CN103123322A - 虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，该方法包括以下步骤：制备虾血细胞悬液；取两份虾血细胞悬液制作成阳性对照组和阴性对照组，加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，利用该阳性对照组和阴性对照组，通过流式细胞仪确定虾类血细胞线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域；取一份虾血细胞悬液进行实验处理，或虾经过活体实验处理后制备血细胞悬液，作为实验组，加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，根据确定的线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域，利用流式细胞仪测定实验组线粒体膜电位下降血细胞的比例。本发明的方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成操作损伤，准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速，为虾类血细胞线粒体膜电位的测定提供了方法依据。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法。
背景技术
虾类是我国重要的经济水产动物，种类繁多，主要包括凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeus monodon）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）等。虾类是我国水产养殖结构调整、农民增产增收、国家出口创汇的重要农产品。但是，近年来，虾类养殖频繁出现大面积发病和死亡，造成严重的经济损失。导致此问题产生的原因有很多，其中养殖水体环境的恶化所带来的一系列不利影响是最主要的原因之一。因此，环境胁迫对虾类生理和免疫的影响一直是研究的焦点。
血细胞在虾类的生理和免疫中均起着十分重要的作用，包括包囊作用、细胞毒活性、吞噬作用、储存和释放酚氧化酶原系统等。研究表明各类水体环境因子胁迫会导致对虾血细胞的免疫功能下降，如pH、盐度、温度、亚硝酸盐、氨氮等。线粒体是合成ATP为细胞生命活动提供能量的重要细胞器，线粒体膜电位是指线粒体内膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差，是维持线粒体正常功能所必须的，其下降也是细胞凋亡早期的一个标志性事件。对虾类血细胞线粒体膜电位进行准确的测定，有利于准确评价血细胞的生理活性和功能，但目前由于缺乏检测方法，尚没有虾类血细胞线粒体膜电位方面的研究报道。
JC-1是一种碳氰化合物类荧光染料，在细胞内以聚合物和单体两种不同形式存在。线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生橙红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，JC-1为单体，产生绿色荧光。通过荧光颜色的转变便可判断线粒体膜电位的变化。结合流式细胞术（Flow cytometry，FCM）进行测定，便可快速、准确地区分线粒体膜电位正常的细胞和线粒体膜电位下降的细胞。流式细胞术目前已成为高等脊椎动物细胞功能的常规检测，但其在虾类中尚未得到广泛应用。
发明内容
为了填补虾类血细胞线粒体膜电位检测技术的空白，本发明的目的在于提供一种快速测定虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，该方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成损伤，具有准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速的特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
（1）制备虾血细胞悬液；
（2）取两份步骤（1）中的虾血细胞悬液制作成阳性对照组和阴性对照组，加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，利用该阳性对照组和阴性对照组，通过流式细胞仪确定虾类血细胞线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域；
（3）取一份步骤（1）中的虾血细胞悬液进行实验处理，或虾经过活体实验处理后制备血细胞悬液，作为实验组，加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，根据步骤（2）所确定的线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域，利用流式细胞仪测定实验组线粒体膜电位下降血细胞的比例。
步骤（1）和（3）所述的制备虾血细胞悬液，是将虾体表水分擦干，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，再用预冷的抗凝剂调整细胞浓度后得到虾血细胞悬液；
所述的抗凝剂由以下方法制备得到：取20.5g葡萄糖、8g柠檬酸钠与4.2g氯化钠混合，加蒸馏水定容至1L，调整pH至7.5，高压灭菌后得到；
所述的虾血细胞悬液，其中血细胞浓度的数量级优选106cells/ml。
