CN111504869A

CN111504869A - 流式聚集体杂质分析仪

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Publication number: CN111504869A
Application number: CN202010413815.8A
Authority: CN
Inventors: 胡志上; 李红梅; 米薇
Original assignee: National Institute of Metrology
Current assignee: National Institute of Metrology
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-05-15
Also published as: CN111504869B

Abstract

本发明涉及药品中聚集体颗粒浓度检测领域，具体涉及一种流式聚集体杂质分析仪。该分析仪包括液流系统(1)、光路系统(2)以及分析控制系统(3)；其中，所述光路系统(2)包括激光器(21)、FSC检测通道(22)和SSC检测通道(23)；其中，所述FSC检测通道(22)能够分别提供405‑435V和175‑205V的检测电压；所述SSC检测通道(23)能够分别提供290‑310V和120‑140V的检测电压，并且能够提供600‑1200的阈值。采用本发明的分析仪能够同时对样品中1微米以下和200纳米以上的可溶性聚集体颗粒以及1微米以上的不溶性聚集体颗粒进行高灵敏度、高分辨率和精准定量地检测。

Description

流式聚集体杂质分析仪

技术领域

本发明涉及药品中聚集体颗粒浓度检测领域，具体涉及一种流式聚集体杂质分析仪。

背景技术

生物制品如重组蛋白药物、疫苗、血制品中的人免疫球蛋白，以及某些基因治疗载体、复杂注射剂、中药注射剂等与小分子药物相比，分子量大、结构复杂、修饰较多、动态变化频繁、工艺控制较难，生产、纯化、灌装、运输、保存过程中都有可能发生聚集的现象，从而影响生物制品的质量和免疫原性，进而影响药品的安全性和有效性，所以从上世纪90年代末以来就受到制造和监管部门的广泛关注。随着制药工艺水平的发展，可监测范围内的产品聚集状况比20年前有了很大改善，但难以做到完全去除，且监测范围本身存在较大空白区域。

目前发达国家药典USP<788＞、<787＞、<1787＞和EP<2.9.19＞中对10μm以上的不溶性聚集体颗粒的检测方法和放行标准均做了规定；同时指出小于10μm的颗粒分布也可能是重要的产品质量参数之一，所以建议收集蛋白质注射制剂中2-10μm颗粒的数据。近年美国FDA又将监管目标从10μm以上、2-10μm延伸到了0.1-2μm，指明了未来相关药品标准和监管法规的升级方向。

由于受限于灵敏度、分辨率或定量能力，现有众多方法不适于蛋白类药物单抗药物中亚微米(0.1-1μm)聚集体杂质检测，这导致了各国药典中亚微米聚集体杂质的检测方法标准空白，因此受到了行业内和监管机构的广泛关注。

在制药工业中，小于0.1μm的聚集体杂质通常用分子排阻色谱(size exclusionchromatography，SEC)测量，而大于100μm的肉眼察看即可。10-100μm的不溶性颗粒依据药典主要推荐光阻法(light obscuration，LO)测量，2-10μm虽无法规强制要求，但申报、放行时的微流照相法(micro-flow imaging，MFI)数据基本已是必不可少。真正的标准技术空白存在于0.1-2μm区间，虽然有DLS(测到的只是平均值，掩盖了样本的异质性)、场流(flowfield-flow fractionation，FFF)、分析超速离心(analytical ultracentrifugation，AUC)、纳米示踪(nanoparticle tracking analysis，NTA)、共振质量测量(Resonant massmeasurement，RMM)等技术提供数据，但由于生物大分子聚集体杂质折射率小、粒径范围宽、浓度波动大，这些技术受限于灵敏度、分辨率或定量能力，难以支撑形成标准和法规。

Nishi等人(Nishi H,

R,Fürst R,Winter G,Label-free flow cytometryanalysis of subvisible aggregates in liquid IgG1 antibody formulations.JPharm Sci.2014 Jan；103(1):90-9.)采用流式细胞仪的光散射模式测量了500纳米以上的蛋白聚集体。Hu等人(Hu Z,Ye C,Mi W,Zhao Y,Quan C,Li WW,Li H,Hang H,Light-scattering detection within the difficult size range of protein particlemeasurement using flow cytometry.Nanoscale.2018 Nov 7；10(41):19277-19285)改造了一台流式细胞仪，进一步实现了测量200纳米以上的微球和蛋白聚集体。但仍然无法实现200纳米以下颗粒的检测，并且灵敏度、分辨率或定量能力仍然难以支撑形成标准和法规。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种流式聚集体杂质分析仪，采用本发明的流式聚集体杂质分析仪能够同时对样品中200纳米以下和以上的聚集体颗粒进行高灵敏度、高分辨率和精准定量地检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种流式聚集体杂质分析仪，该分析仪包括液流系统、光路系统以及分析控制系统；

其中，所述光路系统包括激光器、FSC检测通道和SSC检测通道；

其中，所述FSC检测通道能够分别提供405-435V和175-205V的检测电压；所述SSC检测通道能够分别提供290-310V和120-140V的检测电压，并且能够提供600-1200的阈值。

优选的，所述FSC检测通道包括FSC直接通道检测器和FSC旁侧通道检测器；其中，FSC检测通道上还设置有分光器，其设置使得所述FSC直接通道检测器能够收集和检测与激光光轴夹角为0.5°至15°和-15°至-0.5°的前向散射光，FSC旁侧通道检测器能够收集并检测与激光光轴夹角为15°-30°的前向散射光；或者

所述FSC检测通道包括FSC通道检测器以及设置在样品液流和FSC通道检测器之间的NA＞1的数字光圈；或者

所述FSC检测通道上设置有对前向散射光的收集角度为2°至18°的NanoView前向角散射检测器模块。

优选的，FSC检测通道还能够提供220-330V的检测电压；所述SSC检测通道能够分别提供180-315V的检测电压。

优选的，所述FSC检测通道还包括在FSC通道检测器上游设置的带通透镜，用于对前向散射光进行过滤；其中，所述带通透镜包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜和通过波长为468-508nm的第二带通透镜；和/或

所述SSC检测通道还包括在SSC通道检测器上游设置的带通透镜，用于对侧向散射光进行过滤；其中，所述带通透镜包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜和通过波长为468-508nm的第二带通透镜。

优选的，所述激光器包括第一激光器和第二激光器，其中，所述第一激光器发射的激光束的波长为400-410nm，能量为150-200mW，光斑长轴为9-11μm；所述第二激光器发射的激光束的波长为485-490nm，能量为18-22mW，光斑长轴为115-125μm。

优选的，所述FSC检测通道和SSC检测通道的末端各自独立的设置有检测器，且所述检测器为整合有计数功能的光电倍增管或带有单光子计数功能的雪崩光电二极管。

优选的，所述液流系统包括鞘液管、样品管、流动室和压力控制元件；

其中，沿着液流的方向，在样品管的末端，所述流动室与鞘液管和样品管连接，用于接收包裹鞘液的样品液流，并允许激光横向照射并穿过样品液流；

其中，所述压力控制元件使得所述包裹鞘液的样品液流形成9-11μm或27-33μm的中心液柱。

优选的，所述液流系统的设置使得鞘液和样品液分别以自下而上的方式被引入至鞘液管和样品管中。

优选的，所述流动室的材料为石英。

优选的，流动室的照射面高大于200μm，激光穿过液流的距离为80-120μm。

优选的，所述液流系统还包括样品进样单元，所述进样单元的样品入口处设置有负压设备，用于将样品以负压吸入的方式引入；和/或

所述液流系统还包括鞘液进样单元，所述鞘液进样单元上设置有至少2个过滤设备，以对所述鞘液进行过滤。

通过上述技术方案，本发明能够对0.1-1μm以及1μm以上的聚集体颗粒进行高灵敏度、高分辨率和精准定量地检测。根据相关报道和测量的经验，越小的聚集体浓度越高，且100-200nm的聚集体能够影响产品的质量和免疫原性，因此本发明的方法填补了该测量空白，与分子排阻色谱(SEC)搭配可实现对药物聚集体杂质的全量程分析(0.05-100μm，贯穿纳米、亚微米和微米区间)，促进药品质量控制以及免疫原性、安全性和有效性的评价，可用于蛋白药物、减活疫苗、血制品、复杂注射剂、某些药物载体等产品的工艺优化及质量控制。

