TW202043486A - 定序套組 - Google Patents

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TW202043486A
TW202043486A TW109102492A TW109102492A TW202043486A TW 202043486 A TW202043486 A TW 202043486A TW 109102492 A TW109102492 A TW 109102492A TW 109102492 A TW109102492 A TW 109102492A TW 202043486 A TW202043486 A TW 202043486A
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錫君 陳
吳怡萱
泰倫 庫瑪 庫拉娜
梁梁 羌
安德魯 普萊斯
伊麗莎貝 羅薩斯
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美商伊路米納有限公司
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Abstract

本發明提供一種定序套組之實例，該定序套組包括流體槽、囊封基質前驅體組成物及自由基引發劑。該流體槽包括複數個腔室及附著於該複數個腔室中之每一者內的引子。該囊封基質前驅體組成物由流體、包括自由基產生及鏈伸長官能基之單體或聚合物、自由基源及交聯劑組成。該自由基引發劑為囊封基質前驅體組成物之一部分或為單獨組分。

Description

定序套組
存在多種方法及應用，其需要自雙股DNA（dsDNA）目標分子產生片段化且經標記之DNA分子庫。通常，目的為自較大dsDNA分子產生較小DNA分子（例如DNA片段）以用作DNA定序反應中之模板。模板可使得能夠獲得短讀段長度。在資料分析期間，可對準重疊短序列讀段以重構較長核酸序列。在一些情況下，預定序步驟（諸如特定核酸分子之條碼）可用於簡化資料分析。
本文所揭示之第一態樣為一種定序套組，其包含：流體槽，其包括：複數個腔室；及附著於複數個腔室中之每一者內的引子；囊封基質前驅體組成物，其由以下者組成：流體；包括自由基產生及鏈伸長官能基之單體或聚合物；自由基源；及交聯劑；及作為囊封基質前驅體組成物之一部分或作為單獨組分之自由基引發劑。
在第一態樣之一實例中，下述者中的一者：單體選自由以下者組成之群：丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、二丙烯酸酯、二烯丙胺、三烯丙胺、二乙烯碸、乙二醇二烯丙醚、乙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化二丙烯酸三羥甲酯、乙氧基化新戊四醇四丙烯酸酯、膠原蛋白單體及其組合；或聚合物選自由以下者組成之群：聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯基磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸及其組合；或單體及聚合物之任何組合一起使用。
在第一態樣之一實例中，聚合物包括第一聚合物及第二聚合物；第一聚合物選自由以下者組成之群：聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯基磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸及其組合；及第二聚合物選自由以下者組成之群：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯（alginate sulfate）、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合。
在第一態樣之一實例中，自由基引發劑為四甲基乙二胺。
在第一態樣之一實例中，自由基引發劑為光引發劑且包括於囊封基質前驅體組成物中。
在第一態樣之一實例中，自由基源選自由以下者組成之群：過硫酸鉀、過硫酸銨、4,4'-偶氮雙(4-氰戊酸)、1,1'-偶氮雙(環己烷甲腈)、偶氮二異丁腈、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、過氧化物、核黃素、3-(二甲胺基)丙腈及其組合。
在第一態樣之一實例中，交聯劑選自由以下者組成之群：丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、1,4-二丙烯醯哌
Figure 109102492-A0304-12-0000-4
（1,4-diacroylpiperazine）、N-N' -二烯丙基L-酒石二醯胺（N-N’ -diallyl L-tartardiamide）及N-N' -(1,2-二羥基伸乙基)-雙丙烯醯胺。
在第一態樣之一實例中，各腔室具有底表面，且引子跨越底表面附著於聚合物層。
在第一態樣之一實例中，各腔室具有底表面，且其中引子分別附著於定位於底表面上之複數個空間上分離之聚合物島狀物。
在第一態樣之一實例中，各腔室具有底表面及界定於其中之複數個凹陷，且引子分別附著於凹陷中之每一者內的聚合物層。
在第一態樣之一實例中，定序套組進一步包含庫（library）製備溶液，該庫製備溶液包括接頭序列（adapter sequence）及轉座體（transposome）。
在第一態樣之一實例中，定序套組進一步包含樣品流體，該樣品流體包括遺傳物質。
應理解，定序套組之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。
本文所揭示之第二態樣為一種方法，該方法包含將包括遺傳物質之流體引入至流體槽，該流體槽包括：複數個腔室；及附著於複數個腔室中之每一者內的引子；從而遺傳物質中之至少一些進入複數個腔室中之至少一些；移除來自流體槽之流體之液體；將囊封基質前驅體組成物引入至流體槽，該囊封基質前驅體組成物包括：包括自由基產生及鏈伸長官能基之單體或聚合物；自由基源；及交聯劑；從而囊封基質前驅體組成物中之至少一些進入含有遺傳物質之腔室之至少一些；及藉由引發包含於腔室中之至少一些中的囊封基質前驅體組成物之交聯或交聯及聚合而將遺傳物質囊封於腔室中之至少一些中的水凝膠基質中。
在第二態樣之一實例中，囊封基質前驅體組成物進一步包括紫外光自由基引發劑，且其中產生水凝膠基質涉及將流體槽暴露至紫外輻射。.
在第二態樣之一實例中，腔室中之至少一些中所含有之囊封基質前驅體組成物之交聯或交聯及聚合涉及將自由基引發劑引入至流體槽中。
應理解，此方法之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或定序套組之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合使用。
本文所揭示之第三態樣為一種定序套組，其包含：流體槽，該流體槽包括複數個腔室及附著於該複數個腔室中之每一者內的引子；及囊封基質前驅體組成物，其由流體及選自由以下者組成之群之聚合物組成：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合。
在第三態樣之一實例中，聚合物為海藻酸酯且流體為含鈣溶液。
第三態樣之一實例進一步包含庫製備溶液，該庫製備溶液包括接頭序列及轉座體。
第三態樣之一實例進一步包含包括遺傳物質之樣品流體。
應理解，此定序套組之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應理解，此定序套組及/或方法及/或其他定序套組之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合使用。
本文所揭示之第四態樣為一種方法，其包含將包括遺傳物質之流體引入至流體槽，該流體槽包括複數個腔室及附著與複數個腔室中之每一者內的引子，從而遺傳物質中之至少一些進入複數個腔室中之至少一些；將囊封基質前驅體組成物引入至流體槽，該囊封基質前驅體組成物包括流體及選自由以下者組成之群之聚合物：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合，從而囊封基質前驅體組成物中之至少一些進入含有遺傳物質之腔室之至少一些；在約40℃至約80℃範圍內之溫度下沖洗具有液體外部固定劑之流體槽；及將流體槽暴露至腔室中之至少一些中的聚合物之膠凝溫度，由此將遺傳物質囊封於腔室中之至少一些中的水凝膠基質中。
第四態樣之一實例進一步包含在引入流體及囊封基質前驅體組成物期間及在沖洗期間將流體槽加熱至約40℃至約80℃範圍內之溫度。
在第四態樣之一個實例中，將流體槽暴露於聚合物之膠凝溫度涉及將流體槽冷卻至膠凝溫度且將流體槽維持在膠凝溫度下持續預定時間。
在第四態樣之一實例中，將流體槽暴露於聚合物之膠凝溫度涉及將流體槽加熱至膠凝溫度且將流體槽維持在膠凝溫度下持續預定時間。
應理解，此方法之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或定序套組之一者或兩者之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。
再者，應理解，該等定序套組中之任一者及/或該等方法之任一者的任何特徵可以任何期望的方式組合在一起，及/或可與本文所揭示之實例中之任一者組合以至少達成如本文中所描述之益處。
本文所揭示之流體槽具有允許流體槽上之個別庫之空間分離的特定架構。個別庫包括大小（例如＜1000 bp）類似的較大核酸樣品之去氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）片段，且該等片段具有附著於各別末端處之接頭。在本文所揭示之實例中之一些中，庫包含於引入至流體槽之載體上或中。在本文所揭示之實例中之一些其他中，在將樣品引入至流體槽中之後，在流流體槽上現場形成庫。在一些實例中，流體槽架構包括可捕獲個別載體或樣品之個別捕獲部位。此等捕獲部位位於個別腔室中，且因此可在空間上分離載體（且因此，載體內或上之庫）或跨越個別腔室內之流體槽之樣品。在其他實例中，流體槽架構包括不具有捕獲部位之腔室。在此等其他實例中，腔室本身能夠以物理方式約束載體或樣品中之一或多者。
載體之空間分離及約束可幫助達成包含於載體中或上之庫的空間分離及約束。樣品之空間分離及約束有助於實現在流體槽上自樣品產生之庫之空間分離及約束。在此等實例中之任一者中，自個別載體釋放或自個別樣品形成於流體槽上之庫可包含於特定腔室內。因而，腔室架構減小庫片段跨越流體槽表面之隨機結合。此外，庫片段之轉運及接種以及後續叢集產生亦可受限於各腔室內。因而，約束可導致庫片段之實質上均勻接種且因此導致實質上均勻化叢集密度。在定序期間，當核苷酸併入至叢集之各別模板股中時，個別叢集產生螢光信號之「空間雲」。將叢集約束至腔室可至少減少空間雲串擾及/或重疊，且亦可改良空間雲之識別。再此外，因為自任何個別腔室獲得之讀段可由相同樣品產生，所以其可用於藉由以生物資訊方式將短讀段縫合在一起而重構樣品。
本文所揭示之流體槽架構亦可改良表面積之總利用率。
定義
除非另外規定，否則本文所用之術語應理解為取其在相關技術領域中之普通含義。本文所用之若干術語及其含義闡述於下文中。
如本文所使用，除非上下文明確另外指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」係指單數以及複數兩者。如本文所使用之術語「包含」與「包括」、「含有」或「特徵在於」同義，且為包括性的或開放性的且不排除未敍述之額外要素或方法步驟。
貫穿本說明書對「一個實例（one example）」、「另一實例（another example）」、「一實例（an example）」等等之參考意謂結合實例所描述之特定要素（例如，特徵、結構、組成、組態及/或特性）包括於本文所描述之至少一個實例中，且可存在或可不存在於其他實例中。此外應理解，除非上下文另外明確指示，否則關於任何實例所描述之要素可在各種實例中以任何適合方式組合。
貫穿包括申請專利範圍之本發明所使用的術語「實質上」及「約」用以描述及解釋諸如歸因於處理中之變化的小波動。舉例而言，此等術語可指小於或等於所述值±5%，諸如小於或等於所述值±2%、諸如小於或等於所述值±1%、諸如小於或等於所述值±0.5%、諸如小於或等於所述值±0.2%、諸如小於或等於所述值±0.1%、諸如小於或等於所述值±0.05%。
