CN115004009A - 用于细胞样校准颗粒的组合物和方法 - Google Patents

用于细胞样校准颗粒的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115004009A
CN115004009A CN202180010776.XA CN202180010776A CN115004009A CN 115004009 A CN115004009 A CN 115004009A CN 202180010776 A CN202180010776 A CN 202180010776A CN 115004009 A CN115004009 A CN 115004009A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydrogel
cell
fluorescence
hydrogel particle
characteristic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180010776.XA
Other languages
English (en)
Inventor
J·金姆
A·T·阮
B·米勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Slingshot Biosciences Inc
Original Assignee
Slingshot Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Slingshot Biosciences Inc filed Critical Slingshot Biosciences Inc
Publication of CN115004009A publication Critical patent/CN115004009A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1012—Calibrating particle analysers; References therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L33/00—Compositions of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides or nitriles thereof; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L33/24—Homopolymers or copolymers of amides or imides
    • C08L33/26—Homopolymers or copolymers of acrylamide or methacrylamide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1468—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G01N15/147—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G01N2015/1014—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
    • G01N21/274—Calibration, base line adjustment, drift correction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
    • G01N21/274—Calibration, base line adjustment, drift correction
    • G01N21/278—Constitution of standards
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种方法包括通过将水凝胶颗粒插入用于分析靶细胞的细胞计数装置中来校准所述细胞计数装置。所述水凝胶颗粒具有与所述靶细胞的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种基本上类似的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种。所述方法还包括使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的至少一种特性。

Description

用于细胞样校准颗粒的组合物和方法
相关应用的交叉引用
本申请要求2020年1月24日提交的标题为“用于细胞样校准颗粒的组合物和方法(Compositions and Methods for Cell-Like Calibration Particles)”的美国临时申请号62/965,494的优先权和益处，将其全部公开内容通过引用以其整体并入本文。
本申请涉及2018年3月13日授权且标题为“具有可调光学特性的水凝胶颗粒”的美国专利号9,915,598，并且涉及2017年7月25日授权且标题为“具有可调光学特性的水凝胶颗粒及其使用方法”的美国专利号9,714,897，将其每一个的全部公开内容通过引用并入本文以用于所有目的。
技术领域
本公开文本涉及流式细胞术，并且更具体地涉及水凝胶珠基底，其展现出细胞样自体荧光，从而能够实现更精确的荧光和光谱校准和补偿。
背景技术
流式细胞术和血液学分析是允许快速分离、计数和表征单独细胞的技术，并且通常在临床和实验室环境中用于各种应用。所述技术依赖于将光束引导到聚焦的液体流上。在一些实施中，多个检测器随后瞄准所述流通过光束的点：一个检测器与光束一致(前向散射或“FSC”)且若干个检测器垂直于光束(侧向散射或“SSC”)。FSC通常与细胞体积相关，而SSC取决于颗粒的内部复杂性或粒度(即细胞核的形状、细胞质颗粒的量和类型或膜粗糙度)。由于这些相关性，因此不同的特定细胞类型展现出不同的FSC和SSC，从而允许在流式细胞术中区分细胞类型。这些测量构成了细胞计数分析的基础。在其他形式的细胞计数法中，对细胞成像，并记录细胞的描述性特征(如大小/形状/体积)以及在一些情况下的生化特征。除了这些测量之外，还经常在许多荧光通道中或使用光谱分析仪分析细胞。这些检测模式用于区分不同细胞群体之间的生物标记物曲线和其他生物学特征。
用于细胞分析的大多数合成或聚合物产品由塑料材料制成，如聚苯乙烯(乳胶)，其是一种通常具有基于颗粒直径的固定的前向和侧向散射曲线的不透明的聚合物。此外，聚苯乙烯在重要的检测通道中具有高自体荧光，即使在没有荧光团或相关生物标记物的情况下，其也会导致背景荧光信号。在其他情况下，聚苯乙烯的自体荧光比细胞材料低得多，从而导致不准确的补偿和光谱分离。总体而言，聚苯乙烯固有的自体荧光使其在许多情况下不适合用于荧光校准和补偿。具体地，罕见或低表达的生物标记物无法与聚苯乙烯颗粒适当地区分开，因此无法将其用作对照/标准品。此外，来自聚苯乙烯颗粒的自体荧光可能导致虚假的荧光共振能量转移(FRET)，这会导致依赖FRET功能的染料(例如，串联染料)的信噪比较差。由聚苯乙烯引起的自体荧光干扰在光谱分析中加剧，所述光谱分析可分辨给定靶标相比于分离的荧光通道的完整光谱曲线。总之，聚苯乙烯的这些固有局限性使其在使用一系列荧光物、尤其是在紫色和紫外线范围内显示激发或发射曲线的荧光物进行校准和补偿时作为基底的效果不佳。
若干种关键的细胞计数仪器设置程序依赖于校准颗粒尽可能接近地模拟细胞的能力。在细胞计数法中，补偿是对不同荧光物的发射光谱的通道之间信号重叠的数学校正。当使用多个独特的荧光团分析不同的生化靶标时，补偿是至关重要的，因为区分真实的信号响应与“溢出”信号或来自不同荧光通道的干扰非常重要。在一些已知的实施中，荧光补偿使用基于聚苯乙烯的对照来证明给定抗体/荧光团的组的荧光分辨率。然而，由于聚苯乙烯的自体荧光，存在全部类别的荧光团(例如，串联染料、UV/紫色响应染料)，其中许多不能有效地补偿现有的基于珠的聚苯乙烯产品。聚苯乙烯的自体荧光和不良性能从根本上限制了细胞分析过程中使用的荧光团的复杂性和多样性。
因此，需要更接近地模拟实际细胞的自体荧光的基底。
发明内容
在一些实施方案中，一种方法包括通过将水凝胶颗粒插入用于分析靶细胞的细胞计数装置中来校准所述细胞计数装置。所述水凝胶颗粒具有与所述靶细胞的自体荧光特性或光谱特性中的至少一种基本上类似的自体荧光特性或光谱特性中的至少一种。所述方法还包括使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的至少一种特性。
在本公开文本的一些实施方案中，一种组合物包含水凝胶颗粒，与聚苯乙烯(例如，乳胶)的自体荧光曲线或光谱曲线相比，所述水凝胶颗粒具有更类似于细胞的自体荧光曲线或光谱曲线，如通过细胞计数装置所测量。
在其他实施方案中，本公开文本提供了产生水凝胶颗粒的方法，所述水凝胶颗粒具有与靶细胞的相应自体荧光特性或光谱特性基本上类似的自体荧光特性或光谱特性。本公开文本还阐述了制备具有预先确定的自体荧光特性和/或光谱特性的水凝胶颗粒的方法。本公开文本还阐述了校准用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法，所述方法包括：a)将具有与所述靶细胞的相应自体荧光特性和/或光谱特性基本上类似的自体荧光特性和/或光谱特性的水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中；和b)使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的荧光特性和/或光谱特性，从而校准用于分析所述靶细胞的细胞计数装置。
在一些实施方案中，一种方法包括计算靶细胞的细胞计数测量值的补偿值，以及基于所述补偿值修改所述靶细胞的细胞计数测量值。计算所述靶细胞的细胞计数测量值的补偿值包括在第一时间将第一水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中。所述第一水凝胶颗粒具有与所述靶细胞的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种基本上类似的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种。使用所述细胞计数装置测量所述第一水凝胶颗粒的至少一种特性。所述计算还包括在不同于所述第一时间的第二时间将第二水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中，以及使用所述细胞计数装置测量所述第二水凝胶颗粒的至少一种特性。所述计算还包括将所述第一水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性与所述第二水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性进行比较以确定所述补偿值。
附图说明
