CN107828690B - 能用于石漠地区的植物解磷固氮促生菌及其菌剂与其应用 - Google Patents

能用于石漠地区的植物解磷固氮促生菌及其菌剂与其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解磷固氮菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌PMN1501，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2016313，保藏日期为2016年6月7日。所述的解磷固氮菌在土壤中对作物提供氮素和磷素的应用，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。所述的微生物固氮菌在石漠地区作为解磷固氮促生菌剂的应用。本发明不但能缓解农作物在缺氮、缺磷胁迫下的生长受抑，而且对农作物幼苗生长有明显促进作用，使两种牧草的各项生长指标如株高、根长、单叶面积、单株叶片数、根体积、植株体积、地上鲜干重、地下鲜干重、植株鲜干重、根冠比(R/T)和干鲜重比(D/F)均显著提高。

Description

能用于石漠地区的植物解磷固氮促生菌及其菌剂与其应用
技术领域
本发明涉及一种能用于石漠地区的植物解磷固氮促生菌及其菌剂与其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
氮和磷作为植物必需的矿质元素，是植物活细胞内蛋白质、核酸、磷脂、酶、植物激素等多种结构和功能物质的重要组成成分，在植物能量代谢、有机物合成与代谢、物质运转、基因表达与调控及细胞信号转导等过程中起重要作用。氮素和磷素的缺乏、将使植物的生长发育受抑，引起一些缺素症，甚至于不能完成其生活史。长期大量施用化肥不但提高了农业生产成本，而且造成了土壤中某些元素的选择性积累和土壤理化性质的恶化，对环境造成污染。如何以微生物肥料替代或部分替代化肥是众多研究者共同关注的问题。我国微生物肥料的研究自1950年对根瘤菌进行研究开始，现已经鉴定和筛选出了大量具有优良固氮和溶磷性能的根瘤菌、联合固氮菌和溶磷菌。根瘤菌共生固氮效率虽比联合固氮高，但具有高度的宿主专一性，限制了其在非宿主豆科牧草和非豆科牧草中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用范围广，重点应用于石漠退化土壤环境的微生物解磷固氮菌及其应用与其菌剂，可以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案：
解磷固氮菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌PMN1501(Acinetobactercalcoaceticus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016313，保藏日期为2016年6月7日，保藏地址：中国武汉。
所述的解磷固氮菌在土壤中对作物提供氮素和磷素的应用，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。
所述的微生物固氮菌在石漠地区作为解磷固氮促生菌剂的应用。
该方法将解磷固氮菌按如下方法制备成菌剂用于给作物提供氮素和磷素：将4℃下保存的乙酸钙不动杆菌PMN1501活化2h后接一环于YEM液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。
所用的YEM液体培养基由下述质量份的原料混合而成0.5份3水磷酸氢二钾，0.2份7水合硫酸镁 、0.1份氯化钠、10份甘露醇 、1份酵母粉 、1000份蒸馏水，调节pH 值为7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成。
与现有技术比较，通过实验，申请人得出乙酸钙不动杆菌PMN1501(Acinetobactercalcoaceticus)不但能缓解农作物在缺氮、缺磷胁迫下的生长受抑，而且对农作物幼苗生长有明显促进作用，使两种牧草的各项生长指标如株高、根长、单叶面积、单株叶片数、根体积、植株体积、地上鲜干重、地下鲜干重、植株鲜干重、根冠比(R/T)和干鲜重比(D/F)均显著提高。同时所述的微生物固氮菌在石漠地区作为解磷固氮促生菌剂的应用。
为验证本申请的优越性，申请人进行了实验验证，其部分实验验证过程如下：
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌株