步骤（2）所述的阳性对照组，是在虾血细胞悬液中加入终浓度为10μmol/L的α-羰基氰化氯苯腙（CCCP），在室温下避光孵育30min后得到；
步骤（2）所述的阴性对照组，即虾血细胞悬液；
步骤（2）所述确定虾类血细胞线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域，是这样操作的：将阴性对照组上样，设定流式细胞仪前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC）基本参数，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，再在FL1-H/FL2-H散点图中同时获取血细胞的绿色和红色荧光强度（FL1和FL2数据采用Log对数形式），调整并确定FL1和FL2电压，再将阳性对照组上样，对比阳性和阴性对照组细胞的位置，红色荧光强、绿色荧光弱的细胞群体为线粒体膜电位正常的血细胞，红色荧光弱、绿色荧光强的细胞群体为线粒体膜电位下降的血细胞，在FL1-FL2散点图中圈定线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域。
步骤（2）所述确定虾类血细胞线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域的操作，在仪器状态不变的情况下，使用相同的参数，可直接用于不同实验处理（包括虾活体处理和血细胞离体处理）的虾类血细胞线粒体膜电位的检测。
步骤（2）和（3）所述的加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，是往虾血细胞悬液加入终浓度为10μmol/L的JC-1，室温下避光孵育30min，用200目筛网过滤；
步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定实验组线粒体膜电位下降血细胞的比例，是这样操作的：设定流式细胞仪前向角散射光（FSC）、侧向角散射光（SSC）FL1、FL2基本参数，将实验组上样后先在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，再在FL1-H/FL2-H散点图中同时获取血细胞的绿色和红色荧光强度，读取细胞数10000个以上，根据步骤（2）确定的线粒体膜电位正常血细胞和线粒体膜电位下降血细胞的区域，通过软件分析线粒体膜电位下降血细胞的比例。
本发明的原理是：不经处理的虾血细胞中绝大部分为线粒体膜电位正常的血细胞，用作为阴性对照，JC-1对其线粒体进行染色后JC-1以聚合物形式存在，发红色荧光；经CCCP处理的虾血细胞，线粒体膜电位下降，用作为阳性对照，JC-1对其线粒体进行染色后JC-1以单体形式存在，发绿色荧光；根据血细胞红色和绿色荧光的不同，不同线粒体膜电位的细胞落在FL1-H/FL2-H散点图中不同的位置，对比阳性对照组和阴性对照组的细胞位置，便可确定线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成操作损伤，准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速，为虾类血细胞线粒体膜电位的测定提供了方法依据。
附图说明
图1是实施例中阴性对照血细胞的FL1-H/FL2-H散点图。
图2是实施例中阳性对照血细胞的FL1-H/FL2-H散点图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
使用流式细胞术检测方法测定用镉离子处理后的凡纳滨对虾离体血细胞线粒体膜电位，包括以下步骤：
（1）配制适用于凡纳滨对虾的抗凝剂：蒸馏水中加入葡萄糖20.5g/L，柠檬酸钠8g/L，氯化钠4.2g/L，调整pH至7.5，高压灭菌，冷却后置于4°C冰箱保存备用。
（2）制备对虾的血细胞悬液：取出对虾，用棉球擦干体表水分，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，放入无菌离心管中，取足够的血淋巴后，将其混合，用预冷的抗凝剂调整细胞浓度约为106cells/mL。
（3）阴性对照组和阳性对照组的制备：取2管血细胞悬液，每管600μl，1管血细胞悬液作为阴性对照组，1管血细胞悬液加入终浓度为10μmol/L的α-羰基氰化氯苯腙（CCCP），在室温下避光孵育30min后作为阳性对照组。
（4）JC-1荧光染料与血细胞共孵育：分别在阴性和阳性对照组的血细胞悬液中加入终浓度为10μmol/L的JC-1（购自Sigma公司），避光室温孵育30min后，用200目筛网过滤。
（5）线粒体膜电位正常血细胞和线粒体膜电位下降血细胞区域的确定：所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCalibur，将阴性对照组上样，设定仪器基本参数，前向角散射光（FSC）电压E00，放大器1.6，数据采用Line线性形式，侧向角散射光（SSC）电压350，数据采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，再在FL1-H/FL2-H散点图中同时获取血细胞的绿色和红色荧光强度（FL1和FL2数据采用Log对数形式），确定FL1电压为650，FL2电压为380，再进行阳性对照组上样，对比阳性（图2）和阴性（图1）对照组细胞的位置，红色荧光强、绿色荧光弱的细胞群体为线粒体膜电位正常的血细胞，红色荧光弱、绿色荧光强的细胞群体为线粒体膜电位下降的血细胞，在FL1-H/FL2-H散点图中圈定线粒体膜电位正常血细胞的区域（记为R2）和线粒体膜电位下降血细胞的区域（记为R1）。