图1A示出了根据一些实施方案的(A)本公开文本的水凝胶颗粒、(B)聚苯乙烯珠的示例性光学特性。
图1B示出了聚苯乙烯珠的光学特性，其与图1A(A)的水凝胶颗粒的光学特性形成对照。
图2描绘了根据一些实施方案的聚苯乙烯与本公开文本的实际/靶细胞或水凝胶颗粒的散射曲线之间的差异。
图3示出了根据一些实施方案可将水凝胶的自体荧光或光谱特性工程化为匹配靶细胞群体的自体荧光或光谱特性的方式。
图4示出了根据一些实施方案独立地调节工程化水凝胶的每种特性以匹配任何靶细胞的被动光学散射、自体荧光、生物标记物和荧光特性的能力。
图5示出了根据一些实施方案产生水凝胶颗粒的示例性方法。
图6是强度与波长/通道的关系图，其展示了荧光补偿的原理。
图7A-图7C包括数据的图，其显示了根据一些实施方案在一系列荧光和光谱检测器上人细胞与聚苯乙烯颗粒和水凝胶颗粒的比较。
图8A是用Alexa 700修饰的抗体(“Ab”)染色的淋巴细胞的光谱曲线，并且图8B是根据一些实施方案的本公开文本的水凝胶颗粒的光谱曲线，显示出其与图8A的淋巴细胞的光谱曲线一致。
图9是显示根据一些实施方案用于校准用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法的流程图。
图10是显示根据一些实施方案使用本公开文本的水凝胶进行校准和计算荧光补偿和/或光谱分离的过程的流程图。
图11A-图11D是示出根据一些实施方案在细胞染色、水凝胶补偿珠和已知(基于聚苯乙烯的)产品之间的比较的条形图。
图12是根据一些实施方案比较聚苯乙烯和细胞对照的自体荧光与具有各种组成和特性的本公开文本的示例性水凝胶的自体荧光。
具体实施方式
用于流式细胞仪的若干种已知校准测量(如激光间延迟、荧光响应、分选时间和荧光补偿)使用聚苯乙烯珠。这些校准测量对于细胞仪的准确性能以及细胞群体的任何下游分析或分选至关重要。尽管与使用细胞对照相比，聚苯乙烯是稳健且低成本的，但与细胞相比，其展现出内在不同的光学和荧光行为。作为结果，除最基本的校准过程外，聚苯乙烯珠在所有细胞对照中都代表较差的替代物。
为了克服聚苯乙烯的局限性，有时在仪器设置和校准期间使用细胞，然而此类方法遭受批次间可变性、高成本、较差的保质期和生物危害性运输/处理限制。细胞大小的变化以及用户准备的细胞之间的差异使它们不适合于某些仪器校准对照。此外，在检查罕见疾病时，细胞对照材料通常对来源具有挑战性。
与聚苯乙烯相比，本发明的颗粒显示细胞样自体荧光和光谱曲线，从而允许更灵敏的仪器校准、更好的荧光补偿和更好的总体实验数据分辨率。所述颗粒也是合成制造的，其允许高的批次间精度，而没有使用细胞对照时的任何缺点。
如图1A-图1B和图2所示，聚苯乙烯颗粒在其可以具有的光学特性(如前向和侧向散射)方面受到根本限制。这在很大程度上是由于与细胞相反，它们是不透明的，因此侧向散射是颗粒大小的直接函数，而不是内部细胞复杂性的函数。例如，图1A(A)显示了本公开文本的工程化水凝胶颗粒的示例性光学特性，其中来自激发光源的光可以与工程化水凝胶颗粒的内部结构相互作用以产生关于该内部结构的侧向散射信息。相比之下，图1A(B)和图1B显示了聚苯乙烯珠的示例性光学特性，其中来自激发光源的光不与聚苯乙烯珠的内部结构相互作用，因此所得到的侧面散射信息有限。此外，如图2所示，与实际细胞(例如，靶生物细胞)相比，聚苯乙烯珠在侧向散射曲线上具有3-4个数量级的差异。此外，聚苯乙烯在许多通道中具有高自体荧光，甚至在没有荧光团的情况下也具有高自体荧光，这导致较差的检测器分辨率(参见例如图7A-7C，下面将进一步讨论)。在其他情况下，当与细胞材料相比时，聚苯乙烯具有低自体荧光，从而导致不准确的染色指数计算、补偿或光谱分离。这种现象使得准确测量样品中罕见或表达不佳的生物标记物非常困难或不可能。这也导致在聚苯乙烯发出自体荧光的通道中较差的补偿性能。由于聚苯乙烯的这些局限性，因此用户通常必须依靠纯化的细胞系来校准荧光强度、荧光补偿、激光间延迟、分选延迟、大小和细胞复杂性以进行免疫表型分型实验。这是一个漫长且劳动密集型的过程，其大大增加了流式细胞术验证和研究管线的成本。更重要的是，这些校准细胞系引入了生物变化，导致免疫表型分型数据解释的差异。
为了将多个荧光团用于给定的生物标记物表型分型实验，所述荧光团在细胞计数仪器上应是可区分的。当与含有同源生物标记物/抗原的细胞结合时，给定抗体的荧光曲线可以用于与在同一“组”试剂中使用的其他抗体-荧光团组合进行比较。由于使用细胞进行荧光补偿具有挑战性，因此聚苯乙烯珠通常在荧光补偿设置期间用作替代物。然而，聚苯乙烯的背景自体荧光导致较差的检测器分辨率、不准确的补偿矩阵计算、背景自体荧光以及较差的检测阈值下限。
本公开文本的实施方案提供了包含水凝胶颗粒的组合物，所述水凝胶颗粒具有与靶细胞(例如人细胞)的背景荧光特性基本上类似的背景荧光特性(例如自体荧光)，并且克服了上面讨论的聚苯乙烯的各种缺点。本文所述的水凝胶颗粒可以具有与靶细胞的背景光谱曲线基本上类似的背景光谱曲线。本发明人意外地发现，可以通过改变水凝胶颗粒的组成独立地调节水凝胶颗粒的荧光特性。此外，作者已发现，水凝胶颗粒的背景荧光特性可以在不影响颗粒的基线光学特性的情况下进行调节(即，自体荧光可以独立于前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)进行调节)。该特性使水凝胶能够精确地模拟如通过细胞计数装置测量的靶细胞的光学和自体荧光特性二者。
本公开文本还提供了制备水凝胶颗粒的方法，其中所述水凝胶颗粒具有与靶细胞的荧光特性基本上类似的荧光特性。本发明还提供了制备水凝胶颗粒的方法，其中所述水凝胶颗粒具有预先确定的光学特性或荧光特性。还提供了一种校准用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法，所述方法包括：a)将具有与所述靶细胞的荧光特性基本上类似的荧光特性的水凝胶颗粒插入所述装置中；b)使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的荧光特性，从而校准用于分析所述靶细胞的细胞计数装置。已知的细胞计数装置包括用于进行流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、血液学和高含量成像的可商购装置。
水凝胶
本公开文本的水凝胶颗粒包含水凝胶。水凝胶是包含大分子三维网络的材料，当存在水时所述大分子三维网络允许其膨胀，并且在不存在水(或通过减少水的量)的情况下收缩，但不溶于水。溶胀(即水的吸收)是附接至或分散在大分子网络中的亲水官能团的存在的结果。相邻大分子之间的交联导致这些水凝胶的水不溶性。交联可能是由于化学(例如，共价)或物理(例如，范德华力、氢键合、离子力等)键所致。虽然聚合物工业中的一些可以将本文所述的一种或多种大分子材料在干燥状态下称为“干凝胶”且在水合状态下称为“水凝胶”，但出于本公开文本的目的，术语“水凝胶”是指脱水的或水合的大分子材料。具有特殊价值的水凝胶的特征是，无论是脱水的还是水合的，所述材料都保持其一般形状。因此，如果水凝胶在脱水条件下具有近似球形的形状，则在水合条件下它将是球形的。
根据一些实施方案，本公开文本的所公开的水凝胶可以包含例如大于约30％水、大于约40％水、大于约50％水、大于约55％水、大于约60％水、大于约65％水、大于约70％水、大于约75％水、大于约80％水或大于约85％水。
合成制备的水凝胶可以通过使单体材料聚合以形成骨架并将骨架用交联剂交联来制备。常见的水凝胶单体包括：乳酸、乙醇酸、丙烯酸、甲基丙烯酸1-羟乙酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙二醇酯、丙烯酰胺、N-乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸二醇、乙二醇、富马酸等。常见的交联剂包括二甲基丙烯酸四甘醇酯和N,N'-15亚甲基双丙烯酰胺。在一些实施方案中，本公开文本的水凝胶颗粒通过丙烯酰胺的聚合来制备。
在一些实施方案中，水凝胶包含至少一种单官能单体和至少一种双官能单体的混合物。
单官能单体可以是单官能丙烯酸单体。单官能丙烯酸单体的非限制性例子是丙烯酰胺；甲基丙烯酰胺；N-烷基丙烯酰胺(如N-乙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺或N-叔丁基丙烯酰胺)；N-烷基甲基丙烯酰胺(如N-乙基甲基丙烯酰胺或N-异丙基甲基丙烯酰胺)；N,N-二烷基丙烯酰胺(如N,N-二甲基丙烯酰胺和N,N-二乙基丙烯酰胺；N-[(二烷基氨基)烷基]丙烯酰胺(如N-[3-二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺或N-[3-(二乙基氨基)丙基]丙烯酰胺)；N-[(二烷基氨基)烷基]甲基丙烯酰胺(如N-[3-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺或N-[3-(二乙基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺)；(二烷基氨基)烷基丙烯酸酯(如2-(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(二甲基氨基)丙基丙烯酸酯或2-(二乙氨基)乙基丙烯酸酯)；和(二烷基氨基)烷基甲基丙烯酸酯(如2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)。
双官能单体是可与本公开文本的单官能单体聚合以形成如本文所述的水凝胶的任何单体，所述水凝胶进一步含有可参与第二反应(例如，荧光团的缀合)的第二官能团。
在一些实施方案中，双官能单体选自：烯丙醇、异硫氰酸烯丙酯、烯丙基氯和烯丙基马来酰亚胺。
双官能单体可以是双官能丙烯酸单体。双官能丙烯酸单体的非限制性例子是N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N'-亚乙基双丙烯酰胺、N,N'-亚乙基双甲基丙烯酰胺、N,N’亚丙基双丙烯酰胺和N,N'-(l,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺。
可以在聚合物混合物取代更高阶的支链和直链共聚单体，以在保持聚合物密度的同时调整折射率，如美国专利号6,657,030中所述，将其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，水凝胶包含调节水凝胶的光学特性的分子。下面将进一步讨论能够改变水凝胶光学特性的分子。
可用于本发明的天然存在的水凝胶包括可从天然来源(如植物、藻类、真菌、酵母、海洋无脊椎动物和节肢动物)获得的各种多糖。非限制性例子包括琼脂糖、葡聚糖、几丁质、基于纤维素的化合物、淀粉、衍生化淀粉等。这些通常具有重复的葡萄糖单位作为多糖骨架的主要部分。
水凝胶的聚合可以通过过硫酸盐引发。过硫酸盐可以是任何水溶性过硫酸盐。水溶性过硫酸盐的非限制性例子是过硫酸铵和碱金属过硫酸盐。碱金属包括锂、钠和钾。在一些优选的实施方案中，过硫酸盐是过硫酸铵或过硫酸钾，更优选地，其是过硫酸铵。
水凝胶的聚合可以通过促进剂来加速。促进剂可以是叔胺。叔胺可以是任何水溶性叔胺。优选地，所述叔胺是N,N,N',N’四甲基乙二胺或3-二甲基氨基)丙腈，更优选地，其是N,N,N',N’四甲基乙二胺(TEMED)。
