JP7027459B2 - ヒドロゲルビーズを用いるdna配列決定 - Google Patents
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Description
本明細書に記載のシステム、方法および組成物は、ポリヌクレオチドの配列の決定および関連するライブラリー作製に用いるための、ヒドロゲルビーズ、およびヒドロゲルビーズ内に長いDNAを封入する方法に関する。
次世代シークエンサーは、1回のシークエンシングランで大量のゲノムデータを産生する強力なツールである。この大量のデータを解釈および分析することは、困難な場合がある。1塩基合成(Sequencing by synthesis:SBS)技術は、高品質のシークエンシング(配列決定)データを提供する。しかしながら、ショートリード(最大リード長が2×300bpである)が、現在のSBSケミストリーの1つの限界である。最近では、一塩基多型(single nucleotide variants:SNP)、挿入/欠失、および構造変異をより良好に捕捉するため、および改善されたゲノム識別のために、より長いDNA分子をシークエンシングすることの重要性が増している。
本明細書に記載されるいくつかの態様は、DNA反応を実施するためのヒドロゲルビーズに関する。ある態様において、ヒドロゲルビーズは、ヒドロゲルポリマー前駆体、架橋剤、およびヒドロゲルビーズ内に配置されたDNAを含む。ある態様において、該ビーズは、DNAを保持しつつ、ビーズからの反応剤の拡散を可能にする細孔を含む。ある態様において、DNAは50,000塩基対以上の長いDNA分子である。
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面中、同様の記号は、一般的に、これと異なる記載がない限り、同様の成分を示している。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載される例示的態様は、限定することを意図していない。本明細書に記載される主題の精神または範囲を逸脱することなく、他の態様を利用すること、および他の変更を加えることが可能である。本明細書に一般的に記載され、図面に示される本開示の側面は、多種多様な異なる構成での配置、置き換え、組み合わせ、分離、および設計が可能であることは容易に理解され、それらの全てが本明細書で明示的に企図されている。
一態様は、ヒドロゲルポリマーおよび遺伝物質を含むビーズを含む。本明細書で用いる用語“ヒドロゲル”は、有機ポリマー(天然または合成)が共有結合、イオン結合、または水素結合により架橋されて、水分子を閉じ込めてゲルを形成する、3次元の開放格子構造を形成するときに形成される物質を意味する。ある態様において、ヒドロゲルは、生体適合性ヒドロゲルであり得る。本明細書で用いる用語“生体適合性ヒドロゲル”は、生細胞に毒性がなく、閉じ込められた細胞への酸素および栄養素の十分な拡散を可能にして生存率を維持するゲルを形成するポリマーを意味する。ある態様において、ヒドロゲルポリマーは、60-90%の液体、例えば水、および10-30%のポリマーを含む。ある態様において、ヒドロゲルの含水量は約70-80%である。
本明細書で提供されるいくつかの態様は、長いDNA断片を封入するビーズを作製する方法に関する。ある態様において、ヒドロゲルビーズは、ボルテックス(vortex)攪拌処理によるエマルジョンにより調製される。本明細書で用いる、ボルテックス攪拌処理によるエマルジョンとは、チューブ、バイアルまたは反応容器などの容器内でヒドロゲルポリマーを長いDNA断片または長いDNA断片の供給源と共にボルテックスすることを意味する。複数の成分が、たとえば手動または機械的なボルテックスまたは振とうによって混合され得る。ある態様において、手動混合により、直径2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140または150μmのサイズ、あるいは該値のいずれか2つで定義される範囲内のサイズを有する遺伝物質を封入するヒドロゲルビーズが得られる。ある態様において、ビーズのサイズは不均一であり、それ故に、ビーズのサイズには種々の直径のビーズが含まれる。
いくつかの態様は、ヒドロゲルビーズにおいて長いDNA分子を調製および処理するためのフロー図を示す図2に示されるように、ビーズ内で長いDNA断片を処理する方法を含む。第一工程において、例えばゲノムデータまたは細胞由来のDNAサンプルを、ヒドロゲルビーズ内に封入する。ある態様において、長いDNA断片は、ヒドロゲルビーズ内に保持され、反応剤はヒドロゲルビーズの細孔を通過できる。ある態様において、反応剤としては、溶解剤、核酸精製剤、タグメンテーション剤、PCR反応剤、または遺伝物質の処理に用いられる他の反応剤が挙げられ得る。従って、ヒドロゲルビーズは、反応剤に対するバリアをヒドロゲルビーズの内外に通過可能にする一方で、長いDNA断片をビーズ内に保持する、ヒドロゲルビーズ内の長いDNA断片の制御された反応のための微小環境を提供する。DNAがビーズ内に封入されると、該プロセスは、サンプルをフローセルにロードして、ライブラリー作製プロセスで長いDNA断片を作製できる次の段階に進む。
本明細書に記載のシステム、方法および組成物のいくつかの態様は、アダプターが標的核酸に連結されている方法を含む。アダプターには、配列決定プライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、およびインデックスを含めることができる。例えば、アダプターは、P5配列、P7配列、またはそれらの相補体を含み得る。本明細書で用いる、P5配列は、配列番号1(AATGATACGGCGACCACCGA)で定義される配列を含み、P7配列は、配列番号2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)で定義される配列を含む。ある態様において、P5またはP7配列はさらに、スペーサーポリヌクレオチドを含んでいてよく、これは約1から20ヌクレオチド長、例えば1から15、または1から10ヌクレオチド長、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチド長である。ある態様において、スペーサーは、10個のヌクレオチドを含む。