CN114214245B - 一株蜡样芽孢杆菌ss1、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一株蜡样芽孢杆菌SS1、微生物菌剂及其应用，蜡样芽孢杆菌，其被命名为蜡样芽孢杆菌SS1(Bacillus cereus SS1)，该菌于2021年9月29日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.23509。所述微生物菌剂的活性成分包括上述蜡样芽孢杆菌SS1。该菌株具有优异的耐盐碱性能和抗旱性能，能够显著缓解干旱胁迫对植物造成的危害，能在胁迫下显著提高植物的耐盐耐旱促生能力，减缓胁迫条件下对植株造成的危害，从而促进其生长，作为微生物菌剂具有很高的应用价值。

Description

一株蜡样芽孢杆菌SS1、微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株蜡样芽孢杆菌SS1、微生物菌剂及其应用。
背景技术
随着全球环境的不断恶化，生态系统严重破坏，全球干旱、盐碱、水涝等自然灾害也在大面积不断发生，使农业生产的可持续发展受到威胁。造成农作物大量减产等问题日益严重，因此如何有效提高作物抗逆能力和增加农作物产量已成为当前农业可持续发展工作的重要组成部分。由于水分短缺造成的干旱，严重影响植物的生长发育、造成作物减产，并且日益恶化生态环境。提高作物的抗旱能力及增加旱地农作物的产量成为现代植物育种工作急需解决的关键问题。
在我国的干旱、半干旱农业地区，尽管有大片肥沃的土地，但是由于水资源短缺造成的干旱往往成了其农业生产的主要限制因素。当土壤水分亏缺时，植物根系无法从土壤环境中吸收充足的水分以供树体生长发育，造成树体各组织失水以致树体萎蔫，最终死亡。在此基础上，增强植物的抗旱性是未来农业发展的新方向。利用根际有益菌群来促进植物生长、诱导植物对非生物胁迫的耐受性，有助于提高作物在逆境条件下的生长，在解决作物生长过程中遇到的非生物胁迫方面具有十分重要的意义。种子萌发是植物能够成苗的前提，萌发期是植物整个生活史中最重要、最脆弱的阶段，也是进行抗逆性研究的重要时期。
大量研究表明，PGPR(是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益的细菌)可以通过诱导植物对生物及非生物胁迫的系统抗性来促进植物生长。PGPR不仅可以协助作物高效利用养分资源，促进产量的形成，提高其抗逆性。目前，对具有解磷固氮作用的PGPR的研究较多，但是现有技术对于提高干旱条件下作物的抗旱性的研究较少，而具有提高作物的抗旱能力的植物促生菌更是鲜有报道，与此同时能够应用于干旱条件下的植物促生菌更少之又少。
因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株耐旱促生菌蜡样芽孢杆菌SS1、含有该菌的微生物菌剂及其应用，该菌具有提高植物在盐胁迫或干旱胁迫条件下的抗逆能力等，还具有解磷固氮、促进植物生长的作用，作为微生物菌剂具有很高的应用价值。
为解决上述问题，本发明提供以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一株蜡样芽孢杆菌，其被命名为蜡样芽孢杆菌SS1(Bacillus cereus SS1)，其保藏号为CGMCC No.23509。该菌株于2021年9月29日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(即CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该菌株是从东营市盐碱地土壤采集土样中分离出来的耐盐菌株，对该菌株进行形态学鉴定以及分子生物学和生理生化特征进行测定，确定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，并对其进行不同pH、不同盐度、以及不同PEG6000分析、对盐胁迫条件下及干旱胁迫条件下玉米种子萌发实验，结果表明，该菌株耐盐度为100-900mM，对于干旱胁迫条件，在PEG6000模拟干旱条件下，能够显著缓解干旱胁迫造成的危害。
同时该菌还可产生生长素以及具有固氮、解有机磷、无机磷以及解钾等多种促生特性，利用蜡样芽孢杆菌SS1制备的菌液能在胁迫下显著提高玉米的耐盐耐旱促生能力，减缓胁迫条件下对玉米植株造成的危害，从而促进玉米的生长。
第二方面，本发明提供一种微生物菌剂，其活性成分包括上述的蜡样芽孢杆菌SS1。该微生物菌剂的活性成分采用蜡样芽孢杆菌SS1的菌体、菌液或发酵液。
优选地，所述微生物菌剂的活性成分还包括一株氧化微杆菌41C8，其保藏号为CGMCC No.21585。
菌株41C8是申请人前期筛选的菌株，经鉴定为氧化微杆菌，该菌株已与在申请号为CN202110289660.6的专利中被公开，该专利文档中涉及该菌株的内容被纳入到本申请中；菌株41C8于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.21585。