水凝胶颗粒
在一个方面，本公开文本的水凝胶颗粒包含水凝胶并且通过使液滴聚合而产生(参见图5)。产生多个液滴(包括流体和刚化液滴)的微流体方法是已知的，并且在美国专利申请公开号2011/0218123和美国专利号7,294,503中进行了描述，将其每一个的全部内容通过引用以其整体并入本文。此类方法提供了含有第一流体且基本上由第二流体包围的多个液滴，其中所述第一流体和所述第二流体是基本上不混溶的(例如，含有水基液体的液滴基本上被油基液体包围)。在另一种形式中，经由沉淀或化学聚合产生水凝胶颗粒。在另一种形式中，经由膜乳化产生水凝胶颗粒。在另一种形式中，经由压电分散形成水凝胶颗粒。
多个流体液滴(例如，使用微流体装置制备的)可以是多分散的(例如，具有一系列不同尺寸)，或者在一些情况下，所述流体液滴可以是单分散的或基本上单分散的，例如具有均匀的直径分布，例如，使得不超过约10％、约5％、约3％、约1％、约0.03％或约0.01％的液滴具有大于平均直径的约10％、约5％、约3％、约1％、约0.03％或约0.01％的平均直径。如本文所用，液滴群体的平均直径是指液滴直径的算术平均值。
因此，本公开文本提供了包含多个水凝胶颗粒的水凝胶颗粒群体，其中所述水凝胶颗粒群体基本上是单分散的。
术语微流体是指包括至少一个流体通道的装置、设备或系统，所述至少一个流体通道的截面尺寸小于1mm，并且长度与垂直于所述通道的最大截面尺寸的比率为至少约3:1。包括微流体通道的微流体装置特别适合于制备多个单分散液滴。
可与本发明一起使用的微流体系统的非限制性例子包括在以下专利申请中公开的那些：美国专利申请公开号2006/0163385(“流体种类的形成和控制(Forming andControl of Fluidic Species)”)、美国专利申请公开号2005/0172476(“用于流体分散的方法和设备(Method and Apparatus for Fluid Dispersion)”)、美国专利申请公开号2007/000342(“流体种类的电子控制(Electronic Control of Fluidic Species)”)、国际专利申请公开号WO 2006/096571(“用于形成多重乳液的方法和设备(Method andApparatus for Forming Multiple Emulsions)”)、美国专利申请公开号2007/0054119(“形成颗粒的系统和方法(Systems and Methods of Forming Particles)”)、国际专利申请公开号WO 2008/121342(“乳液和形成技术(Emulsions and Techniques forFormation)”)以及国际专利申请公开号WO 2006/078841(“用于形成包封在颗粒如胶体颗粒中的流体液滴的系统和方法(Systems and Methods for Forming Fluidic DropletsEncapsulated in Particles Such as Colloidal Particles)”)，将其每一个的全部内容通过引用以其整体并入本文。
液滴大小与微流体通道大小有关。微流体通道可以具有任何大小，例如，具有如下垂直于流体流的最大尺寸：小于约5mm或2mm、或小于约1mm、或小于约500μm、小于约200μm、小于约100μm、小于约60μm、小于约50μm、小于约40μm、小于约30μm、小于约25μm、小于约10μm、小于约3μm、小于约1μm、小于约300nm、小于约100nm、小于约30nm或小于约10nm。
可以通过调整相对流速来调节液滴大小。在一些实施方案中，液滴直径等于通道的宽度，或在通道的宽度的约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内。
本公开文本的水凝胶颗粒的尺寸基本上类似于构成其的液滴。因此，在一些实施方案中，水凝胶颗粒具有如下直径：直径小于约1μm、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800或小于1000μm。在一些实施方案中，水凝胶颗粒具有如下直径：直径大于约1μm、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800或大于1000μm。在典型的实施方案中，水凝胶颗粒具有在5μm至100μm的范围内的直径。
在一些实施方案中，本公开文本的水凝胶颗粒是球形形状。
在一些实施方案中，与具有相同直径的聚苯乙烯珠相比，本公开文本的水凝胶颗粒具有更接近地类似于靶细胞的材料模量特性(例如，弹性)。
在一些实施方案中，本公开文本的水凝胶颗粒不包含琼脂糖。
光学特性
被动光学特性和非被动光学特性(例如，荧光特性)
对于流式细胞术的反卷积的三种主要模式是颗粒的两种被动光学特性(前向散射，FSC，对应于折射率或RI；和侧向散射，SSC)和荧光，这是一种非被动光学特性(即，由不是基础聚合物组分的分子(如荧光团、荧光物或量子点)赋予的特性，并且代表存在于给定细胞类型表面上的生物标记物，所述生物标记物通常使用具有缀合的荧光团的抗体来测量。因此，允许本公开文本的水凝胶颗粒关于这三种模式来模拟特定细胞类型的组合物可用于提供用于流式细胞术的合成的、稳健的校准物。
在一些实施方案中，所公开的水凝胶颗粒的折射率(RI)大于约1.10、大于约1.15、大于约1.20、大于约1.25、大于约1.30、大于约1.35、大于约1.40、大于约1.45、大于约1.50、大于约1.55、大于约1.60、大于约1.65、大于约1.70、大于约1.75、大于约1.80、大于约1.85、大于约1.90、大于约1.95、大于约2.00、大于约2.10、大于约2.20、大于约2.30、大于约2.40、大于约2.50、大于约2.60、大于约2.70、大于约2.80或大于约2.90。
在一些实施方案中，所公开的水凝胶颗粒的折射率(RI)小于约1.10、小于约1.15、小于约1.20、小于约1.25、小于约1.30、小于约1.35、小于约1.40、小于约1.45、小于约1.50、小于约1.55、小于约1.60、小于约1.65、小于约1.70、小于约1.75、小于约1.80、小于约1.85、小于约1.90、小于约1.95、小于约2.00、小于约2.10、小于约2.20、小于约2.30、小于约2.40、小于约2.50、小于约2.60、小于约2.70、小于约2.80或小于约2.90。
与靶细胞相比，最有意义地测量所公开的水凝胶颗粒的SSC。在一些实施方案中，所公开的水凝胶颗粒的SSC在靶细胞的SSC的30％内、25％内、20％内、15％内、10％内、5％内或1％内，如通过细胞计数装置所测量。
与靶细胞相比，最有意义地测量所公开的水凝胶颗粒的FSC。在一些实施方案中，所公开的水凝胶颗粒的FSC在靶细胞的FSC的30％内、25％内、20％内、15％内、10％内、5％内或1％内，如通过细胞计数装置所测量。
可以通过在水凝胶中掺入高折射率分子来调节水凝胶的FSC。优选的高折射率分子包括胶体二氧化硅、丙烯酸烷基酯和甲基丙烯酸烷基酯。因此，在一些实施方案中，本公开文本的水凝胶颗粒包含丙烯酸烷基酯和/或甲基丙烯酸烷基酯。
丙烯酸烷基酯或甲基丙烯酸烷基酯可以在烷基基团(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基、2-乙基己基、庚基或辛基基团)中含有1至18、1至8或2至8个碳原子。所述烷基基团可以是支链的或直链的。
高折射率分子还可以包括芳乙烯类，如乙烯基芳烃如苯乙烯和甲基苯乙烯，任选地在芳环上被烷基基团(如甲基、乙基或叔丁基)取代或被卤素取代(如氯苯乙烯)。
在一些实施方案中，通过调整水凝胶形成过程中存在的水含量来调节FSC。
FSC与颗粒体积有关，因此可以如本文所述通过改变颗粒直径来调节。
SSC可以通过将纳米颗粒包封在水凝胶内以模拟靶细胞中的细胞器来进行工程化。在一些实施方案中，本公开文本的水凝胶颗粒包含选自以下的一种或多种类型的纳米颗粒：聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)纳米颗粒、聚苯乙烯(PS)纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒。
水凝胶颗粒的官能化
水凝胶颗粒可以被官能化，以使其模拟标记的细胞的光学和荧光特性。在一些实施方案中，水凝胶颗粒包含双官能单体，并且水凝胶颗粒的官能化经由所述双官能单体发生。在典型的实施方案中，官能化水凝胶颗粒包含游离胺基团。
水凝胶颗粒可以用本领域已知的荧光物的荧光染料官能化，所述荧光染料包括The
Figure BDA0003761003750000071
Handbook—荧光探针和标记技术的指南中所述的荧光染料，将其通过引用以其整体并入本文。官能化可以通过包含游离胺基团(例如烯丙胺)的化合物介导，所述化合物可以在形成过程中被掺入水凝胶颗粒中。
已知荧光染料的非限制性例子包括：6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基伊红；5-羧基荧光素；6-羧基荧光素；5-(和-6)-羧基荧光素；5-羧基荧光素-双-(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)醚,-丙氨酸-甲酰胺或琥珀酰亚胺酯；5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素；2',7'-二氟荧光素；伊红-5-异硫氰酸盐；赤藓红5-异硫氰酸盐；6-(荧光素-5-甲酰氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；6-(荧光素-5-(和-6)-甲酰氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；荧光素-5-EX琥珀酰亚胺酯；荧光素-5-异硫氰酸盐；荧光素-6-异硫氰酸盐；
Figure BDA0003761003750000072
488羧酸或琥珀酰亚胺酯；Oregon
Figure BDA0003761003750000073
488异硫氰酸盐；Oregon
Figure BDA0003761003750000074
488-X琥珀酰亚胺酯；Oregon
Figure BDA0003761003750000075
500羧酸；Oregon
Figure BDA0003761003750000076
500羧酸、琥珀酰亚胺酯或三乙基铵盐；Oregon
Figure BDA0003761003750000077
514羧酸；Oregon
Figure BDA0003761003750000078
