述第二部分之间并且包含所述酶；和
一对正负电极，所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处。
24.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分邻近所述第一端部并且包含第一转座酶辅因子，其中所述第一转座酶辅因子为金属离子；
反应部分，所述反应部分远离所述第一端部并且包含转座体复合物，所述转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子，所述多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域；和
一对正负电极，所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处。
25.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部、第二端部以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分邻近所述第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中所述第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述转座酶的第二转座酶辅因子，所述第二转座酶辅因子具有与所述第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中所述第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
反应部分，所述反应部分在所述第一端部和所述第二端部之间并且包含所述转座酶；和
一对正负电极，所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处。
26.一种电泳设备，包括：
电泳凝胶基质，所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度；
第一部分，所述第一部分邻近所述第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子，其中所述第一转座酶辅因子为金属离子；
第二部分，所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述转座酶的第二转座酶辅因子，所述第二转座酶辅因子具有与所述第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷，其中所述第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子；
第三部分，所述第三部分包含裂解试剂；
第四部分，所述第四部分包含所述转座酶；
反应部分，所述反应部分在所述第一端部和所述第二端部之间；和
第一对正负电极，所述第一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处；和
第二对正负电极，所述第二对正负电极布置在所述第一端部或所述第二端部中的一个端部处的所述宽度的相对两侧。
27.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的系统，包括：
根据权利要求23至26中任一项所述的设备；
电源；
控制器，所述控制器被配置成控制所述第一电场和所述第二电场的方向和/或大小，以驱使所述试剂和/或所述带标签的核酸片段进入和/或通过所述反应部分、所述收集部分和/或所述接收部分。
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