接頭 ：可例如藉由接合或標籤化融合至核酸分子之線性寡核苷酸序列。在一些實例中，接頭與引入至流體槽之任何目標序列之3'端或5'端實質上不互補。適合的接頭長度可在約10個核苷酸至約100個核苷酸、或約12個核苷酸至約60個核苷酸、或約15個核苷酸至約50個核苷酸之範圍內。接頭可包括核苷酸及/或核酸之任何組合。在一些實例中，接頭在一或多個位置包括一或多個可裂解基團。在一些實例中，接頭可包括與引子之至少一部分互補之序列，例如包括通用核苷酸序列（諸如P5或P7序列）之引子。在一些實例中，接頭可包括幫助下游誤差校正、識別及定序之指數或條碼序列。指數對於核酸分子之樣品或來源（例如片段）可為獨特的。在一些實例中，接頭可包括定序引子序列或定序結合部位。不同接頭之組合可併入至核酸分子，諸如DNA片段中。
捕獲部位 ：流體槽表面之一部分已經物理改質及/或化學性質改質以允許複合物或樣品定位。在一實例中，捕獲部位可包括化學捕獲劑。
載體 ：能夠具有其中所含之定序庫之水凝膠支撐物或能夠具有附著於其表面之定序就緒核酸片段的固體支撐物。
化學捕獲劑 ：能夠附著、保留或結合至目標分子（亦即複合物或樣品）之材料、分子或部分。一個實例化學捕獲劑包括與目標核酸之至少一部分互補或附著於目標分子之捕獲核酸（例如捕獲寡核苷酸）。另一實例化學捕獲劑為連接子。對於天然DNA或RNA樣品，連接子可包括一個末端上之核酸結合部分，諸如經由電荷或疏水性相互作用結合之嵌入劑。對於細胞樣品，連接子可包括細胞膜結合部分（例如，針對表面蛋白質之抗原）或膜穿透部分（例如，一末端上之磷脂）。另一實例化學捕獲劑包括能夠結合至目標分子（或附著於目標分子之連接部分）之受體配位體結合對（例如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸結合蛋白、抗原決定基、抗體等）之成員。化學捕獲劑之另一實例為能夠與目標分子形成靜電相互作用、氫鍵或共價鍵（例如硫醇-二硫化物交換、點擊化學（click chemistry）、狄耳士-阿德爾（Diels-Alder）等）的化學試劑。
複合物 ：載體，諸如水凝膠支撐物或固體支撐物，及附著於或包含於載體內之定序就緒核酸片段。載體亦可包括結合對之一個成員，其另一個成員為捕獲部位之一部分。
外部固定劑 ：與已引入至流體槽腔室之複合物或樣品不可混溶的氣態、液態或黏性介質。氣態外部固定劑可用以產生圍繞複合物或樣品之小液滴。氣態外部固定劑之實例為以適合流動速率引導通過流體槽之空氣。舉例而言，空氣可用以自流體槽抽出含有複合物或樣品之流體，該流體形成含有複合物或樣品之液態的小液滴。所形成之小液滴充當擴散障壁。液體或黏性介質用於防止定序庫自複合物釋放或形成於例如流體槽表面上之腔室內的擴散。外部固定劑可形成擴散障壁，因為定序庫或任何其他多核苷酸在外部固定劑中具有極少至無溶合作用。呈液體形式之實施外部固定劑包括疏水性油，諸如礦物油、聚矽氧油、全氟化油、氟化碳油（例如來自3M之FLUORINERT™ FC40）或其組合。呈黏性介質形式之實例外部固定劑包括含有聚合物（例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮等）、聚葡萄糖、蔗糖、甘油及其類似物之緩衝液。在一些實例中，黏性介質為溫度反應性凝膠。溫度反應性凝膠在非接種溫度下為非黏性的，且在接種溫度下轉變成黏性介質。溫度反應性凝膠之實例包括聚(N-異丙基丙烯醯胺)及聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯（PEO-PPO-PEO）/合成鋰皂石奈米粒子複合材料。
片段 ：遺傳物質（例如DNA、RNA等）之一部分或碎片。
水凝膠或水凝膠基質 ：包括有機聚合物（天然或合成）之膠體材料，該有機聚合物經由共價、離子或氫鍵交聯以產生截留水分子以形成凝膠之三維開放晶格結構。在一實例中，水凝膠包括約60%至約90%流體，諸如水及約10%至約30%聚合物。水凝膠可為多孔的，亦即包括開口/空隙空間。孔隙度為水凝膠之分率體積（無因次），亦即量測材料中之空隙空間且為總體積上空隙體積之分率，其為0與100%之間的百分比（或0與1之間的分率）。在一實例中，水凝膠之孔隙度可在約50%（0.5）至約99%（0.99）範圍內。孔隙度可足以允許試劑（例如酶、化學物質及尺寸較小之寡核苷酸（小於50個鹼基對，例如引子））之擴散，但禁止較大尺寸核酸分子（例如樣品、片段等）之擴散。
凝膠支撐物 ：具有至少實質上球形形狀之水凝膠（例如，水凝膠珠粒），其可在其中含有定序庫。
核酸分子 ：任何長度之核苷酸之聚合形式，且可包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。該術語可指單股或雙股多核苷酸。
「目標」或「模板」核酸分子可指代待分析之序列。
核酸分子中之核苷酸可包括天然存在之核酸及其功能類似物。功能類似物之實例能夠以序列特異性方式與核酸雜交或能夠用作用於複製特定核苷酸序列之模板。天然存在之核苷酸一般具有含有磷酸二酯鍵之主鏈。類似物結構可具有包括所屬技術領域中已知之變體中之任一者的替代性主鏈鍵聯。天然存在之核苷酸一般具有去氧核糖（例如發現於DNA中）或核糖（例如發現於RNA中）。類似物結構可具有包括所屬技術領域中已知之變體中之任一者的替代性糖部分。核苷酸可包括天然或非天然鹼基。天然DNS可包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及/或鳥嘌呤中之一或多者，且天然RNA可包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶及/或鳥嘌呤中之一或多者。可使用任何非天然鹼基，諸如鎖核酸（locked nucleic acid；LNA）及橋聯核酸（bridged nucleic acid；BNA）。
引子 ：可與所關注之目標序列雜交之核酸分子。在一實例中，引子充當核苷酸可藉由聚合酶聚合於其上之基質。舉例而言，擴增引子充當用於模板擴增及叢集產生之起始點。在另一實例中，引子可充當DNA或RNA合成之起始點。舉例而言，定序引子可與合成核酸模板股雜交以便引發與合成核酸模板股互補之新股之合成。引子可包括核苷酸或其類似物之任何組合。在一些實例中，引子為單股寡核苷酸或多核苷酸。
樣品 ：遺傳物質之任何來源，諸如細胞、微生物群落或核酸。在一些實例中，細胞為包括原核細胞或真核細胞之單細胞。在一些實例中，細胞為哺乳動物細胞、人類細胞或細菌細胞。在一些實例中，核酸為長DNA分子，包括病毒核酸、細菌核酸或哺乳動物核酸。在一些實例中，樣品經由插入結合至固體支撐物（例如珠粒）表面之轉座子而結合（作為片段）。
定序就緒核酸片段 ：在3'及5'端處具有接頭之遺傳物質之一部分（片段）。在定序就緒核酸片段中，各接頭包括已知通用序列（例如，其與流體槽上引子之至少一部分互補）及定序引子序列。兩種接頭亦可包括指數（條碼或標籤）序列。在一實例中，P5側可含有珠粒指數且P7側可含有樣品指數。定序就緒核酸片段可經由轉座子之插入而結合，其中將插入之DNA分子固定至固體支撐物（例如珠粒）之表面；或經由結合對或其他可裂解連接子直接固定；或經由雜交而結合，其中互補接頭存在於固體支撐物之表面上。
接種 ：本文所揭示之流體槽之實例的腔室中之固定調適片段（例如定序就緒核酸片段）。
定序庫 ：一或多個目標核酸分子之核酸片段或該等片段之擴增子的集合。在一些實例中，片段在其3'及5'端處鍵聯至一或多個接頭。在一些實例中，定序庫係自一或多個目標核酸分子製備且為複合物之一部分。在其他實例中，定序庫係使用樣品在流體槽表面上製備。
固體支撐物 ：由具有表徵為例如球體、橢圓形、微球體或具有規則或不規則尺寸的其他可識別粒子形狀的形狀的剛性或半剛性材料製成的較小物體。固體支撐物可具有附著於其上之定序庫。適用於固體支撐物之實例材料包括但不限於玻璃；塑膠，諸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯與另一材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂或聚四氟乙烯（來自Chemours公司之TEFLON®）；多醣或交聯多醣，諸如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠；耐綸；硝化纖維；樹脂；二氧化矽或基於二氧化矽之材料，包括矽及經改質之矽；碳纖維、金屬；無機玻璃；光纖束或多種其它聚合物。實例固體支撐物包括受控微孔玻璃珠粒、順磁性珠粒或其他磁性珠粒、氧化釷溶膠、瓊脂糖凝膠珠粒、奈米晶體及如描述於例如來自Fishers工業，Bangs實驗室之微球體檢測指南之所屬技術領域中已知之其他材料。
標籤化 ：藉由轉座體修飾核酸分子（例如DNA或RNA樣品）以將核酸分子片段化且在單一步驟中將接頭接合至片段之5'及3'端。標籤化反應可用於製備定序庫，尤其包括固體支撐物之複合物。標籤化反應將隨機樣品片段化與接頭接合組合至單一步驟中，其增加定序庫製備製程之效率。
轉座體 ：形成於整合酶（例如整合酶或轉座酶）與包括整合識別部位（例如轉座酶識別部位）之核酸之間的複合物。
通用核苷酸序列 ：兩個或更多個核酸分子共有之序列區域，其中該等分子亦具有彼此不同之區域。存在於分子集合之不同成員中的通用序列可允許使用通用捕獲核酸（亦即，具有與引子之至少一部分互補之序列的接頭）之群體捕獲若干不同核酸。類似地，存在於分子集合之不同成員中之通用序列可允許使用通用定序結合部位（定序引子序列）之群體擴增或複製若干不同核酸。
流體槽架構
實例流體槽10之一部分展示於圖1中。流體槽10包括基板12、界定於基板12上或中之複數個腔室14、界定於基板12中及複數個腔室14中之每一者之周邊內的複數個凹陷16、附著於凹陷16中之每一者內的引子20及位於複數個腔室14中之每一者內的捕獲部位22。
基板12通常為剛性的且不可溶於水性液體中。基板12可為單層或多層結構。適合的基板12之實例包括環氧矽氧烷、多面體寡聚倍半矽氧烷（polyhedral oligomeric silsequioxane；POSS）或其衍生物、玻璃、經改質之玻璃、塑膠、耐綸、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化矽（氧化矽（SiO2 ））、熔融二氧化矽、基於二氧化矽之材料、矽酸鋁、矽、經改質之矽（例如摻雜硼之p+矽）、氮化矽（Si3 N4 ）、五氧化鉭（TaO5 ）或一或多種其他氧化鉭（TaOx ）、氧化鉿（HfO2 ）、無機玻璃或類似者。用於基板12之適合的塑膠之一些實例包括丙烯酸聚合物、聚苯乙烯、苯乙烯與其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂、聚四氟乙烯（諸如，來自Chemours公司之TEFLON®）、環狀烯烴/環烯烴聚合物（COP）（諸如來自Zeon之ZEONOR®）、聚醯亞胺等。基板12亦可為玻璃或矽或POSS，其在表面具有氧化鉭或另一陶瓷氧化物之塗層。基板12亦可為玻璃或矽，其在表面處具有POSS塗層。適合的基板12之另一實例為絕緣層上矽基板。
基板12之形式可為晶圓、面板、矩形薄片、晶粒或任何其他適合的組態。在一實例中，基板12可為直徑在約2 mm至約300 mm範圍內之圓形晶圓或面板。作為一更特定實例，基板12為直徑在約200 mm至約300 mm範圍內的晶圓。在另一實例中，基板12可為其最大尺寸至多約10尺（約3公尺）之矩形薄片或面板。作為一特定實例，基板12為寬度在約0.1 mm至約10 mm範圍內之晶粒。儘管已提供實例尺寸，但應瞭解，可使用具有任何適合尺寸之基板12。
複數個腔室14可界定於基板12上或基板12中。
界定於基板12上之腔室14之實例展示於圖2A中。在本文所揭示之實例中，當i）基板表面S12 界定腔室14之底表面及ii）分隔材料18定位於基板12上且界定腔室14之壁W18 時，腔室14視為「界定於」基板12上。當絕緣層上矽基板與分隔材料18一起使用時，腔室14之壁W18 可部分地由基板之最外部矽層及分隔材料18界定。
分隔材料18可為疏水性材料，諸如氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物或其混合物。疏水性材料之聚合物主鏈可為碳或矽或其組合。在一些實例中，氟化聚合物為非晶形氟聚合物（其市售實例包括來自AGC化學品之CYTOP®系列中之彼等，其具有以下末端官能基中之一者：A型：-COOH、M型：-CONH-Si(OR)n 或S型：-CONH-Si(OR)n ）、聚四氟乙烯（諸如來自Chemours公司之TEFLON®）、派瑞林（parylen）（例如A級、F級、HT）氟化烴、氟丙烯酸共聚物（諸如來自Cytonix之FLUOROPEL™）、(十三氟-1,1,2,2-四氫辛基)三氯矽烷（FOTS）、氟矽烷或經電漿沈積之碳氟化合物或其混合物。作為另一實例，疏水性聚合物或疏水性聚合物層可包括疏水性烴，諸如1-十七炔。在一些實例中，矽聚合物為聚二甲基矽氧烷或另一矽氧烷。當凹陷16中之一或多種材料為親水性的時，尤其可能需要將疏水性材料用於分隔材料18。可使用其他聚合物作為分隔材料18，只要所得結構能夠誘導液體液滴跨越結構移動。可替代地，若凹陷16中之一或多種材料為疏水性的，則可能需要將親水性材料用於分隔材料18。分隔材料18之疏水性或親水性特性可幫助導引試劑朝向凹陷16。
