JP7457044B2 - ヒドロゲルビーズを用いるdna配列決定 - Google Patents
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Description
本明細書に記載のシステム、方法および組成物は、ポリヌクレオチドの配列の決定および関連するライブラリー作製に用いるための、ヒドロゲルビーズ、およびヒドロゲルビーズ内に長いDNAを封入する方法に関する。
次世代シークエンサーは、1回のシークエンシングランで大量のゲノムデータを産生する強力なツールである。この大量のデータを解釈および分析することは、困難な場合がある。1塩基合成(Sequencing by synthesis:SBS)技術は、高品質のシークエンシング(配列決定)データを提供する。しかしながら、ショートリード(最大リード長が2×300bpである)が、現在のSBSケミストリーの1つの限界である。最近では、一塩基多型(single nucleotide variants:SNP)、挿入/欠失、および構造変異をより良好に捕捉するため、および改善されたゲノム識別のために、より長いDNA分子をシークエンシングすることの重要性が増している。
本明細書に記載されるいくつかの態様は、DNA反応を実施するためのヒドロゲルビーズに関する。ある態様において、ヒドロゲルビーズは、ヒドロゲルポリマー前駆体、架橋剤、およびヒドロゲルビーズ内に配置されたDNAを含む。ある態様において、該ビーズは、DNAを保持しつつ、ビーズからの反応剤の拡散を可能にする細孔を含む。ある態様において、DNAは50,000塩基対以上の長いDNA分子である。
本発明のさらなる態様を、以下に記載する:
[項1]
ヒドロゲルポリマー前駆体;
架橋剤;および
ヒドロゲルビーズ内に配置されたDNAを含む、DNA反応を実施するためのヒドロゲルビーズであって、ここで、該ビーズが、DNAを保持しながらビーズを通しての反応剤の拡散を可能にする細孔を含む、ヒドロゲルビーズ。
[項2]
約50μmから約150μmの直径を有する、項1に記載のビーズ。
[項3]
ヒドロゲルポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)-チオール/PEG-アクリレート、アクリルアミド/N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン(BACy)、PEG/ポリプロピレンオキシド(PPO)、ポリアクリル酸、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(ビニルスルホン酸)(PVSA)、ポリ(L-アスパラギン酸)、ポリ(L-グルタミン酸)、ポリリシン、寒天、アガロース、アルギン酸塩、ヘパリン、硫酸アルギン酸塩、硫酸デキストラン、ヒアルロン酸、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、またはコラーゲンを含む、項1または2に記載のビーズ。
[項4]
架橋剤が、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、エトキシ化トリメチロールトリアクリレート、またはエトキシ化ペンタエリスリトールテトラアクリレートを含む、項1から3のいずれか一項に記載のビーズ。
[項5]
DNAが、50,000塩基対以上の長いDNA分子である、項1から4のいずれか一項に記載のビーズ。
[項6]
反応剤が、酵素、化合物および50塩基対未満のサイズを有するプライマーを含む、項1から5のいずれか一項に記載のビーズ。
[項7]
反応剤が、リゾチーム、プロテイナーゼK、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ(Φ29 DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Bsuポリメラーゼ)、トランスポザーゼ(Tn5)、プライマー(P5およびP7アダプター配列)、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、または二価陽イオンを含む、項1から6のいずれか一項に記載のビーズ。
[項8]
そこに配置されたDNAを封入する分解性ヒドロゲルを有する表面を含む固体支持体を含む、DNA配列決定を実施するためのフローセル装置であって、ここで、該分解性ヒドロゲルが、ヒドロゲルからの反応剤の拡散を可能にするが、DNAが通過するには小さすぎるサイズの細孔を含む、フローセル装置。
[項9]
固体支持体が表面ポリマーで官能化されている、項8に記載のフローセル装置。
[項10]
表面ポリマーが、ポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリルアミド)(PAZAM)またはシラン不含有アクリルアミド(SFA)である、項9に記載のフローセル装置。
[項11]
フローセルがパターン化表面を含む、項8から10のいずれか一項に記載のフローセル装置。
[項12]
パターン化表面がウェルを含む、項11に記載のフローセル装置。
