CN111094589A - 使用水凝胶珠的dna测序 - Google Patents

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Abstract

本文提供的系统、方法和组合物涉及制备用于高通量空间索引的包封长DNA片段的珠。一些实施方案包括在珠内制备核酸文库，其中该珠包括允许试剂扩散而同时保留遗传物质的孔隙。

Description

使用水凝胶珠的DNA测序
技术领域
本文提供的系统、方法和组合物涉及水凝胶微球和将长DNA包封在水凝胶珠内的方法，其用于确定多核苷酸的序列，以及相关的文库制备。
背景技术
下一代测序仪是每次测序运行可产生大量的基因组数据的强大工具。解释和分析如此大量的数据可具有挑战性。合成测序(SBS)技术提供了高质量的测序数据。然而，短阅读片段(最大阅读片段长度为2×300bp)是当前SBS化学的一个限制。最近，为了更好地捕捉单核苷酸变异(SNP)、插入/删除和结构变体，以及改进的基因组鉴定，人们对较长DNA分子的测序越来越重视。
发明内容
本文提供的一些实施方案涉及用于进行DNA反应的水凝胶珠。在一些实施方案中，水凝胶珠包括水凝胶聚合物前体、交联剂和布置在水凝胶珠内的DNA。在一些实施方案中，该珠包括允许试剂通过该珠扩散而同时保留DNA的孔隙。在一些实施方案中，DNA是50,000碱基对更大的长DNA分子。
本文提供的一些实施方案涉及用于执行DNA测序的流动池装置。在一些实施方案中，流动池装置包括固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物包括具有可降解水凝胶沉积在其上的表面，该水凝胶包封DNA。在一些实施方案中，可降解水凝胶包含孔隙，该孔隙的大小设计为允许试剂通过水凝胶扩散，且太小而无法允许DNA穿过孔隙。
本文提供的一些实施方案涉及用于DNA测序的系统。在某些实施例中，该系统包括配置为容纳流动池装置的平台、流动池装置和用于获得测序数据的检测器。
本文提供的一些实施方案涉及DNA测序的方法。在一些实施方案中，该方法包括获得如本文所述的包封DNA的珠。在一些实施方案中，该方法包括提供本文所述的流动池装置。在一些实施方案中，该方法还包括扩增水凝胶内包封的DNA、对水凝胶内包封的DNA进行标签化反应或对DNA进行测序。在一些实施方案中，该方法还包括生成包封在水凝胶内的DNA文库。
附图说明
图1A为说明通过流动池上文库制备和接种对长DNA进行空间索引的实施方案的示意图。
图1B是说明使用包封长DNA分子的水凝胶珠的空间索引的示意图。试剂可用于水凝胶珠上以在流动池表面上空间生成文库。
图2为描绘了将长DNA包封于水凝胶珠内，并制备水凝胶珠内的文库的方法的流程图，该文库可以在流动池装置上簇集和测序。
图3是说明包封于水凝胶珠内的长DNA的DNA测序的工作流程的示意图，包括大约100kb的DNA片段(在标签化(tagmentation)之前没有多重置换扩增(MDA)步骤(图面(a))或具有MDA步骤(图面(b)))和约10-20kb的DNA片段(图面(c))。
图4为描绘没有MDA的情况下来自100kb DNA片段的长DNA水凝胶空间索引测序数据的选通阅读片段的图。
图5显示具有MDA的情况下100kb DNA片段上长DNA水凝胶空间索引的连接阅读片段(linked reads)的图。
图6显示具有MDA的情况下10kb DNA片段上长DNA水凝胶空间索引的连接阅读片段的图。
图7A和7B描绘了包封在水凝胶珠内的长DNA的空间阅读片段的线图。图7A显示了包封在水凝胶珠内的细胞的空间阅读片段，且插入小图描绘了显示水凝胶珠内的细胞的显微图。图7B显示了包封在水凝胶珠内的长DNA片段的空间阅读片段，且插入小图描绘了显示包封在珠内的片段的显微图。
图8所示的显微图显示了包封在水凝胶珠内的微生物物种的鉴别。水凝胶珠包封各种微生物物种，并且进行空间阅读测序来识别微生物。
图9所示的图显示了包封在水凝胶珠内的长DNA的条码阅读的分布。
图10A显示了显示对包封在水凝胶珠内的大肠杆菌细胞来自单次运行的短阅读片段和连接阅读片段的图。如图中所示，连接阅读片段跨越重复的区域，且可以改善从头序列组装。图10B显示了描绘空间连接阅读片段和间隙短阅读片段的显微图。
具体实施方式
在下面的详细说明中，参考了构成说明书的部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则相似的符号通常标识相似的组件。在详细说明、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以进行其他改变。容易理解的是，可以以广泛多样的不同配置来排列、替换、组合、分离和设计如本文一般地描述的以及在附图中示出的本公开的方面，所有这些在本文中明确地设想。
实施方案涉及用于将长DNA片段包封到珠中以确定DNA片段的核苷酸序列的组合物、系统和方法。这允许创建对相对长的DNA片段测序的可靠和高通量的方法，如下所述。本文描述的方法和系统涉及包封在单个珠内的长DNA片段的测序，使得能够改进基因组DNA的测序和鉴定。在一些实施方案中，该方法包括将DNA片段的样品包封于水凝胶珠内,将包封DNA片段样品的水凝胶珠加载在流动池装置上，制备文库，在流动池装置的表面上释放制备的文库，及簇集和测序释放的文库。
在一些实施方案中，制备文库包括包封的DNA的标签化。包封的DNA的标签化将较长的DNA序列切割为较短的标签化片段，其然后用于在流动池装置表面上生成DNA的簇。簇是长DNA的标签化片段的产物，其各自可以例如使用SBS测序进行测序。来自单一长DNA分子的一组簇在这里被称为长DNA岛。在一些实施方案中，单个水凝胶珠可包封单个长DNA分子或多个长DNA分子。每个长DNA分子产生一个长DNA岛。在单个水凝胶珠内的所有长DNA岛的簇在本文中称为簇云(cluster cloud)。因此，簇云代表单个水凝胶珠内的所有簇，并且可包括许多长DNA岛(每个长DNA岛代表单一长DNA分子)，且每个长DNA岛包括多个簇。
这些珠可包括在长DNA分子或者包含长DNA分子的源存在的情况下混合的水凝胶聚合物和交联剂，其然后形成包封DNA分子的水凝胶珠。在一些实施方案中，长DNA源是细胞。水凝胶珠可包含孔隙，其在将长DNA保留在所述珠内的同时允许试剂通过所述水凝胶珠扩散，从而允许反应在每个珠内发生。