在一個實例中，分隔材料18可沈積於基板12上且接著使用光微影來圖案化。在基板12為絕緣層上矽基板之實例中，分隔材料18及最外部矽層可使用光微影圖案化。作為一實例，掩模（例如，光阻劑）可用於界定分隔材料18將沈積之空間/位置。可接著沈積分隔材料18，且移除掩模（例如，經由剝離、溶解或另一適合技術）。作為另一實例，可沈積分隔材料18，且接著將掩模沈積於分隔材料18上。掩模可使用光微影圖案化，且分隔材料18之任何暴露部分可經由電漿蝕刻或具有氧氣之幹式蝕刻移除。可接著移除掩模以揭露殘留分隔材料18。在又一實例中，分隔材料18可層壓至基板12或自模具或犧牲層轉移至基板12。在又一實例中，分隔材料18可使用微接觸印刷（使用印模）、霧劑印刷或噴墨印刷來印刷。
界定於基板12中之腔室14之實例展示於圖2B中。在本文所揭示之實例中，當i）基板表面S12 界定圍繞腔室14之間隙區域、ii）另一基板表面S'12 界定腔室14之底表面及iii）基板12亦界定腔室14之壁W12 時，腔室14視為「界定於」基板12中。
在此實例中，可將腔室14圖案化至基板中。圖案化可涉及將腔室14蝕刻至基板12中及/或使用壓印微影。
不論形成於基板12上抑或形成於基板12中，腔室14可以任何適合的圖案或佈局跨越基板12而分佈。可設想腔室14之多種不同佈局，包括規則、重複及不規則圖案。在一實例中，腔室14安置於六邊形網格中以用於緊密堆積及改良之密度。其他佈局可包括例如平行四邊形佈局（亦即，矩形、正方形等）、三角形佈局、圓形佈局等。在一些實例中，佈局或圖案可為呈行及列之腔室14之x-y格式（如圖1中所示）。
腔室14可具有任何適合之形狀，諸如圓形（如圖1中所示）、橢圓形、多邊形（例如三角形、四邊形、五邊形等）等。
各腔室14之大小可藉由其開口面積、直徑及/或長度及寬度表徵。如圖1中所展示，流體槽10具有位於腔室14中之每一者內之複數個凹陷16。因而，腔室14之大小大於各凹陷16之大小。換言之，腔室14之一或多個尺寸大於各凹陷16之一或多個尺寸。在此實例中，「尺寸」指代由各腔室開口或凹陷開口所佔據之面積，及/或腔室14或凹陷16之直徑，及/或各腔室14或凹陷16之長度及寬度。在圖1中所展示之實例中，腔室14中之每一者之開口面積及直徑大於凹陷16中之每一者之開口面積及直徑。各腔室14之開口面積及直徑或長度及寬度取決於待位於腔室14內之凹陷16的數目及待位於腔室14內之捕獲部位22的大小。
可選擇由各腔室開口所佔據之面積以使得複合物（其實例展示於圖4A至圖4C中）可進入腔室14且附著於腔室14中之捕獲部位22。在一實例中，各腔室開口之面積可為至少約1 μm2 、至少約10 μm2 、至少約100 μm2 或更大。由各腔室所佔據之面積可大於上文指定之值或介於上文指定之值之間。
在一些情況下，各腔室14之直徑或長度及寬度可為至少約1 μm、至少約10 μm、至少約20 μm、至少約30 μm、至少約40 μm、至少約50 μm、至少約100 μm或更大。腔室直徑之實例在約1 μm至約1000 μm範圍內。腔室直徑之另一實例在約10 μm至約50 μm範圍內。當腔室14具有長度及寬度時，應理解，長度及寬度可相同或不同。
腔室14亦可具有取決於用以形成腔室14之技術的深度。舉例而言，各腔室14之深度在微接觸、霧劑或噴墨印刷用以形成腔室壁W18 時可為單層厚。對於其他實例，各腔室14之深度可為約1 μm、約10 μm、約50 μm或更大。在另一實例中，深度為待引入至腔室14中之複合物之平均直徑的至少約50%。在一實例中，此深度可在約10 μm至約30 μm範圍內。此深度足以阻斷所釋放之庫片段在相鄰腔室14之間的側向擴散，因此維持腔室14內之所釋放之庫片段而無任何外部固定劑。在另一實例中，深度為約5 μm或更小。應理解，各腔室14之深度可大於、小於或介於上文指定值之間。
相鄰腔室14可藉由額外材料18之表面S18 （圖2A中所示）或藉由基板12之表面S12 （圖2B中所示）分隔開。平均腔室間距表示自一個腔室14之中心至相鄰腔室14之中心（中心間間距）或自一個腔室14之邊緣至相鄰腔室14之邊緣（邊緣間間距）之間距。腔室14之佈局或圖案可為規則的，使得關於平均間距之變異係數較小，或佈局或圖案可為不規則的，在此狀況下，變異係數可相對較大。在任一情況下，平均間距可為例如至少約1 μm、至少約5 μm、至少約10 μm、至少約100 μm或更大。在一個實例中，平均間距為腔室14之直徑的2倍。腔室14之特定圖案的平均間距可在選自以上範圍的下限值中之一者與上限值中之一者之間。儘管已提供實例平均腔室間距值，但應理解，可使用其他平均腔室間距值。
複數個凹陷16可界定於基板12中。在本文所揭示之實例中，當i）基板表面S12 或S'12 界定隔開凹陷16之間隙區域24、ii）另一基板表面S''12 界定凹陷16之底表面且iii）基板12亦界定凹陷16之壁時，凹陷16視為「界定於」基板12中。
凹陷16可圖案化至基板12中。圖案化可涉及凹陷16蝕刻至基板12中及/或使用壓印微影。
凹陷16之各別子集可跨越腔室14中之每一者以任何適合之圖案或佈局分佈。各腔室14中之凹陷16之圖案可相同，或凹陷16之不同圖案可用於不同腔室14中。可設想凹陷16之多種不同圖案/佈局，包括規則、重複及不規則圖案。在一實例中，凹陷16安置於六邊形網格中以用於緊密堆積及改良之密度。其他佈局可包括例如平行四邊形佈局（亦即，矩形、正方形等）、三角形佈局、圓形佈局等。在圖1中所展示之實例中，各腔室14中之凹陷16以圍繞捕獲部位22之圓形圖案配置。如圖1中所展示，複數個腔室14可以跨越基板12之第一圖案（例如，2×2）配置，且凹陷之各別子集以腔室14中之每一者內之第二圖案（例如，圓形）配置。
各凹陷16可具有任何適合之形狀（及相應3維幾何形狀），諸如圓形（如圖1中所示）、橢圓形、多邊形（例如三角形、四邊形、五邊形等）等。
各凹陷16之大小可藉由其開口面積、直徑及/或長度及寬度表徵。如圖1中所展示，流體槽10具有位於腔室14中之每一者內之複數個凹陷16。因而，各凹陷16之大小小於其位於之腔室14之大小。
可選擇由各凹陷開口所佔據之面積以使得複合物無法進入凹陷16。在一實例中，各凹陷開口之面積可為至少約1×10–4 μm2 、至少1×10–3 μm2 、至少約1×10–2 μm2 、至少約0.1 μm2 、至少約0.5 μm2 、至少約1 μm2 或至少約4 μm2 。各凹陷開口所佔據之面積可小於上文指定之值或介於該等值之間。
在一些情況下，各凹陷16之直徑或長度及寬度可為至少約1 nm、至少約50 nm、至少約100 nm、至少約500 nm或更大，只要尺寸小於腔室直徑或長度及寬度即可。凹陷直徑之實例在約1 nm至約500 nm範圍內。凹陷直徑之另一實例在約300 nm至約2 μm範圍內。
凹陷16亦可具有深度。作為實例，各凹陷16之深度可為至少約10 nm、至少約50 nm、至少約1 μm、至多約2 μm。在一些實例中，深度為約0.4 μm。應理解，各凹陷16之深度可大於、小於或介於上文指定值之間。
在一實例中，凹陷16之縱橫比（直徑:深度）可在約1:1至約1:2或約1:1.25至約1:1.75範圍內。
相鄰凹陷16可藉由給定腔室14內之間隙區域24隔開。平均凹陷間距表示自一個凹陷16之中心至相鄰凹陷16之中心（中心間間距）或自一個凹陷16之邊緣至相鄰凹陷16之邊緣（邊緣間間距）之間距。凹陷16之佈局或圖案可為規則的，使得圍繞平均間距之變異係數較小，或佈局或圖案可為不規則的，在此情況下，變異係數可能相對較大。在任一情況下，平均間距可為例如至少約10 nm、至少約0.1 μm、至少約0.5 μm或更大，取決於腔室14之尺寸。替代地或另外，平均間距可為例如至多約0.5 μm、至多約0.1 μm或更小。凹陷16之特定圖案的平均間距可在選自以上範圍的下限值中之一者與上限值中之一者之間。
引子20亦附著於凹陷16中之每一者內。引子20可為任何正向擴增引子或反向擴增引子，其包括可附著於至少存在於各凹陷16之底部（亦即表面S''12 上）之層26的官能基。引子20可在各凹陷16內形成捕獲寡核苷酸之坪，該等捕獲寡核苷酸可結合至定序就緒核酸片段之接頭。
在一實例中，可藉由在引子20之5'端處或附近之單點共價附著將引子20固定至層26。此附著保留i）引子20之接頭特異性部分不黏合其同源定序就緒核酸片段及ii）不含引子延伸之3'羥基。出於此目的，可使用任何適合之共價附著。可使用之封端引子之實例包括炔烴封端之引子、四
Figure 109102492-A0304-12-0000-4
封端之引子、疊氮基封端之引子、胺基封端之引子、環氧基或縮水甘油基封端之引子、硫代磷酸酯封端之引子、硫醇封端之引子、醛封端之引子、肼封端之引子、胺基磷酸酯封端之引子及三唑啉二酮封端之引子。在另一實例中，引子20可經由非共價相互作用固定至層26。在一實例中，各引子20可包括可非共價結合至層26之連接分子（例如生物素）。在一些實例中，使用兩種不同引子20。適合引子20之特定實例包括用於藉由Illumina公司出售之商業流體槽表面上之P5及P7引子，其用於在HISEQ™、HISEQX™、MISEQ™、MISEQDX™、MINISEQ™、NEXTSEQ™、NEXTSEQDX™、NOVASEQ™、GENOME ANALYZER™、ISEQ™及其他儀器平台上之定序。
在一實例中，層26為能夠非共價結合至附著於引子20之連接分子的物質。作為一個實例，連接分子為生物素，且層26為抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等。在此實例中，層26可藉由微接觸印刷或霧劑、刷、沈積及拋光或另一適合的選擇性沈積技術施加。
在另一實例中，層26為能夠共價附著於引子20之聚合物。可活化凹陷16之底表面（例如，S''12 ），且隨後可施加聚合物以形成層26。
在一些實例中，活化可涉及施加矽烷或矽烷衍生物（例如降冰片烯矽烷）。在其他實例中，活化可涉及電漿灰化以產生可黏附於用以形成層26之聚合物的一或多種表面活化劑（例如，-OH基團）。
可用於形成層26之聚合物之實例包括丙烯醯胺共聚物，諸如聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共聚-丙烯醯胺PAZAM。PAZAM及丙烯醯胺共聚物之一些其他形式由以下結構（I）表示：
Figure 02_image001
其中： RA 選自由以下者組成之群：疊氮基、視需要經取代之胺基、視需要經取代之烯基、視需要經取代之腙、視需要經取代之肼、羧基、羥基、視需要經取代之四唑、視需要經取代之四
Figure 109102492-A0304-12-0000-4
、氧化腈、硝酮及硫醇； RB 為H或視需要經取代之烷基； RC 、RD 及RE 各自獨立地選自由H及視需要經取代之烷基組成之群； -(CH2 )p -中之各者可視需要經取代； p為1至50範圍內之整數； n為1至50,000範圍內之整數；且 m為1至100,000範圍內之整數。 所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，結構（I）中重複的「n」及「m」個特徵之佈置為代表性的，且單體子單元可以任何次序存在於聚合物結構中（例如無規、嵌段、圖案化或其組合）。
在一些實例中，PAZAM為線性聚合物。在一些其他實例中，PAZAM為輕度交聯聚合物。
在其他實例中，可用以形成層26之聚合物可為結構(I)之變體。在一個實例中，丙烯醯胺單元可經N,N-二甲基丙烯醯胺（
Figure 02_image003
）置換。在此實例中，結構(I)中之丙烯醯胺單元可經
Figure 02_image005
置換，其中RD 、RE 及RF 各自為H或C1-C6烷基，且RG 及RH 各自為C1-C6烷基（而非如同丙烯醯胺之情況為H）。在此實例中，q可為1至100,000範圍內之整數。在另一實例中，除丙烯醯胺單元以外可使用N,N-二甲基丙烯醯胺。在此實例中，除重複的「n」及「m」個特徵以外，結構（I）可包括
Figure 02_image005
，其中RD 、RE 以及RF 各自為H或C1-C6烷基，且RG 及RH 各自為C1-C6烷基。在此實例中，q可為1至100,000範圍內之整數。
應理解，可使用其他聚合物或分子來形成層26，只要其經功能化而與表面S''12 及隨後施加之引子20相互作用即可。適用於層26之聚合物之其他實例包括具有膠態結構之彼等聚合物，諸如瓊脂糖；或具有聚合物網狀結構之彼等聚合物，諸如明膠；或具有交聯聚合物結構之彼等聚合物，諸如聚丙烯醯胺聚合物及共聚物、無矽烷丙烯醯胺（SFA）或SFA之疊氮化形式。適合的聚丙烯醯胺聚合物之實例可由丙烯醯胺及丙烯酸或含有乙烯基之丙烯酸合成，或由形成[2+2]光環加成反應之單體合成。適用於層26之聚合物的其他實例包括丙烯醯胺與丙烯酸酯之混合共聚物。
