CN110082265A - 基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法 - Google Patents

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CN110082265A CN201910426066.XA CN201910426066A CN110082265A CN 110082265 A CN110082265 A CN 110082265A CN 201910426066 A CN201910426066 A CN 201910426066A CN 110082265 A CN110082265 A CN 110082265A
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Abstract

本发明提供一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，具体步骤如下：1）取血液样品，经PBS调整细胞浓度后，待用；2）将MTG加入样品中摇匀；加入TMRE混匀；加入Hoechst33342混匀；孵育箱孵育；3）完成孵育后的样品离心清洗两次，经PBS重悬后上流式细胞仪检测，或取样品静置待细胞沉淀后上激光共聚焦检测；4）将检测数据用软件分析，得到不同成熟度的网织红细胞情况。相比手动计数法，数据重复性好；相比单纯流式细胞仪检测，计数更为准确，重复性高，同时增加了流式细胞仪测量的灵敏度。

Description

基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，进一步涉及一种基于线粒体膜电位变化检测不同成熟期网织红细胞的方法。
背景技术
网织红细胞(reticulocyte)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的尚未完全成熟的红细胞。
在正常生理情况下骨髓从原始细胞到网织红细胞需4天，然后网织红细胞在骨髓中成熟48小时进入外围血液，血液中的网织红细胞继续成熟48小时变成成熟的红细胞。外周血中网织红细胞数量，对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。
网织红细胞计数是评价骨髓造血功能和红细胞生成活力的重要指标。计数网织红细胞是血液学诊断中评估红细胞生成能力的基础性实验，是贫血的诊断、分型和疗效监测的基础，能够确认骨髓的化疗和移植疗效，监测EPO(促红细胞生成素)的疗效等。
目前检测网织红细胞的方法主要包括以下几种：(1)人工镜检方法：利用煌焦油蓝染液对血液标本中的红细胞进行推片、染色、烘干得到细胞制片，然后在显微镜下进行观察。观察者选择制片上细胞分布较均匀、厚薄适中的部位，在显微镜的油镜镜头下(放大1000倍)观察并进行计数。人工显微镜计数方法是目前网织红细胞计数的参考方法，但是操作较繁琐、效率很低；(2)流式细胞仪法：荧光染料与网织红细胞中的RNA结合后，在荧光照射下发出特征性的荧光。在流式细胞分析仪中，网织红细胞中的RNA与荧光染料如噻唑橙、派若宁、亚啶橙等结合之后，在鞘流的作用下，细胞单个通过流式细胞仪的检测器，机器发出的荧光照射于细胞上，根据细胞能否发射出特定颜色的荧光，荧光强度，或光吸收量大小、光散射量多少等参数的比例关系对网织红细胞进行计数。该方法自动化程度较高，相比人工镜检方式，效率明显提高，但是仍存在以下不足：第一，网织红细胞中的RNA呈网状或团状分布，RNA与荧光染料结合之后，荧光信号散在分布，细胞通过检测器时，根据荧光信号很难区分出单个细胞。第二，流式细胞分析仪的溶液管路设计复杂，成本很高，必须重复使用，容易导致样本之间的交叉污染。三，流式细胞分析仪检测采用鞘流原理，细胞必须单个依次通过荧光检测机构，导致测试速度减慢。
临床上网织红细胞是判断贫血等疾病和骨髓造血功能的重要指标，而不同成熟程度的网织红细胞是骨髓造血干细胞移植和化疗后骨髓再生的早期标志物，区分不同成熟时期的网织红细胞对了解间日疟原虫感染网织红细胞的潜在机制也是十分必要的，因此急需建立一种检测不同成熟期网织红细胞的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，相比手动计数法，数据重复性好；相比单纯流式细胞仪检测，计数更为准确，重复性高，同时增加了流式细胞仪测量的灵敏度。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一方面，本发明在于提供一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，具体步骤如下：
