CN117887591B - 楚雄牛肝菌促生菌株CxBeF11及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种楚雄牛肝菌促生微生物菌株CxBeF11及应用，所述菌株的保藏名称为：Mortierella elongata CxBeF11；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日，保藏编号为：GDMCC No:64277，分类学名称：Mortierella elongata，所述菌株分离自野生的楚雄牛肝菌菌塘土壤，与同样方法分离到的其它供试菌株相比，具有促进牛肝菌菌丝生长、促进牛肝菌孢子萌发的特点。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种楚雄牛肝菌促生微生物菌株CxBeF11及应用。
背景技术
牛肝菌，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales），牛肝菌科（Boletaceae）的可食用的真菌。地理标志产品楚雄牛肝菌（DB53/T857—2018）是国家质量监督检验检疫总局2016年第128号公告批准的牛肝菌产品，主要有白牛肝菌复合群（Boletus bainiugan species complex）（包括美味牛肝菌Boletus edulisBull.:Fr）、远东皱盖牛肝菌（Rugiboletus extremiorientalis）（俗称黄牛肝）、茶褐牛肝菌（Sutorius brunneissimus）和灰褐牛肝菌（Boletus griseus）（俗称黑牛肝）等种类。其优异特点具有：菌体大，整菇外形圆整，菌盖厚实、菌肉紧实；菌香浓烈、菌味鲜甜；速冻后保持色泽不变，解冻后香气依旧，不仅具有丰富的营养价值，而且具有较高的药用价值，是一种珍贵的食药用野生菌。
楚雄牛肝菌分布于楚雄州境内云南松纯林或松杉栎等针阔混交林，土壤类型以紫色土为主。是与云南松、华山松、滇油杉、栎类、杜鹃等树种共生的菌根食用菌，目前无法进行人工种植。近年来资源因受到各种因素的影响，难以实现可持续性开发利用。作为与植物共生的菌根菌，牛肝菌在自然条件下的生长机制不明，纯培养生长缓慢，对环境、生物因素要求苛刻，至今没能实现人工栽培。目前生产方面的研究主要集中于原生境的保育，菌丝体发酵等，在牛肝菌保育促繁的技术上还仍停留在林地管护等方面，微生态系统研究甚少，难以实现人工干预技术的突破。
在牛肝菌生态微系统中，除了土壤、温度、湿度等非生物因素外，生物因素如植物、真菌、细菌、线虫等组成了一个微妙的协和共同体，它们之间互利互惠，共生共长，如真菌促进共生植物菌根的生长，植物又输送一些特殊的营养给真菌，真菌之间也相互促进。也有研究表明，自然条件根际微生物可能对大型真菌的子实体形成有一定的促进作用，其作用机制包括改善野生菌养分吸收、与病原菌竞争生态位、提高野生菌抗性、促进孢子萌发和菌丝生长等多个方面。
本发明采集自然生境下的楚雄牛肝菌菌塘土壤，对菌塘土中的优势微生物进行分离，实验室内开展促生菌的筛选，并结合形态学与基因组DNA扩增子测序，对原位筛选的促生菌株进行了鉴定。通过实验室开展促生菌对楚雄牛肝菌共培养的应用，为野生菌人工菌塘促繁技术、微生态控制技术找到新途径，为牛肝菌保育促繁的人工干预奠定基础。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明以原位筛选的方法，从分离自楚雄野生牛肝菌菌塘土的优势微生物中筛选到牛肝菌促生菌CxBeF11菌株，鉴定为长孢被孢霉（Mortierella elongata）。
本发明提供了一种楚雄牛肝菌促生微生物CxBeF11菌株，所述菌株的保藏名称为：MortierellaelongataCxBeF11；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日，保藏编号为：GDMCC No:64277，分类学名称：Mortierella elongata。
本发明还提供了一种产品，含所述的CxBeF11菌株或CxBeF11菌株培养液。
进一步的，所述CxBeF11菌株培养液的制备方法为：将所述CxBeF11菌株接种至YPD液体培养基中培养获得的菌液经无菌过滤后获得的滤液。
优选的，培养条件为：温度28℃、转速150r/min，摇瓶培养48h。
进一步的，所述的CxBeF11菌株或所述的产品在促进楚雄牛肝菌的菌丝生长、孢子萌发或孢子生长中的应用。
本发明还提供了一种楚雄牛肝菌促生液体培养方法，包括以下步骤：