一些实施方案包括使用包封长DNA的珠进行核酸反应的方法，包括例如长DNA分子的高通量空间索引。如图1A所示，长DNA分子的文库制备可以通过将来自单一长DNA分子的簇作为“簇云”簇集和接种在表面上来容易地进行，其然后可以阅读和进行空间映射。本文使用的术语“长DNA”可以包括超过300个碱基对的DNA片段。本文使用的长DNA片段指的是长度大于1kb、2.5kb、5kb或者更多的DNA，如10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500kb，或更多，包括任意两个上述值定义的范围内的量。
在不受理论约束的情况下，本文提供的方法、系统和组合包括与当前的文库制备技术相比的几个优点。例如，在一些实施方案中，该方法允许在单个珠中制备样品以用于将基因组样品片段化为一系列长DNA片段。然后，可以将该单个珠粘附在流动池上长DNA片段沉积处的一个特殊位置，从而使每个长DNA片段在流动池装置表面上彼此邻近定位。该系统然后确定每个长DNA片段的核苷酸序列。由于它们在流动池表面上彼此邻近，系统可以利用这一空间位置数据更有效地重建原始基因组DNA的最终序列。该系统可以沉积直接来自单细胞、长DNA片段或染色体的空间共定位的阅读片段。在一些实施方案中，该方法允许低输入、无PCR的文库制备工作流程。在一些实施方案中，该方法可以在不需要分子条码标记的情况下执行。在一些实施方案中，该方法允许简化工作流程的自动化。在一些实施方案中，该方法与各种核酸测定和工作流程兼容。
一些实施方案涉及制备包封长DNA的水凝胶珠的方法。在一些实施方案中，包封长DNA的水凝胶珠可用于处理细胞基因组并在珠内进行DNA文库的制备。在一些实施方案中，包封长DNA的水凝胶珠包封单细胞，其可用于处理细胞基因组DNA，并在珠内部进行全DNA文库制备。
在一些实施方案中，水凝胶珠的孔隙大小可以进行工程设计以允许酶、化学物质和较小尺寸的引物(<50bp)扩散，同时保留较大的核酸(>300bp)，使得长DNA片段和产生的DNA文库可以在处理过程中保留在水凝胶珠内部。在一些实施方案中，特异性引物可以在水凝胶珠基质内化学连接以杂交和处理特定的基因组DNA。然后来自单细胞的DNA文库可以释放到特定区域，例如在流动池表面上，用于文库接种。随后，这导致源于包封的长DNA片段的“DNA簇”在流动池上的空间分布，从而简化后处理过程中的阅读片段比对。
如本文所用，术语“试剂”描述了可用于与样品反应、相互作用、稀释或添加至样品中的试剂或者两种或更多种试剂的混合物，并且可包括用于核酸反应中的试剂，包括例如缓冲剂、化学物质、酶、聚合酶、尺寸小于50个碱基对的引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料或核酸酶。在一些实施方案中，试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。
包封遗传材料的水凝胶珠
一个实施方案包括包含水凝胶聚合物和遗传物质的珠。如本文所用，术语“水凝胶”是指当有机聚合物(天然或合成的)通过共价、离子或氢键交联以产生将水分子截留到其中的三维开放晶格结构而形成凝胶时形成的物质。在一些实施方案中，水凝胶可以是生物相容性水凝胶。如本文所用，术语“生物相容性水凝胶”是指形成对活细胞无毒并且允许氧气和营养物质充分扩散到截留的细胞以保持存活力的凝胶的聚合物。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括60-90％的流体，如水，和10-30％的聚合物。在某些实施方案中，水凝胶的水含量为约70-80％。
可以通过使亲水性生物聚合物或合成聚合物交联来制备水凝胶。因此，在一些实施方案中，水凝胶可包括交联剂。如本文所用，术语“交联剂”是指当与合适的基础单体反应时可以形成三维网络的分子。水凝胶聚合物(其可以包括一种或多种交联剂)的实例包括但不限于透明质酸、壳聚糖、琼脂、肝素、硫酸盐、纤维素、藻酸盐(包括藻酸盐硫酸盐)、胶原蛋白、葡聚糖(包括硫酸葡聚糖)、果胶、角叉菜胶、聚赖氨酸、明胶(包括A型明胶)、琼脂糖、(甲基)丙烯酸酯-低聚乳酸-PEO-低聚乳酸-(甲基)丙烯酸酯、PEO-PPO-PEO共聚物(Pluronics)、聚(磷腈)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、PL(G)A-PEO-PL(G)A共聚物、聚(乙烯亚胺)、聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。因此，例如，组合可以包括聚合物和交联剂，例如聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/聚环氧丙烷(PPO)。
在一些实施方案中，交联剂在水凝胶聚合物中形成二硫键，从而连接水凝胶聚合物。在一些实施方案中，水凝胶聚合物形成具有孔隙的水凝胶基质(例如，多孔水凝胶基质)。这些孔隙能够在水凝胶珠内保留足够大的遗传物质，例如长DNA片段，但允许小的物质(如试剂)穿过孔隙，从而进出水凝胶珠。在一些实施方案中，通过改变聚合物的浓度与交联剂的浓度的比率来精细调节孔隙大小。在一些实施方案中，聚合物与交联剂的比率为30：1、25：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20或1:30，或在由上述比率中的任何两个限定的范围内的比率。在一些实施方案中，可以将如DNA引物或带电化学基团的附加功能接枝到聚合物基质上以满足不同应用的要求。
如本文所用，术语“孔隙率”是指由开放空间(例如，孔隙或其他开口)组成的水凝胶的分数体积(无量纲)。因此，孔隙率测量材料中的空白空间，并且是空白体积相对于总体积的分数，为0到100％(或0到1)之间的百分比。水凝胶的孔隙率可在0.5至0.99，约0.75至约0.99或约0.8至约0.95的范围内。
水凝胶可以具有任何孔隙大小。如本文所用，术语“孔隙大小”是指孔隙的横截面的直径或有效直径。术语“孔隙大小”还可以指基于多个孔隙的测量值的孔隙横截面的平均直径或平均有效直径。非圆形的横截面的有效直径等于具有与该非圆形横截面相同的横截面积的圆形横截面的直径。在一些实施方案中，当水凝胶水化时，水凝胶可溶胀。孔隙大小的尺寸然后可以根据水凝胶中的水含量而改变。在一些实施方案中，水凝胶的孔隙可具有足够大小的孔以将遗传物质保留在水凝胶内但允许试剂通过。
