CN113857235B - 一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料及应用、修复方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于矿山生态修复技术领域，具体涉及一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料及应用、修复方法。本发明提供的促离子型稀土尾矿区的生物结皮修复材料，包括广布藻和/或乡土土壤藻；所述乡土土壤藻的种类包括蓝藻门鞘丝藻和/或绿藻门衣藻；所述广布藻的种类包括固氮念珠藻和/或具鞘微鞘藻。本发明将广布藻和乡土土壤藻的培养液施加到待修复离子型稀土尾矿区的土壤中，可显著提高尾矿土壤中有机质的含量，降低氨氮含量，提高了尾矿表层结皮面积，大幅降低了裸露表层，可快速改善离子型稀土废弃矿区因尾矿废弃地所造成的极度退化的生态环境、提高因稀土矿毁山开采所导致的矿区土壤退化与环境污染。

Description

一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料及应 用、修复方法

技术领域

本发明属于矿山生态修复技术领域，具体涉及一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料及应用、修复方法。

背景技术

离子型稀土是国家战略性资源，具有不可再生性，在国防建设和高新技术领域被广泛应用。离子型稀土开采在创造高收益的同时造成植被和土地资源破坏、水土污染等一系列生态环境问题，如：土质疏松、土壤沙化严重、出现寸草不生的现象(被称为“南方沙漠”)，在南方暴雨季节，还易发生水土流失，由此产生大量废弃边坡，坡体不稳、地表裸露以及缺乏植被而引起塌陷、崩塌、滑坡等严重地质灾害，严重制约和阻碍着该区域农业和社会发展。因此，针对离子型稀土矿开采对周边环境的破坏，开展赣南离子型稀土尾矿区生态重建迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料及应用、修复方法，该生物结皮修复材料能提高尾矿土壤中有机质的含量，降低氨氮含量，提高了尾矿表层结皮面积，大幅降低了裸露表层，可改善矿区土壤退化与环境污染的问题。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料，包括广布藻和/或乡土土壤藻；所述乡土土壤藻包括蓝藻门鞘丝藻和/或绿藻门衣藻；所述蓝藻门鞘丝藻的保藏编号为CCTCC No：M 2021758；所述绿藻门衣藻的保藏编号为CCTCC No：M2021324；所述广布藻包括固氮念珠藻和/或具鞘微鞘藻。

优选的，当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括广布藻和乡土土壤藻时，所述广布藻中叶绿素的含量和乡土土壤藻中叶绿素的含量比为(0～5)∶(0～5)，且所述广布藻中叶绿素的含量和乡土土壤藻中叶绿素不同时为0；

当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括蓝藻门鞘丝藻和绿藻门衣藻时，所述蓝藻门鞘丝藻中叶绿素的含量和绿藻门衣藻中叶绿素的含量比为(0～5)∶(0～5)，且所述蓝藻门鞘丝藻中叶绿素的含量和绿藻门衣藻中叶绿素不同时为0；

当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括固氮念珠藻和具鞘微鞘藻时，所述固氮念珠藻中叶绿素的含量和具鞘微鞘藻中叶绿素的含量比为(0～5)∶(0～5)，且所述固氮念珠藻中叶绿素的含量和具鞘微鞘藻中叶绿素不同时为0。

优选的，所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料的施加量为100～1000μg(叶绿素)·m^-2(待修复土壤)。

本发明还提供了上述技术方案所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料在修复离子型稀土尾矿区中的应用。

本发明还提供了一种修复离子型稀土尾矿区的方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料施加到待修复的离子型稀土尾矿区土壤中，进行修复。

优选的，所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料以藻悬液的方式施加到待修复的离子型稀土尾矿区土壤中。

优选的，所述藻悬液的制备方法包括以下步骤：

将所述促离子型稀土尾矿区的生物结皮修复材料接种于培养液中，进行培养，得到藻悬液。

优选的，所述培养液为无菌BG-11培养液。

优选的，所述培养的光照强度为2500～3500lx；所述培养的光暗比为16h∶8h或12h∶12h；所述培养的方式为静置培养；所述培养的温度为25±5℃；所述培养的时间为3～4周。