[項13]
ウェルが、直径約10μmから約50μm、例えば直径10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、または50μm、あるいは該値のいずれか2つにより定義される範囲内の直径であり、かつ深さ0.5μmから約1μm、例えば0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、または1μm、あるいは該値のいずれか2つにより定義される範囲内の深さである、項12に記載のフローセル装置。
[項14]
ウェルが疎水性材料で構成されている、項11または12に記載のフローセル装置。
[項15]
疎水性材料が、CYTOP、Fluoropel(登録商標)、またはTeflon(登録商標)などの非晶質フルオロポリマーを含む、項14に記載のフローセル装置。
[項16]
分解性ヒドロゲルが、ヒドロゲルビーズまたはヒドロゲル層である、項8から15のいずれか一項に記載のフローセル装置。
[項17]
ヒドロゲルビーズが、直径約50μmから約150μmである、項16に記載のフローセル装置。
[項18]
ヒドロゲルが、ポリエチレングリコール(PEG)-チオール、PEG-アクリレート、アクリルアミド、N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン(BACy)、PEG、ポリプロピレンオキシド(PPO)、ポリアクリル酸、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(ビニルスルホン酸)(PVSA)、ポリ(L-アスパラギン酸)、ポリ(L-グルタミン酸)、ポリリシン、寒天、アガロース、アルギン酸塩、ヘパリン、硫酸アルギン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヒアルロン酸、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、コラーゲン、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、エトキシ化トリメチロールトリアクリレート、エトキシ化ペンタエリトリトールテトラアクリレート、あるいはそれらの組合せまたは混合物を含む、項8から17のいずれか一項に記載のフローセル装置。
[項19]
ヒドロゲルが、PEG-チオール/PEG-アクリレート、アクリルアミド/N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン(BACy)、またはPEG/PPOを含む、項18に記載のフローセル装置。
[項20]
DNAが、50,000塩基対以上の長いDNA分子である、項8から19のいずれか一項に記載のフローセル装置。
[項21]
反応剤が、酵素、化合物および50塩基対未満のサイズを有するプライマーを含む、項8から20のいずれか一項に記載のフローセル装置。
[項22]
反応剤が、リゾチーム、プロテイナーゼK、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ(Φ29 DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Bsuポリメラーゼ)、トランスポザーゼ(Tn5)、プライマー(P5およびP7アダプター配列)、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、または二価陽イオンを含む、項8から21のいずれか一項に記載のフローセル装置。
[項23]
項8から22のいずれか一項に記載のフローセル装置を保持するように構成されたステージ;
項8から22のいずれか一項に記載のフローセル装置;および
配列決定データを取得するための検出器
を含む、DNA配列決定のためのシステム。
[項24]
項1から7のいずれか一項に記載のDNAを封入しているビーズを得るか、または項8から23のいずれか一項に記載のフローセル装置を提供し;
ヒドロゲル内に封入されたDNAを増幅させ;
ヒドロゲル内に封入されたDNAに対してタグメンテーションを実施し;そして
DNAの配列を決定し、それによりヒドロゲル内に封入されたDNAライブラリーを作製することを含む、
DNA配列決定法。
[項25]
DNAが50,000塩基対以上の長いDNA分子である、項24に記載の方法。
[項26]
タグメンテーションを実施する前に、ヒドロゲル内に封入されたDNAに対してDNA増幅反応を行うことをさらに含む、項24または25に記載の方法。
[項27]
DNA増幅反応が多重置換増幅(MDA)を含む、項26に記載の方法。
[項28]
タグメンテーションが、遺伝物質を、アダプター配列およびトランスポソームを含むトランスポザーゼ混合物と接触させることを含む、項24から27のいずれか一項に記載の方法。
[項29]
固体支持体上にDNAライブラリーをシーディングすることをさらに含む、項24から28のいずれか一項に記載の方法。
[項30]
該シーディングが、ヒドロゲルを切断して、該ヒドロゲルからDNAライブラリーを放出させることを含む、項29に記載の方法。