ある態様において、スペーサーは、ポリTスペーサー、例えば10Tスペーサーである。スペーサーヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの5’末端に含まれていてよく、それは、ポリヌクレオチドの5’末端との結合により適当な支持体に結合され得る。結合は、ポリヌクレオチドの5’末端に存在するホスホロチオエートなどの硫黄含有求核反応剤により達成され得る。ある態様において、ポリヌクレオチドは、ポリTスペーサーおよび5’ ホスホロチオエート基を含み得る。従って、ある態様において、P5配列は、5’ホスホロチオエート-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3’であり、ある態様において、P7配列は、5’ホスホロチオエート-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’である。
実施例1-ヒドロゲルビーズの調製
この実施例は、マイクロ流体液滴発生器を用いて長いDNA断片を封入しているヒドロゲルビーズを調製する1つの態様を示す。
この実施例は、MDAを有する、または有しないヒドロゲルビーズ内に封入された100kbの長いDNA断片のストローブ・リードの1つの態様を示す。
この実施例は、ヒドロゲル内に封入された単一細胞微生物を同定する1つの態様を示す。
この実施例は、フローセル上の空間インデックスの1つの態様を実証する。
Claims (14)
- ヒドロゲルポリマー、
還元剤の存在下で切断される可逆性ポリマー架橋剤、および
ヒドロゲルビーズ内に配置されたDNA
を含むヒドロゲルビーズを得る工程であって、ここで、該ビーズは、DNAを保持しながらビーズを通しての反応剤の拡散を可能にする細孔を含む、工程;
ヒドロゲル内に封入されたDNAを増幅させる工程;
ヒドロゲル内に封入されたDNAに対してタグメンテーションを実施して、ヒドロゲル内に封入されたDNAライブラリーを作製する工程;および
該DNAの配列を決定する工程;
を含む、DNA配列決定法。 - ビーズが50μmから150μmの直径を有する、請求項1に記載のDNA配列決定法。
- ヒドロゲルポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)-チオール/PEG-アクリレート、アクリルアミド/N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン(BACy)、PEG/ポリプロピレンオキシド(PPO)、ポリアクリル酸、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(ビニルスルホン酸)(PVSA)、ポリ(L-アスパラギン酸)、ポリ(L-グルタミン酸)、ポリリシン、寒天、アガロース、アルギン酸塩、ヘパリン、硫酸アルギン酸塩、硫酸デキストラン、ヒアルロン酸、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、またはコラーゲンを含む、請求項1または2に記載のDNA配列決定法。
- DNAが、50,000塩基対以上の長いDNA分子である、請求項1から3のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- 反応剤が、酵素、化合物および50塩基対未満のサイズを有するプライマーを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- 反応剤が、リゾチーム、プロテイナーゼK、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ、トランスポザーゼ、50塩基対未満のサイズを有するプライマー、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、または二価陽イオンを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- 還元剤が、ジチオエリスリトール(DTE)、ジチオスレイトール(DTT)、2-メルカプトエタノールまたはβ-メルカプトエタノール(BME)、2-メルカプトエタノール、グルタチオン、チオグリコール酸、2,3-ジメルカプトプロパノール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(THP)、またはP-[トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン]プロピオン酸(THPP)である、請求項1から6のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- DNAを増幅させる工程が多重置換増幅(MDA)を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- タグメンテーションが、DNAを、トランスポザーゼおよびアダプターを含むトランスポソーム複合体と接触させる工程を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- 固体支持体上にDNAライブラリーをシーディングすることをさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- シーディングが、ヒドロゲルを切断して、該ヒドロゲルからDNAライブラリーを放出させることを含む、請求項10に記載のDNA配列決定法。
- 切断が、ヒドロゲルと開裂酵素ミックスを接触させることを含む、請求項11に記載のDNA配列決定法。
- 開裂酵素ミックスが、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、またはトリス(3-ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP)を含む、請求項12に記載のDNA配列決定法。
- 固体支持体がフローセル装置である、請求項10から13のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
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