乙酸钙不动杆菌PMN1501(Acinetobacter calcoaceticus)由实验室石漠条件下金银花内生固氮菌分布特性研究课题组提供。筛选自金银花茎下端，经研磨、离心并用PKO溶无机磷固体培养基，蒙金娜溶有机磷固体培养基和Winogradskyi无氮固体培养基逐次筛选而得。该菌株获得途径为：于2015年9月，将从贵州省黔西县重度石漠化区域采集的野生金银花植株进行表面消毒和研磨，将根系研磨液涂布于PKO溶无机磷培养基上，待培养基上长出单菌落后，取生长最快，菌落溶磷透明圈直径最大的单菌落分离、保存并以划线分离法连续4次纯化菌种，将所得单菌落菌种培养物再分别点接到蒙金娜溶有机磷固体培养基和无N固体培养基上，选择能在蒙金娜溶有机磷固体培养基上形成具有溶磷透明圈的单菌落，并在Winogradskyi无氮培养基上长出单菌落的菌株得到菌株PMN1501。；将该菌种进行16SrRNA核酸序列测定，并在BLAST生物信息数据库上进行比对，确定PMN1501菌株分类命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus）。该菌株在PKO培养基和蒙金娜溶有机磷固体培养基上形成伴有明显的溶磷透明圈的白色圆形菌落，在Winogradskyi无氮培养基上2d内形成圆形无色半透明菌落并分泌大量多糖，具有固氮和溶无机磷能力，可以葡萄糖、甘露醇等糖类为唯一碳源。
所用培养基如下：
(1) Winogradskyi无氮培养基 (g•L-1)：磷酸氢二钾（3水合）50g、母液5mL•L-1 、氯化钠25g 、甘露醇10g 、琼脂15g 、蒸馏水1L，pH7±0.5，121℃湿热灭菌26min制成固体平板。（母液的制备：磷酸二氢钾50 g 、2水合钼酸钠1 g 、7水硫酸镁25 g 、4水硫酸锰1 g 、氯化钠25 g 、7水硫酸铁1 g）
(2) (PKO)固体培养基(g•L-1)：葡萄糖10 g 、磷酸钙5 g（过筛后灭菌与培养基混合）、硫酸铵0.5 g 、氯化钠0.2 g 、氯化钾0.2 g 、7水硫酸镁0.3 g 、硫酸锰0.03 g、硫酸亚铁0.003 g 、酵母粉0.5 g 、琼脂粉18 g 、蒸馏水1L，调节pH值为7.0±0.2，121℃湿热灭菌26min制成平板培养基。
(3)蒙金娜溶有机磷固体培养基(g•L-1)：葡萄糖10g 、卵磷脂0.2g 、硫酸铵0.5g 、氯化钠0.3g 、氯化钾0.3g 、碳酸钙5g 、4水硫酸锰0.03g 、7水硫酸亚铁0.03g 、酵母膏0.4g 、琼脂粉20g 、蒸馏水1L，pH 7.0±0.2，121℃湿热灭菌26min制成平板培养基。
1.1.2植物材料
甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa cv. Gannong No.5)和燕麦Calibre(Avena. Sativa. Calibre)种子由草业生态系统教育部重点实验室提供，种子用70%乙醇溶液浸泡5min，以消除种带根瘤菌和固氮菌对实验结果的影响，经无菌去离子水冲洗5-8遍后播种。
1.1.3菌悬液制备
将4℃下保存的乙酸钙不动杆菌PMN1501活化2h后接一环于YEM液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。
1.1.4营养液制备
Hoagland's完全营养液，构成元素：Ca(NO3)2·4H2O 1417mg/L；KNO3 607mg/L；MgSO4 493mg/L；(NH4)3PO4 115mg/L；微量元素：H3BO3 2.86 mg/L；MnCl2·4H2O 1.81 mg/L；ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L；CuSO4·5H2O 0.08 mg/L；H2MoO4·H2O 0.02 mg/L; FeSO4 50 mg/L。营养液以去离子水稀释至1/4浓度后用NaOH(1mol/L)或HCl(1mol/L)调节pH值为7.0±0.1。
Hoagland's无氮无磷营养液将Hoagland's完全营养液配方中的KNO3 607mg/L改为KCl 582 mg/L，并去除(NH4)3PO4后配制而成，调节pH值至7.0±0.1。
1.2试验设计
试验于2015年3月于贵州师范学院温室大棚内进行，栽培基质使用过1.5mm筛的石漠化生境中的退化土壤。在直径7cm、容积400ml的塑料培养杯中装入280g干燥石漠土壤，用镊子挑选25粒大小一致的甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre的饱满种子均匀摆放于土面，覆土20g；在栽培用土壤添加20g/kg的磷酸钙并混合，以1/4 Hoagland's无氮无磷营养液浇灌。
本发明为甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre分别浇灌用乙酸钙不动杆菌PMN1501制备的菌悬液（PMN1501）20ml；对不接菌液处理，仅以1/4 Hoagland's无氮无磷营养液浇灌的处理作为缺素对照CK1，以1/4Hoagland's完全营养液浇灌的处理作为完全营养对照CK2。每处理3次重复，处理过程中以称量法测定各盆栽水分含量，并以无菌水补充水分至栽培土壤最大持水量的70%。
1.3测定指标和方法
1.3.1活苗率
将各处理盆栽洗出苗后统计活苗数，计算活苗率。
1.3.2株高和主根长
各处理盆栽中随即选取4株幼苗测定株高和主根长度。将洗净植株平铺于在玻璃平板上，用直尺测出苗的自然高度，后再用镊子将植株根系拉直，测定主根长度。
1.3.3单株叶片数和单叶面积
各处理随机选取4株植株，记录其叶片数；单叶面积采用叶面扫描法。从待测植株上随机选取4枚叶片，与3片1cm2的方形黑纸片一同置于施乐CM115W扫描复印一体机上进行扫描，将扫描图片以photoshop10.0打开，分别选取叶片图像和方形黑纸片的轮廓，在直方图中查看所选图形区域的像素点数量，参照下列公式计算出单叶面积：
叶面积S1 = [W1(叶形像素点数量) / W2(1cm2黑色纸片形像素点数量) ]×1cm2
1.3.4植株单株体积与单株根体积
将所选苗清洗后在滤纸上吸干表面明水，以排水法测定植株体积。在量筒内装入10ml蒸馏水，在室温下将植株完全浸入量筒内，量筒内液面上升的值即为植株体积，单位cm3。测完体积的植株从量筒中取出，将根剪下，用滤纸将根系上的水吸干，用同样的方法测量根体积。
1.3.5植株单株、地上、地下鲜重和干重
将洗出的所选苗用滤纸将水吸干，在精度为1×10-5g的电子天平上分别称出植株单株鲜重、地上鲜重、地下鲜重。测完鲜重后的植株用纸袋包装，置于烘箱中，在80℃下48h烘至恒重，用电子天平称出植株单株干重、地上干重、地下干重。
菌剂制备方法：将4℃下保存的乙酸钙不动杆菌PMN1501活化2h后接一环于YEM液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。
1.4数据分析
以EXCL2007和SPSS16.0专业统计分析软件进行数据的整理及分析。
2结果与分析
2.1 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗存活率的影响
处理50d后，对植株幼苗存活率测定结果显示(表1)，甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗存活率由高到低均为：PMN1501＞CK2＞CK1。PMN1501使两种牧草活苗率比CK1提高27%-44%。
表1 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗存活率的影响
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2.2 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗株高的影响
如图1所示，甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗株高由高到低均为：PMN1501＞CK2＞CK1。甘农5号紫花苜蓿接种菌液与不接种菌液的3个处理之间，株高无显著差异。 PMN1501使燕麦Calibre株高比CK1和CK2分别提高17.35%和10.63%。，得出本发明对燕麦株高生长有明显促进作用。
2.3 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗根长的影响
如图2所示，根长是衡量植物根系生长发育状况的主要指标，根系增长可以使植物获得更多的水分和矿质营养，提高光合作用效率，最终提高产量。甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗根长由高到低均为： PMN1501＞CK2＞CK1。PMN1501使甘农5号紫花苜蓿根长比CK1提高121.29%(P＜0.05)，比CK2提高10.13%；使燕麦Calibre根长比CK1提高26.66%，比CK2提高9.86%。
2.4 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗植株体积的影响
甘农5号紫花苜蓿和Calibre燕麦各处理幼苗植株体积和根体积由高到低均为：PMN1501＞CK2＞CK1。甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre的 PMN1501使紫花苜蓿和燕麦植株体积比CK1分别提高165.21%(P＜0.01)和60.14%(P＜0.05)。
2.5 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗植株鲜干重的影响
牧草各部分的生物量是衡量其生产性能高低的重要指标。本试验通过测定植株鲜重和植株干重，来比较PMN1501、CK2和CK1之间紫花苜蓿、燕麦生物量的差异。甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗的这2个指标测定结果由高到低均为：PMN1501＞CK2＞CK1。
对于甘农5号紫花苜蓿，PMN1501使其地上干重比CK2提高41.65%(P＜0.05)。
通过上述试验结果，可以得出，作物的生长指标PMN1501菌液处理均高于或显著高于(P＜0.05)或极显著高于(P＜0.01)对照CK1和CK2。菌液处理的幼苗生长优于CK1，表明PMN1501能够为紫花苜蓿和燕麦的生长提供一定量的氮素和磷素，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。PMN1501除了可以为植物生长提供氮和磷外，还通过其它机制来促进紫花苜蓿和燕麦幼苗生长。对植物根际促生菌(PGPR)的研究认为，根瘤菌、联合固氮菌和溶磷菌除固氮和溶磷作用外，还能产生植物激素(如IAA、GA、CTK、ABA和乙烯等)、维生素、核酸和水杨酸(SA)等多种生理活性物质来调节植物生长，同时通过抑病作用和提高植物抗逆性来间接促进植物生长。
PMN1501使紫花苜蓿和燕麦的根系增长，根体积增加，根冠比提高，促进了植物苗期良好根系的建成，增强了植物对营养物质和水的吸收能力，提高了植物生长潜势，使作物在成熟期获得高产成为可能。此外，PMN1501还使紫花苜蓿和燕麦的干鲜重比增加，即植物体内水分占牧草总重的百分比下降，积累了更多干物质，使牧草生产性能提高。且 PMN1501对甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre地下部分的促生作用优于地上部分。
附图说明
图1 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗株高的影响。
图2 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗根长的影响。
图3 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗植株体积的影响。
图4 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗单株干重的影响。
图5 PMN1501对紫花苜蓿和燕麦幼苗单株湿重的影响。
本申请保藏的微生物其分类命名为其分类命名为乙酸钙不动杆菌PMN1501（(Acinetobacter calcoaceticus)），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016313，保藏日期为2016年6月7日，保藏地址：中国武汉。
具体实施方式
实施例1解磷固氮菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌PMN1501（(Acinetobactercalcoaceticus)），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016313，保藏日期为2016年6月7日，保藏地址：中国武汉。
所述的解磷固氮菌在土壤中对作物提供氮素和磷素的应用，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。
所述的微生物固氮菌在石漠地区作为解磷固氮促生菌剂的应用。
该方法将解磷固氮菌按如下方法制备成菌剂用于给作物提供氮素和磷素：将4℃下保存的乙酸钙不动杆菌PMN1501活化2h后接一环于YEM液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。所用的YEM液体培养基由下述质量份的原料混合而成0.5份3水磷酸氢二钾，0.2份7水合硫酸镁 、0.1份氯化钠、10份甘露醇 、1份酵母粉 、1000份蒸馏水，调节pH 值为7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成。

Claims (1)

1.一种解磷固氮菌在石漠地区作为紫花苜蓿和燕麦解磷固氮促生菌剂的应用，其将解磷固氮菌按如下方法制备成菌剂用于给紫花苜蓿和燕麦提供氮素和磷素：将4℃下保存的乙酸钙不动杆菌PMN1501活化2h后接一环于YEM液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液；所用的YEM液体培养基由下述质量份的原料混合而成：0.5份3水磷酸氢二钾、0.2份7水合硫酸镁、0.1份氯化钠、10份甘露醇、1份酵母粉、1000份蒸馏水，调节pH 值为7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成；解磷固氮菌的分类命名为乙酸钙不动杆菌PMN1501，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016313，保藏日期为2016年6月7日。
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