514羧酸或琥珀酰亚胺酯；RhodamineGreenTM羧酸、琥珀酰亚胺酯或盐酸盐；Rhodamine GreenTM羧酸、三氟乙酰胺或琥珀酰亚胺酯；Rhodamine GreenTM-X琥珀酰亚胺酯或盐酸盐；RhodolGreenTM羧酸、N,0-双-(三氟乙酰基)或琥珀酰亚胺酯；双-(4-羧基哌啶基)磺酰罗丹明(sulfonerhodamine)或二(琥珀酰亚胺酯)；5-(和-6)羧基萘并荧光素,5-(和-6)羧基萘并荧光素琥珀酰亚胺酯；5-羧基罗丹明6G盐酸盐；6-羧基罗丹明6G盐酸盐、5-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；6-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；5-羧基-2',4',5',7'-四溴磺酰荧光素琥珀酰亚胺酯或双-(二异丙基乙铵)盐；5-羧基四甲基罗丹明；6-羧基四甲基罗丹明；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明；5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基-X-罗丹明；5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基-X罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基-X罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-羧基-X-罗丹明三乙铵盐；LissamineTM罗丹明B磺酰氯；孔雀石绿；异硫氰酸盐；
Figure BDA0003761003750000081
单(硫代琥珀酰亚胺酯)；
Figure BDA0003761003750000082
21羧酸或琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA0003761003750000083
7羧酸或琥珀酰亚胺酯；罗丹明RedTM-X琥珀酰亚胺酯；6-(四甲基罗丹明-5-(和-6)-甲酰氨基)己酸；琥珀酰亚胺酯；四甲基罗丹明-5-异硫氰酸盐；四甲基罗丹明-6-异硫氰酸盐；四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸盐；Texas
Figure BDA0003761003750000084
磺酰基；Texas
Figure BDA0003761003750000085
磺酰氯；Texas
Figure BDA0003761003750000086
STP酯或钠盐；Texas
Figure BDA0003761003750000087
琥珀酰亚胺酯；Texas
Figure BDA0003761003750000088
琥珀酰亚胺酯；和X-罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸盐。
荧光染料的其他例子包括从Invitrogen可商购的
Figure BDA0003761003750000089
染料，包括但不限于
Figure BDA00037610037500000810
FL；
Figure BDA00037610037500000811
TMR STP酯；
Figure BDA00037610037500000812
TR-X STP酯；
Figure BDA00037610037500000813
630/650-XSTP酯；
Figure BDA00037610037500000814
650/665-X STP酯；6-二溴-4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3,5-二丙酸；4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-戊酸；4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-戊酸琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3丙酸；4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a二氮杂-s-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4,4二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3丙酸；硫代琥珀酰亚胺酯或钠盐；6-((4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3丙酰基)氨基)己酸；6-((4,4-二氟-5,7二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；N-(4,4-二氟5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酰基)磺基丙氨酸、琥珀酰亚胺酯或三乙铵盐；6-4,4-二氟-l,3-二甲基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼杂3a,4a4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸；4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼杂3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-5-苯基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸；琥珀酰亚胺酯；6-((4,4-二氟-5-苯基-4硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-5-(4-苯基-l,3丁二烯基)-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；6-(((4,4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-yl)苯乙烯基氧基)乙酰基)氨基己酸或琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸；4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸；琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-l,3,5,7-四甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-8-丙酸；4,4-二氟-l,3,5,7-四甲基-4硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-8-丙酸琥珀酰亚胺酯；4,4-二氟-5-(2-二乙基)-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；6-(((4-(4,4-二氟-5-(2-二乙基)-4-硼杂-3a,4a-二氮杂s-引达省-3-yl)苯氧基)乙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；以及6-(((4,4-二氟-5-(2-二乙基)-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-yl)苯乙烯基氧基)乙酰基)氨基己酸或琥珀酰亚胺酯。
荧光染料还可以包括例如从Invitrogen可商购的Alexa荧光染料，包括但不限于Alexa
Figure BDA00037610037500000815
350羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000816
430羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000817
488羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000818
532羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000819
546羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000820
555羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000821
568羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000822
594羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000823
633羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000824
647羧酸；Alexa
Figure BDA00037610037500000825
660羧酸；以及Alexa
Figure BDA00037610037500000826
680羧酸。本发明的荧光染料也可以是例如从Amersham-Pharmacia Biotech可商购的青色素染料，包括但不限于Cy3 NHS酯；Cy 5NHS酯；Cy5.5 NHS酯；以及Cy7 NHS酯。
串联染料(如含有PE-Cy5的那些或其他组合)由于低自体荧光也可以在本公开文本中有效地利用。通常，聚苯乙烯自体荧光会干扰对于利用串联或聚合染料所需的荧光共振能量转移(FRET)信号。
靶细胞
本公开文本的水凝胶颗粒在如通过流式细胞术或FACS进行的染色和分析的程序中表现类似于靶细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。免疫细胞的非限制性例子包括B淋巴细胞(也称为B细胞)、T淋巴细胞(也称为T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞、血小板、朗格汉斯细胞、干细胞、树突状细胞、外周血单个核细胞、肿瘤浸润(TIL)细胞、基因修饰的免疫细胞(包括杂交瘤)、药物修饰的免疫细胞和本文所列任何细胞类型的衍生物、前体细胞或祖细胞。
在一些实施方案中，靶细胞包括具有共享特性的特定细胞类别的所有细胞。例如，靶细胞可以是淋巴细胞，包括NK细胞、T细胞和B细胞。靶细胞可以是激活的淋巴细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是原代细胞、培养的细胞、建立的细胞、正常细胞、转化的细胞、感染的细胞、稳定转染的细胞、瞬时转染的细胞、增殖细胞或终末分化细胞。
在一个实施方案中，靶细胞是原代神经元细胞。多种神经元可以是靶细胞。作为非限制性例子，靶细胞可以是原代神经元；建立的神经元；转化的神经元；稳定转染的神经元；或者运动或感觉神经元。
在其他实施方案中，靶细胞选自原代淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。
靶细胞实际上可以是任何类型的细胞，包括原核和真核细胞。
合适的原核靶细胞包括但不限于细菌(如大肠杆菌(E.coli))、各种芽孢杆菌(Bacillus)物种和嗜极微生物细菌(如嗜热菌)。