附图说明

图1是本发明提供的一种流动室的结构图；

图2是本发明提供的一种流式聚集体杂质分析仪的结构图；

图3为本发明提供的一种具体的标准光散射图谱；

图4为本发明提供的一种具体的标准光散射图谱；

图5为本发明提供的一种具体的标准光散射图谱；

图6为使用本发明提供的方法通过前向散射光(FSC)对200、300与500nm的聚苯乙烯微球的分析结果；

图7为在使用本发明提供的方法检测稀释后的300nm微球的结果；

图8为在使用本发明提供的方法检测稀释后的500nm微球的结果；

图9为使用本发明提供的方法对三种重磅抗体药物进行0.2-1μm区间聚集体检测的结果；

图10为使用本发明提供的方法以微球粒径标尺对应的散射信号区间设定相应粒径的聚集体杂质的信号区间；

图11为采用现有技术的方法对不同粒径微球进行检测的结果；

图12为用场流仪和流式聚集体杂质分析仪比较分辨200、300与500nm的聚苯乙烯微球的结果；

图13为使用本发明提供的方法检测三种不同条件处理后的药物中亚微米聚集体杂质分布的变化。

附图标记说明

1、液流系统 2、光路系统 3、分析控制系统

11、鞘液管 12、样品管 13、流动室

21、激光器 22、FSC检测通道 23、SSC检测通道

24、荧光检测通道 211、第一激光器 212、第二激光器

221、FSC直接通道检测器 222、分光器 223数字光圈

224、带通透镜 225、FSC旁侧通道检测器

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供一种检测样品中聚集体颗粒在目标粒径下浓度的方法，该方法包括：

(1)在流式细胞仪上分别采用FSC通道和SCC通道检测所述样品在激光激发下的前向散射光和侧向散射光，获得前向光散射强度与不溶性聚集体颗粒数量之间关系的样品光散射图谱；

(2)根据不同粒径下的标准微球的标准光散射图谱，获得目标粒径下的光散射强度区间，根据所述光散射强度区间和所述样品光散射图谱，确定样品中在目标粒径下的聚集体颗粒的数量，从而获得样品中在目标粒径下的聚集体颗粒的浓度；

其中，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述FSC通道检测的电压为405-435V，SSC通道的检测电压为290-310V，SSC阈值600-1200；目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述FSC通道检测的电压为175-205V，SSC通道的检测电压为120-140V，SSC阈值600-1200；

其中，所述标准光散射图谱通过与样品检测条件相同的条件下获得。

根据本发明，所述“聚集体颗粒”包括可溶性聚集体颗粒和不可溶性聚集体颗粒。本发明中，将样品中1μm以上的颗粒杂质定义为“不溶性”颗粒，1μm以下的颗粒杂质定义为“可溶性”聚集体颗粒。

根据本发明，通常情况下，在用流式细胞仪对样品进行检测的过程中，样品中的聚集体颗粒基本上以单个粒子的形式流动并穿过激光照射区域，因此，流式细胞仪可以准确地对样品中的颗粒数量进行计数，同时激光以正交的角度聚焦于含有样本的液流柱(下文提及的中心液柱)上，进而照射在流过的微粒上，产生散射光，其中，前向散射光由与激光光线同轴的FSC通道收集并检测，侧向散射光可以被与激光(束)和样品液流垂直的SSC通道进行收集和检测，由此可获得前向散射光强度。

其中，因为FSC-SSC散点图是调试仪器、测量颗粒杂质的基本二维参数图：FSC主要表征颗粒大小，SSC主要表征颗粒内部的均匀度。在二维图里SSC对分辨颗粒也有贡献。如果没有设置合适的SSC电压及SSC阈值，只用FSC一维将很难找到目标颗粒群的位置，观察到的信号也很难区分到底是颗粒的信号还是背景噪音。

根据本发明，所述FSC通道和SCC通道可以各自独立的至少为1路。

根据本发明，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述FSC通道检测的电压为405-435V，例如，可以为405V、415V、416V、417V、418V、419V、420V、421V、422V、423V、424V、425V、430V、435V，优选为415-425V。根据本发明一种最为优选的实施方式，所述FSC通道检测的电压为420V。

根据本发明，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，SSC通道的检测电压为290-310V，例如，可以为290V、295V、300V、305V、310V，优选为295-305V；SSC阈值600-1200，例如，可以为600V、700V、800V、900V、1000V、1100V、1200V，优选为600-1000；最优选的，SSC通道的检测电压为300V，SSC阈值600。

其中，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径可以为0.1-1μm之间任意两个点值组成的范围内的粒径，例如，可以为但不限于0.1-0.2μm、0.1-0.3μm、0.3-0.5μm、0.6-1μm、0.8-0.9μm等等。

其中，目标粒径为0.1-1μm区间中任一粒径可以为0.1-1μm之间任意一个点值所代表的粒径，例如，0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm。

根据本发明，优选的，目标粒径为1μm以上区间为1-100μm。

根据本发明，在目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述FSC通道检测的电压为175-205V，例如，可以为175V、180V、185V、186V、187V、188V、189V、190V、191V、192V、193V、194V、195V、200V、205V，优选为185-195V。根据本发明一种最为优选的实施方式，所述FSC通道检测的电压为190V。

根据本发明，目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，SSC通道的检测电压为120-140V，例如，可以为120V、125V、130V、135V、140V，优选为125-135V；SSC阈值600-1200，例如，例如，可以为600V、700V、800V、900V、1000V、1100V、1200V，优选为600-1000；最优选的，SSC通道的检测电压为130V，SSC阈值600。

其中，目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径可以为1μm以上区间任意两个点值组成的范围内的粒径，例如，可以为但不限于1-5μm、1-25μm、2-10μm、1-2μm、10-50μm、1-100μm等等。

其中，目标粒径为1μm以上区间中任一粒径可以为1μm以上区间任意一个点值所代表的粒径，例如，2μm、3μm、5μm、8μm、10μm、25μm、50μm、70μm、100μm。

根据本发明，本发明的发明人在检测的过程中发现，可以通过如下至少一种方式提高前向散射光的收集并提高信噪比：

1)发明人发现，前向散射光中在0.5°-15°范围内背景噪音较强，基于该发现，发明人提出将FSC通道设置为FSC直接通道和FSC旁侧通道，并且在对前向散射光进行检测前，先对其进行分光，然后再对特定角度的前向散射光进行收集并检测。其中，所述分光可以通过分光器来实现。优选的，所述分光器(60/40)的设置使得所述FSC直接通道能够检测与激光光轴夹角为0.5°至15°和-15°至-0.5°的前向散射光，FSC旁侧通道收集并检测与激光光轴夹角为15°-30°的范围内的前向散射光。当检测微米级颗粒(目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下)时，主要分析FSC直接通道收集的信号，FSC旁侧通道为辅或者不采集；当检测亚微米聚集体微粒(目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下)时，则主要分析FSC旁侧通道收集的信号，FSC直接通道数据为辅或者不采集。