用以用形成層26之聚合物功能化凹陷16之一或多種方法可取決於腔室14是否界定於基板12上或界定於基板12中。
舉例而言，當腔室14藉由分隔材料18界定於基板12上時，應理解，基板表面S12 及S''12 可經處理以功能化凹陷16，且接著分隔材料18可附著於表面S12 以界定腔室14。在一個實例中，矽烷或矽烷衍生物可使用氣相沈積、旋塗或其他沈積方法沈積於基板表面S12 及S''12 上。在另一實例中，基板表面S12 及S''12 可暴露於電漿灰化。可接著使用旋塗或浸漬或浸漬塗佈或在正或負壓下之材料流動或另一適合之技術將聚合物（其將形成層26）施加至經活化之基板表面S12 及S''12 。在一個實例中，聚合物可存在於混合物（例如，與水或與乙醇及水）中。視聚合物而定，所施加之混合物可暴露於固化製程以跨越表面S12 及S''12 形成（共價地鍵合）層26。在一實例中，固化可在室溫（例如約25℃）至約95℃範圍內之溫度下進行約1毫秒至約若干天範圍內之時間。可接著執行拋光以便自表面S12 移除層26，同時使表面S''12 上之層26至少實質上完整。在此等實例中，分隔材料18可接著形成於如本文所描述之表面S12 上（例如，光微影、印刷、膜轉移或層壓等）。
對於另一實例，當腔室14界定於基板12中時，應理解，選擇性沈積技術可用於功能化凹陷16。在此實例中，矽烷或矽烷衍生物及隨後聚合物混合物可藉由微接觸印刷、霧劑印刷或噴墨印刷來沈積。
可進行接枝製程以將引子20接枝至凹陷16中之層26。在一實例中，接枝可涉及經由沈積（例如使用暫時結合之蓋子）、浸塗、噴塗、覆液施配或藉由將一或多個引子20附著於凹陷16中之層26之另一適合方法流動。此等實例技術中之每一者可利用引子溶液或混合物，其可包括一或多種引子、水、緩衝液及催化劑。藉由接枝方法中之任一者，引子20與凹陷16中之聚合物層26之反應性基團反應且對間隙區域24、其他基板表面S12 或S'12 或分隔材料18無親和力。因而，引子20選擇性地接枝至凹陷16中之聚合物層26。
本文所揭示之流體槽10之實例包括位於複數個腔室14中之每一者內之捕獲部位22。捕獲部位22之一個實例展示於圖1、圖2A及圖2B中，且捕獲部位22之其他實例展示於圖3A至圖3C中。
捕獲部位22在物理上及/或化學上能夠固定特定腔室16內之複合物或樣品。在圖3A中所示之實例之情況下，物理固定可為可能的。化學固定涉及本文所定義之化學捕獲劑28。當捕獲部位22能夠化學固定時，所用化學捕獲劑28可部分地取決於待引入至流體槽10中之複合物或樣品。
在本文所揭示之實例中之一些中，捕獲部位22能夠捕獲引入至流體槽10中之複合物。在本文所揭示之其他實例中，捕獲部位22能夠捕獲樣品，接著對流體槽表面進行進一步處理以產生庫。
在圖1、圖2A及圖2B中，捕獲部位22形成於腔室14之中心處。應理解，捕獲部位22可定位於腔室14內之任何合乎需要的位置處，其可取決於凹陷16之佈置。跨越基板12之捕獲部位22之位置可為均勻的（例如，各捕獲部位22係在各腔室14內之實質上相同位置（例如，中心、左側等）中）或可為不均勻的（例如，捕獲部位22係在不同腔室24內之不同位置中）。
捕獲部位22可具有任何適合之形狀、幾何形狀及尺寸，其可至少部分地取決於捕獲部位22之組態（例如，間距、槽、突起等）、形成捕獲部位22之腔室14之尺寸及待由捕獲部位22捕獲之複合物或樣品之類型。
在圖1、圖2A及圖2B中所展示之實例中，捕獲部位22為施加於間隙區域24之一部分上的化學捕獲劑28。可使用本文所揭示之化學捕獲劑28之任何實例。在一個實例中，可使用微接觸印刷、霧劑印刷等將化學捕獲劑28沈積於合乎需要的位置中。在另一實例中，掩模（例如光阻劑）可用於界定將沈積化學捕獲劑28之空間/位置。可接著沈積化學捕獲劑28，且移除掩模（例如，經由剝離、溶解或另一適合技術）。在此實例中，化學捕獲劑28可形成化學捕獲劑28之單層或薄層，其可稱為貼片。
捕獲部位22之其他實例展示於圖3A、圖3B及圖3C中。應理解，捕獲部位22中之任一者可用於流體槽10之任何實例中，包括具有界定於基板12上之腔室14之彼等（且包括額外材料18）或具有界定於基板12中之腔室14之彼等。
在圖3A及圖3B中，捕獲部位22包括界定於基板12中之槽30。槽可以與凹陷16相同之方式「界定於」基板12中。取決於所使用之基板12，可使用蝕刻、光微影及/或壓印形成槽30。在一實例中，槽30可與凹陷16同時形成。
槽30可具有任何適合之形狀及幾何形狀，包括本文針對凹陷16所描述之彼等形狀及幾何形狀中之任一者。
在圖3A中所展示之實例中，槽30具有大於複數個凹陷16中之每一者之開口尺寸的開口尺寸。在此實例中，「開口尺寸」係指由各槽開口及各凹陷開口所佔據之面積，及/或各槽開口及各凹陷開口之直徑，及/或各槽開口及各凹陷開口之長度及寬度。槽30之開口尺寸可視待引入至其上之複合物或樣品而定。在圖3A中所展示之實例中，凹陷16小於槽30，部分使得其以物理方式無法容納複合物或樣品。在圖3A中，凹陷16之深度小於槽30之深度，但應理解，直徑或長度及寬度亦可更小。在其他實例中，槽30之大小可與凹陷16類似或與其相同。在一個實例中，化學捕獲劑28包括引子20，且因此凹陷16中之任一者可充當槽30以捕獲複合物或樣品。
在一些實例中，槽30不具有添加至其中之額外化學捕獲劑28。在此等實例中，開口尺寸使得複合物或樣品能夠藉由尺寸排阻自裝配至槽30中且不是凹陷16中。
在其他實例中，槽30確實具有添加至其中之額外化學捕獲劑28（如圖3A中之虛線所示）。可使用本文所揭示之化學捕獲劑28之任何實例。在一個實例中，可使用微接觸印刷將化學捕獲劑28沈積於槽30中。在另一實例中，可使用掩模（例如光阻劑）將化學捕獲劑28沈積於槽30中。在此等實例中，開口尺寸使得複合物或樣品能夠藉由尺寸排阻及藉由化學捕獲劑28與引入至流體槽10中之複合物或樣品之間的結合親和力自裝配至槽30中且不是凹陷16中。
圖3B中之捕獲部位22包括槽30及捕獲珠粒32（其表面上具有化學捕獲劑28）。捕獲珠粒32可經尺寸化以適配至槽30中且適配至凹陷16中。在一些實例中，捕獲珠粒32可與相鄰間隙區域24共平面或略微在相鄰間隙區域24上方延伸以使得最終附著於其上之複合物或樣品不限於槽30內。在一實例中，捕獲珠粒32選自由以下者組成之群：二氧化矽、超順磁材料、聚苯乙烯及丙烯酸酯。本文所揭示之化學捕獲劑28之任何實例可用於捕獲珠粒32之表面上，且可在將其引入槽30中之前塗佈在捕獲珠粒32上。
槽30（圖3A或3B中）之深度可視是否將化學捕獲劑28引入至其中及是否將捕獲珠粒32引入至其中而變化。深度可經選擇以至少容納此等材料（亦即，材料包含於槽30內）。在一實例中，槽30之深度在約1 nm至約5 μm範圍內。在其他實例中，槽30之深度在約1 nm至約100 nm或約1 µm至約5 µm範圍內。其他深度亦為可能的。
在圖3C中，捕獲部位22包括界定於基板12中或基板12之表面S12 上之突起34。突起34為自相鄰表面朝外（朝上）延伸之三維結構。當突起34形成於基板12中時，基板12經圖案化（例如經由蝕刻、光微影、壓印等）以使得其在相鄰周圍間隙區域24上方延伸。當突起34形成於基板12上時，額外材料18經圖案化（例如，經由蝕刻、光微影、壓印等）使得其在相鄰周圍基板表面S12 上方延伸。
儘管任何適合之三維幾何形狀可用於突起34，但具有至少實質上平坦之頂表面的幾何形狀可為合乎需要的。實例突起幾何形狀包括球體、圓柱體、立方體、多邊形稜柱（例如長方體稜柱、六邊形稜柱等）或類似形狀。
如圖3C中所展示，將化學捕獲劑28施加於突起34之頂表面上。可使用本文所揭示之化學捕獲劑28之任何實例，且可使用任何沈積技術以將化學捕獲劑28施加至突起34之頂表面。
在一些情況下，可能需要每個腔室14具有一個捕獲部位22。在其他情況下，可能需要每個腔室14具有多個隔離捕獲部位22。個別腔室14中之捕獲部位22之數目可幫助控制在給定腔室14內捕獲之複合物之數目。
返回參考圖2A及圖2B，流體槽10亦可包括結合至分隔材料18或基板12之蓋子36。蓋子36可經定位使得其界定單一流動通道（與複數個腔室14流體連通）或多個流體隔開的流動通道（其中之每一者與複數個腔室14之子集流體連通）。
蓋子36可為對朝向一或多個奈米凹陷16導引之激發光透明的任何材料。作為實例，蓋子可為玻璃（例如硼矽酸鹽、熔融二氧化矽等）、塑膠或其類似物。適合之硼矽酸鹽玻璃的市售實例為可購自Schott North America公司之D 263®。適合之塑膠材料（即環烯烴聚合物）的市售實例為可購自Zeon Chemicals有限公司之ZEONOR®產品。
可使用任何適合的技術使蓋子36結合，諸如雷射結合、擴散結合、陽極接合、共晶接合、電漿活化結合、玻璃料結合或其他所屬技術領域中已知之方法。在一實例中，間隔層可用於將蓋子36結合至分隔材料18或基板12之部分。間隔層可為將分隔材料18或基板12及蓋子36中之至少一些密封在一起之任何材料。
儘管圖中未示，但應理解，一或多個額外層可併入基板12與蓋子36之間或基板12與凹陷16之間。此等一或多個額外層可經選擇以充當用於使用消逝場激發凹陷16之平面波導。
應理解，本文亦涵蓋其他流體槽架構。作為一個實例，流體槽10可包括腔室14及捕獲部位22，但無凹陷16。在此等實例中，引子20可附著於腔室14之底表面而非離散凹陷16中。腔室14之底表面可用層26及引子20功能化。在一些實例中，可將層26施加至整個底部表面（除形成捕獲部位22之情況外）。在此等實例中，可跨越腔室14之底表面形成至少實質上均勻之引子20坪。在其他實例中，層26可施加作為腔室14內在空間上彼此隔開之島狀物（例如，圓形、三角形、矩形等形狀）。自流體槽10上捕獲之特定複合物釋放之庫片段或當場形成於流體槽10上之庫片段可在腔室14內隨機地分佈（與受限於腔室14中之凹陷16內相對）。此流體槽架構之實例展示於圖5(i)至圖5(iii)中。
作為另一實例，流體槽10可包括不具有腔室14或凹陷16之捕獲部位22。在此等實例中，捕獲部位22可定位於跨越基板之所需幾何結構中，且引子20可圍繞捕獲部位22附著於基板12之表面。自流體槽10上捕獲之特定複合物釋放之庫片段或當場形成於流體槽10上之庫片段可在基板12上隨機地分佈，且釋放之庫片段之約束可藉由控制反應性擴散來達成。
作為又一實例，流體槽10可包括凹陷16及捕獲部位22，但不包括腔室14。在此等實例中，捕獲部位22可定位於跨越基板12之所需幾何結構中，且引子20可附著於如本文所描述之凹陷16中之每一者內。自流體槽10上捕獲之特定複合物釋放之庫片段或當場形成於流體槽10上之庫片段可在靠近複合物之凹陷16中隨機地分佈，且釋放之庫片段之約束可藉由控制反應性擴散來達成。
在另外其他實例中，不包括捕獲部位22，此係因為腔室14之壁具有足以截獲引入至流體槽10之複合物或樣品中之一或多者的高度。足以截獲複合物或樣品中之一或多者之高度對應於為待引入至流體槽10之複合物或樣品之平均直徑之至少約50%的腔室深度。在一實例中，壁之高度或腔室14之深度為10 µm或更大。在此實例中，給定腔室14中之複合物或樣品之數目/量為隨機的且將藉由泊松分佈（Poisson distribution）測定。
在本文所揭示之實例中之任一者中，應理解，引子20可能不位於凹陷16及/或腔室14側壁上，部分地由於層26可能不位於側壁上。此有助於防止庫片段接種在側壁上。
本文所揭示之流體槽架構可用於多種應用，包括定序技術，諸如鍵聯之長讀段定序應用、高通量蛋白質生物標記研究、微生物群落研究或單細胞組學。舉例而言，本文所揭示之流體槽架構及方法可用於分析經DNA標記之抗體之結合。在此實例中，抗體標記附著於具有P5/P7連接子之獨特DNA序列，其引入至流體槽架構中。抗體可裂解，且所釋放之P5/P7引子接種於流體槽上。接種之引子能夠識別所附著之抗體。
與流體槽架構一起使用之複合物
流體槽架構可能特別適合於與本文所揭示之複合物之實例一起使用。如本文所指出，複合物包括載體（例如水凝膠支撐物或固體支撐物）及附著於或包含於載體內之定序就緒核酸片段。適合之複合物之實例展示於圖4A至圖4C中。儘管描述用於製備複合物之一些實例方法，但應理解，可使用其他方法，只要定序就緒核酸片段附著於載體或包含於載體內即可。
圖4A說明包括固體支撐物42及附著於固體支撐物42之定序就緒核酸片段44之複合物40A。
在一個實例中，為形成此複合物40A，接頭序列（52、52'）經由結合對之一個成員46結合至固體支撐物42。在一實例中，此接頭序列包括第一定序引子序列（例如讀段1定序引子序列）、與流體槽10A-10I上之引子20中之一者之至少一部分互補的第一序列（例如P5'序列）。如所提及，此接頭序列結合至結合對（例如生物素）之一個成員46，使得其可結合至固體支撐物42（其包括結合對之其他成員（例如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等））之表面。此接頭序列亦可包括指數序列。