[項31]
該ヒドロゲルが、ヒドロゲルと開裂酵素ミックスを接触させるか、またはヒドロゲルを約90℃に加熱することにより切断されてDNAライブラリーを放出する、項30に記載の方法。
[項32]
開裂酵素ミックスが、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、またはトリス(3-ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP)を含む、項31に記載の方法。
[項33]
固体支持体がフローセル装置である、項29から32のいずれか一項に記載の方法。
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面中、同様の記号は、一般的に、これと異なる記載がない限り、同様の成分を示している。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載される例示的態様は、限定することを意図していない。本明細書に記載される主題の精神または範囲を逸脱することなく、他の態様を利用すること、および他の変更を加えることが可能である。本明細書に一般的に記載され、図面に示される本開示の側面は、多種多様な異なる構成での配置、置き換え、組み合わせ、分離、および設計が可能であることは容易に理解され、それらの全てが本明細書で明示的に企図されている。
一態様は、ヒドロゲルポリマーおよび遺伝物質を含むビーズを含む。本明細書で用いる用語“ヒドロゲル”は、有機ポリマー(天然または合成)が共有結合、イオン結合、または水素結合により架橋されて、水分子を閉じ込めてゲルを形成する、3次元の開放格子構造を形成するときに形成される物質を意味する。ある態様において、ヒドロゲルは、生体適合性ヒドロゲルであり得る。本明細書で用いる用語“生体適合性ヒドロゲル”は、生細胞に毒性がなく、閉じ込められた細胞への酸素および栄養素の十分な拡散を可能にして生存率を維持するゲルを形成するポリマーを意味する。ある態様において、ヒドロゲルポリマーは、60-90%の液体、例えば水、および10-30%のポリマーを含む。ある態様において、ヒドロゲルの含水量は約70-80%である。
本明細書で提供されるいくつかの態様は、長いDNA断片を封入するビーズを作製する方法に関する。ある態様において、ヒドロゲルビーズは、ボルテックス(vortex)攪拌処理によるエマルジョンにより調製される。本明細書で用いる、ボルテックス攪拌処理によるエマルジョンとは、チューブ、バイアルまたは反応容器などの容器内でヒドロゲルポリマーを長いDNA断片または長いDNA断片の供給源と共にボルテックスすることを意味する。複数の成分が、たとえば手動または機械的なボルテックスまたは振とうによって混合され得る。ある態様において、手動混合により、直径2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140または150μmのサイズ、あるいは該値のいずれか2つで定義される範囲内のサイズを有する遺伝物質を封入するヒドロゲルビーズが得られる。ある態様において、ビーズのサイズは不均一であり、それ故に、ビーズのサイズには種々の直径のビーズが含まれる。
いくつかの態様は、ヒドロゲルビーズにおいて長いDNA分子を調製および処理するためのフロー図を示す図2に示されるように、ビーズ内で長いDNA断片を処理する方法を含む。第一工程において、例えばゲノムデータまたは細胞由来のDNAサンプルを、ヒドロゲルビーズ内に封入する。ある態様において、長いDNA断片は、ヒドロゲルビーズ内に保持され、反応剤はヒドロゲルビーズの細孔を通過できる。ある態様において、反応剤としては、溶解剤、核酸精製剤、タグメンテーション剤、PCR反応剤、または遺伝物質の処理に用いられる他の反応剤が挙げられ得る。従って、ヒドロゲルビーズは、反応剤に対するバリアをヒドロゲルビーズの内外に通過可能にする一方で、長いDNA断片をビーズ内に保持する、ヒドロゲルビーズ内の長いDNA断片の制御された反応のための微小環境を提供する。DNAがビーズ内に封入されると、該プロセスは、サンプルをフローセルにロードして、ライブラリー作製プロセスで長いDNA断片を作製できる次の段階に進む。
本明細書に記載のシステム、方法および組成物のいくつかの態様は、アダプターが標的核酸に連結されている方法を含む。アダプターには、配列決定プライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、およびインデックスを含めることができる。例えば、アダプターは、P5配列、P7配列、またはそれらの相補体を含み得る。本明細書で用いる、P5配列は、配列番号1(AATGATACGGCGACCACCGA)で定義される配列を含み、P7配列は、配列番号2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)で定義される配列を含む。