S1：CxBeF11菌株培养液制备，所述CxBeF11菌株的保藏编号为GDMCC No:64277；将CxBeF11菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20～0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得CxBeF11菌株培养液；
S2:牛肝菌发酵液制备，将牛肝菌菌种分别接入M1液体培养基中，培养获得菌种浓度均为0.5g/L的牛肝菌发酵液；
S3：按照体积比1:5～50将CxBeF11菌株培养液加入牛肝菌发酵液中，继续牛肝菌液体发酵培养。
优选的，步骤S3中，按照体积比1:25将CxBeF11菌株培养液加入牛肝菌发酵液中，继续牛肝菌液体发酵培养。
进一步的，本发明还提供了一种楚雄牛肝菌孢子促生培养方法，包括以下步骤：
（1）促生固体培养基的制备；将CxBeF11菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20~0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得CxBeF11菌株培养液；CxBeF11菌株培养液按体积百分比5~50%添加至M1固体培养基中，配制成M1促生固体培养基，所述CxBeF11菌株的保藏编号为GDMCC No:64277；
（2）制备牛肝菌孢子悬浮液；将悬浮液涂布于M1促生固体培养基上，进行牛肝菌孢子萌发或孢子菌丝培养。
优选的，步骤（1）中，CxBeF11菌株培养液按体积百分比40%添加至M1固体培养基中，配制成M1促生固体培养基。
优选的，所述楚雄牛肝菌为楚雄地区生长的白牛肝菌或黄牛肝菌。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的一种楚雄牛肝菌促生菌CxBeF11菌株，与分离到的其它优势菌相比，具有促进楚雄牛肝菌菌丝生长的特点。
2.本发明提供的CxBeF11菌株与楚雄牛肝菌在平板上的对峙培养，表现了其活菌体促进牛肝菌菌丝生长的作用。
3.本发明提供的CxBeF11菌株的培养液应用于楚雄牛肝菌液体发酵培养，其菌滤液1:25体积比的添加量能够有效促进牛肝菌菌丝的液体培养。
4.本发明提供的CxBeF11菌株的培养液应用于楚雄牛肝菌孢子萌发，能够促进牛肝菌孢子萌发及孢子菌丝生长，菌滤液最适添加比例为40%。
附图说明
图1是本发明中CxBeF11菌株与牛肝菌平板对峙的对比图，图注：a为牛肝菌对照CK，b为牛肝菌与CxBeF11的对峙；
图2是本发明中促生菌株CxBeF11的形态特征图，图注：a 为平板培养初期，b 为后期菌落形态，c为40倍显微图；
图3是本发明中CxBeF11菌株与长孢被孢霉（Mortierella elongata）基于ITS测序的序列比对图；
图4是本发明中CxBeF11菌株培养液培养楚雄牛肝菌孢子生长15d对比图，图注：a为对照CK，b为添加40%菌液。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
本发明提供的生物材料，楚雄牛肝菌促生菌，保藏名称为：Mortierella elongata CxBeF11，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日，保藏编号为：GDMCC No: 64277，分类学名称：Mortierella elongata，该生物材料于2024年01月12日由保藏中心收到，并登记入册，根据请求，由该日起保藏三十年，该生物材料的存活性经保藏中心于2024年01月12日检测，结果是存活。
实施例1
步骤Ⅰ：牛肝菌培养及菌塘优势菌的分离
1）牛肝菌的采集
以楚雄州南华县内牛肝菌主产区域五街镇马龙河村作为本次楚雄牛肝菌调查和样品采集地，该地位于101o01’03” E，25o19’33” N， 海拔2 080.3 ±110.9 m，当地盛产牛肝菌、青头菌、铜绿菌等。选取分散分布的野生牛肝菌菌塘，收集其新鲜子实体（100g以上），初步进行形态学鉴定为白牛肝菌类群。
2）牛肝菌的组织分离与活化
采用M1固体培养基， 配方：葡萄糖20.0 g/L、MgSO41.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、酵母膏2.0 g/L、马铃薯200.0 g/L、琼脂20g/L，pH6.0±0.1，于无菌操作台，取白牛肝菌生长点0.5cm的组织块于试管斜面培养基上，记为“楚白01”，22℃恒温暗培养，10天后转管2次即可。
3）牛肝菌菌塘土壤的采集
选取5个子实体发育期的野生牛肝菌菌塘，按5点取样法，除去表层腐殖质、石砾等，灭菌小铲采集深度2cm、周围10cm范围内的土壤，组成混合土样20g，置采样封口袋中，全部样本均4℃低温保鲜，在24 h之内进行后续处理。