可將Y-接頭與轉座酶（例如兩個Tn5分子）混合以形成轉座體。Y-接頭可包括彼此雜交之兩個嵌合末端序列。嵌合末端序列中之一者可附著於第二定序引子序列（例如，讀段2定序引子序列）、與流體槽10A-10I上之引子36中之一者之至少一部分互補的第二序列（例如，P5'序列）及視需要指數/條碼序列。第二定序引子序列及第二序列共同構成接頭序列48、48'。
標籤化製程可隨後執行。包括樣品（例如DNA）之流體（例如標籤化緩衝液）可添加至轉座體且添加至具有結合至其上之接頭序列之固體支撐物42。當樣品接觸轉座體時，DNA標籤化（用固體支撐物42上之接頭序列52、52'分段且標記）且結合至Y-接頭（例如經由接合自由嵌合末端序列）。將Y-接頭之自由嵌合末端序列接合至固體支撐物42上之接頭序列。樣品之連續標籤化在轉座體之間產生複數個橋聯分子。為完成定序就緒片段，進行進一步延伸及接合以確保片段50、50'附著於序列48及48'。轉座酶可隨後經由十二烷基硫酸鈉（SDS）處理或熱或蛋白酶K消化移除。
所得複合物40A展示於圖4A中。橋聯分子為定序就緒核酸片段42，其中之每一者包括在任一末端附著之片段50、50'及接頭序列48及52或48'及50'。接頭序列52、52'為最初結合至固體支撐物42之接頭序列，且包括第一定序引子序列、與流體槽引子互補之第一序列及結合複合物之一個成員46。接頭序列48、48'選自Y-接頭，且包括與另一流體槽引子互補之第二序列及第二定序引子序列。因為各定序就緒核酸片段44包括用於擴增（例如橋式擴增）及定序之適合的接頭，所以不進行PCR擴增。因此，此等片段44為定序就緒的。此外，因為庫片段44來自相同樣品，所以片段44可能適用於鍵聯之長讀段應用。
圖4B說明包括固體支撐物42及附著於固體支撐物42之定序就緒核酸片段44'的另一複合物40B。在一個實例中，在管中產生無PCR核苷酸庫，且隨後使庫雜交至管中之固體支撐物42。在圖4B中所展示之實例中，將具有結合對之一個成員的引子添加至管中之庫片段，且隨後使定序就緒核酸片段44'結合至固體支撐物42。在另一實例中，固體支撐物42可具有經由結合對（例如該支撐物42上之抗生物素蛋白及附著於引子之生物素）附著於其上之引子。此等引子與庫片段雜交（且因此引子及結合對成員位於片段之一個末端且不位於另一個末端）。在另一實例中，延伸可使用股置換酶進行。此將產生完全雙股庫（例如無叉形或Y接頭，如圖4B中所示）。定序就緒核酸片段44'可經由變性釋放在流體槽上。因為庫片段44'在附著於固體支撐物42之前產生，所以片段44'可不來自相同樣品，且因此可能不適合於鍵聯之長讀段應用。
圖4C說明包括水凝膠支撐物70及包含於水凝膠支撐物70內之定序就緒核酸片段44''之複合物40C之實例。
在形成此複合物40C之一些實例中，在樣品（例如遺傳物質）存在下混合含有一或多種水凝膠單體及/或一或多種聚合物及一或多種交聯劑之流體。此流體可裝載至礦物油或另一適合的疏水性流體中，且乳化以產生小液滴。可添加自由基引發劑以聚合及/或交聯一或多種水凝膠單體及/或一或多種聚合物且形成水凝膠支撐物70。適合之單體、聚合物、交聯劑及引發劑之實例描述於參考圖5(i)至圖(iii)中。
在形成此複合物40C之其他實例中，將含有一或多種水凝膠聚合物之流體與樣品（例如遺傳物質）混合且裝載至流體槽上。流體槽可暴露於加熱或冷卻以使得一或多種水凝膠聚合物形成凝膠（例如水凝膠支撐物70）。適合之聚合物及溫度之實例進一步描述於下文中。
樣品變得囊封於水凝膠支撐物70內，因為其大小足以使得其無法穿過水凝膠珠粒之孔隙。在一些實例中，樣品為DNA或RNA且長度為至少約100個核苷酸（例如1,000個核苷酸或更多、10,000個核苷酸或更多、500,000個核苷酸或更多等）。在一些實例中，水凝膠支撐物70之孔隙大小係指基於複數個孔隙之量測，孔隙之橫截面之平均直徑或平均有效直徑。不為圓形之橫截面之有效直徑等於具有與非圓形橫截面之橫截面面積相同的橫截面面積之圓形橫截面之直徑。在一實例中，孔隙大小在約10 nm至約100 nm範圍內。
庫製備可隨後在水凝膠支撐物70內進行。多重試劑交換可通過水凝膠支撐物70之孔隙發生。樣品及由其產生之任何庫片段保持在水凝膠基質內。庫製備可涉及使樣品分段且添加將產生序列就緒片段44''之接頭。
在一實例中，庫製備可經由在水凝膠支撐物70內進行之標籤化來進行。所得複合物40C在圖4C中展示。接頭序列包括用於橋式擴增及定序之適合的接頭，且因此所得片段44''係定序就緒的。在另一實例中，可使用產生雙股庫之聚合酶延伸來進行庫製備。此實例庫需要在釋放形成水凝膠支撐物70及接種之前變性。
涉及複合物之方法
本文所揭示之方法之一些實例使用本文所揭示之流體槽10之實例及複合物40A、40B或40C中之任一者。如上文所描述，複合物40A、40B或40C中之每一者包括獲自遺傳物質之相同樣品之序列就緒片段。當複合物中之一者或幾個在各別腔室內分離時，獲得來自相同樣品之庫之空間共定位。
在第一實例方法中，流體槽10包括複數個腔室14，但不包括捕獲部位22。實情為，腔室14自身充當引入至流體槽中之複合物40A、40B或40C之捕獲部位。舉例而言，當深度為待引入至其中之複合物40A、40B或40C之平均直徑的至少約50%時，各腔室14可充當捕獲部位。在一實例中，深度為至少約10 µm（約10 µm或更大）。在此實例中，流體槽10可具有附著於腔室14之底表面的引子20，或可包括其中含有引子20之凹陷16。在此等實例中，截留於任何給定向腔室14中的複合物40A、40B或40C之數目可為隨機的且藉由泊松分佈測定。
在此第一實例方法中，複合物40A、40B或40C例如通過一或多個輸入埠引入至流體槽10中。複合物40A、40B或40C可引入至流體，諸如Tris-HCl緩衝液或0.5倍生理食鹽水檸檬酸鈉（SSC）緩衝液。來自流體之至少一些複合物40A、40B或40C將沈降至腔室14中之至少一些中。應理解，一些複合物40A、40B或40C可不沈降，且此等複合物40A、40B或40C將在執行進一步製程之前從流體槽移除。亦應理解，一些腔室14可接收複合物40A、40B或40C中之一或多者，而其他腔室14可不接收複合物40A、40B或40C。此實例中之複合物40A、40B或40C分佈部分地係隨機的，此係因為缺乏捕獲部位22。
此第一實例方法隨後包括自流體槽洗掉未截留之複合物40A、40B或40C。洗滌可涉及將流體引入至流體槽10中。流動可推動未沈降出之任何複合物40A、40B或40C穿過流體槽之出口。深腔室14可防止任何沈降複合物40A、40B或40C變為排放流之部分。
方法之此實例隨後包括引起經截留複合物40A、40B或40C之載體（例如固體支撐物42或水凝膠支撐物70）將定序就緒核酸片段44、44'或44''釋放至各複合物40A、40B或40C經截留之各別腔室14中。在此實例中，定序就緒核酸片段44、44或44''之轉運及接種受各別腔室14之深度限制，且因此不將外部固定劑引入至流體槽中。
引起載體（亦即支撐物42或70）釋放定序就緒核酸片段44、44'或44''可能不同，視所使用之複合物40A、40B或40C而定。在一個實例中，載體為固體支撐物42，且引起涉及將裂解劑引入至流體槽。裂解劑可引發自固體支撐物42之定序就緒核酸片段44、44'的化學、酶或光化學釋放。在此等實例中，另一刺激，諸如熱或光可觸發裂解劑自固體支撐物42釋放庫片段44或44'。作為一個實例，自由生物素可作為裂解劑引入，且加熱至約92℃可用於誘導自固體支撐物42之生物素-寡核苷酸釋放。
在其他實例中，使用複合物40C且因此載體為水凝膠支撐物70。在此等其他實例中，引起庫釋放可涉及加熱流體槽10、將裂解劑引入流體槽10或其組合。加熱以自水凝膠支撐物70釋放庫片段44''可涉及加熱至約90℃之溫度。可加熱整個流體槽10，且當複合物40C加熱時，水凝膠支撐物70可降解以釋放片段44''。在一些實例中，裂解劑可包括一或多種組分，該一或多種組分可使水凝膠支撐物70解聚合且自其釋放定序就緒片段44''。作為實例，裂解劑包括二硫蘇糖醇（DTT）、參-(2-羧基乙基)膦（TCEP）或參-(3-羥丙基)膦（THP）。在其他實例中，裂解劑為光。在此等實例中，用於形成水凝膠支撐物70之交聯劑可包括光可裂解部分，且腔室14中之複合物40C暴露於適當波長之光可裂解此部分且使水凝膠支撐物70降解。
如所提及，定序就緒核酸片段44、44'或44''之轉運及接種受各別腔室14之深度限制。因而，任何特定複合物40A、40B或40C之片段44、44'或44''將被限制至將特定複合物40A、40B或40C限制至之腔室14。
在本文所揭示之流體槽架構之情況下，流體槽10之表面上之引子20可接種所釋放之定序就緒核酸片段44、44'或44''。在一實例中，接種係經由將片段44、44'或44''之第一或第二序列與引子20中之互補者與腔室14雜交來實現。接種可在片段44、44'或44''及一或多個引子20之適合雜交溫度下進行。
定序就緒核酸片段44、44'或44''接種在各別腔室14內之位置部分地取決於引子20如何附著於腔室14內。在流體槽10之一些實例中，各腔室14具有底表面，且引子20跨越底表面附著於聚合物層26，或引子20分別附著於定位於底表面上之複數個空間上分離之聚合物島狀物。在此等實例中，分別地，跨越腔室14之底表面或跨越島狀物中之每一者接種定序就緒核酸片段44、44'或44''。在其他實例中，各腔室14具有界定於其中之底表面及複數個凹陷16，且引子20分別附著於凹陷16中之每一者內之聚合物層26。在此等實例中，跨越凹陷16中之每一者內之聚合物層26接種定序就緒核酸片段44、44''或44''。
在另一實例方法（稱作第二實例方法）中，流體槽10包括複數個腔室14、該複數個腔室14中之每一者內的捕獲部位22；及附著於複數個腔室14中之每一者內的引子20。在此實例中，流體槽10可包括或可不包括凹陷16。
在此第二實例方法中，各腔室14之深度為約5 µm或更小。在此類淺深度下，可包括捕獲部位22以在單個腔室14中固定單個複合物40A、40B或40C。儘管各腔室14具有捕獲部位22，但應理解，在方法之任何給定操作期間，腔室14中之一些可不接收複合物40A、40B或40C。
在此第二實例方法中，複合物40A、40B或40C例如經由一或多個輸入埠引入至流體槽10中。複合物40A、40B或40C可引入至流體，諸如本文所揭示之緩衝液中。在此實例中，各別捕獲部位22及複合物40A、40B或40C為結合對之成員，使得一個複合物40A、40B或40C結合至腔室14中之每一者內的一個捕獲部位22。更特定言之，捕獲部位22可包括結合對之第一成員且複合物40A、40B或40C中之每一者可包括結合對之第二成員。作為一個特定實例，捕獲部位22為捕獲部位引子（例如捕獲寡核苷酸），且複合物40A、40B或40C中之每一者包括可與捕獲部位引子雜交之互補引子。作為另一特定實例，捕獲部位22可包括抗生物素蛋白且生物素可附著於複合物40A、40B或40C之表面。
此第二實例方法隨後包括自流體槽10洗掉未固定之複合物40A、40B或40C。洗滌可涉及將任何適合之緩衝液引入至流體槽10中。流動可推動未附著於捕獲部位22之任何複合物40A、40B或40C穿過流體槽10之出口。
此第二實例方法隨後包括將外部固定劑引入至流體槽10，且特定言之，引入至複數個腔室14。在一實例中，外部固定劑為空氣，或液體介質或黏性介質，其不可與已引入至流體槽腔室14之流體之複合物40A、40B或40C混溶。
使用空氣將洗滌流體自流體槽10抽出可產生環圍繞複合物40A、40B或40C之液體小滴且形成擴散障壁。液體或黏性外部固定劑至少部分地圍繞附著在腔室14內之複合物40A、40B或40C。藉由至少部分地圍繞複合物40A、40B或40C，當釋放片段44、44'或44''時，外部固定劑抑制定序就緒核酸片段44、44'或44''擴散出腔室14。當外部固定劑為溫度反應性材料時，升高溫度至接種溫度可使得試劑更黏且呈可防止庫擴散之形式。
應理解，可使用本文所揭示之任何外部固定劑，但在一個實例中，外部固定劑為選自由以下者組成之群的液體擴散障壁：礦物油及聚矽氧油、選自由甘油及蔗糖組成之群的黏性介質擴散障壁及其組合。
方法之此實例隨後包括引起經截留複合物40A、40B或40C之載體（例如固體支撐物42或水凝膠支撐物70）將定序就緒核酸片段44、44'或44''釋放至各固定40A、40B或40C經截留之各別腔室14中。在此實例中，藉由外部固定劑限制定序就緒核酸片段44、44'或44''之轉運及接種。
引起載體（亦即支撐物42或70）釋放定序就緒核酸片段44、44'或44''可能不同，視所使用之複合物40A、40B或40C而定。在一個實例中，載體為固體支撐物42，且引起涉及將裂解劑引入至流體槽10（如第一實例方法中所描述），且使用另一刺激以觸發裂解劑以自固體支撐物42釋放庫片段44或44'。在其他實例中，使用複合物40C且因此載體為水凝膠支撐物70。在此等其他實例中，引起庫釋放可涉及加熱流體槽、將裂解劑引入至流體槽或其組合（如第一實例方法中所描述）。
如所提及，在此第二實例方法中定序就緒核酸片段44、44'或44''之轉運及接種受到外部固定劑限制。因而，任何特定複合物40A、40B或40C之片段44、44'或44''將被限制至將特定複合物40A、40B或40C限制至之腔室14，因為外部固定劑至少部分地圍繞複合物40A、40B或40C。
在本文所揭示之流體槽架構之情況下，流體槽10之表面上之引子20可接種所釋放之定序就緒核酸片段44、44'或44''。接種係經由將片段44、44'或44''之第一或第二序列與引子20中之互補者與腔室14雜交來實現。接種可在片段44、44'或44''及一或多個引子20之適合雜交溫度下進行。
定序就緒核酸片段44、44'或44''接種在各別腔室14內之位置部分地取決於引子20如何附著於腔室14內。在流體槽之一些實例中，各腔室14具有底表面，且引子20跨越底表面附著於聚合物層26，或引子20分別附著於定位於底表面上之複數個空間上分離之聚合物島狀物。在此等實例中，分別地，跨越腔室14之底表面或跨越島狀物中之每一者接種定序就緒核酸片段44、44'或44''。在其他實例中，各腔室14具有界定於其中之底表面及複數個凹陷，且其中引子分別附著於凹陷16中之每一者內之聚合物層26。在此等實例中，跨越凹陷16中之每一者內之聚合物層26接種定序就緒核酸片段44、44'或44''。
在方法之又一實例（稱作第三實例方法）中，可使用展示於圖1、圖2A、圖2B及圖3A至圖3C中之流體槽10之任何實例。在此第三實例方法中，可包括捕獲部位22以將單個複合物40A、40B或40C固定在單個腔室14中，且各腔室14之深度可足以將定序就緒核酸片段44、44'或44''之轉運及接種限定至各別腔室14中之每一者內的各別凹陷16。
在此第三實例方法中，複合物40A、40B或40C例如通過一或多個輸入埠引入至流體槽10中。複合物40A、40B或40C可引入至流體，諸如本文所揭示之緩衝液中。在此實例中，各別捕獲部位22及複合物40A、40B或40C為結合對之成員，使得一個複合物40A、40B或40C結合至腔室14中之至少一些內的一個捕獲部位22。儘管各腔室14具有捕獲部位22，但應理解，在方法之任何給定操作期間，腔室14中之一些可不接收複合物40A、40B或40C。
此第三實例方法隨後包括自流體槽10洗掉未截留之複合物40A、40B或40C。洗滌可涉及將緩衝液引入至流體槽中。流動可推動未固定在捕獲部位22處之任何複合物40A、40B或40C穿過流體槽10之出口。
方法之此實例隨後包括引起經截留複合物40A、40B或40C之載體（例如固體支撐物42或水凝膠支撐物70）將定序就緒核酸片段44、44'或44''釋放至各複合物40A、40B或40C經截留之各別腔室14中。在此實例中，定序就緒核酸片段44、44或44''之轉運及接種受各別腔室14之深度限制，且因此不將外部固定劑引入至流體槽10中。
引起載體（亦即支撐物42或70）釋放定序就緒核酸片段44、44'或44''可能不同，視所使用之複合物40A、40B或40C而定。在一個實例中，載體為固體支撐物42，且引起涉及將裂解劑引入至流體槽10（如第一實例方法中所描述）及將流體槽10暴露至外部刺激。在其他實例中，使用複合物40C且因此載體為水凝膠支撐物70。在此等其他實例中，引起庫釋放可涉及加熱流體槽、將裂解劑引入至流體槽或其組合（如第一實例方法中所描述）。
如所提及，定序就緒核酸片段44、44'或44''之轉運及接種受各別腔室14之深度限制。因而，任何特定複合物40A、40B或40C之片段44、44'或44''將被限制至將特定複合物40A、40B或40C限制至之腔室14。在此特定實例中，因為流體槽10包括凹陷16中之引子20，所以片段44、44'或44''之接種發生在凹陷16內且不發生在間隙區域24上。
在涉及複合物40A、40B或40C之方法（例如本文所描述之第一、第二或第三方法）之實例中之任一者中，可使用叢集產生擴增經接種之定序庫。
在叢集產生之一個實例中，使用高保真DNA聚合酶藉由3'延伸自雜交引子20複製定序就緒核酸片段44、44'或44''。使初始定序就緒核酸片段44、44'或44''變性，使複本固定在腔室14內。等溫橋式擴增或一些其他擴增形式可用於擴增經固定之複本。舉例而言，經複製之模板循環以與相鄰的互補引子20雜交，且聚合酶複製經複製之模板以形成雙股橋，其變性以形成兩個單股之股。此等兩股於相鄰互補引子20上方循環且與相鄰互補引子20雜交並且再次延伸以形成兩個新的雙股環。藉由等溫變性及擴增之循環在各模板複本上重複該製程以產生密集的純系叢集。使雙股橋之各叢集變性。在一實例中，反向股藉由特異性鹼基裂解移除，留下正向模板多核苷酸股。應理解，叢集導致例如在各腔室14中且在一些情況下在各腔室14內之各凹陷16內形成若干模板定序就緒核酸片段。叢集之此實例為橋式擴增，且為可執行之擴增之一個實例。應理解，可使用其他擴增技術，諸如排阻擴增（ExAmp）工作流（Illumina公司）。
在叢集產生之後，可執行定序。本文所揭示之流體槽10之任何實例可用於多種定序方法或技術中，包括常常被稱作合成定序（sequencing-by-synthesis；SBS）、循環陣列定序、接合定序、焦磷酸定序等等之技術。
作為一個實例，藉由合成定序（SBS）反應可在諸如以下之系統上進行：HISEQ™、HISEQX™、MISEQ™、MISEQDX™、MINISEQ™、NOVASEQ™、NEXTSEQDX™、NEXTSEQ™或來自Illumina（加利福尼亞州，聖地亞哥）的其他定序器系統。
可引入與模板多核苷酸股上之互補序列雜交之定序引子。此定序引子使得模板多核苷酸股呈現準備好進行定序。在SBS中，監測沿模板定序就緒核酸片段（模板多核苷酸股）之定序引子之延伸以確定模板中之核苷酸序列。可阻斷模板之3'末端及任何經流體槽結合之引子20（不附著於複本）以防止對定序反應之干擾，且特定言之，防止不合需要之引發。基本化學方法可為聚合（例如，藉由聚合酶之催化）或接合（例如，藉由接合酶之催化）。
在特定的基於聚合酶之SBS製程中，將經螢光標記之核苷酸以模板依賴性方式添加至定序引子（由此使定序引子延伸）中，以使得可使用偵測添加至定序引子中之核苷酸的次序及類型來確定模板之序列。更特定言之，核苷酸中之一者藉由各別聚合酶併入至延伸定序引子且與模板多核苷酸股互補之新生股中。舉例而言，為引發第一SBS循環，可將一或多個標記核苷酸、DNA聚合酶等遞送至流體槽10中/通過流體槽10，其中定序引子延伸引起標記核苷酸併入。此併入可經由成像事件偵測。在成像事件期間，照明系統（圖中未示）可將激勵光提供至流體槽10。
在一些實例中，經螢光標記之核苷酸可進一步包括可逆終止特性，一旦核苷酸已添加至模板，則該特性即終止進一步引子延伸。舉例而言，具有可逆終止子部分之核苷酸類似物可添加至模板，以使得後續延伸無法進行，直至遞送去阻斷劑以移除該部分。因此，對於使用可逆終止之實例，可將去阻斷試劑遞送至流體槽等（在偵測進行之後）。
在各種流體遞送步驟之間可進行一或多次洗滌。SBS循環接著可重複n次以使模板延伸n個核苷酸，由此偵測長度n之序列。
儘管已詳細描述SBS，但應瞭解，本文所述之流體槽10可與其他定序方案一起用於基因分型或用於其他化學及/或生物學應用中。
涉及在流體槽架構上形成複合物之方法
本文所揭示之方法之其他實例不利用展示於圖4A至圖4C中之複合物40A、40B或40C。實情為，水凝膠基質在流體槽之腔室14內當場形成。將參考圖5(i)至圖5(iii)描述一個實例。
在此實例中，流體槽10'可為定序套組之一部分，其包括流體槽10'及各種試劑以在流體槽10'之腔室14內形成水凝膠基質74。定序套組之實例包括流體槽10'，其包括複數個腔室14（例如，形成於如參考圖1、圖2A及圖2B所描述之基板12中或上）及附著於複數個腔室14中之每一者內之引子20。在圖5(i)至圖5(iii)中所展示之實例中，各腔室具有底表面且引子20跨越底表面附著於聚合物層26。儘管圖中未示，但聚合物層26（位於底部腔室表面上）可替代地呈複數個空間上分離之聚合物島狀物之形式，且引子20將分別附著於島狀物中之每一者。在流體槽10'之又一實例中，複數個凹陷16（如本文針對流體槽10所定義）可界定於腔室之底表面中，且引子20將附著於凹陷16中之每一者中的聚合物層26。
如圖5(i)中所展示，流體槽10'亦包括捕獲部位22'之實例，其中捕獲部位22'經組態以捕獲樣品72。
捕獲部位22'可為可附著於引入至流體槽10'之樣品72的本文所揭示之化學捕獲劑之任何實例。對於天然DNA或RNA樣品72，捕獲部位22'可包括在一個末端上具有核酸結合部分之連接子，諸如經由電荷或疏水性相互作用結合之嵌入劑，或結合對之一個成員（其中樣品72包括另一成員）或可與樣品72雜交之寡核苷酸等。對於細胞樣品72，連接子可包括細胞膜結合部分（例如，針對表面蛋白質之抗原）或膜穿透部分（例如，一末端上之磷脂）。
儘管圖5(i)至圖5(iii)中未示出，流體槽10'可包括腔室14中之每一者內之凹陷16，且引子20可附著於凹陷16中之每一者內。
定序套組之此實例亦包括由流體、包括自由基產生及鏈伸長官能基之單體或聚合物、自由基源及交聯劑組成之囊封（水凝膠）基質前驅體組成物。囊封（水凝膠）基質前驅體組成物不包括樣品72。在一實例中，囊封（水凝膠）基質前驅體組成物包括約2%（w/v）至約20%（w/v）之一或多種單體或一或多種聚合物、約1 wt%至約10 wt%之交聯劑及約0.1%（w/v）至約10%（w/v）之自由基源。當包括於組成物中時，自由基引發劑可以約0.1%（w/v）至約10%（w/v）之量存在。
囊封（水凝膠）基質前驅體組成物之流體可為水（例如去離子水）。
當單體用於囊封（水凝膠）基質前驅體組成物中時，單體選自由以下者組成之群：丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、二丙烯酸酯、二烯丙胺、三烯丙胺、二乙烯碸、乙二醇二烯丙醚、乙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化二丙烯酸三羥甲酯、乙氧基化新戊四醇四丙烯酸酯、膠原蛋白單體及其組合。在一些實例中，當聚合物用於囊封（水凝膠）基質前驅體組成物中時，聚合物選自由以下者組成之群：聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇（例如具有約100至約200,000範圍內之重量平均分子量）、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯基磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸及其組合。在其他實例中，當聚合物用於囊封（水凝膠）基質前驅體組成物中時，聚合物包括第一聚合物及第二聚合物；其中第一聚合物選自由以下者組成之群：聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯基磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸及其組合；且第二聚合物選自由以下者組成之群：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合。聚離胺酸一或多種單體及一或多種聚合物中之任一者亦可在囊封（水凝膠）基質前驅體組成物內組合使用。
自由基源為在分解時產生自由基之分子。在一實例中，自由基源選自由以下者組成之群：過硫酸鉀、過硫酸銨、4,4'-偶氮雙(4-氰戊酸)、1,1'-偶氮雙(環己烷甲腈)、偶氮二異丁腈、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、過氧化物、核黃素、3-(二甲胺基)丙腈及其組合。
交聯劑在水凝膠基質之聚合物中形成鍵，例如雙硫鍵。交聯劑可為可逆的，因為其可視其暴露於之化學物質而交聯及非交聯。在實例中，可逆交聯劑為含有雙硫鍵之雙丙烯醯胺交聯劑，其可與還原劑（諸如DTT、TCEP或THP（膦））一起分解。在一實例中，交聯劑選自由以下者組成之群：丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、1,4-二丙烯醯哌
Figure 109102492-A0304-12-0000-4
、N-N' -二烯丙基L-酒石二醯胺及N-N' -(1,2-二羥基伸乙基)-雙丙烯醯胺。