在一些实施方案中，交联剂是可逆交联剂。在一些实施方案中，可逆交联剂能够使水凝胶聚合物可逆地交联，并且能够在切割剂(cleaver)存在下解交联。在一些实施方案中，交联剂可以通过还原剂的存在、通过升高的温度或通过电场来切割。在一些实施方案中，可逆交联剂可以是N,N’-双(丙烯酰基)胱胺，一种聚丙烯酰胺凝胶的可逆交联剂，其中二硫键可以在合适的还原剂存在下断裂。在一些实施方案中，使交联剂与还原剂接触切割交联剂的二硫键，从而破坏水凝胶珠。水凝胶珠降解并释放内容物，例如保留在其中的核酸。在一些实施方案中，交联剂通过将温度升高至大于50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃来切割。在一些实施方案中，交联剂通过使水凝胶珠与还原剂接触来切割。在一些实施方案中，还原剂包括膦化合物、水溶性膦、含氮膦及其盐和衍生物、二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)(分别2,3-二羟基-1,4-二硫代丁烷的顺式和反式异构体)、2-巯基乙醇或β-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙醇或氨基乙硫醇、谷胱甘肽、巯基乙醇酸盐或巯基乙醇酸、2,3-二巯基丙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THP)或对-[三(羟甲基)膦]丙酸(THPP)。
在一些实施方案中，升高温度以增加扩散或与还原剂的接触使交联剂降解，从而包封的遗传物质从水凝胶珠释放。
在一些实施方案中，交联剂的交联在水凝胶珠内建立孔隙。在一些实施方案中，水凝胶珠中孔隙的大小是可调节的，并且被配制为包封遗传物质，例如大于约5000个碱基对的DNA片段，但是允许较小的颗粒(如试剂)或少于约50个碱基对的较小尺寸的核酸(例如引物)通过孔隙，如图1B所示。在一些实施方案中，试剂包括用于处理遗传物质的试剂，例如用于从细胞分离核酸、用于扩增、条码化或测序核酸或用于制备核酸文库的试剂。在一些实施方案中，试剂包括例如溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂或二价阳离子。
在一些实施方案中，长DNA包括基因组DNA、病毒核酸、细菌核酸或哺乳动物核酸。在一些实施方案中，水凝胶珠包括长DNA的来源，包括例如细胞。在一些实施方案中，细胞是单细胞，包括原核或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞。因此，如图7A和7B所示，该方法可在长DNA片段或细胞上进行，其任一或两方被水凝胶包封。
制备珠的方法
本文提供的一些实施方案涉及制备包封长DNA片段的珠的方法。在一些实施方案中，水凝胶珠通过涡旋辅助乳化制备。如本文所用，涡旋辅助乳化是指水凝胶聚合物与长DNA片段或长DNA片段的来源在容器中(例如在管、小瓶或反应容器中)的涡旋。组分可以例如通过手动或机械涡旋或摇动来混合。在一些实施方案中，手动混合导致大小为2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150μm直径大小，或者在上述任意两个值定义的范围内的大小的包封遗传物质的水凝胶珠。在一些实施方案中，珠的尺寸是不均匀的，因此珠的尺寸包括各种直径的珠。
在一些实施方案中，珠通过微流体液滴发生制备。如图1B所示，微流体液滴发生包括使用用于辅助凝胶乳液生成的微流体装置。在一些实施方案中，微流体装置包括微通道，其配置成产生期望大小的水凝胶珠，并配置成每个珠包封选择量的遗传物质。在一些实施方案中，微流体装置具有50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm的高度，或由上述任意两个值定义的范围内的高度。在一些实施方案中，微流体装置包括一个或多个通道。在一些实施方案中，微流体装置包括用于水性流的通道和用于不混溶流体的通道。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是相同的。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是不同的。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、135、140、145或150μm，或者在上述任意两个值定义的范围内的宽度。在一些实施方式中，水相通道的宽度为75μm。在一些实施方案中，不混溶流体通道的宽度是78μm。本领域技术人员将认识到，宽度可以变化以精细地调节珠的尺寸。除了微流体装置的尺寸和通道的宽度之外，水相通道和不混溶流体通道的流速也可能影响水凝胶珠的大小。
在一些实施方案中，在水相通道中溶液的流速为1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μL/min，或在上述任意两个值定义的范围内的速率。在一些实施方案中，不混溶流体通道中不混溶流体的流速为20、30、50、80、100、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375或400μL/min，或在上述任意两个值定义的范围内的速率。在一些实施方案中，水相中的溶液包括水凝胶聚合物、交联剂和遗传物质，其以小于不混溶流体的流速通过水相通道流入不混溶流体如载体油中，从而形成小滴。在一些实施方案中，不混溶流体是油，例如矿物油、烃油、硅油或聚二甲基硅氧烷油，或其混合物。在一些实施方案中，将含有遗传物质的水凝胶小滴配制成均匀的尺寸分布。在一些实施方案中，通过调节微流体装置的尺寸、一个或多个通道的尺寸或者水溶液或不混溶流体中任一个或两者的流速来精细调节水凝胶珠的尺寸。在一些实施方案中，所得水凝胶珠的直径范围为2-150μm，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150μm，或者在上述任意两个定义的范围内的直径。
在一些实施方案中，包封遗传物质的水凝胶珠的大小和均匀性可以通过在珠形成之前使水凝胶聚合物与流体改性剂例如与醇(包括异丙醇)接触来进一步控制。
在一些实施方案中，可通过稀释或浓缩输入样品中的长DNA片段来控制珠内包封的长DNA片段的量。如本文所述，包括长DNA片段的样品与水凝胶聚合物混合，并且包含长DNA片段的水凝胶聚合物进行涡旋辅助乳化或微流体液滴发生。
在一些实施方案中，水凝胶珠用核苷酸功能化。在一些实施方案中，核苷酸是寡核苷酸或聚T核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸与水凝胶珠结合，并且功能化的珠可用于目的核苷酸的靶向捕获。