4）菌塘共生优势菌的分离
通过稀释及平板划线法分离菌塘土可培养微生物。细菌分离用牛肉膏蛋白胨培养基，配方：牛肉膏 3 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20g/L，pH 7.2-7.5；真菌分离用孟加拉红琼脂培养基，配方：蛋白胨 5g/L，葡萄糖 10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，1/3000孟加拉红溶液100mL/L，自然pH值。
5支装有9ml无菌水的试管，编号分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，称取1g土样加入编号为10-1试管中，充分震荡摇匀后用移液枪吸取1ml转移到编号为10-2中充分震荡摇匀依次稀释至10-5。细菌稀释至10-5，真菌稀释至10-4。移液枪吸取稀释样液0.1ml，加入培养基表面，用涂布棒均匀地涂布在培养基表面，每个样液重复3个平板。把涂好的培养基放入培养箱倒置培养，细菌在37℃恒温培养箱培养，真菌在28℃恒温培养箱培养。细菌培养24h后长出单菌落，真菌培养3d-5d长出单菌落。以试验设计的对照组与试验组做比较，在样品的梯度平板上进一步挑优势单菌落划线纯培养，做优势菌的分离与纯化。
结果：本实验对采集的野生牛肝菌子实体进行组织分离，在实验室成功实现了楚雄牛肝菌“楚白01”菌丝体的培养及活化，经过形态学观察与分子生物学鉴定，“楚白01”确定为美味牛肝菌(Boletus edulis Bull.:Fr)。对采集的野生楚雄牛肝菌菌塘开展优势菌的分离，经纯化和初步的形态鉴定，筛选到目标菌株CxBeF11，为实验室内开展促生菌的筛选研究提供了稳定的试验供试材料。
步骤Ⅱ：促生菌的筛选与鉴定
1. 优势菌株与牛肝菌菌丝体的平板对峙试验
采用M1加富培养基（M1配方+蛋白胨0.5%），以楚雄牛肝菌菌株“楚白01”、为指示菌，将步骤 Ⅰ 分离获得的优势菌各菌株与其采用平板对峙培养法进行促生试验，开展牛肝菌菌丝体促生菌的筛选。取生长良好的“楚白01” 5mm2大小的菌丝块，接入M1+平板一侧，于22℃恒温培养箱中培养15 d。培养后取长势一致的牛肝菌平板，处理组在距牛肝菌菌丝体边缘4cm处接种经活化24 h的优势菌，不接菌的作为对照组CK，3次重复。22℃恒温继续培养，每10 d十字交叉划线法测量牛肝菌菌落直径，连续测量5次，获得牛肝菌菌丝的日均长速（mm/d），计算增长率以测定优势菌对牛肝菌菌丝生长影响。
计算公式：
菌丝的日均长速（mm/d）=[(菌落直径－5)÷2] /菌丝生长天数 （1）
增长率%＝[（处理菌丝长速－对照菌丝长速）/对照菌丝长速]×100 （2）
结果：菌塘优势菌与楚雄牛肝菌“楚白01”的对峙培养结果见表1以及图1。
表1 菌塘优势菌对牛肝菌菌丝生长的影响
表1所示为步骤I中筛选的优势菌对牛肝菌“楚白01”菌丝生长的影响，CxBeF11菌株促进牛肝菌菌丝长速达1.974mm/d，与对照CK的长速1.373 mm/d相比促生作用（增长率）高达43.77%；
图1展示了CxBeF11供试菌株（优势菌）与牛肝菌“楚白01”平板对峙试验，由CxBeF11菌株在牛肝菌菌丝平板上的培养情况可以明确，CxBeF11菌株表现了促进楚雄牛肝菌菌丝生长的作用。
2. 促生菌株物种鉴定
优势菌中筛选获得的促生菌株CxBeF11，经平板培养后直接作菌落形态学观察。同时开展促生菌株CxBeF11的分子生物学鉴定：供试菌株经纯化，采用ITS序列分析法进行分子系统学鉴定。用Fungal gDNA Isolation Kit（Biomiga 公司）试剂盒提取菌株基因组DNA并保存。采用真菌ITS通用引物对进行扩增：ITS1 / 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4 /5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 引物合成和扩增产物测序由擎科生物(昆明)完成，获得的序列经双向测通并拼接处理，在NCBI数据库中进行 BLAST序列比对，下载高相似度序列。利用Clustalx、DNAStar等软件进行多序列比对，生成多重序列比对图。
由图2可以看出，分离并经筛选的CxBeF11菌株，在孟加拉红琼脂培养基上生长快，菌落形状不规则，菌丝白色成丛成层，具气生菌丝（图2中a），初期呈粉红色，后产生大量白色菌丝（图2中b），菌丝分枝少，产生有隔菌丝（图2中c），孢子囊球形，长于气生菌丝端，孢囊梗直接从气生菌丝长出，孢子呈椭圆形，形态结构与接合菌纲被孢霉目被孢霉科被孢霉属长孢被孢霉（Mortierella elongata）基本相似。