在该优选的情况下，能够有效提高最小检测角度，增加亚微米粒子(粒径小于1微米的粒子)信号的收集，阻挡杂散光(0.5°-15°范围内背景噪音较强)，提高信噪比，因此，提高了本发明的检测效果。

2)本发明的发明人在研究的过程中进一步发现，前向散射光的强弱与颗粒的大小正相关，且大于入射光波长的粒子主要在前向上对光发生散射。但是，随着粒径变小，光散射角变宽，并且更多的光沿垂直方向散射，对于小于照射波长的亚微米粒子和纳米粒子就是这种情况。因此，为了提高这些微粒的光散射灵敏度，本发明优选在FSC通道上设置具有2°至18°大收集角度的FSC通道检测器，例如，可以为NanoView前向角散射检测器模块，其收集角度为2°至18°。

3)本发明的发明人在研究中还发现，采用高数值孔径(NA＞1)的数字光圈可以聚集来自被检颗粒的散射光，排除来自流动室、液流套管和液流的散射光，从而提高光收集效率和信噪比，提升对接近0.1微米尺寸的颗粒的检测效率。优选的，所述NA＞1。

根据本发明，为了进一步提高对聚集体颗粒的检测效果，优选的，在采用FSC通道检测所述样品在激光激发下的前向散射光前，该方法还包括使用带通透镜对所述前向散射光进行过滤；其中，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述带通透镜的通过波长为385-425nm；目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述带通透镜的通过波长为468-508nm。

根据本发明，为了进一步提高对聚集体颗粒的检测效果，优选的，在采用SSC通道检测所述样品在激光激发下的侧向散射光前，该方法还包括使用带通透镜对所述侧向散射光进行过滤；其中，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述带通透镜的通过波长为385-425nm；目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述带通透镜的通过波长为468-508nm。

在如上任一优选的情况下，如上特定通过波长带通透镜可在FSC通道检测器和/或SSC通道检测器之前缩小收集光束波长的范围，只收集峰值附近的荧光信号，避免其它波长的干扰，从而提高检测效果。

根据本发明，所述激光由激光器发射，激光器发射一定波长、能量和光斑大小的激光(束)照射在样品液流上，从而产生前向散射光信号和侧向散射光信号。传统流式细胞仪中，以蓝光激光为主，紫光的应用较少。本发明的发明人发现，根据需要检测的聚集体颗粒的目标粒径，通过使用不同波长、能量和光斑大小的激光束对样品液流进行照射，能够获得更加精准的检测结果。因此，优选的，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述激光的波长为400-410nm(例如，可以为400nm、401nm、402nm、403nm、404nm、405nm、406nm、407nm、408nm、409nm、410nm，最优选为405nm)，能量为150-200mW(例如，可以为150mW、160mW、170mW、180mW、190mW、200mW，最优选为150mW)，光斑长轴为9-11μm(例如，可以为9μm、9.2μm、9.4μm、9.6μm、9.8μm、10μm、10.2μm、10.4μm、10.6μm、10.8μm、11μm，最优选为10μm)，也即紫光激光；目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述激光的波长为485-490nm(例如，可以为485nm、486nm、487nm、488nm、489nm、490nm，最优选为488nm)，能量为18-22mW(例如，可以为18mW、19mW、20mW、21mW、22mW，最优选为20mW)，光斑长轴为115-125μm(例如，可以为115μm、116μm、117μm、118μm、119μm、120μm、121μm、122μm、123μm、124μm、125μm，最优选为120μm)，也即蓝光激光。

根据本发明，还可以用荧光染料标记聚集体颗粒，采用荧光激发，会更有利于区分背景、提高检测灵敏度和分辨率，还可以对聚集体的性质进行进一步分析。所述荧光可以被与激光(束)和样品液流垂直的荧光通道进行收集和检测。其中，所述荧光通道至少3条，例如，可以为3-4路。检测步骤可以为：

使用特异的荧光染料(如：Thioflavin T,SYPRO Orange等)或探针标记聚集体，分析方法选择荧光激发，选择染料所对应的荧光通道采集荧光信号，在多荧光标记时相应荧光通道之间需要根据荧光素的不同调节补偿。

如果微粒上结合了荧光染料，且能被激光激发，则会产生散射光信号和荧光信号。通过对特定的分子进行荧光染色，可以从背景中捕捉纳米、亚微米颗粒并将其与其他颗粒物区分开。荧光检测有助于提高聚集体分析的灵敏度，与散射光信号配合还有助于提高检测的分辨率，还有可能帮助区分微粒的属性(nature)。其中，一个微粒可以用多个不同激发或发射波长的染料/探针标记，可以同时使用多杆不同波长的激光激发同一个微粒。

根据本发明，所述标准光散射图谱由一系列不同浓度且不同粒径的标准物质的光散射图谱汇集而成，所述标准光散射图谱可以为多套，但优选的，每套标准光散射图谱中汇集的每个浓度和每种粒径下的标准物质的光散射图谱的峰高基本相同，以便在对样品光散射图谱进行分析时，可以精准且清晰的进行比对。所述标准光散射图谱可以事先存储于对样品光散射图谱进行分析的分析软件中，待使用时直接调出即可。

优选的，根据所述样品光散射图谱进行标准光散射图谱的选择，选择的标准为所述标准光散射图谱的峰高为样品光散射图谱中最高峰高的1/5-1/2。

根据本发明，所述标准物质为乳胶微球，其中，在所述标准物质中，颗粒浓度已知或未知，颗粒粒径可溯源，例如，可以是美国NIST制备的溯源微球。。

根据本发明，所述样品通过流式细胞仪的液流系统进行输送，在输送的过程中，激光聚焦于每个快速流过的聚集体颗粒并均匀激发(同等照射时间)出散射光。其中，如图1所示，样品液在样品管12和流动室13中流动，在样品管12中流动时，其外周间接包裹鞘液；在流动室13中流动时，其外周直接包裹鞘液(如此形成的液柱称为中心液柱，以下将详细介绍)。通常情况下，外周的鞘液流(sheath stream)呈套筒状，中心的样本液流呈柱状，在两种流体接触处流体套管直径收细，鞘液流压力大于样本流，将样本流变细聚焦，将样本中被测颗粒聚焦于空间特定直线上，形成中心液柱，使激光能够准确照射颗粒。

本发明的发明人在研究的过程中发现，中心液柱直径越细，液流背景散射越低，信噪比升高，有利于小微粒子的测量。所以，在能适当包裹住粒子的前提下，缩减中心液柱直径，能够进一步提高亚微米粒子检测的精准性。但考虑到蛋白类聚集体杂质有着很宽的粒径分布，追求亚微米级粒子的测量必然会导致因液柱过细而影响微米级粒子的准确测量。因此，为了真正满足生物制品聚集体全量程的测量需求，发明人设计了双中心液柱，小液柱(直径约9-11μm)用于亚微米级的聚集体测量，大液柱(直径约27-33μm)用于微米级的聚集体测量。因此，优选的，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述中心液柱的直径为9-11μm，例如，可以为9μm、9.2μm、9.4μm、9.6μm、9.8μm、10μm、10.2μm、10.4μm、10.6μm、10.8μm、11μm；目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述中心液柱的直径为27-33μm，例如，可以为27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm。