处理水凝胶珠内的长DNA片段的方法
一些实施方案包括如图2所示的处理珠内的长DNA片段的方法，该图描述了制备和处理水凝胶珠内的长DNA分子的流程图。在第一步骤中，DNA样品(例如来自基因组数据或细胞)包封在水凝胶珠内。在一些实施方案中，长DNA片段保留在水凝胶珠内，并且试剂能够穿过水凝胶珠的孔隙。在一些实施方案中，试剂可包括裂解剂、核酸纯化剂、标签化剂、PCR剂或用于长DNA片段处理的其他试剂。因此，水凝胶珠通过允许试剂进入和流出水凝胶珠的屏障而同时将长DNA片段本身保留在珠内提供了水凝胶珠内长DNA片段的受控反应的微环境。一旦DNA被包封到珠中，该过程就进行到下一个步骤，其中样品可以加载到流动池中以通过文库制备过程产生长DNA片段。
如本文所用，术语“标签化”是指通过包含与含有转座子末端序列的接头复合的转座酶的转座体复合物对DNA的修饰。标签化同时导致DNA的片段化和接头与双链体片段的两条链的5'末端的连接。在去除转座酶的纯化步骤之后，另外的序列可以添加至衔接的片段的末端，例如通过PCR、连接或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法。
在一些实施方案中，整个DNA文库的制备可以通过穿过多孔水凝胶的多个试剂交换而同时将gDNA及其文库产物保留在水凝胶基质中在与流动池结合的水凝胶珠内部无缝地完成。水凝胶可耐受高达95℃的高温达数小时，以支持不同的生化反应。
在该方法的下一步骤中，处理来自先前文库制备的包封长DNA片段的水凝胶珠以从珠释放、纯化和分离长DNA片段。因此，例如，水凝胶珠与裂解缓冲液接触。如本文所用，“裂解”是指对细胞壁或病毒颗粒的扰动或改变，从而有助于接近或释放细胞RNA或DNA。细胞壁的完全破坏或破裂都不是裂解的基本要求。术语“裂解缓冲液”是指包含至少一种裂解剂的缓冲液。典型的酶促裂解剂包括但不限于溶菌酶、葡萄糖酶、消解糖、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E及病毒内溶素和外溶素。因此，例如，可通过将裂解剂如溶菌酶和蛋白酶K引入水凝胶珠中来进行珠中细胞的裂解。来自细胞的gDNA现在包含在珠内。在一些实施方案中，在裂解处理后，分离的核酸保留在水凝胶珠内，并且可以用于进一步处理。
如本文所用，除非另有说明，本文所用的术语“分离的”、“待分离”、“分离”、“纯化的”、“待纯化”、“纯化”及其语法等同术语是指减少来自样品或来自材料从其分离的来源(例如，细胞)的至少一种污染物(例如蛋白质和/或核酸序列)的量。因此，纯化导致“富集”，例如，样品中所需蛋白质和/或核酸序列的量增加。
在一些实施方案中，包封的核酸在水凝胶珠内全部或部分测序。可以根据任何合适的测序方法，如直接测序，包括合成测序、连接测序、杂交测序、纳米孔测序等，对包封的核酸进行测序。
本文提供的一些实施方案涉及对长DNA片段能够实现的合成测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如靶核酸或其扩增子)的延伸以确定模板中核苷酸的序列。基础的化学过程可以是聚合反应(例如，通过聚合酶催化的)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，将荧光标记的核苷酸以模板依赖的方式添加到引物上(从而延伸引物)，使得添加到引物上的核苷酸的顺序和类型的检测可以用于确定模板的序列。
一种或多种扩增的包封核酸可以进行SBS或其他检测技术(其涉及试剂在循环中的重复递送)。例如，为了启动第一SBS循环，一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以流入/通过容纳一个或多个扩增的核酸分子的水凝胶珠。可以检测引物延伸导致标记的核苷酸掺入的那些位点。任选地，核苷酸可以进一步包括可逆的终止性质，其在核苷酸添加到引物中时，终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物，使得随后的延伸不能发生直到解封闭剂(deblocking agent)被递送以除去该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，解封闭剂可以递送至流动池(在检测发生之前或之后)。可以在各个递送步骤之间进行洗涤。然后该循环可以重复n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可以容易地适应于与通过本公开的方法产生的扩增子一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台描述于例如Bentley等人，Nature 456：53-59(2008)，WO 04/018497；美国专利号7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；美国专利号7,329,492；美国专利号7,211,414；美国专利号7,315,019；美国专利号7,405,281和US 2008/0108082中，其各自通过引用并入本文。
可以使用利用循环反应的其他测序程序，例如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测无机焦磷酸(PPi)的释放，因为特定的核苷酸被掺入了新生的核酸链中(Ronaghi等人，Analytical Biochemistry 242(1)，84-9(1996)；Ronaghi，Genome Res.11(1)，3-11(2001)；Ronaghi等人Science 281(5375)，363(1998)；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其各自通过引用引入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)而进行检测，并且可以通过荧光素酶产生的光子来检测所产生的ATP的水平。因此，可以通过发光检测系统监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源对于焦测序过程不是必需的。可以适用于将焦磷酸测序应用于根据本公开产生的扩增子的有用的流体系统、检测器和程序在例如WIPO专利申请序列号PCT/US11/57111，US 2005/0191698 A1，美国专利号7,595,883和美国专利号7,244,559中描述，其每个通过引用并入本文。