合适的真核目标细胞包括但不限于真菌，如酵母和丝状真菌，包括酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)和脉孢菌属(Neurospora)的物种；植物细胞，包括玉米、高粱、烟草、油菜籽、大豆、棉花、番茄、马铃薯、苜蓿、向日葵等的细胞；以及动物细胞，包括鱼、鸟和哺乳动物。合适的鱼细胞包括但不限于来自鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、金枪鱼、鲤鱼、比目鱼、大比目鱼、剑鱼、鳕鱼和斑马鱼的物种的细胞。合适的鸟细胞包括但不限于鸡、鸭、鹌鹑、野鸡和火鸡以及其他丛林暴躁鸟类或野鸟的细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于来自马、牛、水牛、鹿、绵羊、兔子、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、山羊、猪、灵长类动物、海洋哺乳动物(包括海豚和鲸鱼)的细胞；以及细胞系(如任何组织或干细胞类型的人细胞系)和干细胞(包括多能和非多能)以及非人受精卵。
合适的细胞还包括与多种疾病有关的那些细胞类型，甚至处于非患病状态的那些。因此，合适的真核细胞类型包括但不限于所有类型的肿瘤细胞(例如，黑色素瘤、骨髓性白血病、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌和睾丸癌)、心肌细胞、树突状细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞(T细胞和B细胞)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、血管内膜细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、红细胞、肝细胞、白细胞(包括单个核白细胞)、干细胞(如造血、神经、皮肤、肺、肾、肝和心肌细胞干细胞(例如用于针对分化和去分化因子进行筛选))、破骨细胞、软骨细胞和其他结缔组织细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、肝细胞、肾细胞和脂肪细胞。在某些实施方案中，所述细胞是原代疾病状态细胞，如原代肿瘤细胞。合适的细胞还包括已知的研究细胞，包括但不限于Jurkat T细胞、NIH3T3细胞、CHO、COS等。参见ATCC细胞系目录，将其通过引用特别并入于此。
在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤微囊泡或肿瘤大囊泡。肿瘤微囊泡也称为肿瘤分泌性微囊泡或肿瘤分泌性外泌体，其可在循环血液中发现并且可能具有免疫抑制活性。肿瘤微囊泡的直径通常在大小为30-200nm的范围内。较大的肿瘤微囊泡可称为肿瘤大囊泡，并且直径可在大小为3-10μm的范围内。
实施例
实施例1：水凝胶颗粒的产生
用于UV光刻的光掩模来源于CADart Services Inc.，并使用AutoCad(AutoDesk，inc.)进行设计。SU-8光致抗蚀剂(Microchem，inc.)使用准直UV光源(OAI，inc.)在4”硅片上进行光交联以创建用于微流体装置制作的母版。PDMS(聚二甲基硅氧烷，Sigma Aldrich，inc.)是使用标准公开的用于软光刻和微流体装置制作的方法制备和形成的(参见McDonald JC等人,2000,Electrophoresis 21:27–40)。
使用流动聚焦几何学形成液滴，其中两个油通道集中水性单体溶液的中心流，以分解油包水乳液中的液滴。使用氟代烃油(Novec 7500 3M,inc.)作为用于形成液滴的外部连续相液体。为了在聚合之前稳定液滴，将0.5％w/w的表面活性剂添加至油相(Krytox157FSH,Dupont的羧酸铵盐)中。为了制备碱性聚丙烯酰胺凝胶颗粒，使用含有N-丙烯酰胺(1％-20％w/v)、交联剂(N,N'-双丙烯酰胺，0.05％-1％w/v)、促进剂和过硫酸铵(1％w/v)的水性单体溶液的中心相。将促进剂(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺2％体积％)添加至油相中，以在液滴形成后引发水凝胶颗粒聚合。
将若干种共聚单体添加至碱性凝胶配制品中以增加官能性。在一个例子中，添加芳基-丙烯酸酯以调节颗粒的自体荧光特性。在其他例子中，将聚苯乙烯纳米颗粒以低浓度添加至水凝胶基质中以调节颗粒的自体荧光特性。也通过调整颗粒的交联密度、通过使交联和固化过程的动力学工程化(例如，改变温度、时间和/或一种或多种促进剂的浓度中的一种)来调节荧光特性。调节碱性凝胶配制品的共聚单体、纳米颗粒添加剂和交联密度以影响颗粒的荧光和光谱特性，从而创建模拟细胞样背景光学响应的配制品模型。具体地，在掺入凝胶基质中的各种共聚单体上存在的化学侧基的类型影响颗粒的荧光和光谱特性，共聚单体、添加剂的浓度和核心聚合物的交联密度也影响颗粒的荧光和光谱特性。
通过使用含有化学正交侧基(胺、羧基、马来酰亚胺、环氧化物、炔烃等)的共聚单体进行二级标记来实现水凝胶颗粒的化学计量多重化。
我们以5kHz的平均速率形成液滴，并在氟代烃油相中收集它们。在50℃下完成30分钟聚合后，我们将所得的水凝胶颗粒从油洗涤至水溶液中。
实施例2：水凝胶颗粒光学特性的多维调节
如图3所示，水凝胶颗粒的自体荧光特性可以在多个维度上调节以匹配特定细胞类型的细胞样背景自体荧光/光谱曲线(不同于聚苯乙烯珠)。可以通过调节/选择性地修饰共聚单体组成、纳米颗粒添加剂的组成和/或水凝胶颗粒的交联密度来实现自体荧光和前向散射的独立调节。使用光学参数(如FSC和SSC或二级标记物)的组合对细胞进行去卷积。调节水凝胶颗粒以精确匹配特定细胞类型的SSC和FSC，这不同于大小和侧向散射受到限制的聚苯乙烯珠(如图1A(B)和图1B所示)。图1A(A)显示了细胞和本文所述的工程化水凝胶是半透明的，从而允许通过侧向散射(SSC)分辨内部特征。相比之下，如图1A(B)所示，聚苯乙烯珠是不透明的并且具有由直径决定的确定的侧向散射。水凝胶颗粒可以进一步用特定化学侧基和二级标记物的比率来调节，从而允许精确地匹配任何细胞类型，而不会像固定细胞系那样遭受生物噪声(参见图4)。具体地，如图4所示，官能化水凝胶的多重化能力允许将抗原和其他生物标记物添加至水凝胶基聚合物中，从而为产品添加进一步的“细胞样”尺寸。
实施例3：工程化水凝胶颗粒与聚苯乙烯颗粒和细胞的比较。
使用上述方法形成水凝胶颗粒，并在Beckman Coulter Cytoflex仪器上的所有荧光通道中进行测量。并行测量5um聚苯乙烯珠(BD Biosciences)。将从商业供应商获得的细胞在磷酸盐缓冲盐水中运行，并在Beckman Coulter Cytoflex仪器上进行测量。图6是强度与波长/通道的关系图，其展示了荧光补偿的原理。具体地，图6示出了荧光溢出和补偿的概念。如图6所示，主检测通道(A)显示了模型荧光团的最高强度，而通道B和C显示了来自单个荧光团的溢出或残留发射信号。当与在这些通道中发射的其他荧光团组合时，可以从测量的荧光信号中减去此类值，以计算更准确或“真实”的荧光信号强度。
图7A-图7C有助于比较淋巴细胞、聚苯乙烯珠和本公开文本的工程化水凝胶自体荧光水凝胶(“流式细胞(FlowCytes)”)之间的荧光特征。每个图代表在普通实验过程中标准的荧光检测通道和在该检测通道中命名的示例性抗原靶标或生物靶标。通道如下：
·通道FL1-A-硫唑橙-A(DNA结合光敏剂)
·通道FL2-A-PerCP-A(PerCP-缀合的抗体，其中PerCP是多甲藻素-叶绿素-蛋白，一种荧光复合物)
·通道FL3-A-CD4 apc-a(分化簇(CD)4别藻蓝蛋白(APC)抗体)
·通道FL4-A-APC-A700-A(缀合的抗体)
·通道FL5-A-APC-A750-A(缀合的抗体)
·通道FL6-A-BV421-1(亮紫421抗体缀合物)
·通道FL7-A-BV510-A(亮紫421抗体缀合物)
·通道FL8-A-紫色610-A荧光纳米颗粒染料
·通道FL9-A-紫色660-A荧光纳米颗粒染料
·通道FL10-A-PE-A(藻红蛋白抗体)
·通道FL11-A-ECO-A
·通道FL12-A-7AAO-A(7-氨基放线菌素D)
如图7A-图7C所示，与聚苯乙烯珠相比，流式细胞(FlowCytes)展现出更具细胞样的自体荧光(即，它们相关的自体荧光特征更接近淋巴细胞的自体荧光特征)。这允许在相同的仪器上测量更大的动态范围，并进行更准确的荧光补偿。例如，图7C显示了流式细胞在紫外线和紫色光谱中具有较低的自体荧光，并且更具细胞样(即，比聚苯乙烯珠更类似于淋巴细胞)。此外，流式细胞具有相对较高的信噪比，其通过降低本底噪声和增加给定检测器的动态范围促进更好地检测不佳表达的或“模糊的”生物标记物。本文所描述的水凝胶还允许将合成珠产品与在紫色和紫外线范围内激发或发射的荧光物一起使用，这是当前基于聚苯乙烯的产品无法匹配的特性。
图8A是用Alexa 700修饰的Ab染色的淋巴细胞的光谱曲线，并且图8B是根据实施方案用Alexa 700修饰的Ab染色的本公开文本的水凝胶颗粒(流式细胞)的光谱曲线。如图8A-图8B所示，染色的流式细胞具有细胞样光谱特征，且峰间匹配为r2＝1。
图9是显示根据一些实施方案用于校准用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法的流程图。如图9所示，方法900任选地包括在902处获得或产生具有至少一种背景荧光特性和/或至少一种光谱特性的水凝胶颗粒，所述至少一种背景荧光特性和/或至少一种光谱特性与靶细胞(例如，人细胞)的相应至少一种荧光特性和/或至少一种光谱特性基本上类似(例如，在10％内)。在904处，方法900包括将至少一种水凝胶颗粒(例如，多个水凝胶颗粒，任选地在水性介质或溶液中)插入细胞计数装置中。所述方法还包括在906处使用细胞计数装置测量水凝胶颗粒的荧光特性。
图10是显示使用本公开文本的水凝胶进行校准和计算荧光补偿和光谱分离的过程的流程图。如图10所示，方法1000包括在1008处修饰水凝胶颗粒以使抗体-荧光团缀合物或DNA结合染料(例如，抗κ轻链抗体)与水凝胶颗粒结合。在1010处，结合单独试剂，并将水凝胶颗粒插入细胞计数装置中以测量其荧光和/或光谱特性。然后在1012处计算多个单独荧光团的荧光补偿矩阵和/或光谱分离表。
图11A-图11D是示出根据一些实施方案在细胞染色、水凝胶补偿珠和已知(基于聚苯乙烯的)珠产品之间的比较的条形图。在所有描述的情况下，本公开文本的水凝胶珠显示出更具细胞样的特征，从而导致优越的补偿和光谱分离性能。图11A描述了与已知产品相比水凝胶补偿珠的染色指数和分辨性能。如图11A所示，本公开文本的水凝胶补偿珠的染色指数比已知的补偿珠产品更具细胞样。图11B描述了与已知补偿产品相比染色的水凝胶的平均荧光强度(MFI)。如图11B所示，与已知的补偿珠产品相比，染色的水凝胶补偿珠具有更具细胞样的MFI。图11C描述了与已知补偿产品相比，水凝胶的背景自体荧光。如图11C所示，与已知的补偿珠产品相比，在广泛范围的通道上，未染色的水凝胶补偿珠具有更具细胞样的背景自体荧光。图11D描述了与已知补偿产品相比，水凝胶的溢出性能。图11D显示了与已知的补偿珠产品相比，本公开文本的水凝胶补偿珠的荧光通道溢出是优越的。