1)取血液样品，经PBS调整细胞浓度后，待用；
2)将MTG加入样品中摇匀；加入TMRE混匀；加入Hoechst33342混匀；孵育箱孵育；
3)完成孵育后的样品离心清洗两次，经PBS重悬后上流式细胞仪检测，或取样品静置待细胞沉淀后上激光共聚焦检测；
4)将检测数据用软件分析，得到不同成熟度的网织红细胞情况。
进一步地，所述血液样品来自外周血、骨髓或脾脏等；优选来自小鼠的外周血、骨髓或脾脏等。
进一步地，所述血液样品为外周血，取100μL全血加入含15g/L EDTA的PBS中并调整细胞浓度约1-2×106个/mL。
进一步地，所述血液样品来自骨髓，在无菌超净台中解剖取出2条股骨，用已高压消毒的剪刀剪去股骨两端的小部分关节，修剪干净骨骼周围的组织，先用PBS洗一次骨头，单支股骨用1mL一次性注射器吸取1mL含有2％胎牛血清的PBS，迅速小心将针头插入股骨末端，分别冲洗出股骨里面的骨髓细胞，用200目滤网过滤并制成单细胞悬液，吸取并调整细胞浓度约1-2×106个/mL。
进一步地，所述血液样品来自脾脏，在无菌超净台中用已高压消毒的剪刀解剖取出脾脏，置于100目筛网中，用1mL一次性注射器弃去针头，轻柔碾压脾脏后过滤，用含有2％胎牛血清的PBS反复冲洗筛网并制成单细胞悬液，调整细胞浓度约1-2×106个/mL。
进一步地，步骤2)中，取10μLMTG(工作液浓度10μM)加入样品(终体积为100μL,细胞浓度约1-2×106个/mL)中摇匀，加入20μLTMRE(工作液浓度300μM)于样品中摇匀，加入1μL Hoechst33342(工作液浓度1mg/mL)混匀，置于37℃孵育箱孵育2-2.5h。
进一步地，步骤3)中，所述离心条件为300g，离心5min。
进一步地，步骤3)中，所述流式细胞仪为具有三激光十通道的流式细胞仪。
更进一步地，所述流式细胞仪的设门步骤如下：(1)使用SS和FS确定细胞群，排除血小板、细胞碎片；(2)使用Cascede Blue通道信号设门排除有核细胞群干扰；(3)使用FITC(获取MTG荧光信号)和PE(获取TMRE荧光信号)通道设门标记网织红细胞及其不同成熟期分群；每样本至少检测30000个细胞。
进一步地，所述流式细胞仪的设门条件中，Hoechst33342的激发光在346nm，发射光波长在460±15nm；MTG的激发光在488nm，发射光在515±15nm；TMRE的激发光在543nm，发射光在605±32.5nm。
进一步地，所述激光共聚焦检测的条件为：用激光共聚焦激光346nm、488nm和543nm激发，发射波长包括460±15nm、515±15nm和605±32.5nm；激光共聚焦的透射光设置在TD1模式，在蓝色、红色和绿色通道中，采集图像。
进一步地，所述流式细胞术的数据用EXPO32TM ADC软件分析；激光共聚焦数据用FV10-ASW软件分析；所述软件分析过程如下：对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，样本均采用平均值±标准差(mean±SD)表示，每个样本重复3次。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明在于提供一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，通过将网织红细胞使用MTG/TMRE/Hoechst33342染色后上激光共聚焦进行检测，获得能直观地观察网织红细胞在形态学上的变化的情况；或，通过将网织红细胞使用MTG/TMRE/Hoechst33342染色后上流式细胞仪进行检测，获得精确定量不同时期的网织红细胞的情况。
本发明的方法检测的样品种类多，可检测外周血、血虚模型样品、骨髓样品和脾脏样品等。本发明的检测方法不仅可以得到不同样品的有核细胞、网织红细胞和成熟红细胞的细胞数量，不同成熟期网织红细胞的细胞数量，网织红细胞不同成熟期与成熟红细胞比值和不同成熟期网织红细胞占所有细胞比值。
相比新亚甲蓝手工计数法，本发明MTG/TMRE/Hoechst33342染色流式细胞法更稳定，波动更小。