优选地，微生物菌剂的剂型为水剂、粉剂或颗粒剂。例如，所述微生物菌剂可以直接采用蜡样芽孢杆菌SS1/和氧化微杆菌41C8的菌液；或者也可以采用便于储存的微生物颗粒。
第三方面，本发明还提供一种上述蜡样芽孢杆菌或上述微生物菌剂在促进植物生长、解磷固氮作用中的应用。
第四方面，本发明还提供一种上述蜡样芽孢杆菌或上述微生物菌剂在提高植物在盐胁迫或干旱胁迫条件下的抗逆能力中的应用。
通过大量实验证明，菌株SS1和菌株41C8单独施用或混合施用都可增加玉米的发芽指标。上述两种促生菌均能促进玉米种子萌发，并且混合施用比单独施用效果更好，且在盐胁迫条件和干旱胁迫条件下比在正常条件下对玉米种子的萌发效果更好。
而干旱胁迫条件下，混合施用两种菌液的发芽率提高了31.90％，发芽势增加了35.27％，发芽指数提高了87.50％，活力指数增加了35.93％，效果明显高于单个菌株使用的效果。
第五方面，本发明还提供一种上述蜡样芽孢杆菌或上述微生物菌剂在促进植物在酸性条件下生长的应用。
实验证明，单独施加菌株SS1或菌株41C8可显著提高烟草幼苗的生长情况，对烟草幼苗的促生效果较明显，并且在酸性条件下，其促生效果更显著。而包括由两种菌株的微生物菌剂在酸性条件下对烟草幼苗的促生作用显著高于单个菌株的施加效果，如混合施用在酸性条件下，混合施用组的叶片数提高了45.4％、叶面积提高了118％，植物干重提高了42.8％。并且，接菌处理之后土壤中的酶活性显著提高，对植物的抗逆促生效果也就明显的加强。
前述提及的可应用的植物包括玉米、烟草、番茄、辣椒等，后续具体实施例中以玉米和烟草的实验为主。
本发明具有以下有益效果：
1、首次从东营土壤中筛选到一株具有优异耐旱性能的促生菌蜡样芽孢杆菌SS1，并对该菌株进行鉴定后确定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌株具有优异的综合抗逆性能，其最高耐盐度达到900mM，能够显著缓解干旱胁迫造成的危害；同时还可产生生长素以及具有固氮、解有机磷、无机磷以及解钾等多种促生特性。
所述蜡样芽孢杆菌SS1可用于制备生物菌剂，用于在胁迫下显著提高玉米的耐盐耐旱促生能力，减缓胁迫条件下对玉米植株造成的危害，从而促进玉米的生长。
2、本发明还提供一种包括两种促生菌(蜡样芽孢杆菌SS1和菌株41C8)复配的复合菌剂，这两种促生菌相互协同作用，使复合菌剂相对于单株促生菌对植物具有更高的抗逆、促生长效果，在农业产业应用中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1的菌落形态图；
图2为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1的耐盐性分析；A-F分别采用的NaCl的浓度依次分别为100mM、300mM、600mM、900mM、1200mM和1500mM；
图3为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1的功能定性鉴定图；图中a-d分别依次为有机磷、无机磷、矿物钾和固氮溶解能力测定；
图4为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1以及氧化微杆菌41C8产生生长素的结果图；
图5为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1的16S rDNA基因序列扩增示意图；
图6为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1的基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树；
图7为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1的gyrB基因序列扩增示意图；
图8为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1的gyrB基于基因序列构建的系统发育树；
图9为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1与氧化微杆菌41C8拮抗性实验；
图10为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8在盐胁迫条件下对玉米种子萌发的影响；图10A为蜡样芽孢杆菌SS1对其在盐胁迫条件下种子萌发的影响；图10B为氧化微杆菌41C8对其在盐胁迫条件下种子萌发的影响；图10C为混合菌株SS1和41C8对其在盐胁迫条件下种子萌发的影响；