图12是显示根据一些实施方案调节水凝胶颗粒的自体荧光的两种示例性方法的图表：(1)调节共振共聚单体添加剂的百分比或(2)改变水凝胶的交联密度。图12比较了聚苯乙烯和细胞对照的自体荧光与这些示例性水凝胶颗粒的自体荧光。如在图12的左侧表中所见，用5％共振共聚单体添加剂制备的水凝胶颗粒具有细胞样自体荧光(1050)，而聚苯乙烯对照具有不期望的高的自体荧光(9781)。如在图12的右侧表中所见，用10％交联密度制备的水凝胶颗粒具有细胞样自体荧光(1104)，而聚苯乙烯对照具有不期望的高的自体荧光(9781)。
在一些实施方案中，组合物包含水溶液和悬浮在水溶液中的水凝胶颗粒。所述水凝胶颗粒具有与靶细胞的背景自体荧光基本上类似的背景自体荧光或与靶细胞的光谱曲线基本上类似的光谱曲线中的至少一种。已经使用共聚单体添加剂、调整的固化动力学(受时间、温度和化学促进剂的影响，因此可以通过改变它们来调整)和低浓度纳米颗粒添加剂的组合对这些特定特性进行了工程化。这些特性(自体荧光和光谱曲线)使用非被动光学激发通道进行表征，从而使其与被动光学特征(如SSC和FSC)区分开。
水凝胶颗粒还可以具有在靶细胞的SSC的10％内的SSC，如通过细胞计数装置所测量。水凝胶颗粒还可以具有在靶细胞的FSC的10％内的FSC，如通过细胞计数装置所测量。
水凝胶颗粒还可以具有大于约1.15、或大于约1.3、或大于约1.7的折射率。
水凝胶颗粒也可以具有小于约100μm、或小于约10μm、或小于约1μm的直径。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒含有聚合物纳米颗粒添加剂。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒是化学官能化的。例如，水凝胶颗粒可以包含游离胺基团。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒包含烯丙胺。
在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒通过使液滴聚合来产生。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒通过使液滴聚合来产生，并且水凝胶颗粒随后通过缀合或附接荧光团/荧光物进行修饰。经修饰的水凝胶颗粒可以具有与靶细胞的荧光曲线匹配(例如，与靶细胞的荧光曲线基本上类似或在其10％内)的荧光曲线。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒群体包含多个水凝胶颗粒，来自所述多个水凝胶颗粒的每个水凝胶颗粒具有与靶细胞的背景自体荧光或光谱曲线基本上类似的背景自体荧光或光谱曲线中的至少一种。水凝胶颗粒群体可以基本上是单分散的。在一些此类实施方案中，不超过10％的水凝胶颗粒具有大于水凝胶颗粒群体的平均直径的约10％的平均直径。
在一些实施方案中，一种方法包括通过将至少一种水凝胶颗粒(例如，多个水凝胶颗粒，任选地在水性介质或溶液中)插入用于分析靶细胞的细胞计数装置中来校准所述细胞计数装置。所述至少一种水凝胶颗粒具有与靶细胞的背景荧光特性(例如，自体荧光)或光谱特性中的至少一种基本上类似的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种。所述方法还包括使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的至少一种特性(例如，校准相关的特性)。所述至少一种特性可以包括以下中的一种或多种：激光间延迟、荧光响应、分选时间或荧光补偿。所述方法任选地还包括基于所测量的特性来调整荧光补偿或光谱分离中的一种。光谱分离是将混合像素的光谱特征分解为一组最终成员及其相应丰度的过程。使用所描述的细胞样试剂进行补偿和光谱分离的计算允许通过降低噪声并提高给定荧光团的细胞样精度来使扩大范围的荧光团多重化。在一些实施方案中，所述方法还包括在将所述水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中之前：使含有荧光团的试剂与所述水凝胶颗粒结合以形成复合物、测量所述复合物的至少一种特性、以及基于所述至少一种测量的特性计算荧光补偿或光谱分离。任选地，所述方法还包括使用经修饰的水凝胶颗粒来评估靶细胞的活力。
在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒已被修饰为与结合至缀合的荧光团(例如，荧光物)的抗体结合。
在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒是经修饰的水凝胶颗粒，所述经修饰的水凝胶颗粒已被修饰为与嵌入核酸标记试剂或胺反应性核酸标记试剂中的至少一种结合。
水凝胶颗粒可以具有在靶细胞的SSC的10％内的SSC，如通过细胞计数装置所测量。可替代地或另外地，水凝胶颗粒可以具有在靶细胞的FSC的10％内的FSC，如通过细胞计数装置所测量。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒可以具有大于约1.15、或大于约1.3、或大于约1.7的折射率。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒可以具有小于约100μm的直径、或小于约10μm的直径、或小于约1μm的直径。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒包含聚合物纳米颗粒添加剂。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒是化学官能化的水凝胶颗粒。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒包含游离胺基团。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒包含烯丙胺。
在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括使液滴聚合以产生水凝胶颗粒。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒是已通过缀合或附接荧光团或荧光物中的一种进行修饰的水凝胶颗粒，并且经修饰的水凝胶颗粒匹配细胞的荧光或光谱曲线。
在一些实施方案中，一种方法包括计算靶细胞的细胞计数测量值的补偿值，以及基于所述补偿值修改所述靶细胞的细胞计数测量值。计算所述靶细胞的细胞计数测量值的补偿值包括在第一时间将第一水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中。所述第一水凝胶颗粒具有与所述靶细胞的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种基本上类似的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种。使用所述细胞计数装置测量所述第一水凝胶颗粒的至少一种特性。所述计算还包括在不同于所述第一时间的第二时间将第二水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中，以及使用所述细胞计数装置测量所述第二水凝胶颗粒的至少一种特性。所述计算还包括将所述第一水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性与所述第二水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性进行比较以确定所述补偿值。
在一些实施方案中，一种方法包括计算靶细胞的细胞计数测量值的多个调整值，以及基于所述多个调整值修改所述靶细胞的细胞计数测量值。计算靶细胞的细胞计数测量值的多个调整值包括将两种水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中：来自水凝胶颗粒的第一水凝胶颗粒，其具有与所述靶细胞的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种基本上类似的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种；以及来自水凝胶颗粒的第二水凝胶颗粒，其被配置为与试剂结合或与所述试剂预结合，所述试剂是产生不同于所述背景荧光特性的荧光信号或不同于所述光谱特性的光谱信号中的至少一种的试剂。计算靶细胞的细胞计数测量值的多个调整值还包括使用细胞计数装置测量第一水凝胶颗粒的至少一种特性和第二水凝胶颗粒的至少一种特性，以及比较第一水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性和第二水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性，以确定与至少一种另外的试剂的荧光重叠和与所述至少一种另外的试剂的光谱重叠。然后基于所述多个调整值(例如，包括或基于与至少一种另外的试剂的荧光重叠和/或与所述至少一种另外的试剂的光谱重叠)来修改所述靶细胞的细胞计数测量值。
尽管本文示出和描述为用于细胞计数装置校准和细胞计数测量补偿的上下文中，但本文所述的细胞样水凝胶颗粒也可以用于改善其性能和/或准确性的其他应用中。例如，与本公开文本的细胞样水凝胶颗粒相容的另外的应用包括但不限于：(1)设置仪器的检测下限(“LLOD”)(仪器的例子包括但不限于：流式细胞仪、血液分析仪、细胞分析仪或基于图像的细胞计数器)，以确定模糊或表达不佳的生物标记物的真实信噪比；(2)光电倍增管(“PMT”)增益调整以捕获细胞样荧光线性；(3)平均荧光强度(“MFI”)计算，以及(4)用于荧光检测的仪器设置和质量控制(“QC”)(主动光学特性，而不是被动光学特性)。
虽然已经示出和描述了各种具体实施方案，但是应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变。
如在整个说明书和所附权利要求中使用的，以下术语和表达旨在具有以下含义：
不定冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”以及定冠词“所述”旨在包括单数和复数，除非在使用它们的上下文中另有明确说明。
“至少一个/一种”和“一个/一种或多个/多种”可互换地使用以表示物品可以包括一个/一种或多于一个/一种所列出的要素。
除非另有说明，否则应理解，在说明书和权利要求中使用的表示成分的数量、比率和数值特性、反应条件等的所有数字都预期能够在所有情况下由术语“约”修饰。
如本文所用，术语“约”和“大约”通常意指所述值的加或减10％，例如约250μm将包括225μm至275μm，约1,000μm将包括900μm至1,100μm。
除非另有明确说明或从上下文中清楚看出，否则在本公开文本中，对单数项的提及应理解为包括复数项，反之亦然。除非另有说明或从上下文清楚看出，否则语法连词旨在表达结合的条款、句子、单词等的任何和所有分离和连接组合。因此，术语“或”通常应理解为意指“和/或”等。本文提供的任何和所有例子或示例性语言(“例如”、“如”、“包括”等)的使用仅旨在更好地说明实施方案，而不构成对实施方案或权利要求的范围的限制。