ある態様において、P5またはP7配列はさらに、スペーサーポリヌクレオチドを含んでいてよく、これは約1から20ヌクレオチド長、例えば1から15、または1から10ヌクレオチド長、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチド長である。ある態様において、スペーサーは、10個のヌクレオチドを含む。ある態様において、スペーサーは、ポリTスペーサー、例えば10Tスペーサーである。スペーサーヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの5’末端に含まれていてよく、それは、ポリヌクレオチドの5’末端との結合により適当な支持体に結合され得る。結合は、ポリヌクレオチドの5’末端に存在するホスホロチオエートなどの硫黄含有求核反応剤により達成され得る。ある態様において、ポリヌクレオチドは、ポリTスペーサーおよび5’ ホスホロチオエート基を含み得る。従って、ある態様において、P5配列は、5’ホスホロチオエート-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3’であり、ある態様において、P7配列は、5’ホスホロチオエート-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’である。
実施例1-ヒドロゲルビーズの調製
この実施例は、マイクロ流体液滴発生器を用いて長いDNA断片を封入しているヒドロゲルビーズを調製する1つの態様を示す。
この実施例は、MDAを有する、または有しないヒドロゲルビーズ内に封入された100kbの長いDNA断片のストローブ・リードの1つの態様を示す。
この実施例は、ヒドロゲル内に封入された単一細胞微生物を同定する1つの態様を示す。
この実施例は、フローセル上の空間インデックスの1つの態様を実証する。
Claims (10)
- ヒドロゲルポリマー;
還元剤の存在下で切断される可逆性ポリマー架橋剤N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン(BACy);および
ヒドロゲルビーズ内に配置された、300塩基対以上の長さのDNA
を含む、ヒドロゲルビーズであって、ここで、該ビーズが、DNAを保持しながらビーズを通してのリゾチーム、プロテイナーゼK、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ、トランスポザーゼ、50塩基対未満のサイズを有するプライマー、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤または二価陽イオンを含む反応剤の拡散を可能にする細孔を含む、核酸反応を行うためのヒドロゲルビーズ。 - 50μmから150μmの直径を有する、請求項1に記載のビーズ。
- DNAが、50,000塩基対以上の長いDNA分子である、請求項1または2に記載のビーズ。
- 還元剤が、ジチオエリスリトール(DTE)、ジチオスレイトール(DTT)、2-メルカプトエタノールまたはβ-メルカプトエタノール(BME)、2-メルカプトエタノール、グルタチオン、チオグリコール酸、2,3-ジメルカプトプロパノール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(THP)またはP-[トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン]プロピオン酸(THPP)である、請求項1から3のいずれか一項に記載のビーズ。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のヒドロゲルビーズを得る工程;
ヒドロゲルビーズ内に封入されたDNAを増幅させる工程;
ヒドロゲルビーズ内に封入されたDNAに対してタグメンテーションを実施する工程;および
DNAの配列を決定し、それによりヒドロゲルビーズ内に封入されたDNAライブラリーを作製する工程
を含む、DNA配列決定法。 - DNAが50,000塩基対以上の長さを有する、請求項5に記載のDNA配列決定法。
- DNAを増幅させる工程が多重置換増幅(MDA)を含む、請求項5に記載のDNA配列決定法。
- タグメンテーションが、DNAを、トランスポザーゼおよびアダプターを含むトランスポソーム複合体と接触させることを含む、請求項5から7のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- ヒドロゲルビーズと開裂酵素ミックスを接触させることにより該ヒドロゲルビーズが切断されてDNAライブラリーを放出することをさらに含む、請求項5から8のいずれか一項に記載のDNA配列決定法。
- 開裂酵素ミックスが、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)またはトリス(3-ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP)を含む、請求項9に記載のDNA配列決定法。
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