图11为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8在干旱胁迫条件下对玉米种子萌发的影响；图11A为蜡样芽孢杆菌SS1对其在干旱胁迫条件下种子萌发的影响；图11B为氧化微杆菌41C8对其在干旱胁迫条件下种子萌发的影响；图11C为混合菌株SS1和41C8对其在干旱胁迫条件下种子萌发的影响；
图12为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1对酸性条件下烟草幼苗的影响；图12A为蜡样芽孢杆菌SS1对其在酸性胁迫条件下烟草幼苗的影响；图12B为氧化微杆菌41C8对其在酸性胁迫条件下烟草幼苗的影响；图12C为混合菌株SS1和41C8对其在酸性胁迫条件下烟草幼苗的影响；
图13为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下烟草幼苗的SOD酶活性指标的影响；
图14为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下烟草幼苗的POD酶活性指标的影响；
图15为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下烟草幼苗的CAT酶活性指标的影响；
图16为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下烟草幼苗的MDA含量的影响；
图17为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下烟草幼苗的脯氨酸含量的影响；
图18为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下烟草幼苗土壤pH变化影响；
图19为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下土壤脲酶活性指标的影响；
图20为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下土壤过氧化氢酶活性指标的影响；
图21为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下土壤蔗糖酶活性指标的影响；
图22为本发明提供的蜡样芽孢杆菌SS1及氧化微杆菌41C8对酸性胁迫下土壤酸性磷酸酶活性指标的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1菌株SS1的分离筛选
从东营市盐碱地土壤采集土样，土壤装入准备好的干净无菌保鲜袋中，低温带回实验室进行菌种分离。放入装有100mL含玻璃珠的无菌水的三角瓶中，在摇床中振荡20分钟，静置1-2分钟后，形成悬液，然后用无菌水进行梯度稀释，稀释后吸取100微涂布于LB固体培养基中，28℃恒温培养箱培养24小时后，挑取菌落接种于LB液体培养基进行摇瓶培养，之后进行多次的分离纯化，最后将菌株通过平板划线保存于固体LB培养基平板上，待用。挑取菌落分别置于装有浓度为100mM、300mM、600mM、900mM、1200mM、1500mM、不同的NaCl浓度的液体LB培养基三角瓶中进行摇瓶培养，于28℃140r/min培养24-36小时，观察不同盐浓度下菌株的生产情况，并对筛选出的生长良好的菌株进行多次平板划线分离纯化，得到五株单一菌落的耐盐菌株，将其中一株菌命名为菌株SS1。
实施例2菌株SS1的鉴定
1.形态学鉴定
如图1所示，菌株SS1菌体细胞杆状，成短或长链，直径为2-3mm，菌落较大，呈白色，表面光滑，扁平不规则，不透明，革兰氏染色结果显示菌株SS1为革兰氏阳性菌。
2.生理生化鉴定
参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰式细菌鉴定手册》通过对耐盐促生菌菌株进行生理生化特征进行鉴定，鉴定结果如表1所示：
表1菌SS1的生理生化鉴定
Figure BDA0003436167310000061
注：“+”为阳性，“—”为阴性。
由结果可知：该菌株SS1可使淀粉水解，可利用葡萄糖，伏-普实验反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶阳性，符合蜡样芽孢杆菌的特征。
3.分子生物学鉴定
(1)16S rDNA的分子鉴定：
将菌株SS1活化提取DNA并作为模板，16S rDNA通用上游引物为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列表中的序列3)，下游引物为1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(序列表中的序列4)，对16SrDNA核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段送公司进行测序。16S rDNA的PCR体系反应条件见表2。
表2 16S rDNA PCR体系反应条件