优选的，所述藻悬液中叶绿素含量为100～1000μg·L^-1。

本发明提供了一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料，包括广布藻和/或乡土土壤藻；所述乡土土壤藻包括蓝藻门鞘丝藻和/或绿藻门衣藻；所述蓝藻门鞘丝藻的保藏编号为CCTCC No：M 2021758；所述绿藻门衣藻的保藏编号为CCTCC No：M2021324；所述广布藻包括固氮念珠藻和/或具鞘微鞘藻。本发明提供的促离子型稀土尾矿区的修复材料用于促离子型稀土尾矿区的生态修复时，藻细胞的胞外分泌物为土壤有机质的重要来源，可显著提高尾矿区土壤中有机质的含量，营养液中的盐离子可以促进土壤中氨氮的淋溶现象的发生，从而降低土壤中氨氮含量，提高尾矿表层结皮面积，大幅降低裸露表层，可快速改善离子型稀土废弃矿区因尾矿废弃地所造成的极度退化的生态环境、解决因稀土矿毁山浸矿开采所导致的矿区土壤退化与环境污染的问题。

附图说明

图1为乡土土壤藻在显微镜下的形态图；

图2为实施例1中纯化培养的绿藻门衣藻的形态图和实施例2纯化培养的蓝藻门鞘丝藻的形态图；

图3为接种后不同处理藻类后土壤表层藻类结皮变化图；

图4为实施例1和实施例2中乡土土壤藻叶绿素含量随培养时间的变化图；

图5为在稀土尾矿土壤中加入不含藻的BG-11培养液46d后的表层藻结皮变化图；

图6为接种不同藻类组合后尾矿土壤表层藻结皮放大倍数分别为2000倍和5000倍的SEM微观结构图。

生物保藏说明

蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1，于2021年6月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2021758；

绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2，于2021年4月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2021324。

具体实施方式

本发明提供了一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料，包括广布藻和/或乡土土壤藻；

所述乡土土壤藻的种类包括蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1和/或绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2；所述蓝藻门鞘丝藻的保藏编号为：CCTCC No：M2021758；所述绿藻门衣藻的保藏编号为：CCTCC No：M 2021324。

所述广布藻的种类包括固氮念珠藻(Nostoc sp.)和/或具鞘微鞘藻(Microcoleusvaginatus)。

在本发明中，所述乡土土壤藻优选种类筛选自江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区。

在本发明中，所述乡土土壤藻的分离、纯化方法优选包括以下步骤：

采集江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区在自然条件下形成的生物结皮样品，使用75％酒精其进行消毒，防止样品在采集过程中交叉污染，将消毒后的样品放置于无菌铝盒(规格：50mm×30mm)中，运回实验室，并在低温-4℃下进行保存；在无菌环境条件下，取0.5g生物结皮样品于装有无菌BG-11培养液的150mL三角瓶内(BG-11培养液的组成和配制方法见表1)，在匀浆器中分散均匀后，在光照培养箱中特定的环境条件下静置培养(光暗比＝16h∶8h，光照强度在3000lx，温度为25℃)，培养3～4周后，当形成明显藻溶液时，用毛细管取2μL藻溶液于含2mL无菌BG-11培养液的24孔细胞培养板中，进行培养(培养条件如上所述)，形成明显绿色时，使用毛细管在显微镜(光学显微镜，CX33RTFS2，OLYMPUS，日本)下分别吸取挑选蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1或绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2，并将挑选出的蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1或绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2在无菌条件下接种于无菌BG-11培养液进行单独培养(培养条件如上所述)，将单独培养的过程重复8次，得到纯化培养的单一的蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1或绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2。

在本发明中，所述广布藻优选种类购买于中科院水生生物研究所国家藻种库。其中，固氮念珠藻(Nostoc sp.)的保藏编号为FACHB-119，丝状的具鞘微鞘藻(Microcoleusvaginatus)的保藏编号为FACHB-253。

在本发明中，当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括广布藻和乡土土壤藻时，所述广布藻中叶绿素的含量和乡土土壤藻中叶绿素的含量比优选为(0～5)∶(0～5)，且所述广布藻中叶绿素的含量和乡土土壤藻中叶绿素不同时为0；所述广布藻中叶绿素的含量和乡土土壤藻中叶绿素的含量比更优选为(1～4)∶(1～5)；

当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括蓝藻门鞘丝藻和绿藻门衣藻时，所述蓝藻门鞘丝藻中叶绿素的含量和绿藻门衣藻中叶绿素的含量比优选为(0～5)∶(0～5)，且所述蓝藻门鞘丝藻中叶绿素的含量和绿藻门衣藻中叶绿素不同时为0；所述绿藻门鞘丝藻中叶绿素的含量和绿藻门衣藻中叶绿素的含量比更优选为(1～4)∶(1～5)；

当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括固氮念珠藻和具鞘微鞘藻时，所述固氮念珠藻中叶绿素的含量和具鞘微鞘藻中叶绿素的含量比优选为(0～5)∶(0～5)，且所述固氮念珠藻中叶绿素的含量和具鞘微鞘藻中叶绿素不同时为0；所述固氮念珠藻中叶绿素的含量和具鞘微鞘藻中叶绿素的含量比更优选为(1～4)∶(1～5)；

在本发明中，所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料的施加量优选为100～1000μg(叶绿素)·m^-2(待修复土壤)，更优选为150～950μg(叶绿素)·m^-2(待修复土壤)。

本发明还提供了上述技术方案所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料在修复离子型稀土尾矿区中的应用。

本发明还提供了利用上述技术方案所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复离子型稀土尾矿区的方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料施加到待修复的离子型稀土尾矿区土壤中，进行修复。

本发明优选将所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料以藻悬液的方式施加到待修复的离子型稀土尾矿区土壤中。

在本发明中，所述藻悬液的制备方法优选包括以下步骤：

将所述促离子型稀土尾矿区的生物结皮修复材料接种于培养液中，进行培养，得到藻悬液。

在本发明中，所述培养液优选为无菌BG-11培养液；所述无菌BG-11培养液的组成如表1所示；本发明对所述BG-11培养液的配制方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程根据表1的配方配制母液并混合形成BG-11培养液即可。

表1 BG-11培养液的组成及配制方法

注：A5溶液(用水稀释至1000mL):H₃BO₃(61.0mg)；MnSO₄·H₂O(169.0mg)；ZnSO₄·7H₂O(287.0mg)；CuSO₄·5H₂O(2.5mg)；(NH₄)Mo₇O₂₄·4H₂O(12.5mg)。

如无特殊说明，本发明对所用配制BG-11培养液的原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明对所述无菌BG-11培养液的灭菌方式没有特殊限定，采用本领域熟知的灭菌方式即可。

在本发明中，所述接种优选在无菌条件下进行。本发明对所述接种方式没有特殊限定，采用本领域熟知的方式即可。在本发明中，所述培养的装置优选为光照培养箱；所述培养的方式优选为静置培养；所述培养的光暗比优选为16h∶8h或12h∶12h，所述培养的光照强度优选为2500～3500lx，所述培养的温度优选为25±5℃；所述培养的时间优选为3～4周。

在本发明中，所述藻悬液中叶绿素含量优选为100～1000μg·L^-1，更优选为150～950μg·L^-1。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

采集江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区在自然条件下形成的生物结皮样品，使用75％酒精其进行消毒，防止样品在采集过程中交叉污染，将消毒后的样品放置于无菌铝盒(规格：50mm×30mm)中，运回实验室，并在低温-4℃下进行保存；在无菌环境条件下，取0.5g生物结皮样品于装有无菌BG-11培养液的150mL三角瓶内(BG-11培养液的组成和配制方法见表1)，在匀浆器中分散均匀后，在光照培养箱中特定的环境条件下静置培养(光暗比＝16h∶8h，光照强度在3000lx，温度为25℃)，培养4周后，当形成明显藻溶液时，用毛细管取2μL藻溶液于含2mL无菌BG-11培养液的24孔细胞培养板中，进行培养(培养条件如上所述)，形成明显绿色时，使用光学显微镜(型号为CX33RTFS2，OLYMPUS，日本)进行观察。显微镜下藻溶液中乡土土壤藻的形态如图1所示。由图1的镜检结果可知：培养获得的藻类主要包括丝状的蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1和球形的绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2，球形绿藻门衣藻镶嵌分布于缠绕的丝状蓝藻门鞘丝藻体间；使用毛细管在显微镜下分别吸取挑选蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1，并将挑选出的蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1在无菌条件下接种于无菌BG-11培养液进行单独培养(培养条件如上所述)，将单独培养的过程重复8次，得到纯化培养的单一的蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1；

将丝状蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1接种于无菌的BG-11培养液中，在光照培养箱中特定的环境条件下静置培养(光暗比＝16h：8h，光照强度在3000lx，温度为25℃)，培养4周，得到丝状蓝藻门鞘丝藻藻悬液，叶绿素含量为192μg·L^-1。

实施例2

采集江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区在自然条件下形成的生物结皮样品，使用75％酒精其进行消毒，防止样品在采集过程中交叉污染，将消毒后的样品放置于无菌铝盒(规格：50mm×30mm)中，运回实验室，并在低温-4℃下进行保存；在无菌环境条件下，取0.5g生物结皮样品于装有无菌BG-11培养液的150mL三角瓶内(BG-11培养液的组成和配制方法见表1)，在匀浆器中分散均匀后，在光照培养箱中特定的环境条件下静置培养(光暗比＝16h∶8h，光照强度在3000lx，温度为25℃)，培养4周后，当形成明显藻溶液时，用毛细管取2μL藻溶液于含2mL无菌BG-11培养液的24孔细胞培养板中，进行培养(培养条件如上所述)，形成明显绿色时，使用光学显微镜(型号为CX33RTFS2，OLYMPUS，日本)进行观察。显微镜下藻溶液中乡土土壤藻的形态如图1所示。由图1的镜检结果可知：培养获得的藻类主要包括丝状蓝藻门鞘丝藻(Lyngbya sp.)JXSHKY-1和球形绿藻门衣藻(Chlamydononassp.)JXSHKY-2，球形绿藻门衣藻镶嵌分布于缠绕的丝状蓝藻门鞘丝藻体间；使用毛细管在显微镜下分别吸取挑选绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2，并将挑选出的绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2在无菌条件下接种于无菌BG-11培养液进行单独培养(培养条件如上所述)，将单独培养的过程重复8次，得到纯化培养的单一的绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2；

将绿藻门衣藻(Chlamydononas sp.)JXSHKY-2接种于无菌的BG-11培养液中，在光照培养箱中特定的环境条件下静置培养(光暗比＝16h∶8h，光照强度在3000lx，温度为25℃)，培养4周，得到绿藻门衣藻藻悬液，叶绿素含量为339μg·L^-1。

实施例3

将蓝藻门的固氮念珠藻(Nostoc sp.)(购买于中科院水生生物研究所国家藻种库)接种于无菌的BG-11培养液中，在光照培养箱中特定的环境条件下静置培养(光暗比＝16h∶8h，光照强度在3000lx，温度为25℃)，培养4周，得到固氮念珠藻藻悬液，叶绿素含量为441μg·L^-1。

实施例4

与实施例3的区别在于促离子型稀土尾矿区快速生态恢复的藻类生物结皮修复材料为蓝藻门丝状的具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatus)(购买于中科院水生生物研究所国家藻种库)，其他内容与实施例3一致，具鞘微鞘藻藻悬液中叶绿素含量为558μg·L^-1。

应用例1

效果评价

地点：江西省南昌市东湖区——江西省生态环境科学研究与规划院科研玻璃房内；

供试土壤来源：稀土尾矿基质——江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区；黄壤——取自江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区附近未开发的自然林地。

时间：2020年11月～2021年3月。

培养条件：有效光合辐射约为3.5μmol·m^-2·s^-1，平均温度为10℃，平均空气湿度为70％RH。

稀土尾矿基质的基本理化指标含量为：pH值4.36，氨氮含量173.89mg·kg^-1，有机质含量0.236g·kg^-1。

试验方案：

通过浮游植物分类荧光仪PHYTO-PAM-II测定实施例1～4得到的4种藻悬液(鞘丝藻A、衣藻B、固氮念珠藻C、具鞘微鞘藻D)的叶绿素含量并绘制生长曲线。实施例1和2得到的藻悬液中叶绿素含量见图2。

处理组1：

将实施例1的蓝藻门鞘丝藻藻悬液A和实施例2绿藻门衣藻藻悬液B按照叶绿素含量2∶1进行混合，并分别加入0.03％琼脂、3g黄壤和无添加作为3个处理，用无菌BG-11培养液将每个处理补足为45mL，每个处理设置三次平行样，震荡12h后，将45mL处理液均匀施加到分装好稀土尾矿基质的白色塑料盆(每盆装有2.5kg供试土壤)中，溶液中装入4颗玻璃珠，用透气封口膜封闭，水温设置和振荡频率分别设置为29℃和100转·min^-1，振荡时间为24h，使溶液和稀土尾矿基质混合均匀。为了防止周围枯枝落叶进入盆栽以及降低盆栽中水分损失速率，接种完试验后覆盖透明薄膜。为了保证水分补给，接种藻液结束后2周内，继续施加370mL·m^-2·d^-1/2.5kg土的BG-11培养液补充稀土尾矿基质中水分和营养，以供藻类的生长。

处理组2：

与处理组1的区别在于接种的藻悬液为实施例2绿藻门衣藻藻悬液B和实施例3的固氮念珠藻藻悬液C按照叶绿素含量2∶1混合的混合藻悬液，其余内容同处理组1。

处理组3：

与处理组1的区别在于接种的藻悬液为实施例4的具鞘微鞘藻藻悬液D和实施例3的固氮念珠藻藻悬液C按照叶绿素含量2∶1混合的混合藻悬液，其余内容同处理组1。

处理组4：

与处理组1的区别在于接种的藻悬液为实施例1的蓝藻门鞘丝藻藻悬液A和实施例2绿藻门衣藻藻悬液B按照叶绿素含量2∶5混合的混合藻悬液，其余内容同处理组1。

对照组：

与处理组1的区别在于不接种藻类，其余内容同处理组1。

对照组、处理组1～4的具体组合方式见表2。

表2实施例1～4制备的藻悬液的组合方式

具体检测内容如下：

(1)鉴定及优势种确定：采用光学显微镜直接观察法，用加样枪吸取200μL的培养液接种液制成临时水装片，每个样品取3个临时装片，每个装片至少观察10个视野，使用带有成像系统的光学显微镜在40倍物镜和100倍油镜下观察藻形态，对藻个体进行拍照，统计不同种类并计数，根据其形态、结构、大小等特点，参考《中国淡水藻类》等将其进行对比与鉴定最后根据出现频率的大小确定优势种。

图2为实施例1中纯化培养的衣藻的形态图和实施例2纯化培养的鞘丝藻的形态图，其中(a)和(b)为绿藻门衣藻，(c)和(d)为蓝藻门鞘丝藻。

由图2可知，本发明从江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区的生物结皮组织中提纯培养的两种藻类分别为球形的绿藻门衣藻和丝状的蓝藻门鞘丝藻。

(2)覆盖度：使用点针法测定，记录15cm×15cm网格焦点下藻结皮出现次数。

由图3可知，稀土尾砂表层在接种乡土土壤藻和/或广布藻后，藻结皮覆盖度均为100％，说明，接种乡土土壤藻和/或广布藻显著提高了表层土壤藻结皮的覆盖面积，图4b显示，当绿藻门衣藻多于蓝藻门鞘丝藻时，两者共同增长，且叶绿素含量比例相对稳定。

(3)藻结皮的生物量测定

表3为不同处理方式后藻结皮发育特征，使用生物量和厚度表征结皮生长状态。藻结皮生物量的测定：藻结皮的生物量用叶绿素含量(Chl-a)表示。称量2.0g冷冻干燥后的结皮样品于10mL离心管中，加入5mL 95％乙醇溶剂，4℃避光过夜，8000rpm下离心5min，取上清液，使用紫外分光光度计分别于波长665和750nm处测量吸光度值，然后加5滴1mol·L^-1盐酸酸化，90s后置分别于波长665和750nm处再测吸光值。藻类叶绿素a含量的计算公式为：

Chl-a(mg·g^-1)＝27.9×[(E₆₆₅-E₇₅₀)-(A₆₆₅-A₇₅₀)]×V/M

E665和E750分别为萃取液酸化前的吸光度值，A665和A750分别为萃取液酸化后的吸光度值，V和M分别代表萃取液体积(mL)和结皮样品质量(g)。结果如表3所示。

表3不同处理方式后藻结皮发育特征(平均值±标准偏差)

注：上标不同的小写字母表示同一列各均值间具有显著性差异(p＜0.05)。

由表3可知，结皮厚度随接种时间增加而提高，BG-11处理组与对照组间差异显著(p<0.05，p＝0.026)，而加入琼脂和黄壤后，与对照组差异不明显，表明限制稀土尾砂生态恢复及演替的主要因素是营养元素缺失，但人为干扰能缩短藻类定殖的时间。接种藻类30d后，藻结皮平均厚度为1.22mm，前期野外调查发现稀土矿区自然形成的生物结皮厚度平均厚度为2.14mm，表明人工接种能加速藻类与尾砂颗粒粘结。琼脂对照组与BG-11对照组相比，两者结皮厚度无显著性差异，表明加入琼脂对土壤颗粒也具有胶结作用。藻结皮厚度大小顺序依次为琼脂处理组>BG-11处理组>黄壤处理组，分别为1.08、1.02和0.98mm。

由表3可知，添加各添加剂后各藻组合在接种60d后，叶绿素含量大小顺序依次为BG-11处理组>黄壤处理组>琼脂处理组，叶绿素平均浓度分别为2.63、2.34、2.00mg·g^-1。而在4种不同藻处理组合下(处理方式见表2)，当绿藻门衣藻与蓝藻门鞘丝藻接种比例为2：1时，叶绿素平均含量的最大，为2.75mg·g^-1，大小顺序依次为藻组合3>藻组合4>藻组合1>藻组合2，但藻结皮厚度最低。表明使用琼脂按照固氮念珠藻：球形绿藻门衣藻＝2∶1为最好的接种方式，更有利于藻类的快速发育，但是固氮念珠藻对土壤颗粒的缠绕能力相对较弱，导致藻结皮厚度最低。

(4)生长曲线测定：取一定量各组分溶液于高压灭菌锅灭菌(121℃，30min)，冷却后混合获得BG-11培养液(表1)。将实施例1和实施例2的两种土著藻类鞘丝藻和绿藻门衣藻接种于装有400mL上述BG-11的1L锥形瓶中，静置培养(光暗比＝12h∶8h，光照强度为2500～3500lx，温度为25±5℃)，每天手动摇荡3次，利用浮游植物分类荧光仪(PHYTO-PAM-Ⅱ，德国)测定叶绿素含量。当培养至10d后，藻细胞开始出现结块，停止测定叶绿素含量。实施例1和2的两种土著藻类蓝藻门鞘丝藻和绿藻门衣藻叶绿素含量随培养时间的变化特征如图4所示。

由图4可知，当绿藻门衣藻生物量低于蓝藻门鞘丝藻生物量时，接种初期，蓝藻门鞘丝藻生物量增加速率随接种时间增加，增长量约为48.95μg·L^-1·d^-1，接种至7d后，蓝藻门鞘丝藻增长速率逐渐降低至平稳，增长量约为18.2μg·L^-1·d^-1。绿藻门衣藻生长速度快，增长速率约为1.4μg·L^-1·d^-1，而蓝藻门鞘丝藻生长速率约为1.2μg·L^-1·d^-1，两者均呈现增长量随培养时间增加而降低的现象。而绿藻门衣藻生物量高于蓝藻门鞘丝藻时，绿藻门衣藻在接种初期生长缓慢，绿藻门衣藻生长速度远快于蓝藻门鞘丝藻，蓝藻门鞘丝藻生长受限，培养9d后，绿藻门衣藻叶绿素含量从20μg·L^-1迅速上升至934.9μg·L^-1。总叶绿素含量达到1076.2μg·L^-1，绿藻门衣藻占87.16％，蓝藻门鞘丝藻仅占总量的13.20％，但蓝藻门鞘丝藻与绿藻门衣藻在培养过程中叶绿素含量之比维持在2∶1到4∶1之间。

(5)BG-11培养液对稀土尾砂中结皮组织的影响

图5为稀土尾砂加入不含藻的BG-11培养液46d后变化图。由图5可知，通过表观直接观察和显微镜观察后发现，直接添加BG-11营养液后，有利于利用空气传播的微生物(如苔藓植物孢子等)在表层尾砂定殖。

(6)扫描电子显微镜(SEM)：取小块上层藻结皮样品，冷冻干燥后进行喷金镀膜，使用电子扫描显微镜对样品上表层超微结构特征进行观察并拍照。图6为接种不同藻类组合后尾矿土壤表层藻结皮放大倍数分别为2000倍和5000倍的SEM微观结构图，图中编号a、c、e、h、j和l放大倍数为2000倍，b、d、f、i、k和m放大倍数为5000倍，即右侧图(×5000倍)为左侧图(×2000倍)红色圆圈内的放大部分)。

如图6显示，大量针状矿物存在于稀土尾矿中。加入琼脂后，稀土尾砂表层形成了一层膜，对表层颗粒具有保护作用。尾砂接种30d后，添加藻类的琼脂处理组，藻类附着或镶嵌于琼脂膜上，表面疏松多孔，具较大的比表面积。而空白组接种相同时间后，表层无藻体出现或土壤颗粒聚集的现象，表明与接种处理的试验组相比，微生物或空气中的颗粒等附着在表层稀土尾砂所需时间较长。加入含藻的黄壤溶液后，藻类与黄壤颗粒形成团聚体，各团粒间结合较紧密。而直接加入黄壤溶液的稀土尾砂，形成了颗粒-颗粒接触的颗粒基质，表明藻细胞能胶结细小颗粒形成团聚体。加入含藻的BG-11营养液，与直接加入BG-11营养液显微结构明显差异，粗颗粒含量明显多于细颗粒，藻细胞镶嵌于土壤颗粒间。图6中球形绿藻门衣藻体观察明显，耐受性强的土著绿藻门衣藻占优势。接种30d后，土壤颗粒间仍以胞外胶鞘的粘结力为主。

(7)土壤理化性质测试：

A、pH：采用pH计法测定。将样品带回室内经风干、粉碎、去除杂质后，按照2.5∶1的水土比来混合土壤和蒸馏水，搅拌静置1h，用酸度计(雷磁)依次测定上清溶液的pH，每个样品测定3个重复值。

B、土壤有机质的测定：在一定温度下(100℃，90min)用重铬氧化土壤中有机碳，部分六价铬(Cr⁶⁺)被还原成绿色的三价铬(Cr³⁺)，用比色法测定三价铬的吸光度，以葡萄糖标准溶液中碳氧化液为标准色阶，计算土壤中有机碳并换算成有机质含量。所涉及的试剂及配制方法参考鲁如坤(2000)所著的《土壤农业化学分析方法》。计算方法如下：

m₁—有标准曲线查出的土样含碳量，mg；

1.724—有机碳换算有机质的系数；

1.08—氧化校正系数；

m—土样质量，g。

C、土壤氨氮(NH₄ ⁺-N)的测定：土壤浸出液中的NH₄ ⁺强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性燃料靛酚蓝，溶液的蓝色很稳定，在浓度NH₄ ⁺为0.05～0.5mg·L^-1范围内，其深浅与含量呈正比。所涉及的试剂及配制方法参考鲁如坤(2000)所著的《土壤农业化学分析方法》。计算方法如下：

w(N)—土壤中氨态氮的质量分数，mg·kg^-1；

ρ—从工作曲线上查得显色液中氮的浓度，mg·L^-1；

V—显色液的体积，mL；

ts—分取倍数，

10^-3，1000—分别代表将mL换算成L；换算成每kg土含量；

m—土样的质量。

不同处理组稀土尾砂土壤基本理化性质结果如表4所示。

表4不同处理组稀土尾砂土壤基本理化性质

表4为不同处理组稀土尾砂基本理化性质。由表4可知，与不添加藻类的稀土尾矿土壤相比，黄壤、琼脂、BG-11处理组和对照组稀土尾矿土壤中氨氮含量分别下降93.51％、94％、91.75％和91.66％，土壤pH介于4.5～5.5之间，有机质含量提高了85.26％，稀土尾矿土壤中有机质含量从0.23g·kg^-1提高到1.56g·kg^-1。

由上述实施例的结果可知，本发明提供的促离子型稀土尾矿区的生物结皮修复材料用于促离子型稀土尾矿区的快速生态修复时，可显著提高尾矿土壤基质中有机质的含量，降低氨氮含量，提高尾矿表层结皮面积，大幅降低裸露表层，可快速改善离子型稀土废弃矿区因尾矿废弃地所造成的极度退化的生态环境、提高因稀土矿毁山开采所导致的矿区土壤退化与环境污染。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (2)

1.一种促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料，所述的离子型稀土尾矿区为：江西省赣州市寻乌县文峰镇打罗石废弃稀土矿区；

所述的生物结皮修复材料，包括广布藻和乡土土壤藻；

其中，广布藻购买于中科院水生生物研究所国家藻种库，包括固氮念珠藻和/或具鞘微鞘藻；

固氮念珠藻的保藏编号为FACHB-119；丝状的具鞘微鞘藻的保藏编号为FACHB-253；

乡土土壤藻包括蓝藻门鞘丝藻JXSHKY-1和/或绿藻门衣藻JXSHKY-2；

所述蓝藻门鞘丝藻的保藏编号为CCTCC No：M 2021758；

所述绿藻门衣藻的保藏编号为CCTCC No：M 2021324；

上述的生物结皮修复材料中，

当所述的生物结皮修复材料包括广布藻和乡土土壤藻时，所述广布藻中叶绿素的含量和乡土土壤藻中叶绿素的含量比为（0~5）∶（0~5），且所述广布藻中叶绿素的含量和乡土土壤藻中叶绿素不同时为0；

当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括蓝藻门鞘丝藻和绿藻门衣藻时，所述蓝藻门鞘丝藻中叶绿素的含量和绿藻门衣藻中叶绿素的含量比为（0~5）∶（0~5），且所述蓝藻门鞘丝藻中叶绿素的含量和绿藻门衣藻中叶绿素不同时为0；

当所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料包括固氮念珠藻和具鞘微鞘藻时，所述固氮念珠藻中叶绿素的含量和具鞘微鞘藻中叶绿素的含量比为（0~5）∶（0~5），且所述固氮念珠藻中叶绿素的含量和具鞘微鞘藻中叶绿素不同时为0；

所述促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料的施加量为100~1000 μg（叶绿素）·m^-2（待修复土壤）。

2.一种修复离子型稀土尾矿区的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1所述的促离子型稀土尾矿区生态恢复的生物结皮修复材料，以藻悬液的方式施加到待修复的离子型稀土尾矿区土壤中，进行修复；

所述的藻悬液，通过将所述促离子型稀土尾矿区的生物结皮修复材料接种于培养液中，进行培养获得的。

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