定序套組之此實例亦包括作為囊封基質前驅體組成物之一部分或作為單獨組分之自由基引發劑。在一實例中，自由基引發劑可為光引發劑。光引發劑之實例包括偶氮二異丁腈、過氧化苯甲醯、曙紅-5-異硫氰酸酯。此類型之自由基引發劑可包括於囊封（水凝膠）基質前驅體組成物中，因為其不會引發交聯直至暴露於適當波長之光。在另一實例中，自由基引發劑可在暴露於囊封（水凝膠）基質前驅體組成物中之自由基源時引發交聯。在此等實例中，自由基引發劑保持與囊封（水凝膠）基質前驅組成物分離，直至需要在流體槽10'上形成水凝膠基質為止。此類型自由基引發劑之實例為四甲基乙二胺（TEMED）。
在一實例中，定序套組可進一步包括樣品流體，其包括水及樣品72（例如遺傳物質）。
在一實例中，定序套組可進一步包括庫製備溶液，其包括接頭序列及轉座體。
在使用定序套組之此實例方法的一實例中，將樣品流體（包括遺傳物質之樣品72）例如通過輸入埠引入至流體槽10'（圖5(i)）。通過各別腔室14中之一或多個捕獲部位22'，遺傳物質（樣品72）中之至少一些進入複數個腔室14中之至少一些。樣品72固定至一或多個捕獲部位22'。
接著可移除樣品流體之液體，包括任何未結合之樣品72。移除可涉及將洗滌緩衝液（例如TRIS HCl）引入至流體槽10'中。流動可通過流體槽10'之出口向外推出任何未結合之樣品72。
方法之此實例包括將囊封基質前驅體組成物76引入至流體槽10'中（圖5(ii)）。囊封基質前驅體組成物76中之至少一些進入含有樣品72之腔室14中之至少一些。
該方法接著包括藉由引發腔室14中之至少一些中所含有之囊封基質前驅體組成物76之交聯或交聯及聚合而將樣品72（亦即遺傳物質）囊封於腔室14中之至少一些中的水凝膠基質74中（圖5(iii)）。
在囊封之前，可將外部固定劑引入至流體槽10'中。除已進入腔室之組成物76以外，此試劑可自流體槽10'移除囊封基質前驅體組成物76。此在水凝膠基質形成期間產生障壁。可使用本文所揭示之外部固定劑之任何實例。
當囊封基質前驅體組成物76包括光引發劑（例如，紫外光自由基引發劑）時，囊封涉及將流體槽10'暴露於紫外輻射。此暴露引發自由基產生，該自由基產生繼而引發保留於腔室14中之囊封基質前驅體組成物76中之組分的交聯或交聯及聚合。交聯或交聯及聚合形成腔室14中之水凝膠基質74。此囊封腔室14內之水凝膠基質74內之樣品72。
當使用在暴露於自由基源時引發交聯之自由基引發劑時，自由基引發劑與囊封基質前驅體組成物76分開引入。在此等實例中，囊封涉及將流體槽10'暴露於自由基引發劑。在此實例中，自由基引發劑可與外部固定劑一起引入。外部固定劑中之自由基引發劑引發囊封基質前驅體組成物76中之自由基產生，其繼而引發保留在腔室14中之囊封基質前驅體組成物76中之組分的交聯或交聯及聚合。交聯形成或交聯及聚合形成腔室14內之水凝膠基質74。此囊封腔室14內之水凝膠基質74內之樣品72。
庫製備可在流體槽10'表面上進行。可移除外部固定劑，且可將緩衝液與庫製備溶液一起引入至流體槽10'。庫製備可如參考圖4C所描述進行。
接著可根據本文所揭示之實例進行接種及叢集及定序。
在另一實例中，水凝膠基質在無交聯劑或自由基引發劑之情況下原位形成於流體槽10'之腔室14中。在此實例中，囊封（水凝膠）基質前驅體組成物中之聚合物在暴露於膠凝溫度時能夠形成凝膠。
在此實例中，流體槽10'可為定序套組之一部分，該定序套組包括流體槽10'及囊封（水凝膠）基質前驅體組成物。
流體槽10'包括複數個腔室14（例如，形成於如參考圖1、圖2A及圖2B所描述之基板12中或上）及附著於複數個腔室14中之每一者內之引子20。應理解，可使用本文所揭示之流體槽之任何實例。
定序套組亦包括由流體及選自由以下者組成之群的聚合物組成之囊封（水凝膠）基質前驅體組成物：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合。當暴露於特定膠凝溫度時，此等聚合物中之每一者可形成凝膠。囊封（水凝膠）基質前驅體組成物不包括樣品。在一實例中，囊封（水凝膠）基質前驅體組成物包括約0.1%（w/v）至約10%（w/v）之一或多種聚合物。在另一實例中，囊封（水凝膠）基質前驅體組成物包括約2%（w/v）至約8%（w/v）之一或多種聚合物。囊封（水凝膠）基質前驅體組成物之流體可為水（例如去離子水）或緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝出售（PBS））。當聚合物為海藻酸酯時，流體為含鈣溶液，因為鈣離子在凝膠形成期間與海藻酸酯交聯。在一實例中，鈣離子之莫耳濃度可在約1 mM至約10 mM之範圍內。
在一實例中，定序套組可進一步包括樣品流體，其包括水及樣品72（例如遺傳物質）。
在一實例中，定序套組可進一步包括庫製備溶液，其包括接頭序列及轉座體。
在使用定序套組之此實例之方法的一實例中，樣品流體（包括遺傳物質之樣品72）及囊封（水凝膠）基質前驅體組成物可在引入至流體槽中之前混合。在一個實例中，樣品流體藉由以下製備：使所需遺傳物質短暫離心、將其懸浮於緩衝溶液中及使溶液升溫至所需溫度（例如42℃）。分別地，在高溫（例如，80℃）下製備聚合物之溶液（例如，含2.5%瓊脂糖之PBS），且使其冷卻（例如，42℃）。接著以所需比率將經濃縮之樣品流體與囊封（水凝膠）基質前驅體組成物組合。在一個實例中，樣品流體與囊封（水凝膠）基質前驅體組成物之混合物具有約2%之聚合物。
可例如通過輸入埠將樣品流體與囊封（水凝膠）基質前驅體組成物之組合引入至流體槽10'。聚合物及樣品進入腔室14中之至少一些。
方法之此實例接著包括在約40℃至約80℃範圍內之溫度下用液體外部固定劑沖洗流體槽10'。在其他實例中，可用液體外部固定劑在約40℃至約70℃或約40℃至約50℃範圍內之溫度下沖洗流體槽10'。可使用液體外部固定劑之任何實例。在一實例中，液體外部固定劑為礦物油且溫度為約42℃。需要沖洗流體槽10'以便移除任何未特異性附著之聚合物。加熱液體外部固定劑可幫助將聚合物洗出間隙區域，而不自腔室14移除聚合物之樣品。
在方法之此實例中，流體槽之溫度為升高或降低至腔室14中之至少一些的聚合物之膠凝溫度。在此溫度下，聚合物進行膠凝且形成囊封遺傳物質之水凝膠基質。在一個實例中，將流體槽10'暴露於聚合物之膠凝溫度涉及將流體槽10'冷卻至膠凝溫度，且將流體槽維持在膠凝溫度下持續預定時間。作為實例，膠凝溫度可為約25℃或更低，且預定時間可至多約30分鐘。當瓊脂糖為聚合物時，膠凝溫度可在約4℃至約20℃之範圍內，且預定時間為約10分鐘。在另一實例中，將流體槽10'暴露於聚合物之膠凝溫度涉及將流體槽10'加熱至膠凝溫度，且將流體槽維持在膠凝溫度下持續預定時間（例如，至多約10分鐘）。
接著可視所使用之樣品而定進行細胞裂解及DNA萃取。
庫製備亦可在流體槽10'表面上進行。可移除外部固定劑，且可將緩衝液與庫製備溶液一起引入至流體槽10'。庫製備可如參考圖4C所描述進行。
接著可根據本文所揭示之實例進行接種及叢集及定序。
為進一步說明本發明，本文給出實施例。應理解，此等實施例係出於說明之目的而提供且不欲理解為限制本發明的範圍。非限制性實施例
實施例 1
將疏水層（CYTOP® S）沈積於絕緣層上矽基板之最外部矽層上，且將正型光阻劑沈積於疏水層上。使用光微影，接著以光阻劑圖案化具有50 µm直徑之微腔室。隨後在光阻圖案之後蝕刻疏水層及最外部矽層。接著剝離光阻劑。
使基板中之微腔室矽烷化，且使PAZAM沈積於其上。洗掉未附著之PAZAM，且接著使P5及P7引子接枝於微腔室中之PAZAM。將蓋子附著於基板。
製備與展示於圖4A中之複合物類似之彼等複合物，平均直徑為3 µm。特定珠粒上之片段來自相同個長DNA分子（來自PhiX基因組）。庫片段經由具有與生物素相比對珠粒表面上之抗生蛋白鏈菌素具有更弱親和力的去硫生物素寡核苷酸附著於固體支撐物。庫片段包括P5及P7序列以及指數序列，及讀段1及讀段2序列。將複合物裝載至微腔室中。
圖6A為說明微腔室中之一者內之複合物中之一者的顯微照片。
藉由自複合物釋放庫片段來引發接種且使用橋式擴增進行叢集。圖6B為源自來自圖6A之複合物之接種庫的叢集之螢光顯微照片。
進行第一鹼基定序，且圖6B之微腔室之即時分析（RTA）展示於圖6C中。圖6D說明自圖6C之微腔室內之讀段獲得之島狀物之實例。圖6D中之結果指示所有讀段來源於長DNA片段之相同碎片。
實施例 2
利用具有兩個通道之玻璃基板製備流體槽。將疏水性材料沈積於玻璃基板上。將正型光阻劑施加至疏水性材料。暴露及顯影正型光阻劑以界定在兩個通道中之每一者中勾勒不同微腔室之圓形圖案。將未顯影之抗蝕劑下方之任何疏水性材料蝕刻掉。此暴露各微腔室之表面。在顯影光阻劑處於適當位置之情況下，將微腔室矽烷化，且使PAZAM沈積於其上。使用剝離技術，藉由光阻劑移除未附著之PAZAM。隨後，使P5及P7引子接枝於微腔室中之PAZAM。使用UV可固化黏著劑將蓋子結合至基板。
在此實例中，微腔室具有不同直徑及間距，且在兩個不同通道中沿著流體槽之長度製備。表1說明通道中之每一者之直徑及間距。表 1
流體槽區塊 第 1 區塊 第 2 區塊 第 3 區塊 第 4 區塊 第 5 區塊
通道 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
圖標識 (i) (vi) (ii) (vii) (iii) (viii) (iv) (ix) (v) (x)
間距 100 µm 20 µm 80 µm 40 µm 60 µm 60 µm 40 µm 80 µm 20 µm 100 µm
直徑 50 µm 10 µm 40 µm 20 µm 30 µm 30 µm 20 µm 40 µm 10 µm 50 µm
用於此實例中之複合物包括固體支撐物及經由抗生物素蛋白-生物素連接子附著於固體支撐物之定序就緒核酸片段。複合物之庫片段與圖4B中所示之彼等庫片段類似。在TruSeq™平台（Illumina公司）方案之後在管中製備無PCR之庫。庫經由與P7引子雜交而結合至珠粒，該等引子經由生物素附著於珠粒。
藉由使含有複合物（雜交緩衝液中之200 µL）之雜交緩衝液流動通過流體槽通道而將複合物引入至流體槽。圖7A為說明在引入複合物之後流體槽通道之各區塊之放大部分的顯微照片。通道及區塊標識與表1對應。如所描繪，在至少一些微孔內分離一或多種複合物。
藉由自複合物釋放庫片段來引發接種。庫釋放係藉由將流體槽加熱高於P7引子之熔融溫度來引發。使片段雜交且進行第一股延伸。固體支撐物及未雜交之片段用0.2 M NaOH溶液移除。隨後使用橋式擴增進行叢集。進行第一鹼基定序，且徽腔室之即時分析（RTA）展示於圖7B中。此等結果說明在接收複合物之微腔室與未接收複合物之彼等徽腔室之間不存在串擾。
實施例 3
以與實施例2中所描述類似之方式形成流體槽。
將用Sytox綠色染色且分散於TRIS HCl洗滌緩衝液（pH 8.1）中之大腸桿菌與囊封基質前驅體混合，且引入流體槽中。接著洗滌流體槽。囊封基質前驅體組成物包括丙烯醯胺單體、過硫酸鉀（KPS）及雙丙烯醯胺。隨後引入含有自由基引發劑（TEMED）之礦物油。油迫使囊封基質進入微腔室中之至少一些中且引發交聯。圖8中之數字1為在形成水凝膠之後徽腔室中之一些之顯微照片。如所描繪，水凝膠形成於徽腔室中之大部分中。
水凝膠基質允許試劑在基質外自由交換，但保留其中之細菌。為了表明此情況，進行洗滌，且隨後藉由將溶菌酶引入至流體槽中來進行細胞分解。將流體槽加熱至約37℃持續約30分鐘以活化溶菌酶。圖8中之數字2為在細胞分解之後的微腔室（數字1之微腔室）之顯微照片。
在蛋白酶K（ProK）存在下進行DNA萃取，該蛋白酶消化污染蛋白質。圖8中之數字3為在DNA萃取之後的微腔室（數字2之微腔室）之顯微照片。
使用具有P7-ME（嵌合體末端）/ME'及P5-ME/ME'接頭混合物之轉座子（來自Illumina公司之NEXTERA™ DNA庫製備套組）進行庫製備。標籤化之後，SDS用於移除蛋白質且用PCR酶進行延伸反應以產生雙股庫。
圖8中之數字4為在庫製備之後之微腔室（數字3之微腔室）之顯微照片。此等結果指示可在流體槽表面上進行現場樣品囊封及水凝膠形成。
實施例 4
採用玻璃基板且其中蝕刻有圓形奈米凹陷。CYTOP® S用作疏水性聚合物（分隔材料18），其跨越玻璃基板（包括在奈米凹陷中）沈積。將光阻劑（Shipley S-1805）施加至疏水性聚合物且顯影以界定用於疏水性聚合物之圓形圖案。疏水性聚合物藉由電漿蝕刻自未覆蓋光阻劑之奈米凹陷移除。接著使經暴露之奈米凹陷矽烷化且用凝膠材料塗佈。凝膠材料為PAZAM。剝離製程接著用以移除光阻劑及光阻劑上之任何凝膠材料。此揭露底層疏水性聚合物。疏水性聚合物在間隙區域上方之Z方向上延伸約1 µm至約2 µm。Z方向係指用於三維空間之笛卡爾座標系（Cartesian coordinate system）之Z軸。在此實施例中，疏水性聚合物界定具有直徑為50 µm之圓形成型腔室。進行引子接枝以使P5及P7引子附著於奈米凹陷中之PAZAM。