根据本发明，所述中心液柱的直径可通过压力控制元件来实现，例如，空气泵和精密流量计精确控制鞘液压力，蠕动泵/注射器精准控制样品液的速度，从而得到9-11μm或27-33μm中心液柱。

本发明的发明人在研究的过程中还发现，当样品流速慢时粒子照射时间长，信号强度会升高，有利于亚微米粒子的分析，但却不利于微米级粒子的分析。因此，检测亚微米微粒时希望流速越低越好，检测微米级微粒时希望流速相对较快。根据本发明一种优选的实施方式，目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，控制所述中心液柱中的流速9-11μL/min，例如，可以为9μL/min、9.2μL/min、9.4μL/min、9.6μL/min、9.8μL/min、10μL/min、10.2μL/min、10.4μL/min、10.6μL/min、10.8μL/min、11μL/min；目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的情况下，所述中心液柱中的流速为45-55μL/min，例如，可以为45μL/min、46μL/min、47μL/min、48μL/min、49μL/min、50μL/min、51μL/min、52μL/min、53μL/min、54μL/min、55μL/min。其中，样品的流速可以通过压力的精确控制实现，例如，通过采用空气压力泵。

根据本发明，为了进一步提高测量的精准性、灵敏性和稳定性，优选的，将样品液以自下而上的方式引入至样品管中。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上、下”通常是指在水平高度的上和下。

根据本发明，为了进一步提高测量的精准性、灵敏性和稳定性，优选的，将所述样品以负压吸入的方式引入流式细胞仪的样品液的暂存处，而并非是通过加正压进样的方式。具体的，流式细胞仪的样品入口处远端可以设置有空气泵，用于将样品以负压吸入的方式引入样品液的暂存处，然后再以蠕动泵/注射器系统精确进样至样品流动管中。

根据本发明，为了进一步提高测量的精准性、灵敏性和稳定性，优选的，在对标准微球进行测试时，在将其引入至流式细胞仪前，该方法还包括对所述标准微球进行过滤、超声和消气处理中的至少一种。

根据本发明，为了进一步提高检测的效果，优选的，在样品的连续分析时，样品的上样间隔为20-40s。

根据本发明，所述样品可以为任意的需要对其中的聚集体颗粒浓度进行测定的生物制品，例如，可以为但不限于重组蛋白药物、疫苗、血制品中的人免疫球蛋白、基因治疗载体、复杂注射剂、中药注射剂等。其中，所述样品在上样前可以稀释或不稀释。此外，样品混匀宜轻柔，避免产生气泡；不要超声和除气，以免影响聚集体分布。

根据本发明，如上所述的，样品液流在鞘液流的直接或间接包裹下流动，且所述鞘液流的压力大于所述样品液流的压力(采用空气泵和精密流量计精确控制鞘液压力，采用蠕动泵/注射器系统精确控制进样速度)，以及所述鞘液流的流动方向与所述样品液流的流动方向一致。

为了进一步提高测量的精准性、灵敏性和稳定性，优选的，在将所述鞘液引入至鞘液管中之前，该方法还包括对所述鞘液进行至少2次过滤；优选的，所述过滤用滤膜的孔径为0.1-0.22μm。

优选的，所述鞘液为PBS缓冲液或纯水。

根据本发明，为了提高检测效果，优选的，在对所述样品和鞘液进行上样前，对各自的管路进行冲洗，冲洗的时间优选在1h以上，直至0.1-1μm检测方法下粒子检测数量在100个/s左右并基本稳定。在冲洗的过程中发现，通过采用先快速后低速的方式对流动室和各管路进行冲洗至少1小时，能够进一步提高检测效果。

其中，可以使用过滤后的鞘液对管路进行冲洗。

其中，所述过滤后的鞘液还可以作为溶解和稀释样品(如何需要)的缓冲液。具体的，先根据测量区间初步调出能将相应亚微米/微米微球与背景噪音区分开的条件。用此条件测试样品浓度，当粒子浓度过高时最好将样品稀释到100-10000events/s，以提高信噪比、避免与噪音重合(浓度过低)，同时避免信号重叠(浓度过高)。

根据本发明，为了进一步提高检测的精准性，该方法还包括校准步骤，具体的：在FSC通道检测电压为220-330V(例如，可以为220V、230V、240V、250V、260V、270V、280V、290V、300V、310V、320V、330V，最优选220V)，SSC通道检测电压为180-315V(例如，可以为180V、190V、200V、210V、220V、230V、240V、250V、260V、270V、280V、290V、300V、310V、315V，最优选180V)，SSC阈值600-1200(例如，可以为600V、700V、800V、900V、1000V、1100V、1200V，最优选600)的条件下分别获得样品中粒径在0.5-1μm区间和1-10μm区间的聚集体颗粒的总浓度；

然后，获得FSC通道检测电压为220-330V，SSC通道检测电压为180-315V，SSC阈值600-1200条件下与FSC通道检测电压为405-435V，SSC通道的检测电压为290-310V，SSC阈值600-1200条件下获得的样品中粒径在0.5-1μm区间的聚集体颗粒的总浓度的比值，并作为第一校准系数，并根据该第一校准系数校准FSC通道检测电压为405-435V，SSC通道的检测电压为290-310V，SSC阈值600-1200的条件下获得的样品中目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体颗粒的浓度；

获得FSC通道检测电压为220-330V，SSC通道检测电压为180-315V，SSC阈值600-1200条件下与175-205V，SSC通道的检测电压为120-140V，SSC阈值600-1200条件下获得的样品中粒径在1-10μm区间的聚集体颗粒的总浓度的比值，并作为第二校准系数，并根据该第二校准系数校准FSC通道检测电压为175-205V的条件下获得的样品中目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体颗粒的浓度。

优选的，目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的情况下，在采用FSC通道检测所述样品在激光下激发的前向散射光前，该方法还包括使用带通透镜对所述前向散射光进行过滤，所述带通透镜的通过波长为468-508nm。

优选的，目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的情况下，在采用SSC通道检测所述样品在激光激发下的侧向散射光前，该方法还包括使用带通透镜对所述侧向散射光进行过滤，所述带通透镜的通过波长为468-508nm。

优选的，目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的情况下，使用波长为485-490nm、能量为18-22mW、光斑长轴为115-125μm的激光激发前向散射光。

优选的，目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的情况下，所述中心液柱中的流速为45-55μL/min，所述中心液柱的直径为27-33μm。

能够理解的是，当使用的标准微球为其中的聚集体颗粒的粒径和浓度被精确确定的标准物质时，如上的校准步骤可以被省略。

根据本发明，为了确保检测的有效性，优选的，在每次样品正式检测前，本发明的方法还包括使用标准物质对仪器进行检测和调试，以确保检测信号区域正常。同时使用缓冲液(例如，可以为过滤后的鞘液)进行对照测试，以确保背景干扰的区分可以接受，例如，丢弃率控制在10％以下，优选5％以下。需要说明的是，电压或阈值设置不合适时，会有信号被仪器丢弃，丢弃的多少即为丢弃率。如微粒浓度过高时，可能丢掉一些大粒子的信号，具体由软件算法决定。

根据本发明，如上的方法优选在以下流式聚集体杂质分析仪中完成，如图2所示，所述流式细胞仪包括液流系统1、光路系统2以及分析控制系统3；

其中，所述光路系统2包括激光器21、FSC检测通道22和SSC检测通道23；

其中，需要说明的是，“所述FSC检测通道能够分别提供405-435V、175-205V和220-330V的检测电压”是指FSC检测通道具有这样的能力，但并局限于只能够提供这样的电压，其可以提高不低于999V的电压。

其中，需要说明的是，“所述SSC检测通道能够分别提供290-310V、120-140V和180-315V的检测电压”是指SSC检测通道具有这样的能力，但并局限于只能够提供这样的电压，其可以提高不低于999V的电压。

其中，需要说明的是，“SSC检测通道能够提供600-1200的阈值”是指SSC检测通道具有这样的能力，但并局限于只能够提供这样的阈值，其可以提供至少500的阈值。

根据本发明，FSC检测通道22优选与激光光线同轴设置，SSC检测通道23优选与激光(束)和样品液流垂直设置。

根据本发明，在FSC检测通道22和SSC检测通道23的每路检测通道的末端均设置有收集并检测相应散射光的检测器，所述检测器为整合有计数功能的光电倍增管或带有单光子计数功能的雪崩光电二极管。

根据本发明，可以通过如下至少一种设置来提高前向散射光的收集并提高信噪比：

1)所述FSC检测通道22包括FSC直接通道检测器221和FSC旁侧通道检测器225，其中，在FSC检测通道22上还设置有分光器222，所述FSC直接通道检测器221设置在所述分光器222的正向，所述FSC旁侧通道检测器225与所述分光器222呈角度设置。通过分光器222的分光可以使得所述FSC直接通道检测器221和FSC旁侧通道检测器225收集和检测不同角度的前向散射光。

具体的，所述分光器222的设置使得所述FSC直接通道检测器221能够收集和检测与激光光轴夹角为0.5°至15°和-15°至-0.5°的前向散射光；FSC旁侧通道检测器225收集和检测激光光轴的夹角15°-30°(包括20°-25°关键区间，具体需调试确定)狭角范围内的前向散射光。

FSC直接通道检测器221和FSC旁侧通道检测器225因为是独立的光路通道。当检测微米级颗粒时，主要分析FSC直接通道检测器221收集的信号，FSC旁侧通道检测器225数据为辅或者不采集；当检测亚微米聚集体微粒时，则主要分析FSC旁侧通道检测器225收集的信号，FSC直接通道检测器221数据为辅或者不采集。

2)在所述FSC检测通道22上设置对前向散射光的收集角度为2°至18°的FSC通道检测器，可以为NanoView前向角散射检测器模块，其收集角度为2°至18°。

3)所述FSC通道检测22包括设置在其末端的FSC通道检测器以及设置在样品液流和FSC通道检测器之间的NA＞1的数字光圈223。

根据本发明，为了进一步提高对聚集体颗粒的检测效果，优选的，所述FSC检测通道22还包括在FSC通道检测器上游设置的带通透镜224，用于对前向散射光进行过滤；其中，所述带通透镜224包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜(对目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用)和通过波长为468-508nm的第二带通透镜(对目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用，以及目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的聚集体检测时使用)。

根据本发明，为了进一步提高对聚集体颗粒的检测效果，优选的，所述SSC检测通道23包括SSC通道检测器以及设置在所述SSC通道检测器上游的带通透镜224，用于对侧向散射光进行过滤；其中，所述带通透镜224包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜(对目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用)和通过波长为468-508nm的第二带通透镜(对目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用，以及目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的聚集体检测时使用)。

本发明的发明人发现，根据需要检测的聚集体颗粒的目标粒径，通过使用不同波长、能量和光斑大小的激光束对样品液流进行照射，能够获得更加精准的检测结果。因此，优选的，所述激光器21包括第一激光器211和第二激光器212，其中，所述第一激光器211发射的激光束的波长为400-410nm，能量为150-200mW，光斑长轴为9-11μm，也即紫光激光器，对目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用；所述第二激光器212发射的激光束的波长为485-490nm，能量为18-22mW，光斑长轴为115-125μm，也即蓝光激光器，对目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用，以及目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的聚集体检测时使用。

根据本发明，为了对分析结果的补充，优选的，所述光路系统2还包括用于对荧光进行收集和检测的荧光检测通道24。所述荧光检测通道可以与激光(束)和样品液流垂直设置。其中，所述荧光检测通道至少为3路，例如，可以为3-4路，可以包括：450±10nm、525±10nm、≥600nm波长范围的荧光。

根据本发明，如图1所示，所述液流系统1包括鞘液管11、样品管12和流动室13和和压力控制元件，所述鞘液管11呈套筒状，沿液流方向，上宽下窄，样品管12呈柱状设置在所述鞘液管11内部，并与所述鞘液管11的内壁留有间隙，鞘液从该间隙中流出。并且沿着液流方向，在样品管12的末端，所述流动室13与鞘液管11和样品管12连接，也即在样品液流和鞘液流的直接接触处，在如此设置的情况下，样品液流在样品管12流出时与鞘液接触，鞘液流压力大于样本流，鞘液包裹样品液，将样本流变细聚焦，将样本中被测颗粒聚焦于空间特定直线上，从而形成中心液柱，使激光能够准确照射颗粒。

优选的，为了满足生物制品聚集体全量程的测量需求，发明人设计了双中心液柱，包括直径为9-11μm的第一中心液柱(对目标粒径为0.1-1μm区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用)和直径为27-33μm的第二中心液柱(对目标粒径为1μm以上区间中任一区间粒径或任一粒径的聚集体检测时使用，以及目标粒径为0.5-1μm区间或1-10μm区间的聚集体检测时使用)。

根据本发明，所述中心液柱的直径通过压力控制元件来实现，例如，空气泵和精密流量计精确控制鞘液压力，蠕动泵/注射器精准控制样品液的速度，从而得到9-11μm或27-33μm中心液柱。

根据本发明，优选的，所述液流系统1的设置使得鞘液和样品液分别以自下而上的方式被引入至鞘液管11和样品管12中。

根据本发明，优选的，流动室13的材料为石英。

根据本发明，优选的，流动室13的照射面高大于200μm，激光穿过液流的距离为80-120μm。

根据本发明，优选的，所述液流系统1还包括样品进样单元，所述进样单元的样品入口处设置有负压设备，用于将样品以负压吸入的方式引入，具体的，所述进样单元在样品入口处远端设置有空气泵，用于将样品以负压吸入的方式流式细胞仪的样品液的暂存处，然后再以蠕动泵/注射器系统精确进样至样品管中。

根据本发明，优选的，所述液流系统1还包括鞘液进样单元，所述鞘液进样单元上(例如，在鞘液流向鞘液管11的管路上)设置有至少2个过滤设备，以对所述鞘液进行过滤。优选的，所述过滤用滤膜的孔径为0.1-0.22μm。

根据本发明，所述分析控制系统3中设置有分析仪，所述分析仪的检测速度优选达到3万/秒。

其中，分析控制系统3中的系统控制软件优选可依据需求设置控制(20mw-200mw功率)激光器、电动阀(例如，20个电动阀)、传感器、电机以及其他器部件的运行。

其中，优选的，所述分析控制系统3配置有可采集6路以上的实时数据采集系统，每路检测速度优选达到30000个信号/秒。

其中，优选采用动态范围为24bit的模拟-数字转换器(Analog-digitalconverter)，以满足0.1μm以上粒径(例如，0.1-100μm)的微粒的检测。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

一、流式聚集体杂质分析仪

如图2所示，包括液流系统1、光路系统2以及分析控制系统3；其中，

液流系统1，包括：

样品进样单元，所述进样单元在样品入口处远端设置有空气泵，用于将样品以负压吸入的方式引入流式细胞仪的样品液的暂存处，然后再以蠕动泵/注射器系统精确进样至样品管12中；

鞘液进样单元，在鞘液流向鞘液管11的管路上设置有至少2个过滤设备，所述过滤用滤膜的孔径为0.1μm；所述鞘液进样单元在鞘液入口处远端设置有空气泵，用于将鞘液以负压吸入的方式引入流式细胞仪，进而进入鞘液管11中；

鞘液管11、样品管12和流动室13和压力控制元件(空气泵和精密流量计，用于控制鞘液压力，蠕动泵用于控制样品液流速)，如图1所示，所述鞘液管11呈套筒状，沿液流方向，下宽上窄，样品管12呈柱状设置在所述鞘液管11内部，并与所述鞘液管11的内壁留有间隙，鞘液从该间隙中流出。并且沿着液流方向，在样品管12的末端，所述流动室13与鞘液管11和样品管12连接，也即在样品液流和鞘液流的直接接触处，所述样品液流和鞘液流接触后形成中心液柱，在流动室13中流动，通过压力控制元件得到直径为10μm的第一中心液柱和直径为30μm的第二中心液柱。

其中，所述液流系统1的设置使得鞘液和样品液分别以自下而上的方式被引入至鞘液管11和样品管12中。

其中，所述鞘液管11和所述样品管12的材料均为金属材质；流动室13的材料为石英。

其中，所述流动室13的尺寸为240μm(激光照射面高)×100μm(激光穿过液流的距离)。

光路系统2，包括

激光器21、FSC检测通道22共1路(包括FSC直接通道检测器221，为整合有计数功能的光电倍增管)，SSC检测通道23共1路，荧光检测通道24共3路，其中，所述FSC检测通道22与激光器21发射的激光同轴设置，SSC检测通道23和荧光检测通道24与激光器21发射的激光垂直设置。

在FSC检测通道22、SSC检测通道23和荧光检测通道24的每路检测通道的末端均设置有收集并检测相应散射光的检测器，检测器为整合有计数功能的光电倍增管。

其中，所述激光器21包括第一激光器211和第二带通透镜212，其中，所述第一激光器211发射的激光束的波长为405nm，能量为150mW，光斑长轴为10μm；所述第二激光器212发射的激光束的波长为488nm，能量为20mW，光斑长轴为120μm。

其中，FSC检测通道22包括如下至少一种设置：

1)包括FSC检测通路22包括FSC直接通道检测器221和FSC旁侧通道检测器225的两条通道检测，在所述FSC直接通道检测器221的上游还设置有60/40分光器222，其中，所述FSC直接通道检测器221设置在所述分光器222的正向，所述FSC旁侧通道检测器225与所述分光器222呈角度设置。各部件的设置使得所述FSC直接通道检测器221能够收集和检测与激光光轴夹角为0.5°至15°和-15°至-0.5°的前向散射光；FSC旁侧通道检测器225收集和检测激光光轴的夹角15°-30°(包括20°-25°关键区间，具体需调试确定)狭角范围内的前向散射光；

2)所述FSC检测通道22上设置对前向散射光的收集角度为2°至18°的NanoView前向角散射检测器模块；

3)FSC检测通道22包括在样品液流和FSC通道检测器之间设置的NA＞1的高效数字光圈223。

其中，FSC检测通道22还包括在FSC通道检测器上游设置的带通透镜224，所述带通透镜224包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜和通过波长为468-508nm的第二带通透镜。

其中，所述SSC检测通道23还包括在SSC通道检测器上游设置的带通透镜224，所述带通透镜224包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜和通过波长为468-508nm的第二带通透镜。

分析控制系统3，包括

分析仪，所述分析仪的检测速度达到3万/秒；

系统控制软件，依据需求设置控制激光器21、电动阀、传感器、电机以及其他器部件的运行；

配置有可采集6路以上的实时数据采集系统，每路检测速度达到30000个信号/秒；

配制有动态范围为24bit的模拟-数字转换器(Analog-digital converter)。

二、鞘液

鞘液：预先0.1μm滤膜过滤后的0.1M PBS。

三、检测方法

1)在样品的连续分析时，样品的上样间隔为30s。

2)在对所述样品和鞘液进行上样前，使用鞘液对各管路进行冲洗，冲洗的时间在1h以上，直至0.1-1μm检测方法下粒子检测数量在100个/s左右并基本稳定。在冲洗的过程先快速后低速的方式对管路进行冲洗。

3)检测条件

·目标粒径0.1-1μm区间任一区间粒径或任一粒径：

采用所述第一激光器211；

带通透镜224为第一带通透镜；

FSC检测通道中检测器电压设置为420V；

SSC检测通道中检测器电压设置为300V，SSC阈值设为600；

采用第一中心液柱，直径10μm，采用低流速(10μL/min)收样3秒；

·0.5-10μm区间任一区间粒径或任一粒径：

采用所述第二激光器212；

带通透镜224为第二带通透镜；

FSC检测通道中检测器电压设置为220V；

SSC检测通道中检测器电压设置为180V，SSC阈值设为600；

采用第二中心液柱，直径30μm，采用低流速(50μL/min)收样3秒；

·1-100μm区间任一区间粒径或任一粒径：

采用所述第二激光器212；

带通透镜224为第二带通透镜；

FSC检测通道中检测器电压设置为190V；

SSC检测通道中检测器电压设置为130V，SSC阈值设为600；

采用第二中心液柱，直径30μm，采用高流速(50μL/min)收样3秒。

四、标准微球

标准微球：乳胶微球，100、200、300和500nm的参考微球来自于Beckman Coulter公司，1-100μm的为DUKE尺寸参考微球(美国NIST制备的溯源微球)，共17种不同粒径，用0.1μm滤膜过滤的含0.1％Tween 20的PBS缓冲液稀释微球至不同浓度(稀释前用超声波消除聚集并抽气)。

按照“三、检测方法”中的方法进行标准微球的检测，得到一系列不同浓度且不同粒径的标准物质的光散射图谱，并按照实施例1中的校准方法进行校准，然后将峰高相近的标准物质的光散射图谱汇集成标准光散射图谱，如图3-图5，显示了几套标准光散射图谱。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的检测样品中聚集体颗粒在目标粒径下浓度的方法

1)该测定在如上“一、流式聚集体杂质分析仪”中进行，且“FSC检测通道22”的设置选择第三种。

2)样品在样品进样单元经过滤、超声和抽气处理后，机械泵先将样品吸入管路，再用蠕动泵/注射器打入样品管12。

3)鞘液在鞘液进样单元经2次0.1μm孔径滤膜过滤后被引入至鞘液管11。

4)两种液流在流经流动室13时方向为自下而上。

5)获得校准系数：

按照“三、检测方法”中“目标粒径0.1-1μm区间任一区间粒径或任一粒径”、“0.5-10μm区间任一区间粒径或任一粒径”的方法检测样品中目标粒径“0.5-1μm”区间聚集体颗粒浓度的检测，具体的：分别获得样品在不同检测方法下的样品光散射图谱，选择标准光散射图谱(所述标准光散射图谱的峰高为样品光散射图谱中最高峰高的1/5-1/2)，获得目标粒径下的光散射强度区间，根据所述光散射强度区间和所述样品光散射图谱，确定样品中在不同检测方法下的0.5-1μm目标粒径下的聚集体颗粒的数量，从而获得样品中在不同检测方法下的0.5-1μm目标粒径下的聚集体颗粒的浓度a1(目标粒径0.1-1μm区间任一区间粒径或任一粒径)和b1(0.5-10μm区间任一区间粒径或任一粒径)，得到校准系数c1(b1/a1)。

同样的，获得在不同检测方法下的1-10μm目标粒径下的聚集体颗粒的浓度a2(0.5-10μm区间任一区间粒径或任一粒径)和b2(1-100μm区间任一区间粒径或任一粒径)，得到校准系数c2(b2/a2)。

6)样品中目标粒径下聚集体颗粒浓度的检测

按照“三、检测方法”中“目标粒径0.1-1μm区间任一区间粒径或任一粒径”“1-100μm区间任一区间粒径或任一粒径”对目标粒径的聚集体进行检测，获得样品光散射图谱，选择标准光散射图谱(所述标准光散射图谱的峰高为样品光散射图谱中最高峰高的1/5-1/2)，获得目标粒径下的光散射强度区间，根据所述光散射强度区间和所述样品光散射图谱，确定样品中在目标粒径下的聚集体颗粒的数量，然后再根据目标粒径的范围乘以上述校准系数c1或c2，从而获得样品中在目标粒径下的聚集体颗粒的浓度。

如图6所示，依照此方案制造的聚集体分析仪能通过前向散射光(FSC)清晰地分辨200、300与500nm的聚苯乙烯微球，三种微球的峰型完整、对称，微球信号间均实现基线分离。

其中，a显示的是200nm微球的前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)检测结果图，b显示的是300nm微球的检测结果，c显示的是500nm微球的检测结果，d显示的是三种微球的混合样品的检测结果。聚集体分析仪测量的200nm vs.300nm微球的分离度R为2.46，300nmvs.500nm微球的分离度R为3.96，远高于相同混合微球样品在场流仪测量中200nmvs.300nm的分离度0.83和300nm vs.500nm的分离度0.78。

目前国外药企分析药物中的亚微米级聚集体主要使用场流仪，因此申请用梯度稀释的300nm粒径聚苯乙烯微球样品比较了依照此方案制造的聚集体分析仪和非对称场流仪(AF4)的性能。结果显示当微球稀释到1：500时非对称场流仪(AF4)已无法有效检测到微球的存在，但依照此方案制造的聚集体分析仪对一千万倍稀释的同一样品仍能正常定量。所以，该聚集体分析仪的灵敏度远高于国外药企常用的场流仪系统。

如图7和图8所示，在依照此方案制造的聚集体分析仪上检测稀释后的300nm或500nm微球线性良好，300nm微球的检测限低至6个/μL，500nm微球的检测限低至3个/μL，目前未有类似灵敏度的亚微米聚集体检测设备的报道。

依照此方案制造的聚集体分析仪对混合微球测量的重现性很好。对200nm、300nm和500nm微球定量分别产生的相对标准偏差(RSD)为2.23％、3.59％和0.97％，远低于相同混合微球在场流仪定量中的相对标准偏差(RSD)：50.55％、4.45％和12.97％。

如图9所示，在新聚集体分析仪上应用“0.2-1μm”参数设置对三种重磅抗体药物(a.帕博利珠单抗注射液，默沙东(爱尔兰)，Lot：0000902944；b.纳武利尤单抗注射液，百时美施贵宝，Lot：AAQ6441；c.阿特珠单抗注射液，罗氏(基因泰克)，Lot：H0101B09)进行0.2-1μm区间聚集体检测的结果(小峰为微球粒径标尺)，以微球粒径标尺对应的散射信号区间设定相应粒径的聚集体杂质的信号区间(如图10所示)。

分析得到的各粒径(μm)的聚集体杂质浓度(/mL)如下：

实施例2

按照实施例1的方法进行聚集体颗粒在目标粒径下浓度的检测，不同的是，“FSC检测通道22”的设置选择第一种。

由于FSC旁侧通道检测器225主要提高了亚微米检测的信噪比，故对实施例2中300nm和500nm微球检测的灵敏度和分辨率不低于实施例1中的效果，且有可能将分析范围从200nm推进至100nm甚至50nm(50nm对灵敏度、信噪比和分辨率的要求更高，参考文献报道及申请人自己的研究经验，推测50nm左右是为本发明设计可实现的极限)。由于实施例2与实施例1的改变有限，不认为此有限的变动会影响仪器测量的重现性。

实施例3

按照实施例1的方法进行聚集体颗粒在目标粒径下浓度的检测，不同的是，“FSC通道检测器22”的设置选择第二种。

NanoView系统采用了自定义非球面成像透镜，将收集的散射光通过200微米针孔成像，极大降低了检测器接收的背景光，提高了信噪比，故对实施例3中300nm和500nm微球检测的灵敏度和分辨率与实施例1效果相近，并有可能将分析范围从200nm推进至150nm左右。另外，由于实施例3与实施例1的改变有限，不认为此有限的变动会影响仪器测量的重现性。

实施例4

按照实施例1的方法进行聚集体颗粒在目标粒径下浓度的检测，不同的是，不进行步骤4)的校准。

虽然“0.1-1μm”与“1μm以上”的设置已分别覆盖了亚微米和微米级的测量区间，但由于不同电压设置下仪器的响应有所不同，所以需要进行校准。

申请人在实施例1中选取一个折中的参数设置(“0.5-10μm”设置)，可以向下与“0.1-1μm”设置检测区间部分重叠，向上与“1μm以上”设置检测区间部分重叠，用重叠区间的特定粒径杂质浓度相除，即可得到大致的校正系数，从而把“0.1-1μm”与“1μm以上”设置下所得的数据统一起来，消除不同电压设置下仪器响应不同所造成的偏差。

例如：“0.1-1μm”设置主要针对亚微米微粒的测量，发明人使用该设置对a、b、c三种药物进行聚集体分析，得到0.5与1.0μm微球对应区域的聚集体杂质浓度；再用“0.5-10μm”设置对上述三种药物进行聚集体浓度分析，得到0.5与1.0μm微球对应区域的杂质浓度。将获得的两组数据相除，即可获得“0.1-1μm”段数据的校准系数；同理也可获得“1-70μm”段数据的校准系数，最后把从亚微米到微米的聚集体杂质浓度都统一到“0.5-10μm”设置对应的仪器响应背景上来，部分消除仪器响应不同所造成的偏差(见下表)。

		0.2-1设置	0.5-10设置
						药品号	标尺粒径μm	浓度(/mL)	浓度(/mL)	比值	校正系数(平均值)
a	0.5	65,099	187,756	2.88414956	0.5μm校正系数
						b	0.5	44,230	132,923	3.005302414	2.888285545
c	0.5	41,002	113,798	2.77540466
						a	1	8,776	28,038	3.194970189	1μm校正系数
b	1	6,046	23,920	3.956124631	3.584210976
						c	1	5,004	18,022	3.601538109

实施例5

按照实施例1的方法进行聚集体颗粒在目标粒径下浓度的检测，不同的是，光路系统2仅包括FSC直接通道检测器221，没有分光器222以及带通透镜224的设置。

该实施例中，去掉带通滤镜会使杂光进入PMT，使信噪比降低；去掉大角度前向光收集通道则使仪器失去检测亚微米颗粒的灵敏度下降。故此实施例将会降低分析仪对亚微米颗粒分析的灵敏度和分辨率。

实施例6

按照实施例1的方法进行聚集体颗粒在目标粒径下浓度的检测，不同的是，激光器21仅为第二激光器212，也即，不具有第一激光器211。

1)激光器的发射波长越短，分辨率越高，可测得的粒径便越小。2)由于增加了相对折射率(RI)，短波长的激发光可增加小颗粒的散射光量。故短波长激光会有利于亚微米颗粒的检测。

因此，如果不配备405nm的激光器，只配备488nm激光器，也可以达到实施例1的效果，但很难将聚集体微粒的量程向前推进到100nm甚至50nm。

实施例7

按照实施例1的方法进行聚集体颗粒在目标粒径下浓度的检测，不同的是，所述中心液柱112仅包括第二中心液柱，且样品流速均为高流速50μL/min。

此时小微粒由于散射光弱、干扰光强，会被背景信号掩盖，会降低分析仪对亚微米颗粒分析的灵敏度和分辨率。

对比例1

本对比例用于说明参比的检测样品中聚集体颗粒在目标粒径下浓度的方法

按照实施例1的方法进行聚集体颗粒在目标粒径下浓度的检测，不同的是，FSC通道检测的电压不按照目标粒径进行区分，均为410V。

只设置一组电压会监测不全。

因为一组电压只能放大、接收到一定范围内的光信号，对应的只是一段粒径区间的聚集体杂质。高电压着重采集的是小微粒的信号，低电压主要捕捉的是大微粒的信号。总体来说，当电压设置增大时，FSC检测的粒径区间

变窄并向零点平移。

对比例2

如图11所示，目前商业化的流式细胞仪经过方法优化后，最(Nishi H,

R,Fürst R,Winter G,Label-free flow cytometry analysis of subvisible aggregates inliquid IgG1 antibody formulations.J Pharm Sci.2014 Jan；103(1):90-9)低只能检测到500nm的二氧化硅微球(FSC：429，SSC：423)。该设置条件下，除500nm微球以外，作者还检测了1、1.5、3和5μm的微球[(a)0.5,(b)1,(c)1.5,(d)3,and(e)5μm]。通过比较发现，500nm和1μm的FSC、SSC信号区域均有重叠(不能有效分辨，所以5种微球均单独进样，未见混合后测量)，且文中未提供阈值设置信息和缓冲液对照的结果，反映出商业化的流式细胞仪对5μm以下的小微粒分辨力有限。

对比例3

如图12所示，用场流仪和聚集体分析仪比较分辨200、300与500nm的聚苯乙烯微球。

分辨率方面，场流仪测量200nm vs.300nm的分离度为0.83，测量300nm vs.500nm的分离度为0.78，远低于聚集体分析仪测量的200nm vs.300nm微球分离度2.46和300nmvs.500nm微球的分离度3.96。

重现性方面，混合微球在场流仪定量中的相对标准偏差(RSD)为：50.55％、4.45％和12.97％，远低于聚集体分析仪对混合微球测量的重现性：对200nm、300nm和500nm微球定量分别产生的相对标准偏差(RSD)为2.23％、3.59％和0.97％。

灵敏度方面，用梯度稀释的300nm粒径聚苯乙烯微球样品比较聚集体分析仪和非对称场流仪(AF4)的性能。结果显示当微球稀释到1：500时非对称场流仪(AF4)已无法有效检测到微球的存在，但依照此方案制造的聚集体分析仪对一千万倍稀释的同一样品仍能正常定量。所以，聚集体分析仪的灵敏度远高于场流仪系统。

对比例4

应用0.2-1μm参数设置对三种药物进行0.2-1μm区间聚集体检测(小峰为微球标尺)。

如图13所示，应用聚集体分析仪检测三种不同条件处理后的药物中亚微米聚集体杂质分布的变化，发现粒径和浓度差异明显；但SEC-UV/RI/MALS只能检测100nm以下的成分，不能发现100nm以上聚集体分布的变化。

由于流式类系统的相似性，虽然不同仪器性能有差异，但本发明的设置方法完全可以用作其他流式系统测量聚集体杂质时的参考。当本发明的仪器继续改进时，由于性能的提升，这些参数设置也可能需要调整。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种流式聚集体杂质分析仪，其特征在于，该分析仪包括液流系统(1)、光路系统(2)以及分析控制系统(3)；

其中，所述光路系统(2)包括激光器(21)、FSC检测通道(22)和SSC检测通道(23)；

其中，所述FSC检测通道(22)能够分别提供405-435V和175-205V的检测电压；所述SSC检测通道(23)能够分别提供290-310V和120-140V的检测电压，并且能够提供600-1200的阈值。

2.根据权利要求1所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，FSC检测通道(22)还能够提供220-330V的检测电压；所述SSC检测通道(23)能够分别提供180-315V的检测电压。

3.根据权利要求1所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述FSC检测通道(22)包括FSC直接通道检测器(221)和FSC旁侧通道检测器(225)；其中，FSC检测通道(22)上还设置有分光器(222)，其设置使得所述FSC直接通道检测器(221)能够收集和检测与激光光轴夹角为0.5°至15°和-15°至-0.5°的前向散射光，FSC旁侧通道检测器(225)能够收集并检测与激光光轴夹角为15°-30°的前向散射光；或者

所述FSC检测通道(22)包括FSC通道检测器以及设置在样品液流和FSC通道检测器之间的NA＞1的数字光圈(223)；或者

所述FSC检测通道(22)上设置有对前向散射光的收集角度为2°至18°的NanoView前向角散射检测器模块。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述FSC检测通道(22)还包括在FSC通道检测器上游设置的带通透镜(224)，用于对前向散射光进行过滤；其中，所述带通透镜(224)包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜和通过波长为468-508nm的第二带通透镜；和/或

所述SSC检测通道(23)还包括在SSC通道检测器上游设置的带通透镜(224)，用于对侧向散射光进行过滤；其中，所述带通透镜(224)包括通过波长为385-425nm的第一带通透镜和通过波长为468-508nm的第二带通透镜。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述激光器(21)包括第一激光器(211)和第二激光器(212)，其中，所述第一激光器(211)发射的激光束的波长为400-410nm，能量为150-200mW，光斑长轴为9-11μm；所述第二激光器(212)发射的激光束的波长为485-490nm，能量为18-22mW，光斑长轴为115-125μm。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述FSC检测通道(22)和SSC检测通道(23)的末端各自独立的设置有检测器，且所述检测器为整合有计数功能的光电倍增管或带有单光子计数功能的雪崩光电二极管。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述液流系统(1)包括鞘液管(11)、样品管(12)、流动室(13)和压力控制元件；

其中，沿着液流的方向，在样品管(12)的末端，所述流动室(13)与鞘液管(11)和样品管(12)连接，用于接收包裹鞘液的样品液流，并允许激光横向照射并穿过样品液流；

8.根据权利要求7所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述液流系统(1)的设置使得鞘液和样品液分别以自下而上的方式被引入至鞘液管(11)和样品管(12)中。

9.根据权利要求7或8所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述流动室(13)的材料为石英；

优选的，流动室(13)的照射面高大于200μm，激光穿过液流的距离为80-120μm。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的流式聚集体杂质分析仪，其中，所述液流系统(1)还包括样品进样单元，所述进样单元的样品入口处设置有负压设备，用于将样品以负压吸入的方式引入；和/或

所述液流系统(1)还包括鞘液进样单元，所述鞘液进样单元上设置有至少2个过滤设备，以对所述鞘液进行过滤。