Claims (22)

1.一种方法，其包括：
通过以下方式校准用于分析靶细胞的细胞计数装置：
将具有与所述靶细胞的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种基本上类似的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种的水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中；以及
使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的至少一种特性。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：在将所述水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中之前：
使含有荧光团的试剂与所述水凝胶颗粒结合以形成复合物；
测量所述复合物的至少一种特性；以及
基于所述至少一种测量的特性计算荧光补偿或光谱分离。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒已被修饰为与结合至缀合的荧光团的抗体结合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述缀合的荧光团是荧光物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒是经修饰的水凝胶颗粒，所述经修饰的水凝胶颗粒已被修饰为与嵌入核酸标记试剂或胺反应性核酸标记试剂中的至少一种结合。
6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括使用所述经修饰的水凝胶颗粒评估所述靶细胞的活力。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒具有大于约1.15的折射率。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒具有大于约1.3的折射率。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒具有大于约1.7的折射率。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒具有小于约100μm的直径。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒具有小于约10μm的直径。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒具有小于约1μm的直径。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒含有聚合物纳米颗粒添加剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒是化学官能化的水凝胶颗粒。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒包含游离胺基团。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒包含烯丙胺。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞是免疫细胞。
18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使液滴聚合以产生水凝胶颗粒。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶颗粒是已通过缀合或附接荧光团或荧光物中的一种进行修饰的水凝胶颗粒。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述经修饰的水凝胶颗粒与细胞的荧光或光谱曲线相匹配。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种特性包括激光间延迟、荧光响应、分选时间或荧光补偿中的一种。
22.一种方法，其包括：
通过以下方式计算用于靶细胞的细胞计数测量值的多个调整值：
将第一水凝胶颗粒和第二水凝胶颗粒插入所述细胞计数装置中，所述第一水凝胶颗粒具有与所述靶细胞的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种基本上类似的背景荧光特性或光谱特性中的至少一种，并且所述第二水凝胶颗粒被配置为与试剂结合或与所述试剂预结合，所述试剂是产生不同于所述背景荧光特性的荧光信号或不同于所述光谱特性的光谱信号中的至少一种的试剂，
使用所述细胞计数装置测量所述第一水凝胶颗粒的至少一种特性和所述第二水凝胶颗粒的至少一种特性，以及
比较所述第一水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性和所述第二水凝胶颗粒的所测量的至少一种特性，以确定与至少一种另外的试剂的荧光重叠和与所述至少一种另外的试剂的光谱重叠；以及
基于所述多个调整值修改所述靶细胞的细胞计数测量值。
CN202180010776.XA 2020-01-24 2021-01-22 用于细胞样校准颗粒的组合物和方法 Pending CN115004009A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062965494P 2020-01-24 2020-01-24
US62/965,494 2020-01-24
PCT/US2021/014538 WO2021150838A1 (en) 2020-01-24 2021-01-22 Compositions and methods for cell-like calibration particles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115004009A true CN115004009A (zh) 2022-09-02

Family

ID=76970780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180010776.XA Pending CN115004009A (zh) 2020-01-24 2021-01-22 用于细胞样校准颗粒的组合物和方法

Country Status (9)

Country Link
US (3) US11313782B2 (zh)
EP (1) EP4094064A4 (zh)
JP (1) JP2023511132A (zh)
KR (1) KR20220129585A (zh)
CN (1) CN115004009A (zh)
AU (1) AU2021209907A1 (zh)
CA (1) CA3165821A1 (zh)
TW (1) TW202141019A (zh)
WO (1) WO2021150838A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230141834A (ko) 2015-02-09 2023-10-10 슬링샷 바이오사이언시즈 인코포레이티드 튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를 사용하기 위한 방법
US11047845B1 (en) * 2017-11-15 2021-06-29 Medica Corporation Control material and methods for cell analyzers
TW202141019A (zh) 2020-01-24 2021-11-01 美商史林夏特生化公司 類細胞校正粒子之組合物與方法
CN115485556A (zh) 2020-05-04 2022-12-16 弹弓生物科学公司 用于多路复用测定的被动光学条形码化的组合物和方法
WO2023215886A1 (en) * 2022-05-05 2023-11-09 Slingshot Biosciences, Inc. Engineered particles as red blood cell mimics and compositions containing same for hematology
WO2023235885A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Slingshot Biosciences, Inc. Apoptotic cell mimic

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5093234A (en) 1984-12-24 1992-03-03 Caribbean Microparticles Corporation Method of aligning, compensating, and calibrating a flow cytometer for analysis of samples, and microbead standards kit therefor
US4774189A (en) 1984-12-24 1988-09-27 Flow Cytometry Standards Corp. Fluorescent calibration microbeads simulating stained cells
US4857451A (en) 1984-12-24 1989-08-15 Flow Cytometry Standards Corporation Method of compensating and calibrating a flow cytometer, and microbead standards kit therefor
US4704891A (en) 1986-08-29 1987-11-10 Becton, Dickinson And Company Method and materials for calibrating flow cytometers and other analysis instruments
US5091206A (en) 1987-10-26 1992-02-25 Baxter Diagnostics Inc. Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
US5395688A (en) 1987-10-26 1995-03-07 Baxter Diagnostics Inc. Magnetically responsive fluorescent polymer particles
ATE116442T1 (de) 1988-04-22 1995-01-15 Massachusetts Inst Technology Verfahren zum formen und zum gebrauch von mikrotröpchen.
