CN101245368A - 应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法 - Google Patents

应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法 Download PDF

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唐发辉
赵元莙
唐安科
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Abstract

本发明公开了一种应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法，步骤如下：材料的收集、仪器校正、样品的制备、上机检测、流式细胞学数据分析；其中数据分析是先进行分别上样获取的散点图与直方图的比较分析，然后再进行与混合上样获取的散点图与直方图分别进行对比研究，并通过相关数据及图形的比较研究，得出结果。本发明检测方便、快捷。如果对每种粘孢子虫的相关物理参数(如散射光及自发荧光)进行测定、分析、存档，(如在已测定完足够虫种的情况下)然后通过对多种待测粘孢子进行相同的测定，并进行对比分析，即可比较容易地判断出为具体的某一种粘孢子虫。

Description

应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法
技术领域
本发明涉及鱼类寄生粘孢子虫的分类，具体的说，涉及一种通过流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法。
背景技术
流式细胞仪是在上世纪70年代发展起来的一种对细胞特征及细胞或细胞器的组成进行定性及定量分析的方法，其基本原理是光学和电学原理。近年来，随着细胞和分子生物学技术尤其是单克隆抗体技术的发展和分子探针的开发，流式细胞技术日见成熟，在国内外被广泛应用于医学基础研究和临床实践。目前流式细胞仪在肿癌学、临床细胞免疫学，血液病及相关病征的诊断和治疗中应用较多。
粘孢子虫是一类对水养殖业具有严重危害的一类病原孢子虫。对粘孢子虫的研究，尤其对其系统地位的研究，是目前国际间研究的一个热点，经典的形态分类学一直将粘孢子虫视为一种单细胞动物进行研究，但在分子技术问世后，粘孢子虫的单细胞地位逐渐受到人们的质疑；直至目前，当分子手段亦用于揭示某些粘孢子虫分类学上的系统地位时，国际间大部分的分子数据都认为粘孢子虫应归属多细胞起源的动物。由于该虫体孢子阶段具备坚硬的几丁质外壳，如要破壳并保持其内的原生质体的完整性是实验过程中难以攻克的一个环节，因此，这成为人们始终对粘孢子虫细胞学的数据知之甚少的主要原因。
粘孢子虫的形态分类学主要是人们以光镜下虫体的形态结构进行主观能动性的经验判定，相对来说涉及的主观因素较多，故有时难免会存在失误或不准确之处；分子手段虽可在一定程度上解决部分形态学上的疑难种或存疑种，但其同样存在主观因素的类似问题，故引入一种可不依赖于人为因素的判定粘孢子虫的方法是亟待进行的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种运用流式细胞术进行粘孢子虫分类的方法，该方法应用流式细胞术检测粘孢子虫散射光及自发荧光参数以获取散点图与直方图进行直观比较。
本发明的技术方案如下：
首先收集需要区分的粘孢子虫材料；
将需要使用的相关仪器及设备进行校正：
仪器：Nikon E-600生物显微镜，Nikon SMZ1500体视镜，流式细胞仪(美国BD FASCS Calibur)，离心机(Hermle Z323K)等；
仪器校正及数据获取分析：检测前应用流式细胞仪自带程序并以标准校正微球校正仪器；采用CellQuest软件获取数据并进行数据分析。
步骤1，样品的制备
1)破孢囊：于Nikon SMZ1500体视镜下用解剖针将粘孢子虫的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。
2)提纯制备单细胞悬液：用PBS清洗孢子及孢囊壁，尽量将孢囊内的孢子清洗干净，然后滤膜多次过滤去杂屑；超声波振碎，离心，去上清，加PBS后振荡；以上过程3～5次重复；最后一次离心后加PBS悬浮孢子，待其单个孢子完全分散开后调整其浓度达1×105～1×106/ml。
步骤2，上机检测
将制备好的粘孢子虫的单细胞悬液进行上机检测并用CellQuest获取数据分别以散点图与直方图显示。其中散点图分别以SSC与FSC(二者均为散射光)为纵横坐标显示，并且具备相应的数值；而直方图则分以收集细胞数目与自发荧光强度为纵横坐标显示。
步骤3，数据分析和比较，将各获取的粘孢子虫的单细胞悬液的散点图和直方图分别进行比较研究，以此可提示两点重要信息：(1)有无自发光荧光可作为一种类判定指标；(2)如果有自发荧光，则强度会以相应的峰值显示。通过获取的各粘孢子虫的单细胞悬液的散点图和直方图，以及叠加比较，便可比较容易地判定所测的粘孢子虫是否为同种。
流式细胞仪要获取的两种重要的物理参数是散射光(FSC与SSC)与自发荧光，其中散射光是不依赖于任何细胞样品的制备技术(如染色)的参数，因此，它具物种的稳定性；通常情况下，FSC常与被测细胞的大小有关，确切是与细胞直径的平方密切相关，故它常与细胞的大小呈正相关；SSC常与细胞内的精细结构及颗粒性质相关，故它常与胞内的复杂程度呈正相关。而自发荧光也具有物种或细胞特异性，并不是所有的粘孢子虫都具有自发荧光，或者具有自发荧光的不同虫种的荧光强度(峰值)亦存在差异。
有益效果：本发明可直接从各数据及图形的情况(如散点图中细胞群的数量、直方图中峰的数目及峰值的分离等)进行观察分析得出结果；同时也可通过数据图形进行叠加比较，亦可判断每种粘孢子虫的物理固有值(如FSC、SSC及自光荧光)的稳定性，通过这些物理固有值的比较即可获得比较结果。该方法检测方便、快捷。如果对每种粘孢子虫的相关物理参数(如散射光及自发荧光)进行测定、分析、存档；然后通过对待分析的多种粘孢子进行相同的测定后进行对比分析，(如在已测定完足够的虫种的情况下)即可比较容易地判断出为具体的某一种粘孢子虫。同时检测中不需任何染色方法的介入即可排除人为主观因素对判定虫体的影响。
附图说明
图1为粘孢子虫Myxobolusampullicapsulus的形态结构图；
图2为粘孢子虫Myxobolusepisquamalis的形态结构图；
图3为粘孢子虫Myxobolus ampullicapsulus的散点图；
图4为粘孢子虫Myxobolusampullicapsulus的自发荧光直方图；
图5为粘孢子虫Myxobolus episquamalis的散点图；
图6为粘孢子虫Myxobolus episquamalis的自发荧光直方图；
图7为两种粘孢子虫Myxobolusampullicapsulus和Myxobolus episquamalis的混合上样散点图；
图8为两种粘孢子虫Myxobolusampullicapsulus和Myxobolus episquamalis的混合上样的自发荧光直方图；
图9为图1中M1标注的为红色细胞群；
图10为图1中M2标注的为绿色细胞群。
具体实施方式
实施例1
1、材料：
所选取的两种粘孢子虫隶属于碘泡虫属下的两种不同的碘泡虫，分别为Myxobolusampullicapsulus及Myxobolus episquamalis。其中Myxobolusampullicapsulus采自重庆淡水鲫鱼的鳃丝，而Myxobolus episquamalis则采自厦门沿海的海水淄鱼之皮肤鳞片上，且二者都已形成孢囊。
2、仪器及仪器校正
仪器：Nikon E-600生物显微镜，Nikon SMZ1500体视镜，流式细胞仪(美国BD FASCS Calibur)，离心机(Hermle Z323K)等
仪器校正及数据获取分析：检测前应用流式细胞仪自带程序并以标准校正微球校正仪器；采用CellQuest软件获取数据并进行数据分析。
3、样品的制备及检测
破孢囊：于Nikon SMZ1500体视镜下用解剖针将Myxobolus ampullicapsulus及Myxobolus episquamalis的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。
提纯制备单细胞悬液：用PBS清洗孢子及孢囊壁，尽量将孢囊内的孢子清洗干净，然后将孢子经过滤膜过滤去杂屑；超声波振碎约5min，12000rpm/min离心5min，加PBS悬浮，去上清；重复3次操作；最后一次离心后加PBS悬浮，待其单个孢子完全分散开后调整其浓度达1×105～1×106/ml左右，然后上样检测并获取数据。
就形态学特征而言，Myxobolus ampullicapsulus属于中到大型的淡水粘孢子虫，虫体平均直径均超过10μm(参见图1)，而Myxobolus episquamalis则属于相对小型的海水粘孢子虫，其虫体直径均低于10μm(参见图2)。按如下设计方案进行实验研究。
具体方案如下：首先取采自淡水鲫鱼的Myxobolus ampullicapsulus及海水淄鱼的Myxobolus episquamalis的单细胞悬液上机检测，分别获取二者的散射光及自发荧光的数据，以散点图及直方图分别显示。其中图3为Myxobolusampullicapsulus的散点图，图4为其自发荧光的直方图；同样，图5为Myxobolusepisquamalis的散点图，图6为其自发荧光的直方图。通过图3(Myxobolusampullicapsulus)与图5(Myxobolus episquamalis)的散点图的比较可以看出：Myxobolus ampullicapsulus的FSC值明显大于Myxobolus episquamalis，说明Myxobolus ampullicapsulus的个体普遍较Myxobolus episquamalis大，这与二者的形态学数据一致；同时Myxobolus ampullicapsulus的SSC值也大于Myxobolusepisquamalis，则说明Myxobolus ampullicapsulus的胞内结构较Myxobolusepisquamalis复杂，这是单纯的形态学手段难以观察及揭示的特征。从各自的自发荧光图亦可看出二者的自发荧光强度明显不同，其中Myxobolusampullicapsulus的自发荧光强度明显强于Myxobolus episquamalis：Myxobolusampullicapsulus的自发荧光峰值约在102处，而Myxobolus episquamalis的自发荧光峰值却远低于102(介于101与102之间)。
实施例2
1、材料；2、仪器及仪器校正；与实施例1相同，
3、样品的制备及检测
破孢囊：于Nikon SMZ1500体视镜下用解剖针将Myxobolus ampullicapsulus及Myxobolus episquamalis的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。
提纯制备单细胞悬液：用PBS清洗孢子及孢囊壁，尽量将孢囊内的孢子清洗干净，然后将孢子经过滤膜过滤去杂屑；超声波振碎10min，6000rpm/min离心10min，加PBS悬浮，去上清；重复4次操作；最后一次离心后加PBS悬浮，待其单个孢子完全分散开后调整其浓度达1×105～1×106/ml左右，然后上样检测并获取数据。
具体方案如下：
将制备好的二者的单细胞悬液等比例混合后，再将此混合液进行上机检测并获取相关数据。(参见图7)从散点图可观察到二者虽有交叉聚集，(参见图8)但从自发荧光直方图则可观察到两个明显的峰，说明获取的混合单细胞悬液中确实存在两个不同的虫种。根据两个峰分别以Marker设门，便可轻易地将散点图中聚集的二者区别开来：其中通过M1设门可将红色细胞群分辨及分离出来(如图9所示)；通过M2设门可将绿色细胞群分辨及分离出来(如图10所示)；而且绿色细胞群的FSC及SSC值均大于红色细胞群，则说明绿色细胞群的个体大小及胞内复杂程度均明显大于或强于红色细胞群，这与分别上样获取数据结果一致，根据该结果即可推断：M1标注的红色细胞群为Myxobolus episquamalis，而M2标注的绿色细胞群则为Myxobolus ampullicapsulus。
比较研究：
为了验证分别获取及混合获取数据时，两种粘孢子虫各自物理固有特征(FSC，SSC及自发荧光)的稳定性，我们分别作了叠加比较研究(图4)。
叠加研究一：单独调出Myxobolus ampullicapsulus的自发荧光图，然后将之与Myxobolus episquamalis的自发荧光图叠加，发现二者的自发荧光强度截然不同：Myxobolus ampullicapsulus明显强于Myxobolus episquamalis，这与分别获取的自发荧光强度比较结果一致。
叠加研究二：单独调取混合液的自发荧光图，然后将之与二者先前独立上样时的自发荧光图进行叠加，分别获取的自发荧光强度峰值恰好与以混合上样获取的峰值相吻合。该研究结果表明每种粘孢子虫都具各自独立、稳定的自发荧光。
实施例3
1、材料；2、仪器及仪器校正；与实施例1相同；
3、样品的制备及检测
破孢囊：于Nikon SMZ 1500体视镜下用解剖针将Myxobolus ampullicapsulus及Myxobolus episquamalis的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。
提纯制备单细胞悬液：用PBS清洗孢子及孢囊壁，尽量将孢囊内的孢子清洗干净，然后将孢子经过滤膜过滤去杂屑；超声波振碎5min，10000rpm/min离心8min，加PBS悬浮，去上清；重复操作5次；最后一次离心后加PBS悬浮，待其单个孢子完全分散开后调整其浓度达1×105～1×106/ml左右，然后上样检测并获取数据。
具体方案如下：将制备好的二者的单细胞悬液按7∶3的比例混合后，再将此混合液进行上机检测并获取相关数据。(参见图7)从散点图可观察到二者虽有交叉聚集，(参见图8)从自发荧光图仍可观察到两个明显的峰，说明获取的混合单细胞悬液中确实存在两个不同的种。根据两个峰分别以Marker设门，便可轻易地将散点图中聚集的二者区别开来：其中通过M1设门可将红色细胞群分辨及分离出来如图9所示；通过M2设门可将绿色细胞群分辨及分离出来如图10所示。而且绿色细胞群的FSC及SSC值均大于红色细胞群，则说明绿色细胞群的个体大小及胞内复杂程度均明显大于或强于红色细胞群，这与分别上样获取数据结果一致，根据该结果即可推断：M1标注的红色细胞群为Myxobolusepisquamalis，而M2标注的绿色细胞群则为Myxobolus ampullicapsulus。
比较研究：
为了验证分别获取及混合获取数据时，两种粘孢子虫各自固有特征(FSC，SSC及自发荧光)的稳定性，我们分别作了叠加研究(图4)。
叠加研究一：单独调出Myxobolus ampullicapsulus的自发荧光图，然后将之与Myxobolus episquamalis发荧光图叠加，发现二者的自发荧光强度截然不同：Myxobolus ampullicapsulus明显强于Myxobolus episquamalis，这与分别获取的自发荧光强度比较结果一致。
叠加研究二：单独调取混合液的自发荧光图，然后将之与二者先前独立上样时的自发荧光图进行叠加，分别获取的自发荧光强度峰值恰好与以混合液获取的峰值相吻合。该研究结果仍表明每种粘孢子虫的都具各自独立、稳定的自发荧光。

Claims (3)

1、一种应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：样品的制备，收集进行分类的粘孢子虫，将收集的粘孢子虫的孢囊壁戳破，提取流出孢子；然后将孢子经过滤膜过滤去杂屑；超声波振碎5～10min，6000～12000rpm/min离心5～10min，加PBS悬浮，去上清，以上过程3～5次重复，最后一次离心后加PBS悬浮，待其单个孢子完全分散开后调整其浓度达1×105～1×106/ml；
步骤2：将制备好的粘孢子虫的单细胞悬液进行上机检测，CellQuest获取数据，且数据分别以散点图与直方图显示；
步骤3：数据分析和比较。将各获取的粘孢子虫的单细胞悬液的散点图和直方图分别进行比较研究，得出结果。
2、根据权利要求1所述应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法，其特征在于：步骤1所述将孢囊壁戳破，提取流出孢子是在Nikon SMZ1500体视镜下，用解剖针将粘孢子虫的孢囊壁戳破后待其孢子完全流出，使用适合虫体大小孔径的滤膜过滤，超声波破碎并将其制成单细胞悬液。
3、根据权利要求1所述应用流式细胞术中的散射光及自发荧光参数进行粘孢子虫分类的方法，其特征在于：步骤2，散点图分别以SSC为纵坐标，以FSC为横坐标，以揭示粘孢子虫的虫体大小及内部结构的复杂程度；直方图以收集细胞数目为纵坐标，以自发荧光强度为横坐标，以揭示粘孢子虫的自发荧光的有无或自发荧光的强度。
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