本发明还评估了手动计数法和自动化流式细胞仪计数法的相关性。新亚甲蓝手动计数法根据网织红细胞成熟过程保留嗜碱性RNA物质，在活体染色后会出现蓝绿色的网状结构；其数据波动大，重复性较差；而使用MTG和TMRE荧光染料的仪器法采用流式细胞仪检测，使网织红细胞的计数更为精准，重复性高；MTG和TMRE荧光染料与线粒体的特异性结合同时增加了流式细胞仪测量的灵敏度；同时文献(In vitro maturation of nascentreticulocytes to erythrocytes；Mark J.Koury,Stephen T.Koury,PrapapornKopsombut,and Maurice C.Bondurant；BLOOD,1MARCH 2005VOLUME 105,NUMBER 5；2168-2174)报道网织红细胞成熟过程中RNA较线粒体更快降解和消失，因此本发明所检测到网织红细胞的数量较手动计数法多，可能是终末段成熟期网织红细胞的RNA已降解，但仍然保留有线粒体，并能被MTG和TMRE荧光染料检测，实现对所有不同成熟期的网织红细胞的检测。
附图说明
图1：骨髓中红细胞生成的终末成熟图示及与成熟发育过程相关的主要特征和变化。幼红细胞脱去细胞核后形成无核的成熟红细胞，此阶段会经历线粒体去极化、自噬过程，实现线粒体消除；其膜电位下降，并可被膜电位染料MTG和TMRE检测到。消除过程中网织红细胞会经历4个阶段即R1、R2-1、R2-2和R3阶段，分别为早期、中期、较晚期和晚期网织红细胞，最终形成成熟红细胞。在红细胞的成熟过程中，细胞体积变小，MTG染色率在成熟红细胞阶段消失，TMRE染色率降低至网织红细胞的R2期消失。R1期网织红细胞能被TMRE识别而显红色；R2-1和R2-2期网织红细胞能被TMRE和MTG同时识别显橙黄色，R2-1期的细胞在体积上较R2-2期更大，以FS大小作区分；而R3期网织红细胞只能被MTG识别而显示绿色。
图2：技术路线图。
图3：网织红细胞可视化图片及不同荧光通道统计图：A图是不同样品(从左往右依次为小鼠正常外周血样品、骨髓样品和脾脏样品)通过激光共聚焦拍摄的代表性图片(图片放大600倍)，红色圆圈为网织红细胞；B图是相对应的不同荧光通道的饼状统计图，比例越小表示线粒体去极化程度越高，每个视野约30-60个细胞，每个样品拍摄至少6张照片。
图4：激光共聚焦所拍摄的不同发育期的网织红细胞图：横坐标分别是BF(白场)、MTG通道(绿色荧光)、TMRE通道(红色荧光)和三个通道结合的图片；从形态和染色情况可将网织红细胞大致分为R1、R2和R3期，分别代表网织红细胞成熟的不同时期。可以观察到R1和R2期网织红细胞的体积更大，形状不一，表面凹凸不一；R3期细胞表面更光滑，且逐渐出现凹陷的形态。
图5：外周血流式细胞术程序设门方案。(A)外周血的流式细胞仪程序建立过程，在所有细胞群中除去死细胞、血小板和细胞碎片后，除去染上Hoechst33342的有核细胞群，此细胞群均为外周血的红细胞和网织红细胞，通过MTG/TMRE染色后将网织红细胞分期，包括R1、R2、R3三个分期，分别代表网织红细胞早期、中期、晚期。(B)在激光共聚焦下拍摄的网织红细胞不同成熟期图片。
图6：骨髓和脾脏细胞的流式细胞术程序设门方案。(A)骨髓和脾脏细胞的流式细胞仪程序建立过程，在所有细胞群中除去死细胞、血小板和细胞碎片后，除去染上Hoechst33342的有核细胞群，此细胞群均为骨髓和脾脏的红细胞和网织红细胞，通过MTG/TMRE染色后将网织红细胞分期，包括R1、R2-1、R2-2、R3四个分期，分别是网织红细胞早期、中期、较晚期和晚期。(B)在激光共聚焦下拍摄的网织红细胞不同成熟期图片。
图7：骨髓基质细胞染色时间的优化。横坐标是MTG/TMRE/Hoechst33342三种染料，纵坐标是优化的时间(0.5h、1.5h、2.5h和3.5h)，可以看出三种染料随着染色时间的增加，三种染料的染色率均增加，在2.5h时染色结果较3.5h理想，因此选用2.5h为最佳染色时间。
图8：网织红细胞检测方法的通用性：不同样品的流式结果的统计图(从左到右：小鼠正常外周血、骨髓和脾脏)。(A)表示有核细胞、网织红细胞和成熟红细胞的细胞数量(105)；(B)表示不同成熟期网织红细胞的细胞数量(105)；(C)网织红细胞不同成熟期与红细胞数量的比值；(D)网织红细胞占所有细胞数量的比值。样品个数≥3，数据用表示。
图9：新亚甲蓝手动计数法与MTG/TMRE流式细胞仪计数法相关性分析：使用新亚甲蓝手动计数法和MTG/TMRE染色法对网织红细胞进行计数，SPSS软件分析得到y＝0.86*x-1.88，相关系数R＝0.817(p＜0.01)。