一些实施方案可以利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶和γ-磷酸酯标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用，或利用零模波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂描述于例如Levene等人Science 299，682-686(2003)；Lundquist等人Opt.Lett.33，1026-1028(2008)；Korlach等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105，1176-1181(2008)中，其公开内容通过引用并入本文。
一些SBS实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子。例如，基于释放质子的检测的测序可以使用可商购的电检测器和相关技术。这样的测序系统的实例是焦磷酸测序(例如，Roche子公司454Life Sciences的可商购平台)、使用γ-磷酸酯标记的核苷酸的测序(例如，Pacific Biosciences的可商购平台)和使用质子检测的测序(例如，来自Life Technologies的子公司Ion Torrent的可商购平台)或者US 2009/0026082 A1；US2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1中描述的测序方法和系统，其每一个通过引用并入本文。本文阐述的使用动力学排除来扩增靶核酸的方法可以容易地应用于用于检测质子的基质。更具体地，本文阐述的方法可以用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
另一种测序技术是纳米孔测序(参见，例如，Deamer等人Trends Biotechnol.18，147-151(2000)；Deamer等人Acc.Chem.Res.35：817-825(2002)；Li等人.Nat.Mater.2：611-615(2003)，其公开内容通过引用并入本文)。在一些纳米孔实施方案中，靶核酸或从靶核酸去除的单个核苷酸穿过纳米孔。随着核酸或核苷酸穿过纳米孔，每种核苷酸类型可以通过测量孔的电导率的波动来识别。(美国专利号7,001,792；Soni等人，Clin.Chem.53，1996-2001(2007)；Healy，Nanomed.2，459-481(2007)；Cockroft等人，J.Am.Chem.Soc.130，818-820(2008)，其公开内容通过引用并入本文)。
根据本公开可应用于检测的基于阵列的表达和基因型分析的示例性方法描述于美国专利号7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或者美国专利公开号2005/0053980 A1；2009/0186349 A1或US 2005/0181440 A1中，其各自通过引用合并在此。
在本文所述的分离核酸、扩增和测序的方法中，各种试剂用于核酸分离和制备。这样的试剂可以包括例如溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。这些试剂穿过水凝胶珠的孔隙，而长DNA片段保留在水凝胶珠内。本文阐述的方法的优点在于它们提供了用于水凝胶珠内核酸的处理的包封微环境。这使得能够进行单细胞处理以快速和有效地处理靶核酸。
接头可以包括测序引物位点、扩增引物位点和索引。如本文所用，“索引”可以包括可用作分子标识和/或条码以标记核酸和/或鉴别核酸来源的核苷酸序列。在一些实施方案中，索引可用于鉴定单个核酸或核酸的亚群。在一些实施方案中，可以在水凝胶珠粒内制备核酸文库。在一些实施方案中，包封在水凝胶珠粒内的单细胞可用于单细胞的组合索引，例如使用邻近性保留转座(CPTSeq)方法。在一些实施方案中，来自单细胞的DNA可以通过在WGA扩增后用带有条码化转座子的另一珠包封单细胞，并通过使其与还原剂接触来溶解凝胶基质(例如)以释放用于条码化的基因组DNA而进行条码化。
本文所述的“空间索引”方法和技术的实施方案缩短了数据分析，并简化了从单细胞和长DNA分子制备文库的过程。现有的单细胞测序的方案要求细胞的有效物理分离，并对每个分离的细胞唯一地条码化和然后将其所有汇集在一起进行测序。当前的用于合成长阅读片段的方案也需要繁琐的条码化步骤，和将每个条码化片段合并在一起进行测序并进行数据分析以区分来自每个条码化细胞的遗传信息。在这些长的过程中，还存在长DNA片段的损失，其导致序列的放弃。本文描述的实施方案不仅缩短了该过程，而且提高了单细胞的数据分辨率。此外，本文提供的实施方案简化了新生物体的基因组的组装。本文所述的实施方案可用于揭示罕见的遗传变异和突变的共现。在一些实施方案中，局限在水凝胶珠粒中直至释放的DNA文库提供了通过控制释放过程和水凝胶制剂来控制在表面上释放的片段大小的机会。
在一些实施方案中，表面是流动池装置。在一些实施方案中，流动池是具有孔、槽或图案的定制流动池装置。在一些实施方案中，流动池包括图案化表面。在一些实施方案中，图案化包括孔。在一些实施方案中，孔直径为约10μm到约50μm，如10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm或上述任意两个值定义的范围内的直径，且其中孔深度为约0.5μm到约1μm，如0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm，或上述任意两个值定义的范围内的深度。在一些实施方案中，孔由疏水性材料组成。在某些实施例中，疏水性材料包括无定形含氟聚合物，如CYTOP、
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在一些实施方案中，文库可使用接头序列中的引物位点来扩增，并使用接头序列中的测序引物位点进行测序。在一些实施方案中，接头序列可以包括索引以鉴别核酸的来源。后续扩增步骤的效率可以通过形成引物二聚体降低。为了提高后续扩增步骤的效率，可以从连接产物除去非连接的单链接头。
用水凝胶珠制备核酸文库