US5820879A (en) 1993-02-12 1998-10-13 Access Pharmaceuticals, Inc. Method of delivering a lipid-coated condensed-phase microparticle composition
DE4339509A1 (de) 1993-11-22 1995-05-24 Basf Ag PPE/PA-Frommassen zur Herstellung von Formkörpern mittels Blasformen, Profilextrusion und Rohrextrusion
USRE39542E1 (en) 1994-01-13 2007-04-03 The Rogosin Institute Preparation of agarose coated, solid agarose-collagen beads containing secretory cells
JP3875754B2 (ja) 1995-11-17 2007-01-31 シスメックス株式会社 フローサイトメータ用標準液
US6613234B2 (en) 1998-04-06 2003-09-02 Ciphergen Biosystems, Inc. Large pore volume composite mineral oxide beads, their preparation and their applications for adsorption and chromatography
JP2002531056A (ja) 1998-08-07 2002-09-24 セレイ， エルエルシー 遺伝子分析におけるゲルマイクロドロップ
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
ATE324588T1 (de) 1999-08-17 2006-05-15 Luminex Corp Verkapselung von fluoreszierenden partikeln
AU7646000A (en) 1999-11-05 2001-05-14 Novozymes A/S Methods to screen microorganisms or gene libraries for products secreted from a cell
EP2299256A3 (en) 2000-09-15 2012-10-10 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
US6905881B2 (en) 2000-11-30 2005-06-14 Paul Sammak Microbead-based test plates and test methods for fluorescence imaging systems
CA2447691A1 (en) 2001-05-26 2002-12-05 One Cell Systems, Inc. Secretion of proteins by encapsulated cells
NZ530700A (en) 2001-06-21 2009-02-28 Altus Pharmaceuticals Inc Spherical protein particles and methods of making and using them
US6838289B2 (en) * 2001-11-14 2005-01-04 Beckman Coulter, Inc. Analyte detection system
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
JP4239637B2 (ja) 2003-03-24 2009-03-18 富士ゼロックス株式会社 高分子ゲル組成物及びそれを用いた光学素子
DK2309245T3 (en) 2003-03-28 2016-01-04 Inguran Llc Methods for providing sex-sorted animal semen
EP3616781A1 (en) 2003-04-10 2020-03-04 President and Fellows of Harvard College Formation and control of fluidic species
CN104069784B (zh) 2003-08-27 2017-01-11 哈佛大学 流体物种的电子控制
NZ547140A (en) 2003-10-22 2009-09-25 Encelle Inc Bioactive hydrogel compositions in dehydrated form for regenerating connective tissue
US20050089987A1 (en) 2003-10-27 2005-04-28 Lonza Ltd. Polyacryamide beads containing encapsulated cells
WO2005072334A2 (en) 2004-01-23 2005-08-11 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Photoresponsive hydrogels
WO2006078841A1 (en) 2005-01-21 2006-07-27 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for forming fluidic droplets encapsulated in particles such as colloidal particles
JP2008529014A (ja) 2005-01-31 2008-07-31 ベックマン コールター インコーポレイテッド 添加物含有シリカを用いたマイクロスフェア型光イオン・センサ
US20070054119A1 (en) 2005-03-04 2007-03-08 Piotr Garstecki Systems and methods of forming particles
EP2248578B1 (en) 2005-03-04 2012-06-06 President and Fellows of Harvard College Method for forming multiple emulsions
EP1744145B1 (en) 2005-07-12 2015-09-09 Sysmex Corporation Standard material for particle analyzer
JP4744264B2 (ja) 2005-10-19 2011-08-10 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置用標準物質。
US20080019921A1 (en) 2006-06-30 2008-01-24 Invitrogen Corporation Uniform fluorescent microsphere with hydrophobic surfaces
US7935518B2 (en) 2006-09-27 2011-05-03 Alessandra Luchini Smart hydrogel particles for biomarker harvesting
WO2008121342A2 (en) 2007-03-28 2008-10-09 President And Fellows Of Harvard College Emulsions and techniques for formation
DK2271657T3 (en) 2008-03-04 2017-05-15 Crystal Bioscience Inc GEL-MICRO-DROP COMPOSITION AND METHOD OF USING IT
CN101245368A (zh) 2008-03-20 2008-08-20 重庆师范大学 应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法
AU2009237945B2 (en) 2008-04-17 2014-11-13 Qiagen Lake Constance Gmbh Fluorescence standard, and the use thereof
WO2010025988A1 (en) 2008-09-04 2010-03-11 Unilever Plc Method and apparatus for producing microparticles
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
US8415161B2 (en) 2008-11-13 2013-04-09 Becton, Dickinson And Company Instrument setup system for a fluorescence analyzer
CA2753520C (en) 2009-03-12 2017-10-24 Conocophillips Company Crosslinked swellable polymer
US8187885B2 (en) 2009-05-07 2012-05-29 Nodality, Inc. Microbead kit and method for quantitative calibration and performance monitoring of a fluorescence instrument
WO2011098407A1 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Cemm Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Microspheres
CN102762655B (zh) 2010-02-18 2016-05-11 道康宁公司 表面改性的水凝胶和水凝胶微粒
CA2802059C (en) 2010-06-07 2020-05-12 Firefly Bioworks, Inc. Nucleic acid detection and quantification by post-hybridization labeling and universal encoding
US20110318820A1 (en) 2010-06-29 2011-12-29 Life Technologies Corporation Immobilized Buffer Particles and Uses Thereof
JP5858451B2 (ja) 2010-06-29 2016-02-10 国立大学法人 岡山大学 ヒドロゲルカプセルの製造方法
US8530449B2 (en) 2010-09-09 2013-09-10 Assad S. Sawaya Composition for a topical ophthalmic clear colloidal liquid which undergoes a liquid-gel phase transition in the eye
US20120196770A1 (en) 2011-01-28 2012-08-02 Amyris, Inc. Gel-encapsulated microcolony screening
JP2013015357A (ja) 2011-07-01 2013-01-24 Shimadzu Corp フローサイトメータ
JP2013155358A (ja) 2012-01-31 2013-08-15 Kanazawa Univ 乳化重合法及びヒドロゲルの合成方法
US20150177115A1 (en) 2012-04-06 2015-06-25 Slingshot Biosciences Hydrogel particles with tunable optical properties
WO2013181453A2 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Cytojene Corp. Flow cytometer
WO2014059446A1 (en) * 2012-10-12 2014-04-17 Case Western Reserve University Biodegradable hydrogel for polynucleotide delivery
CN103744185B (zh) 2013-12-30 2016-03-30 维林光电(苏州)有限公司 一种基于流式细胞仪用多色光源光腰位置的定标系统的定标方法
US10392557B2 (en) * 2014-04-08 2019-08-27 Dna Medicine Institute, Inc. Multi-dye microparticles
US10583091B2 (en) 2014-10-23 2020-03-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Amphiphile-polymer particles
US20230067460A1 (en) 2015-02-09 2023-03-02 Slingshot Biosciences, Inc. Hydrogel particles as feeder cells and as synthetic antigen presenting cells
KR20230141834A (ko) * 2015-02-09 2023-10-10 슬링샷 바이오사이언시즈 인코포레이티드 튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를 사용하기 위한 방법
WO2018000082A2 (en) 2016-05-19 2018-01-04 Molly Shoichet Encapsulation-free controlled protein release system
EP3335695B1 (en) * 2016-12-15 2020-02-05 UPM-Kymmene Corporation A method for freeze-drying hydrogel comprising nanofibrillar cellulose, a freeze-dried medical hydrogel comprising nanofibrillar cellulose, and a hydrogel comprising nanofibrillar cellulose
WO2018156935A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 The Regents Of The University Of California Particle-drop structures and methods for making and using the same
SG11202001916TA (en) 2017-09-11 2020-04-29 Evorion Biotechnologies Gmbh Systems, methods and hydrogels for cell culture and analysis
JP7027459B2 (ja) 2018-02-13 2022-03-01 イルミナ インコーポレイテッド ヒドロゲルビーズを用いるｄｎａ配列決定
US10344100B1 (en) * 2018-02-28 2019-07-09 The Florida International University Board Of Trustees Micro/nano magnetic hydrogels with autofluorescence for therapeutic and diagnostic applications
JP2021534402A (ja) 2018-08-17 2021-12-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 単分散流体容積を有する粒子包含小滴系
US11697793B2 (en) 2018-10-10 2023-07-11 Washington University Compositions and methods of making and using protein-functionalized hydrogels
CN113272449B (zh) 2018-10-26 2024-03-12 Illumina公司 调整聚合物小珠以进行dna处理
WO2020139848A1 (en) * 2018-12-28 2020-07-02 Becton, Dickinson And Company Methods for spectrally resolving fluorophores of a sample and systems for same
US20200232979A1 (en) 2019-01-22 2020-07-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Microcapsules and Methods for Analyte Detection
TW202141019A (zh) 2020-01-24 2021-11-01 美商史林夏特生化公司 類細胞校正粒子之組合物與方法
WO2021154900A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Bio-Rad Laboratories, Inc. Stable reference materials for automated hematology testing platforms
CN115485556A (zh) 2020-05-04 2022-12-16 弹弓生物科学公司 用于多路复用测定的被动光学条形码化的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021209907A1 (en) 2022-07-07
US20240053248A1 (en) 2024-02-15
CA3165821A1 (en) 2021-07-29
TW202141019A (zh) 2021-11-01
KR20220129585A (ko) 2022-09-23
JP2023511132A (ja) 2023-03-16
EP4094064A1 (en) 2022-11-30
US11726023B2 (en) 2023-08-15
US20210231552A1 (en) 2021-07-29
US11313782B2 (en) 2022-04-26
EP4094064A4 (en) 2024-02-28
WO2021150838A1 (en) 2021-07-29
US20220364976A1 (en) 2022-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10481068B2 (en) Hydrogel particles with tunable optical properties
US11313782B2 (en) Compositions and methods for cell-like calibration particles
KR102656644B1 (ko) 튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를 사용하기 위한 방법
US11598768B2 (en) Compositions and methods for passive optical barcoding for multiplexed assays
KR101469703B1 (ko) 유세포 분석을 이용한 나노 물질 위해성 평가 방법
WO2023215886A1 (en) Engineered particles as red blood cell mimics and compositions containing same for hematology

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination