CN1928114A

CN1928114A - 好氧不产氧光合异养细菌的流式细胞检测方法

Info

Publication number: CN1928114A
Application number: CN 200610152031
Authority: CN
Inventors: 焦念志; 骆庭伟; 张瑶
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2006-09-11
Filing date: 2006-09-11
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2026-09-11
Also published as: CN100396787C

Abstract

好氧不产氧光合异养细菌的流式细胞检测方法，涉及一种细菌的检测。样品中加甲醛培养；用DAPI对样品染色，置于流式细胞仪样品台，采集前向和侧向散射光、DAPI荧光信号、叶绿素荧光信号以及细菌叶绿素a的荧光信号，用DAPI荧光信号将浮游生物与泥沙、细胞碎屑分开，用不同浮游生物在AAPB的细菌叶绿素a荧光信号上的差异将AAPB与其他浮游生物分开；用DAPI荧光信号的强弱将浮游生物与泥沙、细胞碎屑等分开；按前向与侧向散射光的强弱将浮游细菌与微型浮游生物分开；按叶绿素荧光信号的强弱排除聚球藻、原绿球藻等对AAPB检测的影响；用细菌叶绿素a，将AAPB与其他细菌分开，获取样品中AAPB的准确数量。

Description

好氧不产氧光合异养细菌的流式细胞检测方法

技术领域

本发明涉及一种细菌的检测，尤其是涉及一类海洋超微型生物——好氧不产氧光合异养细菌(Aerobic Anoxyenic Phototrophic Bacteria，AAPB)的检测，通过与流式细胞技术相结合，建立一种好氧不产氧光合异养细菌的快速检测方法。

背景技术

发现于20多年前(Shiba T，Simidu U，Taga N.Distribution of aerobic bacteria which containbacteriochlorophyll a.Appl Environ Microbiol，1979，38：43～45)的好氧不产氧光合异养细菌是一类具有不产氧光合作用功能的好氧异养细菌，但是直到最近，其在海洋生态系统中的重要作用才得到广泛的关注(Kolber Z S，Plumley F G，Lang A S，et al.Contribution of aerobicphotoheterotrophic bacteria to the carbon cycle in the ocean.Science，2001，292：2492～2495)，AAPB作为海洋碳循环的重要组成部分，是迄今为止没有被充分估算的细菌固碳组分。这对目前已有的海洋初级生产力理论——海洋初级生产力是由浮游植物(藻类)通过产氧光合作用机制来实现的理论——产生了巨大的冲击(1.Beatty J T.On the natural selection andevolution of the aerobic phototrophic bacteria.Photosynthesis Research，2002，73：109～114；2.焦念志，Sieracki M E，张瑶，等.好氧不产氧光合异养细菌及其在海洋生态系统中的作用.科学通报，2003，48(6)：530～534)，使得我们必须对业已建立的光合作用基础上的海洋碳和能量循环进行重新认识(Karl D M，Hidden in a sea of microbes.Nature，2002，415：590～591)。

AAPB具有含量很低的细菌叶绿素a(BChl a)，而不含有细菌叶绿素b，c，d，e，f。由于BChl a嵌合在色素—蛋白的复合体中，相应的荧光发射峰在870～900nm近红外区(YurkovV V，Stackebrandt E，Beatty T.New obligately aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria isolatedfrom“black smoker”plume waters of the Juan de Fuca Ridge in the Pacific Ocean.abstr.190B.In：IX International Symposium on Phototrophic Prokaryotes，1997.190)。根据这个特性，目前国际上主要使用荧光显微镜-红外摄像技术(EFM-IRP)对AAPB进行检测和计数。然而，研究表明，这种方法同时将蓝细菌计数在内，造成AAPB定量的显著误差，这在蓝细菌密度高的海域或季节表现的更为明显。这有可能会对全球AAPB生物量的估计带来误差，甚至影响对AAPB在碳循环中的作用等方面的结论或推论(张瑶，焦念志.好氧不产氧光合异养细菌定量方法的研究.科学通报，2003，48(1))。

发明内容

本发明的目的在于针对现有采用荧光显微镜-红外摄像技术检测好氧不产氧光合异养细菌所存在的缺点，提供一种通过与流式细胞技术相结合的好氧不产氧光合异养细菌的快速检测方法，实现对好氧不产氧光合异养细菌的快速、准确定量，为准确评价好氧不产氧光合异养细菌在全球碳循环中的作用提供手段。为实现本发明的目的，本发明采用配置有紫外激光器和红敏检测器的流式细胞仪。

本发明的具体步骤为：

1)样品准备：在样品中加入终浓度为0.5％～2％(V/V)的甲醛，2～10℃下避光培养；

2)样品染色：吸取至少200μL的样品，利用核酸染料4，6-联脒-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride，DAPI)对样品进行染色；

3)样品的流式细胞分析：将DAPI染色过的样品放置于流式细胞仪的样品台上，利用流式细胞仪对样品进行分析，采集前向散射光、侧向散射光、核酸染料DAPI荧光信号、自养浮游生物的叶绿素荧光信号以及AAPB的细菌叶绿素a的荧光信号等数据，其中，域值(Discrimination)设置在DAPI荧光上，利用核酸染料DAPI荧光信号将浮游生物与泥沙、细胞碎屑区分开来，同时，利用红敏检测器采集AAPB的细菌叶绿素a的荧光信号，利用不同浮游生物在AAPB的细菌叶绿素a荧光信号上的差异，将AAPB与其他浮游生物区分开来；

4)数据分析：利用流式细胞分析软件对流式细胞仪采集到的数据进行分析，利用核酸染料DAPI荧光信号的强弱，将浮游生物与泥沙、细胞碎屑等区分开来；根据前向散射光及侧向散射光的强弱，将浮游细菌与微型浮游生物区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素荧光信号的强弱，排除聚球藻、原绿球藻等对于AAPB检测的影响；而利用AAPB的细菌叶绿素a，将AAPB与其他细菌区分开来，从而获取样品中AAPB的准确数量。

样品避光培养至少16小时。

在利用流式细胞仪对样品进行分析时，调节各个检测器的电压值，使得流式检测效果最好，再采集前向散射光、侧向散射光、核酸染料DAPI荧光信号、自养浮游生物的叶绿素荧光信号以及AAPB的细菌叶绿素a的荧光信号等数据。

流式细胞分析软件可采用如Beckman Coulter公司开发的EXPO^TM32 MultiCOMP软件。

现有的流式细胞仪是根据20世纪70年代发展起来的流式细胞技术(Flow Cytometry，FCM)设计的，流式细胞技术是一种对单细胞的物理化学特征和生物化学特征，如细胞的大小、细胞质的颗粒性、自身色素的含量、DNA或RNA含量等，进行多参数快速检测的技术。

在本发明中，根据检测对象——AAPB的特性，采集了前向散射光、侧向散射光、核酸染料DAPI荧光信号、自养浮游生物的叶绿素荧光信号以及AAPB的细菌叶绿素a的荧光信号，其中前向散射光反应了细胞的大小、形态等物理特征；而侧向散射光反应了细胞的内含物的高低。通过核酸染料DAPI对样品进行染色，根据核酸的有无、多寡将浮游生物与泥沙、细胞碎屑等杂质区分开来；而利用叶绿素荧光信号将聚球藻、原绿球藻等超微型光合自养生物与浮游细菌区分开来；利用改造后的红敏检测器采集细菌叶绿素a的荧光信号，从而将AAPB从浮游细菌中区分开来。

DAPI染色的优点不仅在于可以去除泥沙、细胞碎屑等杂质的影响，而且，可以在不影响AAPB检测的同时对样品中的浮游细菌总量进行计数。这是由于AAPB具有很低含量的细菌叶绿素a，而不含有细菌叶绿素b，c，d，e，f等色素，而在相同环境中的其他细菌，其细菌叶绿素a的含量极低或者没有，因此，可以利用AAPB的这个特点，利用细菌叶绿素a将AAPB从海洋细菌中区分开来，从而准确评价AAPB在海洋浮游细菌中所占的比例。

与现有的采用荧光显微镜-红外摄像技术检测AAPB技术相比，本发明的突出优点在于：

在利用荧光显微镜-红外摄像技术(EFM-IRP)对AAPB的研究中发现，聚球藻和原绿球藻等浮游自养生物对于AAPB的计数有极大的影响，造成AAPB定量的显著误差，这在聚球藻和原绿球藻等密度高的海域或季节表现的更为明显，可能导致30％以上的误差。而本发明根据流式细胞技术能够同时进行多参数快速检测的特点，利用聚球藻和原绿球藻等浮游自养生物含有叶绿素，而AAPB不含有叶绿素的特点，通过设置滤光片采集叶绿素的荧光信号，根据叶绿素荧光信号的差异将聚球藻和原绿球藻与AAPB区分开来，从而排除聚球藻和原绿球藻的影响，实现AAPB的准确定量，为评价AAPB在全球碳循环中的作用提供可靠依据。

附图说明

图1为本发明实施例采用的流式细胞仪的光路系统结构示意图。

图2为不同生物在红敏检测器中表现出来的细菌叶绿素a荧光信号。其中：

A：Roseobacter denitrificans，购于德国DSM公司，AAPB的代表菌株；

B：Erythrobacter litoralis，购于德国DSM公司，AAPB的代表菌株；

C：Escherichia coli，大肠杆菌，典型异养细菌；

D：Synechococcus ssp.，购于美国Biglow实验室，作为聚球藻、原绿球藻的代表菌株。

从图2中可以看出，由于AAPB的代表种Roseobacter denitrificans与Erythrobacter litoralis含有细菌叶绿素a，从而表现出较高的细菌叶绿素a荧光信号；而Escherichia coli不具有细菌叶绿素a，其荧光信号几乎为0，因此，可以利用细菌叶绿素a的含量高低，将AAPB从细菌群落中区分出来。由于Synechococcus sp.具有较强的自发荧光，在红敏检测器中也具有相当的荧光信号，这些荧光信号在AAPB的荧光显微镜检测中造成了30％以上的误差。

在图2中，横坐标为PMT4Log(4号光电倍增管的对数信号，经改造作为前向散射光的检测器，表示前向散射光的强度)，纵坐标为PMT5Log(5号光电倍增管的对数信号，表示细菌叶绿素a荧光的强度)。

图3为不同生物在流式细胞仪上展示出来的叶绿素荧光信号。其中：

A：Roseobacter denitrificans，购于德国DSM公司，AAPB的代表菌株；

B：Erythrobacter litoralis，购于德国DSM公司，AAPB的代表菌株；

C：Escherichia coli，大肠杆菌，典型异养细菌；

D：Synechococcus sp.，购于美国Biglow实验室，作为聚球藻、原绿球藻的代表菌株。

从图3中可以看出，Synechococcus sp.具有很高的叶绿素含量，而Roseobacterdenitrificans、Erythrobacter litoralis和Escherichia coli在叶绿素检测器中的荧光信号都非常微弱，甚至没有。因此，可以利用叶绿素荧光信号将可能影响AAPB检测的聚球藻、原绿球藻区分开来。

在图3中，横坐标为PMT4Log(4号光电倍增管的对数信号，表示前向散射光强度)，纵坐标为PMT3Log(3号光电倍增管的对数信号，表示叶绿素荧光的强度)。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

首先，对商业化的流式细胞仪的优化设置。对流式细胞仪中的滤光片设置进行优化，至少需要采集前向散射光1、侧向散射光2、核酸染料DAPI荧光信号3、自养浮游生物的叶绿素荧光信号4以及细菌叶绿素a的荧光信号5(参见图1)。选用高灵敏度的红敏检测器代替原来的光电倍增管，用于细菌叶绿素a荧光信号的检测。现有的商业化流式细胞仪，其检测系统的光谱响应范围主要为300～800nm，如美国Beckman Coulter公司生产的Epics Altra II流式细胞仪，其配备的光电倍增管为美国BURLE公司生产的4526A型光电倍增管，光谱响应范围为300～800nm，可以满足前向散射光、侧向散射光、核酸染料DAPI荧光信号以及自养浮游生物的叶绿素荧光信号检测的要求。而对于AAPB中细菌叶绿素a的荧光信号，由于其相应的荧光发射峰在870～900nm近红外区，利用原来的光电倍增管无法对细菌叶绿素a的荧光信号进行检测，因此，需要利用红敏检测器替代原来的光电倍增管，用于近红外荧光信号的获取。

图1给出本发明实施例采用的流式细胞仪的光路系统结构示意图。流式细胞仪设有激光器6、光束整形器7、透镜9、3片二向色性滤光片10～12、4片带通滤光片13～16。光束整形器7设于激光器6的输出光光路上，被检测细胞8放置于光束整形器7的输出光光路上。在图l中，经细胞8获得的“前向散射光”1表征了细胞8的大小和形态的物理特征；经透镜9和二向色性滤光片10和带通滤光片13获得的“侧向散射光”2表征了细胞8的内含物；经透镜9和二向色性滤光片10与11以及带通滤光片14获得的“核酸染料DAPI荧光信号”3为样品被核酸染料DAPI染色后所激发出来的荧光信号，利用DAPI的荧光信号可以将浮游生物与泥沙、细胞碎屑等杂质区分开来；经透镜9和二向色性滤光片10～12以及带通滤光片15获得的“自养浮游生物的叶绿素荧光信号”4表示叶绿素含量的高低，利用其可以将聚球藻和原绿球藻等超微型光合自养生物与浮游细菌区分开来；经透镜9和二向色性滤光片10～12以及带通滤光片16获得的“AAPB的细菌叶绿素a荧光信号”5所使用的检测器是改造后的红敏检测器(在这里，我们采用的是日本HAMAMATSU公司生产的R2658近红外侧窗型光电倍增管，其电压输入与信号输出与美国BURLE公司生产的4526A型光电倍增管类似，可以利用原来的信号处理系统对采集的细菌叶绿素a荧光信号进行处理)，用于采集细菌叶绿素a的荧光信号，将AAPB从浮游细菌中区分开来。

对流式细胞仪状态的调节最好以标准荧光小球为参照，调节光路系统，使得各个检测器检测到的标准荧光小球的变异系数低于2％。

样品的准备可在样品中加入终浓度为0.5％～2％(V/V)的甲醛，2～10℃下避光培养16小时以上。样品的染色可吸取至少200μL的样品，利用DAPI对样品进行染色，这是因为活体细胞中的细菌叶绿素a在376nm附近具有最大吸收峰(参见文献：Michal

Oded Béjà，Robert R.Bidigare，Stephanie Christenden，Bryan Benitez-Nelson，Costantino Vetriani，Marcin K.Kolber，Paul G.Falkowski and Zbigniew S.Kolber.Isolation and characterization ofErythrobactersp.Strains from the uppcr occan.Arch Microbiol，2003，180：327-338)，而DAPI的最佳激发峰也在这附近。样品的分析可利用流式细胞仪对样品进行分析，调节各个检测器的电压值，使得流式检测效果最好。采集前向散射光、侧向散射光、核酸染料DAPI荧光信号、自养浮游生物的叶绿素荧光信号以及细菌叶绿素a的荧光信号。

当利用分析软件对流式细胞仪采集到的数据进行分析时，可利用DAPI荧光信号的强弱，将浮游生物与泥沙、细胞碎屑等区分开来；根据前向散射光及侧向散射光的强弱，将浮游细菌与微型浮游生物区分开来；根据叶绿素荧光信号的强弱，排除聚球藻、原绿球藻等对于AAPB检测的影响；而利用细菌叶绿素a，将AAPB与其他细菌区分开来，从而获取样品中AAPB的准确数量。

Claims

1.好氧不产氧光合异养细菌的流式细胞检测方法，其特征在于其步骤为：

1)样品准备：在样品中加入终浓度为0.5％～2％的甲醛，2～10℃下避光培养；

2)样品染色：吸取至少200μL的样品，利用核酸染料4，6-联脒-2-苯基吲哚对样品进行染色；

3)样品的流式细胞分析：将DAPI染色过的样品放置于流式细胞仪的样品台上，利用流式细胞仪对样品进行分析，采集前向散射光、侧向散射光、核酸染料DAPI荧光信号、自养浮游生物的叶绿素荧光信号以及AAPB的细菌叶绿素a的荧光信号等数据，其中，域值设置在DAPI荧光上，利用核酸染料DAPI荧光信号将浮游生物与泥沙、细胞碎屑区分开来，同时，利用红敏检测器采集AAPB的细菌叶绿素a的荧光信号，利用不同浮游生物在AAPB的细菌叶绿素a荧光信号上的差异，将AAPB与其他浮游生物区分开来；

2.如权利要求1所述的好氧不产氧光合异养细菌的流式细胞检测方法，其特征在于所述的样品避光培养至少16小时。

3.如权利要求1所述的好氧不产氧光合异养细菌的流式细胞检测方法，其特征在于所述的在利用流式细胞仪对样品进行分析时，调节各个检测器的电压值，使得流式检测效果最好，再采集前向散射光、侧向散射光、核酸染料DAPI荧光信号、自养浮游生物的叶绿素荧光信号以及AAPB的细菌叶绿素a的荧光信号等数据。

4.如权利要求1所述的好氧不产氧光合异养细菌的流式细胞检测方法，其特征在于所述的流式细胞分析软件采用如Beckman Coulter公司开发的EXPO^TM32MultiCOMP软件。