图中，pyrenocyte核红细胞；erythroblast成红细胞；reticulocyte网织红细胞；erythrocyte红细胞；cell size细胞尺寸；cell nucleus细胞核；bone marrow骨髓；flushing out the bone marrow cells清除骨髓细胞；filter过滤；dilution稀释；spleen脾；peripheral blood外周血；staining染色；flow cytometry流式细胞术；laserconfocal scanning激光共聚焦扫描；correlation analysis相关性分析；网织红细胞增多；fluorescence red/green荧光红/绿；samples样品；Manual reticulocyte count手工计数法；MTG/TMRE reticulocyte countMTG/TMRE染色法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
实施例：
实施例1
动物实验：KM小鼠(SPF级，5-6w，购自中山大学实验动物中心东校区)在符合标准的稳定光源下(白天与黑夜交替光照12小时)和能自由获取饮食饮水的条件下饲养，根据《动物管理和使用指南》对动物进行实验。所有动物实验均经当地伦理审查委员会批准。将小鼠连续4d进行眼眶静脉丛放血，每天放血量为320-400μL。第四天取100μL全血加入含15g/L EDTA的PBS中并调整细胞浓度至约1×106-2×106个/mL进行染色。
材料收集：取小鼠的外周血、骨髓和脾脏进行实验。具体操作步骤如下：
1)小鼠正常外周血样品：取小鼠眼眶静脉丛取血后取100μL全血加入含15g/LEDTA的PBS中并调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL进行染色。
2)小鼠骨髓样品：取小鼠脱颈处死，用75％酒精进行表皮消毒。在无菌超净台中解剖取出2条股骨，用已高压消毒的剪刀剪去股骨两端的小部分关节，修剪干净骨骼周围的组织，先用PBS洗一次骨头，单支股骨用1mL一次性注射器吸取1mL含有2％胎牛血清的PBS，迅速小心将针头插入股骨末端，分别冲洗出股骨里面的骨髓细胞，用200目滤网过滤并制成单细胞悬液，吸取并调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL进行染色。
3)小鼠脾脏样品：取小鼠脱颈处死，用75％酒精进行表皮消毒。在无菌超净台中用已高压消毒的剪刀解剖取出脾脏，置于100目筛网中，用1mL一次性注射器弃去针头，轻柔碾压脾脏后过滤，用含有2％胎牛血清的PBS反复冲洗筛网并制成单细胞悬液，调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL进行染色。
优化MTG、TMRE、Hoechst 33342染色方法：
1)MTG染色方法的优化：取骨髓单细胞悬液(细胞浓度约1-2×106个/mL)，加10μL10μM MTG(MB6044，Meilunbio，China)，放到37℃恒温箱(生化培养箱,SPX-250B-Z，BDXUN,China)内避光恒温孵育，从染色0.5h开始上流式细胞仪检测，时间点为0.5h、1.5h、2.5h和3.5h。
2)TMRE染色方法的优化：取骨髓单细胞悬液(细胞浓度约1×106-2×106个/mL)，加入20μL 300μM TMRE(Cas.115532-52-0，Meilunbio，China)，放到37℃恒温箱内避光恒温孵育，染色时间由染色0.5h开始检测，时间点为0.5h、1.5h、2.5h和3.5h。
3)Hoechst33342染色条件的优化：取骨髓单细胞悬液(细胞浓度约1×106-2×106个/mL)，加入1μL 1mg/mL Hoechst33342(Meilunbio，China),放到37℃恒温箱内避光恒温孵育，染色时间由染色0.5h开始检测，时间点为0.5h、1.5h、2.5h和3.5h。
结论：利用骨髓细胞作为细胞模型，进一步对流式染色条件进行了优化，结果表明染色2.5小时是最佳时间，阳性细胞率分别是94.3％(MTG)，84.5％(TMRE)，70.4％(Hoechst33342)。低于2.5小时，当染色时间为0.5和1.5小时，有一部分细胞没有被染色，阳性细胞率分别为56.8％(MTG)，16.7％(TMRE)，5.6％(Hoechst33342)和78.4％(MTG)，61.2％(TMRE)，12.7％(Hoechst33342)。而实验中发现染色时间延长，染色时间为3.5小时时，死细胞会增多，比例下降为77.3％(MTG)，72.4％(TMRE)，68.5％(Hoechst33342)，因此2.5h时为最佳染色时间(图7)。
网织红细胞检测：
1)激光共聚焦染色方法：取MTG(工作液浓度10μM)10μL加入样品(终体积为100μL,细胞浓度约1×106-2×106个/mL)中摇匀，加入TMRE(工作液浓度300μM)20μL于样品中摇匀，加入Hoechst33342(工作液浓度1mg/mL)1μL混匀，置于37℃孵育箱孵育2-2.5h。300g，5min离心清洗两次，取100μL至激光共聚焦皿(NEST，Cat.No.801001，China)静置5min，待细胞沉淀至底部后上激光共聚焦(Olympus FV1000 laser confocal,Japan)观察。
激光共聚焦定量：用激光共聚焦激光346nm、488nm和543nm激发，发射波长包括460±15nm、515±15nm和605±32.5nm，可使极化的线粒体呈现红色，去极化(膜电位下调)的线粒体呈现绿色，正在去极化的线粒体呈现橙黄色。将激光共聚焦的透射光设置在TD1模式，在蓝色、红色和绿色通道中，采集图像。为了量化结果，用MTG/TMRE/Hoechst33342染色。用FV10-ASW软件划分感兴趣的区域(例如细胞)，记录红色和绿色通道中的平均荧光强度及测定信号的比率，比率越小，线粒体去极化的程度越高。每个视野约30-60个细胞，每个样品拍摄至少6张照片，绘制饼状统计图。
激光共聚焦可视化展示网织红细胞的形态及染色情况
细胞形态结构和数目变化是判断很多疾病的指标。为了能直观地观察网织红细胞在形态学上的变化，利用不同样品(小鼠正常外周血样品、骨髓样品和脾脏样品)进行染色，在激光共聚焦下观察细胞形态结构，统计不同荧光通道代表的数值并绘制饼状图(图3)。
结果表明，小鼠正常外周血样品中占大多数比例的细胞是红细胞，极少部分呈多褶皱形状的细胞为网织红细胞(红圈)；被TMRE染色后线粒体呈现红色，表明线粒体还未去极化，仍为早期网织红细胞；线粒体呈现黄色的是同时染上MTG和TMRE的中期网织红细胞；被MTG染色后线粒体呈现绿色，表明线粒体已去极化，为晚期网织红细胞；蓝色为Hoechst染色的细胞核，为有核细胞，排除该细胞群，没有被Hoechst染色成功的细胞为网织红细胞及红细胞(图3A)。饼状统计图的颜色与线粒体被染的颜色相对应。
从小鼠正常外周血的饼状统计图(图3B)中可以发现早期网织红细胞(红色)与中期网织红细胞(黄色)占外周血所有细胞的比例相近，分别约为3.40％和3.30％，而晚期网织红细胞(绿色)占外周血所有细胞的比例相对较少，约为1.90％；骨髓样品中网织红细胞的早期、中期和晚期网织红细胞占骨髓中所有细胞的比例有较大差异，分别为7.40％、14.0％和5.40％。小鼠脾脏样品的网织红细胞不同分期情况与骨髓样品的相似，占脾脏中所有细胞的比例分别为4.30％、12.0％和2.70％。
2)流式细胞仪染色方法：取MTG(工作液浓度10μM)10μL加入样品(终体积为100μL,细胞浓度约1×106-2×106个/mL)中摇匀，加入TMRE(工作液浓度300μM)20μL于样品中摇匀，加入Hoechst33342(工作液浓度1mg/mL)1μL混匀，置于37℃孵育箱孵育2-2.5h。300g，5min离心清洗两次，1mLPBS重悬后上流式细胞仪检测；
流式设门方案：使用具有三激光十通道的流式细胞仪(Gallios，BeckmanCoulter，USA)检测。使用EXPO32TM ADC软件进行结果分析。具体设门步骤为：(1)使用侧向散射光(SS)和前向散射光(FS)确定细胞群，排除血小板、细胞碎片；(2)使用Cascede Blue通道信号设门排除有核细胞群干扰；(3)使用FITC(获取MTG荧光信号)和PE(获取TMRE荧光信号)通道设门标记网织红细胞及其不同成熟期分群。每样本至少检测30000个细胞。Hoechst33342的激发光在346nm,发射光波长在460±15nm；MTG的激发光在488nm,发射光在515±15nm；TMRE的激发光在543nm,发射光在605±32.5nm。
流式细胞术可区分和鉴定外周血和骨髓样品中不同成熟时期的网织红细胞
由于激光共聚焦的检测结果只能通过肉眼和软件初步判断网织红细胞的形态及染色情况(见图4)，无法准确定量不同成熟期网织红细胞，为了更精确定量不同时期的网织红细胞，进一步通过流式细胞仪检测。将网织红细胞使用MTG/TMRE/Hoechst33342染色后上流式细胞仪进行检测,可将外周血的网织红细胞群分成R1(MTGneg/TMREhigh)、R2(MTGhigh/TMREhigh)、R3(MTGhigh/TMREneg)三个成熟期以及对应的激光共聚焦拍摄的代表性图片(图5)，将骨髓的网织红细胞群分成R1(MTGneg/TMREhigh)、R2-1(MTGhigh/TMREhigh/FSbig)、R2-2(MTGhigh/TMREhigh/FSsmall)和R3(MTGhigh/TMREneg)四个成熟期以及对应的激光共聚焦拍摄的代表性图片(图6)。因此，流式细胞仪可以准确定量不同成熟期网织红细胞。