本文提供的系统、方法和组合物的一些实施方案包括其中接头与靶核酸连接的方法。接头可包括测序引物结合位点、扩增引物结合位点和索引。例如，接头可以包括P5序列、P7序列或其互补序列。如本文所用，P5序列包含由SEQ ID NO：1(AATGATACGGCGACCACCGA)定义的序列，和P7序列包含由SEQ ID NO：2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)定义的序列。在一些实施方案中，P5或P7序列可以进一步包括间隔区多核苷酸，其可以是1至20个核苷酸，例如1至15个核苷酸，或1至10个核苷酸，例如长度2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区包含10个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区是聚T间隔子，例如10T间隔子。间隔区核苷酸可被包括在多核苷酸的5'端，其可通过与多核苷酸的5'端的键附接至合适的支持物。可以通过存在于多核苷酸5'端的含硫亲核试剂如硫代磷酸酯来实现附接。在一些实施方案中，多核苷酸包括聚T间隔子和5'硫代磷酸酯基团。因此，在一些实施方案中，P5序列是5′硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3′，并且在一些实施方案中，P7序列是5′硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′。
索引可用于鉴别核酸分子的来源。在一些实施方案中，可以修饰接头以防止形成串接体，例如通过添加防止接头在一端或两端延伸的封闭基团。3'封闭基团的实例包括3'-间隔区C3、双脱氧核苷酸和与基质的附接。5'封闭基团的实例包括去磷酸化的5'核苷酸和与基质的附接。
接头包括核酸，例如单链核酸。接头可包括长度小于、大于或等于约5个核苷酸、10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸，或前述大小中任何两个之间的范围的短核酸。在一些实施方案中，接头具有足够的大小以穿过水凝胶珠的孔隙。靶核酸包括DNA，如基因组或cDNA；RNA，如mRNA、sRNA或rRNA；或者DNA和RNA的杂合体。可以从包封在水凝胶珠粒内的单细胞分离核酸。核酸可以包含磷酸二酯键，并且可以包括其他类型的骨架，包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺和肽核酸骨架和键。核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和碱基类似物，如硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)和硝基吲哚(包括5-硝基吲哚))的任何组合。在一些实施方案中，核酸可包含至少一个混杂碱基。混杂碱基可以与一种以上不同类型的碱基进行碱基配对，并且例如当包含在寡核苷酸引物或用于在复杂核酸样品(例如基因组DNA样品)中的随机杂交的插入序列中时，可以是有用的。混杂碱基的一个例子包括可与腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶配对的肌苷。其他实例包括次黄嘌呤、5-硝基吲哚、无环的5-硝基吲哚、4-硝基吡唑、4-硝基咪唑和3-硝基吡咯。可以使用可以与至少两种、三种、四种或更多种类型的碱基配对的混杂碱基。
一种示例方法包括使靶核酸的5'端脱磷酸以防止在随后的连接步骤中形成串接体；使用连接酶将第一接头连接至去磷酸化靶标的3'端，其中第一接头的3'端被封闭；使连接的靶标的5'端重新磷酸化；使用单链连接酶将第二接头连接至脱磷酸靶标的5'端，其中第二接头的5'端是非磷酸化的。
另一个例子包括用5'核酸外切酶部分消化核酸以形成具有单链3'突出端的双链核酸。可以将含有3'封闭基团的接头连接到具有3'突出端的双链核酸的3'端。具有3'突出端与连接的接头的双链核酸可以去杂交以形成单链核酸。可以将含有非磷酸化5'端的接头连接至单链核酸的5'端。
使核酸例如核酸的5'核苷酸脱磷酸的方法包括使核酸与磷酸酶接触。磷酸酶的例子包括小牛肠磷酸酶、虾碱性磷酸酶、南极磷酸酶和APEX碱性磷酸酶(Epicentre)。
连接核酸的方法包括使核酸与连接酶接触。连接酶的实例包括T4 RNA连接酶1、T4RNA连接酶2、RtcB连接酶、甲烷杆菌RNA连接酶和TS2126 RNA连接酶(CIRCLIGASE)。
使核酸例如核酸的5'核苷酸磷酸化的方法包括使核酸与激酶接触。激酶的实例包括T4多核苷酸激酶。
本文提供的实施方案涉及在水凝胶珠中制备核酸文库，使得核酸文库在单个反应体积中制备。
本文提供的系统和方法的实施方案包括试剂盒，其包含用于制备包封长DNA片段的水凝胶珠的水凝胶聚合物、交联剂或微流体装置中的任何一种或多种，并且还包括用于长DNA片段处理的组分，包括用于细胞裂解、核酸扩增和测序或用于核酸文库制备的试剂，包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子，如本文所述且用于长DNA片段的相应处理。
实施例
实施例1—水凝胶珠粒的制备
以下实施例说明了使用微流体液滴发生器制备包封长DNA片段的水凝胶珠的实施方案。
使用液滴发生器生成水凝胶珠。将含有长DNA片段的样品与聚合物前体混合，然后将混合物加载到料盒上的样品储器中。在2分钟内，从每个通道(每个料盒8个通道用于8个独立样品处理)生成约5万个含有长DNA的水凝胶珠。长DNA水凝胶珠加载到流动池上，其中水凝胶珠被卡在内部(100μm高通道和120μm水凝胶珠直径)用于无手动(hands-free)文库制备。Nextera酶和试剂与流动池接触，从而接触嵌入水凝胶珠内的长DNA，形成文库。然后文库接种到流动池上。在文库接种过程中，加载油以填充珠与流动池之间的空隙，并加热流动池以加速文库的扩散。在油存在的情况下，接种密切靠近每个水凝胶珠的足迹(对于直径120μm的水凝胶珠，文库接种限于约120μm直径的区域)发生。
长DNA分子被加载并截留在水凝胶珠(直径约120μm)中，并直接对嵌入在水凝胶珠内部的这些长DNA分子进行文库制备。因此，来自特定长DNA分子的所有DNA文库储存在相同的水凝胶珠内。然后将文库从水凝胶珠释放到流动池表面以将它们作为一组接种在流动池表面上。从长DNA分子释放的簇在流动池上一起组合为“簇斑块”。来自单一长DNA分子的单个斑块内部的簇以更高的准确性和更少的支架缺口(scaffolding gap)简化基因组的重建。
实施例2—长DNA空间索引
以下实施例说明了在有或没有MDA的情况下，包封在水凝胶珠内的100kb的长DNA片段的选通阅读片段的实施方案。
水凝胶珠通过在约100kb的Corriell基因组DNA的存在下混合聚合物，并使用微滴发生器形成水凝胶珠来制备。通过将形成的包封DNA片段的水凝胶珠放置在流动池装置上并使流动池与试剂接触，对DNA进行空间索引测序。未进行MDA。珠被降解并在流动池装置上形成簇。如图5所示，每个长DNA岛的平均簇数为约33个，平均长DNA岛大小为64000个碱基对，且每个珠子有约405个长DNA岛。
通过在约100kb的Corriell基因组DNA存在下混合聚合物，并使用微滴发生器形成水凝胶珠来制备第二组水凝胶珠。通过将形成的包封DNA片段的水凝胶珠放置在流动池装置上并使流动池与试剂接触，对DNA进行空间索引测序。在标签化之前进行MDA。珠降解，并在流动池装置上形成簇。如图6所示，每个长DNA岛的平均簇数增加到约85个，平均长DNA岛大小为58000个碱基对，且每个珠有大约166个长DNA岛。
通过在约10kb的Corriell基因组DNA存在下混合聚合物，并使用微滴发生器形成水凝胶珠来制备第三组水凝胶珠。通过将形成的包封DNA片段的水凝胶珠放置在流动池装置上并使流动池与试剂接触，对DNA进行空间索引测序。在标签化之前进行MDA。珠降解，并在流动池装置上形成簇。如图7所示，每个长DNA岛的平均簇数为约57，平均长DNA岛大小为10461个碱基对，且每个珠有约85个长DNA岛。
实施例3—微生物物种的复杂混合物的宏基因组学
以下的实施例说明鉴定包封在水凝胶内的单细胞微生物的实施方案。
如本文所述，使用微流体微滴发生器制备水凝胶珠。将聚合物材料与包含多种微生物的样品混合，所述微生物包括格氏乳杆菌(L.gasseri)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、普通拟杆菌(B.vulgatus)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、无乳链球菌(S.agalactiae)和痤疮丙酸杆菌(P.acnes)。然后将包封的细胞裂解并进行文库制备，此时水凝胶珠被降解并且文库沉积在表面上。如图9所示，由于其在流动池装置上的空间区室化，因此每种微生物能够被鉴别。因此，包封和随后的核酸反应使得能够在微型宏基因组学测定中使用阅读片段区室化来对复杂混合物中的微生物物种进行菌株级鉴定。
实施例4—流动池上空间索引
以下的实施例显示了用于流动池上空间索引的实施方案。
获得流动池装置并用200μl PR2洗涤。用于处理的珠也用PR2洗涤。在PR2中制备稀释的水凝胶。稀释度增加导致水凝胶之间的间距增加。将水凝胶嵌入到流动池上，并避免气泡引入到流动池中。200μl PR2流过流动池以确保珠保持固定以通过整个过程。100μl RSB流过流动池。
通过混合25μl标签化试剂、23μl RSB和2μl酶制备标签化混合物。将标签化混合物引入到窄通道以在入口去除任何可能的气泡。然后将标签化混合物缓慢地流动到入口。将流动池密封，并在55℃下孵育10分钟。
终止缓冲液混合物通过混合25μl标签化缓冲液、25μl RSB和10μl终止缓冲溶液制备。终止缓冲液混合物缓慢流到流动池上而不引入任何气泡，并在室温下孵育5分钟。孵育后，200μl PR2流过该装置。
通过175μl RSB与75μl NPM混合制备NPM。将NPM混合物缓慢地流动到流动池装置上而不引入任何气泡，并在室温下孵育3分钟。将200μl含表面活性剂的油流动到流动池装置上。显微照片显示，水凝胶被NPM混合物和油包围。将流动池密封，并在72℃下孵育3min用于缺口填充反应。
20–30μl含表面活性剂的油和含DTT的油(29/2比率)流动到流动池装置上，且装置密封。起始温度释放过程为：90℃3分钟，60℃5分钟，40℃2分钟，20℃2分钟。用400μl PR2和200μl CLM洗涤流动池。然后用400μl PR2洗涤流动池。在需要phix接种的情况下，制备浓度2-3pM的Phix，且将phix文库流动到装置上，并在室温下孵育5分钟。流动池用200μl PR2洗涤。用于第一次延伸的100-200μl AMX流过，并在50℃下孵育5分钟。用PR2洗涤流动池，并进行24或30个循环的扩增。
本文所述的实施方案、实施例和附图提供了在从裂解到文库生成的过程中用于将长DNA片段保留在物理限制的空间中的组合物、方法和系统。一些实施方案提供了在限制空间中用于在流动池的表面上释放的源自单一长DNA分子或单个细胞的文库。一旦来自单个隔室中的单DNA分子或单细胞的文库释放到流动池的表面，每个隔室中的文库彼此紧密接近地接种。
如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“以……为特征”同义，并且是包括性的或开放性的，且不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。
上面的描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于进行方法和材料的改变，以及制造方法和设备的变化。通过考虑本公开或本文公开的本发明的实践，这样的修改对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，无意将本发明限制于本文公开的特定实施方案，而是其涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代方式。
本文引用的所有参考文献，包括但不限于公开和未公开的申请、专利和参考文献，均通过引用全文并入本文，并因此成为本说明书的一部分。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中所包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
Figure IDA0002347996710000011
Figure IDA0002347996710000021

Claims (33)

1.一种用于进行DNA反应的水凝胶珠，其包含:
水凝胶聚合物前体；
交联剂；以及
布置在所述水凝胶珠内的DNA，其中所述珠包含允许试剂通过所述珠扩散而同时保留所述DNA的孔隙。