（6）用镉离子处理血细胞：取2管血细胞悬液，每管495μl，1管血细胞悬液中加入5μl抗凝剂为对照组，另1管血细胞悬液中加入5μl浓度为10-2mol/L的Cd2+溶液，在室温下避光孵育6h后为镉离子处理组。
（7）JC-1荧光染料与血细胞共孵育：分别取200μl对照组和镉离子处理组的血细胞悬液，加入终浓度为10μmol/L的JC-1，避光室温孵育30min后，用200目筛网过滤。
（8）流式细胞仪测定用镉离子处理后凡纳滨对虾血细胞线粒体膜电位：按照步骤（5）确定的参数进行流式细胞仪基本参数的设定，前向角散射光（FSC）电压E00，放大器1.6，数据采用Line线性形式，侧向角散射光（SSC）电压350，数据采用Log对数形式，FL1电压为650，数据采用Log对数形式，FL2电压为380，数据采用Log对数形式，上样后（对照组和镉离子处理组是分别上样、分别测定）先在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，再在FL1-H/FL2-H散点图中同时获取血细胞的绿色和红色荧光强度，读取细胞数10000个，根据已划定的线粒体膜电位正常血细胞（记为R2）和线粒体膜电位下降血细胞（记为R1）的区域，用CellQuest Pro软件分析线粒体膜电位下降血细胞（R1）的比例。
计算结果如下所示：
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备虾血细胞悬液；
（2）取两份步骤（1）中的虾血细胞悬液制作成阳性对照组和阴性对照组，加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，利用该阳性对照组和阴性对照组，通过流式细胞仪确定虾类血细胞线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域；
（3）取一份步骤（1）中的虾血细胞悬液进行实验处理，或虾经过活体实验处理后制备血细胞悬液，作为实验组，加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，根据步骤（2）所确定的线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域，利用流式细胞仪测定实验组线粒体膜电位下降血细胞的比例；
步骤（2）所述的阳性对照组，是在虾血细胞悬液中加入终浓度为10μmol/L的α-羰基氰化氯苯腙，在室温下避光孵育30min后得到；
步骤（2）所述的阴性对照组，即虾血细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（1）和（3）所述的制备虾血细胞悬液，是将虾体表水分擦干，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，再用预冷的抗凝剂调整细胞浓度后得到虾血细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，其特征在于：所述的抗凝剂由以下方法制备得到：取20.5g葡萄糖、8g柠檬酸钠与4.2g氯化钠混合，加蒸馏水定容至1L，调整pH至7.5，高压灭菌后得到。
4.根据权利要求1所述的虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的虾血细胞悬液，其中血细胞浓度的数量级为106cells/mL。
5.根据权利要求1所述的虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（2）所述确定虾类血细胞线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域，是这样操作的：将阴性对照组上样，设定流式细胞仪前向角散射光和侧向角散射光基本参数，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，再在FL1-H/FL2-H散点图中同时获取血细胞的绿色和红色荧光强度， 调整并确定FL1和FL2电压，再将阳性对照组上样，对比阳性和阴性对照组细胞的位置，红色荧光强、绿色荧光弱的细胞群体为线粒体膜电位正常的血细胞，红色荧光弱、绿色荧光强的细胞群体为线粒体膜电位下降的血细胞，在FL1-H/FL2-H散点图中圈定线粒体膜电位正常血细胞的区域和线粒体膜电位下降血细胞的区域。
6.根据权利要求1所述的虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（2）和（3）所述的加入荧光染料JC-1与血细胞共孵育，是往虾血细胞悬液加入终浓度为10μmol/L的JC-1，室温下避光孵育30min，用200目筛网过滤。
7.根据权利要求1所述的虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定实验组线粒体膜电位下降血细胞的比例，是这样操作的：设定流式细胞仪前向角散射光、侧向角散射光、FL1、FL2基本参数，将实验组上样后先在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，再在FL1-H/FL2-H散点图中同时获取血细胞的绿色和红色荧光强度，读取细胞数10000个以上，根据步骤（2）确定的线粒体膜电位正常血细胞和线粒体膜电位下降血细胞的区域，通过软件分析线粒体膜电位下降血细胞的比例。
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