流式细胞术对不同样品具有通用性
为了检验新建立的网织红细胞检测方法的通用性，利用上述染色方法和设门方案分别检测了几种不同的样品(包括小鼠正常外周血样品、骨髓样品和脾脏样品)。通过流式结果统计图我们可以得到不同样品的有核细胞、网织红细胞和成熟红细胞的细胞数量(图8A)；不同成熟期网织红细胞的细胞数量(图8B)；网织红细胞不同成熟期与成熟红细胞比值(图8C)和不同成熟期网织红细胞占所有细胞比值(图8D)。
结果表明外周血的网织红细胞可以明显分为R1、R2和R3三个发育期，正常外周血的网织红细胞总数约占成熟红细胞比例为5.40±0.59％，占外周血所有细胞的比例为5.11±0.53％；R1、R2和R3期占成熟红细胞的比例分别为1.13±0.35％，1.00±0.12％，3.28±0.21％，占所有细胞的比例分别为1.07±0.32％、0.94±0.11％和3.10±0.19％。
骨髓和脾脏细胞分别染色后网织红细胞可以分为四个期，骨髓中网织红细胞总数占成熟红细胞比例约为68.06±14.33％，占所有骨髓细胞的比例为13.98±1.51％；R1、R2-1、R2-2和R3期占成熟红细胞比例分别为1.42±0.92％，8.66±2.74％，16.02±1.78％，41.95±17.70％，占骨髓所有细胞的比例分别约为0.34±0.22％、2.00±0.86％、3.47±0.93％和8.17±0.90％。
脾脏细胞中网织红细胞总数占成熟红细胞比例约为8.55±0.28％，占所有脾脏细胞的比例约3.61±0.11％；R1、R2-1、R2-2和R3期占成熟红细胞比例分别为0.18±0.05％，0.35±0.06％，2.59±0.26％，5.43±0.08％，占所有细胞的比例分别约为0.08±0.02％、0.15±0.02％、1.09±0.07％和2.30±0.13％。
激光共聚焦与流式细胞仪检测到的网织红细胞比例有差异。相比于激光共聚焦，流式细胞仪检测正常外周血网织红细胞总比例、早期和中期网织红细胞比例更低。针对骨髓和脾脏样品，激光共聚焦无法区分R2-1和R2-2期，而流式细胞仪可以通过设门对其进行区分，因此利用流式细胞仪可以将网织红细胞更加精确定量并进一步分成不同发育期网织红细胞。
3)新亚甲蓝染色：新亚甲蓝粉末(Cat No.234052,Meilunbio,China)0.5g、氯化钠0.8g，溶于含有EDTA的PBS中配成5g/L的新亚甲蓝溶液备用。使用试管法，将等量血液与新亚甲蓝溶液混合于一小试管内，染色10-15分钟制成薄的涂片后镜检。计数1000个红细胞中的网织红细胞百分数,取均值。
数据分析：使用GraphPad Prism 7.0进行图表统计绘制；流式细胞术的数据用EXPO32 TM ADC软件分析；激光共聚焦数据用FV10-ASW软件分析。首先对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，样本均采用平均值±标准差(mean±SD)表示，每个样本重复3次。相关性分析则采用SPSS 22.0(IBM)统计软件，以手工法与仪器法的Ret％测定值作Spearman相关性统计学处理，重复检测20个样本，计算平均值，标准偏差(SD)，变异系数(CV)。通过计算Spearman的rho值检验相关性。P＜0.01则认为具有显著性。
相关性分析
进一步通过相关性分析与传统新亚甲蓝染色法所得结果进行了比较。采用正常外周血样品，重复检测20个样本，得到新亚甲蓝手工计数法获得的平均值(mean±SD)，变异系数(CV)和范围(％)分别为2.66±0.52％，19.59和1.8-3.7％。MTG/TMRE/Hoechst33342染色流式细胞法获得的平均值(mean±SD)，变异系数(CV)和范围(％)分别为5.29±0.50％，9.75和4.6-6.3％(表1)。MTG/TMRE染色法与新亚甲蓝手工计数法相比结果相似，从CV值我们得出，MTG/TMRE染色法比新亚甲蓝手工计数法更稳定，波动更小。以新亚甲蓝手工计数法(Y轴)与MTG/TMRE染色法(X轴)的Ret％测定值作Spearman相关性处理(图9)，得到线性关系y＝0.86*x-1.88，相关系数R＝0.817(p＜0.01)，具有统计学意义。
表1.使用手工计数法与MTG/TMRE染色法计数的网织红细胞值
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，具体步骤如下：
取血液样品，经PBS调整细胞浓度后，待用；
将MTG加入样品中摇匀；加入TMRE混匀；加入Hoechst33342混匀；孵育；
完成孵育后的样品离心清洗两次，经PBS重悬后上流式细胞仪检测，或取样品静置待细胞沉淀后上激光共聚焦检测；
将检测数据用软件分析，得到不同成熟度的网织红细胞情况。
2.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述血液样品来自外周血、骨髓或脾脏。
3.根据权利要求2所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述血液样品为外周血，取100μL全血加入含15 g/L EDTA的PBS中并调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL；
所述血液样品来自骨髓，在无菌超净台中解剖取出2条股骨，用已高压消毒的剪刀剪去股骨两端的小部分关节，修剪干净骨骼周围的组织，先用PBS洗一次骨头，单支股骨用1mL一次性注射器吸取1mL含有2%胎牛血清的PBS，迅速小心将针头插入股骨末端，分别冲洗出股骨里面的骨髓细胞，用200目滤网过滤并制成单细胞悬液，吸取并调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL；
所述血液样品来自脾脏，在无菌超净台中用已高压消毒的剪刀解剖取出脾脏，置于100目筛网中，用1mL一次性注射器弃去针头，轻柔碾压脾脏后过滤，用含有2%胎牛血清的PBS反复冲洗筛网并制成单细胞悬液，调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL。
4.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，步骤2）中，取10μL MTG（工作液浓度10μM）加入样品（终体积为100μL，细胞浓度约1×106-2×106个/mL）中摇匀，加入20μL TMRE（工作液浓度300μM）于样品中摇匀，加入1μLHoechst33342（工作液浓度1mg/mL）混匀，置于37℃孵育箱孵育2-2.5h。
5.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，步骤3）中，所述离心条件为300g，离心5min。
6.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，步骤3）中，所述流式细胞仪为具有三激光十通道的流式细胞仪。
7.根据权利要求6所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述流式细胞仪的设门步骤如下：（1）使用SS和FS确定细胞群，排除血小板、细胞碎片；（2）使用Cascede Blue通道信号设门排除有核细胞群干扰；（3）使用FITC（获取MTG荧光信号）和PE（获取TMRE荧光信号）通道设门标记网织红细胞及其不同成熟期分群；每样本至少检测30000个细胞。
8.根据权利要求7所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述流式细胞仪的设门条件中，Hoechst33342的激发光在346nm，发射光波长在460±15nm；MTG的激发光在488nm，发射光在515±15nm；TMRE的激发光在543nm，发射光在605±32.5nm。
9.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述激光共聚焦检测的条件为：用激光共聚焦激光346nm、488nm和543nm激发，发射波长包括460±15nm、515±15nm和605±32.5nm；激光共聚焦的透射光设置在TD1模式，在蓝色、红色和绿色通道中，采集图像。
10.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述流式细胞术的数据用EXPO32 TM ADC软件分析；激光共聚焦数据用FV10-ASW软件分析；所述软件分析过程如下：对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，样本均采用平均值±标准差（mean±SD）表示，每个样本重复3次。
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