2.如权利要求1所述的珠，其中所述珠的直径为约50μm至约150μm。
3.如权利要求1-2中任一项所述的珠，其中所述水凝胶聚合物包含聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)、PEG/聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素或胶原蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的珠，其中所述交联剂包含双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯。
5.如权利要求1-4中任一项所述的珠，其中所述DNA是50000个碱基对或更大的长DNA分子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的珠，其中所述试剂包括酶、化学物质和小于50个碱基对的引物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的珠，其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。
8.一种用于执行DNA测序的流动池装置，其包括:
包括表面的固体支持物，包封DNA的可降解水凝胶沉积在该表面上，其中所述可降解水凝胶包含孔隙，该孔隙的大小设计为允许试剂通过所述水凝胶扩散，但太小而无法允许DNA穿过所述孔隙。
9.如权利要求8所述的流动池装置,其中所述固体支持物用表面聚合物功能化。
10.如权利要求9所述的流动池装置，其中所述表面聚合物为聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)或无硅烷丙烯酰胺(SFA)。
11.如权利要求8-10中任一项所述的流动池装置，其中所述流动池包括图案化表面。
12.如权利要求11所述的流动池装置，其中所述图案化表面包括孔。
13.如权利要求12所述的流动池装置，其中所述孔直径为约10μm到约50μm，如直径为10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm，或上述任意两个值定义的范围内的直径，且其中所述孔深度为约0.5μm到约1μm，如深度为0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm，或上述任意两个值定义的范围内的深度。
14.如权利要求11-12中任一项所述的流动池装置，其中所述孔由疏水性材料组成。
15.如权利要求14所述的流动池装置，其中所述疏水性材料包括无定形含氟聚合物，如CYTOP、
Figure FDA0002414141460000021
或
Figure FDA0002414141460000022
16.如权利要求8-15中任一项所述的流动池装置，其中所述可降解水凝胶为水凝胶珠或水凝胶层。
17.如权利要求16所述的流动池装置，其中所述水凝胶珠的直径为约50μm至约150μm。
18.如权利要求8-17中任一项所述的流动池装置，其中所述水凝胶包含聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或其组合或混合物。
19.如权利要求18所述的流动池装置，其中所述水凝胶包含PEG-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N′-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/PPO。
20.如权利要求8-19中任一项所述的流动池装置，其中所述DNA是50000个碱基对或更大的长DNA分子。
21.如权利要求8-20中任一项所述的流动池装置，其中所述试剂包括酶、化学物质和小于50个碱基对的引物。
22.如权利要求8-21中任一项所述的流动池装置，其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。
23.一种用于DNA测序的系统，其包括:
配置成容纳如权利要求8-22中任一项所述的流动池装置的平台；
如权利要求8-22中任一项所述的流动池装置；以及
用于获得测序数据的检测器。
24.一种DNA测序的方法，其包括:
获得如权利要求1-7中任一项所述的包封DNA的珠，或提供如权利要求8-23中任一项所述的流动池装置；
扩增包封在所述水凝胶内的DNA；
对包封在所述水凝胶内的DNA进行标签化反应；以及
对所述DNA进行测序，
从而产生包封在所述水凝胶内的DNA文库。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述DNA是50000个碱基对或更大的长DNA分子。
26.如权利要求24-25中任一项所述的方法，进一步包括在进行所述标签化反应之前对包封在所述水凝胶内的DNA进行DNA扩增反应。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述DNA扩增反应包括多重置换扩增(MDA)。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述标签化反应包括使遗传物质接触转座酶混合物，该转座酶混合物包含接头序列和转座体。
29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，进一步包括在固体支持物上接种所述DNA文库。
30.如权利要求29所述的方法，其中接种包括裂解水凝胶以从所述水凝胶释放所述DNA文库。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述水凝胶通过使所述水凝胶与裂解混合物接触或通过将所述水凝胶加热到约90℃来裂解以释放所述DNA文库。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述裂解混合物包含二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羟丙基)膦(THP)。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是流动池装置。
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