製備與展示於圖4A中之彼等複合物類似的複合物。特定珠粒上之片段來自相同長DNA分子。庫片段經由具有與生物素相比對珠粒表面上之抗生蛋白鏈菌素具有更弱親和力的去硫生物素寡核苷酸附著於固體支撐物。將複合物裝載至微腔室中。複合物附著於微腔室表面係藉由錨定物（例如具有與附著於凝膠材料之P5引子雜交的生物素的互補引子或使用點擊化學將炔烴-PEG-生物素連接子共價附接至凝膠材料上之自由疊氮化合物）來實現。引入含自由生物素之具有十二烷基硫酸鈉之生理食鹽水檸檬酸鈉緩衝液，且加熱流體槽至約80℃以自各別複合物釋放庫。通過流體槽抽吸空氣以將自由生物素溶液推出。由於疏水性/親水性表面結構，當液體藉由空氣推出時，小液滴形成於微腔室內部。小液滴防止庫片段擴散至鄰近微腔室。
隨後使所釋放之庫片段與微腔室中之表面引子雜交，且進行延伸步驟以產生互補複本。藉由橋式擴增進行叢集產生。隨後對流體槽進行定序。
圖9說明在定序操作之資料分析之後的流體槽之一部分。原始顏色表示島狀物或基於其在參考基因組上之接近度分組在一起之短讀段。因為各別顏色分離至特定微腔室，推斷給定微腔室中之短讀段為來自基因組DNA的相同碎片且因此來自同一種複合物。此等結果指示微腔室能夠限制各別腔室內之複合物及所釋放之庫片段。
實施例 5
此實施例說明水凝膠之流體槽形成。
採用具有兩個通道之玻璃基板。將不同大小的微腔室蝕刻至玻璃載片中。通道中之每一者中之微腔室的直徑及間距與表1中所示相同。將疏水性材料沈積於玻璃基板上。將正型光阻劑施加至疏水性材料。將正型光阻劑暴露且顯影以界定覆蓋在徽腔室之間的間隙上之疏水性材料。將未顯影之抗蝕劑下方（且因此在徽腔室）之任何疏水性材料蝕刻掉。此暴露各微腔室之表面。在顯影光阻劑處於適當位置之情況下，將微腔室矽烷化，且使PAZAM沈積於其上。使用剝離技術，藉由光阻劑移除未附著之PAZAM。隨後，使P5及P7引子接枝於微腔室中之PAZAM。使用UV可固化黏著劑將蓋子結合至基板。
將囊封基質前驅體引入至流體槽中。接著洗滌流體槽。囊封基質前驅體組成物包括N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、丙烯醯胺及2,2'-偶氮雙(2-甲基丙脒)二氫氯化物。隨後將Evagreen油引入至流體槽。該油迫使囊封基質進入微腔室中之至少一些中。圖10A為在囊封之後2個通道之不同區塊（1-5）中之不同大小的微腔室（參見表1之直徑及間距）之顯微照片。各影像10A(i)-10A(x)之較淺區域描繪微腔室，且較深區域描繪間隙。圖10A(i)至圖10A(x)描繪不論微腔室之大小如何，間隙相對囊封基質較清晰。接著使流體槽暴露於紫外輻射以引發水凝膠形成。接著用TRIS HCl洗滌緩衝液（pH 8.1）洗滌流體槽。圖10B為在水凝膠形成之後2個通道之不同區塊（1-5）中之大小不同的微腔室之顯微照片。各影像10B(i)-10B(x)之較淺區域描繪微腔室，且較深區域描繪間隙。圖10B(i)至圖10B(x)說明不論微腔室之大小，水凝膠形成於徽腔室中之至少一些中。
此外，應理解，本文所提供之範圍包括所陳述範圍及在所陳述範圍內之任何值或子範圍，如同其明確敍述一般。舉例而言，由約2 mm至約300 mm表示之範圍應解釋為不僅包括自約2 mm至約300 mm之明確敍述限值，而且包括個別值，諸如約15 mm、22.5 mm、245 mm等，及子範圍，諸如約20 mm至約225 mm等。
應瞭解，前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合（限制條件為此等概念並不彼此不相容）預期作為本文中所揭示之發明主題的部分。特定言之，在本發明結尾處出現之所主張主題的全部組合預期為本文所揭示之發明主題的部分。亦應瞭解，本文明確採用之術語亦可出現在以引用的方式併入之任何揭示內容中，應符合與本文所揭示之特定概念最一致的含義。
儘管已詳細地描述若干實例，但應理解，可修改所揭示之實例。因此，前述描述應被視為非限制性的。
無
參考以下實施方式及圖式，本發明之實例之特徵將變得顯而易見，在以下實施方式及圖式中，類似的圖式元件符號對應於類似但或許不相同的組件。出於簡潔起見，具有先前所描述功能之圖式元件符號或特徵可以或可以不結合出現該等圖式元件符號或特徵之其他附圖來描述。 [圖1]為流體槽之實例之一部分的透視圖； [圖2]2A及2B為分別沿圖1之線2A-2A及2B-2B拍攝之橫截面圖，其說明流體槽之腔室架構之不同實例； [圖3]3A至3C為說明可用於流體槽中之捕獲部位之不同實例的橫截面圖； [圖4]4A至4C為本文所揭示之複合物之不同實例之示意圖； [圖5]為包括(i)至(iii)之示意性流程圖，其說明其中水凝膠基質形成於流體槽之腔室內之方法的實例； [圖6]6A至6C分別描繪：圖6A)微腔室中之複合物之顯微照片；圖6B)自來自圖6A之微腔室中之複合物之接種庫產生之叢集的顯微照片；及圖6C)在第一鹼基定序操作期間，圖6B之微腔室之即時分析之螢光顯微照片；圖6D說明自圖6C中所示之微腔室讀段獲得之島狀物； [圖7]7A及7B描繪a）在複合物引入之後（圖7A）及b）在對第一鹼基定序操作之即時分析期間（圖7B）的流體槽之5個不同區塊及2個不同通道之部分的顯微照片，其中通道1之區塊1-5中之部分分別標記為(i)-(v)，且通道2之區塊1-5中之部分分別標記為(vi)-(x)； [圖8]說明若干顯微照片，其展現1）關於藉由水凝膠形成流體槽樣品囊封、2）關於流體槽樣品裂解、3）關於流體槽DNA萃取及4）關於流體槽庫製備； [圖9]為在進行定序操作之後流體槽上之不同微腔室之最初有色螢光顯微鏡影像的黑色及白色版本；及 [圖10]10A及10B描繪a）在囊封基質前驅體囊封之後（圖10A）及b）在水凝膠形成之後（圖10B）的流體槽之5個不同區塊及2個不同通道之部分的顯微照片，其中通道1之區塊1-5中之部分分別被標記為(i)-(v)，且通道2之區塊1-5中之部分分別被標記為(vi)-(x)。
2A:線
2B:線
10:流體槽
12:基板
14:腔室
16:凹陷
18:材料
20:引子
22:捕獲部位
W12:壁
W18:壁

Claims (23)

  1. 一種定序套組，該定序套組包含： 流體槽，其包括： 複數個腔室；及 附著於該複數個腔室中之每一者內的引子； 囊封基質前驅體組成物，其由以下者組成： 流體； 包括自由基產生及鏈伸長官能基之單體或聚合物； 自由基源；及 交聯劑；及 作為該囊封基質前驅體組成物之一部分或作為單獨組分之自由基引發劑。
  2. 如請求項1之定序套組，其中以下中之一者： 該單體選自由以下者組成之群：丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、二丙烯酸酯、二烯丙胺、三烯丙胺、二乙烯碸、乙二醇二烯丙醚、乙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化二丙烯酸三羥甲酯、乙氧基化新戊四醇四丙烯酸酯、膠原蛋白單體及其組合；或 該聚合物選自由以下者組成之群：聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯基磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸及其組合；或 該單體與該聚合物之任何組合一起使用。
  3. 如請求項1之定序套組，其中： 該聚合物包括第一聚合物及第二聚合物； 該第一聚合物選自由以下者組成之群：聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯基磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸及其組合；及 該第二聚合物選自由以下者組成之群：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合。
  4. 2或3中任一項之定序套組，其中該自由基引發劑為四甲基乙二胺。
  5. 2或3中任一項之定序套組，其中該自由基引發劑為光引發劑且包括於該囊封基質前驅體組成物中。
  6. 2、3、4或5中任一項之定序套組，其中該自由基源選自由以下者組成之群：過硫酸鉀、過硫酸銨、4,4'-偶氮雙(4-氰戊酸)、1,1'-偶氮雙(環己烷甲腈)、偶氮二異丁腈、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、過氧化物、核黃素、3-(二甲胺基)丙腈及其組合。
  7. 2、3、4、5或6中任一項之定序套組，其中該交聯劑選自由以下者組成之群：丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、1,4-二丙烯醯哌
    Figure 109102492-A0304-12-0000-4
    、N-N' -二烯丙基L-酒石二醯胺及N-N' -(1,2-二羥基伸乙基)雙丙烯醯胺。
  8. 2、3、4、5、6或7中任一項之定序套組，其中各腔室具有底表面，且其中該等引子跨越該底表面附著於聚合物層。
  9. 2、3、4、5、6或7中任一項之定序套組，其中各腔室具有底表面，且其中該等引子分別附著於定位於該底表面上之複數個空間上分離之聚合物島狀物。
  10. 2、3、4、5、6或7中任一項之定序套組，其中各腔室具有底表面及界定於其中之複數個凹陷，且其中該等引子分別附著於該等凹陷中之每一者內的聚合物層。
  11. 2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之定序套組，其進一步包含庫（library）製備溶液，該庫製備溶液包括接頭序列及轉座體（transposome）。
  12. 2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一項之定序套組，其進一步包含包括遺傳物質之樣品流體。
  13. 一種方法，其包含： 將包括遺傳物質之流體引入至流體槽，該流體槽包括： 複數個腔室；及 附著於該複數個腔室中之每一者內的引子； 從而該遺傳物質中之至少一些進入該複數個腔室中之至少一些； 從該流體槽移除該流體之液體； 將囊封基質前驅體組成物引入至該流體槽中，該囊封基質前驅體組成物包括： 包括自由基產生及鏈伸長官能基之單體或聚合物； 自由基源；及 交聯劑； 從而該囊封基質前驅體組成物中之至少一些進入含有該遺傳物質之腔室中之至少一些；及 藉由引發包含於該等腔室中之至少一些中的囊封基質前驅體組成物之交聯或交聯及聚合而將該遺傳物質囊封於該等腔室中之至少一些中的水凝膠基質中。
  14. 如請求項13之方法，其中該囊封基質前驅體組成物進一步包括紫外光自由基引發劑，且其中產生該水凝膠基質是藉由使該流體槽暴露於紫外輻射來實現。
  15. 如請求項13之方法，其中包含於該等腔室中之至少一些中的囊封基質前驅體組成物之交聯或交聯及聚合係藉由將自由基引發劑引入至該流體槽中來實現。
  16. 一種定序套組，該定序套組包含： 流體槽，其包括： 複數個腔室；及 附著於該複數個腔室中之每一者內的引子；及 囊封基質前驅體組成物，其由以下者組成： 流體；及 選自由以下者組成之群之聚合物：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合。
  17. 如請求項16之定序套組，其中該聚合物為海藻酸酯且該流體為含鈣溶液。
  18. 如請求項16或17中任一項之定序套組，其進一步包含庫製備溶液，該庫製備溶液包括接頭序列及轉座體。
  19. 如請求項16、17或18中任一項之定序套組，其進一步包含包括遺傳物質之樣品流體。
  20. 一種方法，其包含： 將包括遺傳物質之流體引入至流體槽，該流體槽包括： 複數個腔室；及 附著於該複數個腔室中之每一者內的引子； 從而該遺傳物質中之至少一些進入該複數個腔室中之至少一些； 將囊封基質前驅體組成物引入至該流體槽中，該囊封基質前驅體組成物包括： 流體；及 選自由以下者組成之群之聚合物：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合； 從而該囊封基質前驅體組成物中之至少一些進入含有該遺傳物質之腔室中之至少一些； 在約40℃至約80℃範圍內之溫度下用液體外部固定劑沖洗該流體槽；及 使該流體槽暴露於該等腔室中之至少一些中的聚合物之膠凝溫度，由此將該遺傳物質囊封於該等腔室中之至少一些中的水凝膠基質中。
  21. 如請求項20之方法，其進一步包含在引入該流體及該囊封基質前驅體組成物期間及在沖洗期間將該流體槽加熱至約40℃至約80℃範圍內之溫度。
  22. 如請求項20之方法，其中使該流體槽暴露至該聚合物之膠凝溫度涉及使該流體槽冷卻至該膠凝溫度且維持該流體槽處於該膠凝溫度持續一段預定時間。
  23. 如請求項20之方法，其中將該流體槽暴露於該聚合物之膠凝溫度涉及將該流體槽加熱至該膠凝溫度且維持該流體槽處於該膠凝溫度持續一段預定時間。
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