由图3可见，CxBeF11菌株ITS扩增序列片段大小为649 bp，NCBI数据库中下载高相似度序列MT521794（序列号），经Clustalx序列比对，与长孢被孢霉（Mortierella elongata）的序列相似度为99 %以上。
结合CxBeF11菌株的形态学特征及 ITS序列比对结果，将本研究分离到的CxBeF11菌株确定为一种楚雄牛肝菌促生菌，属名长孢被孢霉，分类学名称：Mortierella elongata，已于2024年1月12日提交广东省微生物菌种保藏中心保藏，编号GDMCC No.64277。
应用例1：促生菌株CxBeF11在牛肝菌发酵培养上的应用
1）促生菌株CxBeF11活化后采用常规YPD培养基（配方：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖）进行液体摇瓶培养，温度28℃、转速150r/min，培养48h后，干重法测菌液浓度达0.20～0.25g/L即可；菌液经无菌纱布过滤后0.22μm无菌过滤器收集滤液，记作A液，即本发明所述的CxBeF11菌株培养液；
2）分两个试验组：一是将牛肝菌“楚白01”菌种（菌丝块）切细碎，分别接入100mlM1液体培养基中，24℃摇床（130r/min）培养10d后，各取均匀菌液5ml转接至30个100ml M1液体培养基中继续发酵培养15d，干重法测菌液浓度达0.5g/L即可，培养条件为温度24℃、转速180r/min，记作B1液；二是将另一个楚雄牛肝菌菌种“楚黄223”（黄牛肝菌类群）作为对比例，按同法培养，制备B2液；
3）两个试验组均按体积比1:5，1:10，1:25，1:50的4个处理，将促生菌滤液“A液”分别加入到牛肝菌发酵液B1、B2中，以不加A液为对照CK1、CK2，每组处理重复3个，24℃摇床（180r/min）30d。
4）牛肝菌菌丝体生物量的测定：以上10个试验组共30瓶促生菌共培养的菌液，在3000r/min下离心20min 用去离子水反复洗涤菌丝体，于105℃烘干至恒重，分析天平称重。
结果：
表2 CxBeF11菌液与牛肝菌发酵共培养比较
表2比较了CxBeF11菌液与两种牛肝菌发酵共培养的结果，促生菌滤液A与楚雄牛肝菌发酵液B1及B2在不同浓度水平上促生效果不同，随着滤液A浓度从高到低的下降，牛肝菌菌丝生物量的积累均呈升高趋势，在体积比1:25的水平下“楚白01”菌丝体生物量达401.6mg，其增长率为37.63%，表现为显著促进作用；在另一实例中，“楚黄223”菌丝体生物量最高达440.3mg，比对照增长率为36.84%，即促生菌滤液1:25表现显著促进作用。结果表明，促生菌株CxBeF11菌株滤液应用于楚雄牛肝菌发酵培养上，均有效促进两种楚雄牛肝菌的液体培养。
应用例2：促生菌株CxBeF11在牛肝菌孢子萌发上的应用
1）牛肝菌孢子的采集：取开伞成熟的楚雄牛肝菌（白牛肝菌）子实体的菌盖，室温扣置在20cm×20cm 赛璐玢膜上，避光避风静置5d 后获得孢子印，剪下0.5 cm2的孢子印放入1.5ml带盖离心管中，用生理盐水清洗并定容，获得孢子液。
2）镜检与孢子混悬液配制：移液枪吸取孢子液滴入细胞计数板，显微镜下对孢子计数，定量孢子液浓度，并用生理盐水适当稀释至浓度2×104个/ml（添加1%链霉素）。
3）制备促生固体培养基：用促生菌株CxBeF11液体培养的菌滤液A，按体积百分比分别为5 %、10 %、20 %、40 %添加到灭菌并冷却至50℃～60℃的M1固体培养基中，混合均匀，倒平板制成 4种浓度的M1促生固体培养基，每个浓度设置3个重复，以未添加A液的M1固体培养基为对照(CK)；移液枪吸取孢子悬浮液0.1ml，加入促生固体培养基表面，用涂布棒轻柔均匀地涂于培养基表面，23℃暗培养。
4）15 d后统计孢子萌发数，比较萌发率。
5）对萌发的孢子镜检观察，将确认的孢子萌发菌落转接入相同培养基的平皿中，23℃暗培养每5d观察菌丝生长情况，通过十字法测量菌落直径，连续测量5次获得孢子菌丝的日均长速（mm/d）。
计算公式：
孢子菌丝的日均长速（mm/d）=菌落直径(mm)÷2 /菌丝生长天数(d) （3）
结果：促生菌CxBeF11菌滤液的添加影响了楚雄牛肝菌孢子的萌发与生长，菌滤液A不同体积百分比的处理水平，牛肝菌孢子的萌发率和孢子菌丝长速差异显著。
表3 CxBeF11菌液对楚雄牛肝菌孢子生长的影响
表3结果显示，菌滤液对孢子萌发率与菌丝长速的影响趋势一致，随着浓度的增加，促生作用有显著的上升趋势，在添加比例40%的高浓度水平下孢子萌发率达52.74，比对照增加88.49%，但菌丝长速增长趋势较缓慢，菌滤液添加比例10%~40%浓度水平下，长速均较为接近。结果表明：CxBeF11菌株能够促进牛肝菌孢子萌发与生长，表现为其菌滤液添加到M1固体培养基上，菌滤液最适添加比例为40%时，牛肝菌孢子萌发率和孢子菌丝长速表现最佳。
图4显示促生菌株CxBeF11菌滤液培养牛肝菌孢子的萌发情况，对照与添加40%菌滤液A，影响牛肝菌孢子的萌发和生长，呈显著差异。
综上，本发明以原位筛选的方法，从分离自野生牛肝菌菌塘土壤的优势微生物中筛选到楚雄牛肝菌促生菌CxBeF11菌株，结合形态学与基因组ITS测序，鉴定为长孢被孢霉（Mortierella elongata）。本发明在实验室开展促生菌CxBeF11对牛肝菌共培养的应用，结果表明，CxBeF11菌株在楚雄牛肝菌菌丝平板上表现了其活体菌落促进牛肝菌菌丝生长的作用；CxBeF11菌株在楚雄牛肝菌发酵培养上表现其菌滤液1:25体积比的添加量，可以有效促进牛肝菌菌丝的液体培养；CxBeF11菌株在楚雄牛肝菌孢子培养上表现其菌滤液在最适添加比例为40%时，牛肝菌孢子萌发率和孢子菌丝长速表现最佳。本发明提供的楚雄牛肝菌促生菌及其促生特点，可以应用于牛肝菌的人工培养，为人工菌塘促繁技术、微生态控制技术找到新途径，为牛肝菌保育促繁的人工干预奠定基础；同时丰富了功能微生物资源，为农林作物的微生态构建积累了菌种资源与应用技术。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种楚雄牛肝菌促生微生物CxBeF11菌株，其特征在于，所述菌株的保藏名称为：Mortierella elongata CxBeF11；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日，保藏编号为：GDMCC No:64277，分类学名称：Mortierella elongata。
2.一种产品在促进楚雄牛肝菌的菌丝生长、孢子萌发或孢子生长中的应用，其特征在于，所述产品含权利要求1所述的CxBeF11菌株的培养液，所述CxBeF11菌株的培养液的制备方法为：将所述CxBeF11菌株接种至YPD液体培养基中培养获得的菌液经无菌过滤后获得的滤液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，培养条件为：温度28℃、转速150r/min，摇瓶培养48h。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述楚雄牛肝菌为楚雄地区生长的白牛肝菌或黄牛肝菌。
5.一种楚雄牛肝菌促生液体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：CxBeF11菌株培养液制备，所述CxBeF11菌株的保藏编号为GDMCC No:64277；将CxBeF11菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20～0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得CxBeF11菌株培养液；
S2:牛肝菌发酵液制备，将牛肝菌菌种分别接入M1液体培养基中，培养获得菌种浓度为0.5g/L的牛肝菌发酵液；
S3：按照体积比1:5～50将CxBeF11菌株培养液加入牛肝菌发酵液中，继续牛肝菌液体发酵培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3中，按照体积比1:25将CxBeF11菌株培养液加入牛肝菌发酵液中，继续牛肝菌液体发酵培养。
7.一种楚雄牛肝菌孢子促生培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）促生固体培养基的制备；将CxBeF11菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20~0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得CxBeF11菌株培养液；CxBeF11菌株培养液按体积百分比5~50%添加至M1固体培养基中，配制成M1促生固体培养基，所述CxBeF11菌株的保藏编号为GDMCC No:64277；
（2）制备牛肝菌孢子悬浮液；将悬浮液涂布于M1促生固体培养基上，进行牛肝菌孢子萌发或孢子菌丝培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，CxBeF11菌株培养液按体积百分比40%添加至M1固体培养基中，配制成M1促生固体培养基。
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