组分 使用量(μL)/管
细菌组DNA 2
引物27f(10μmol/L) 1
引物1492r(10μmol/L) 1
Taq DNA聚合酶 0.25
dNTP(2.0mmol/L) 2
10×PCR buffer 2.5
ddH2O 16.25
总体积 25
(2)gyrB基因的分子鉴定：
提取菌株SS1的DNA并作为扩增模板，并以gyrB通用上游引物gyrB UP1(见序列表中序列5)和下游引物gyrB UP2(见序列表中序列6)对gyrB核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段送公司进行测序。
表3gyrB PCR体系反应条件
Figure BDA0003436167310000071
Figure BDA0003436167310000081
(3)实验结果及分析
菌株SS1的16S rDNA和gyrB的测序结果分别见序列表中序列1和序列2，将该测序结果分别输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对。结果显示：该菌株SS1的16SrDNA和gyrB核苷酸序列与GenBank基因库中不动杆菌属中的Bacillus cereus的同源度最高，初步鉴定菌株SS1为蜡样芽孢杆菌。
通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16SrDNA序列进行遗传进化分析，得到如图6和图8的系统发育树。该结果显示，菌株SS1的16S rDNA与Bacillus cereus的同源性高达99.8％，因此可以初步判定该菌株SS1为芽孢杆菌属的一株蜡样芽孢杆菌。
综上所述，通过形态、分子生物学鉴定和生理生化特征可知，该菌株为蜡样芽孢杆菌，命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)SS1。
实施例3菌株SS1的功能定性鉴定
1、实验方法：
先将菌株SS1进行摇瓶培养，活化扩繁，同时分别配制有机磷培养基、无机磷培养基、解钾培养基及阿须贝固氮培养基，用于后续鉴定菌株SS1是否具有水解有机磷、水解无机磷、解钾、固氮的能力；准备好灭菌的平板，将四种培养基分别灭菌之后倒板，待凝固之后，吸取菌液1μL点到四种不同的培养基平板上，封好板放置28℃倒置培养，待平板上出现透明水解圈或者菌斑时，观察实验结果。
本实施例采用的培养基如下。
有机磷培养基：葡萄糖10g，NaCl 0.3g，MgSO4 0.3g，MnSO4 0.03g，CaCO3 5g，卵磷脂2g，琼脂18g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.3g，FeSO4 0.03g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5，121℃高压灭菌15min。
无机磷培养基：葡萄糖10g，硫酸镁0.3g，磷酸钙5g，硫酸铵0.5，硫酸锰0.03g，氯化钠0.3g，硫酸亚铁0.03g，pH 7.0-7.5，琼脂20g，蒸馏水1 000mL，121℃高压灭菌15min。
解钾培养基：葡萄糖10g，Na2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O0.2g，CaCO3 5g，钾长石粉25g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃高压灭菌15min。
阿须贝固氮培养基：甘露醇10g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO3 5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃高压灭菌15min。
解钾解磷评估标准：直径比＝透明圈直径/菌斑直径*100％；
固氮评估标准：测定菌斑直径。
2、实验结果及分析
从图3的结果可知，本实施例的菌株SS1具有水解有机磷、无机磷、难溶性钾源并固氮的能力。
菌株SS1对多种矿物质的溶解能力测定结果具体见下表4。
表4菌株SS1对矿物质的溶解能力测定
矿物质 菌斑直径(cm) 透明圈直径(cm) 溶钾/溶磷指数
有机磷 0.7 2.8 4.0
无机磷 0.5 1.1 2.2
矿物钾 0.3 1.0 3.3
固氮 0.6
实施例4菌株SS1的产生长素能力的鉴定
1、实验方法：
向含有L-色氨酸的不同盐浓度LB培养基中接种菌液，于温度28℃、转速140r/min条件下摇床培养24h，首先用分光光度法测定菌悬液OD600值，然后将菌悬液10000rpm离心10分钟，取上清液置于白色陶瓷板上，加入50μL Salkowski比色液(50mL35％Hclo4+1mL0.5mol/LFeCl3)，只在比色液中加入50μL的50mg/L的植物激素IAA作为对照，然后置于室温下避光放置30分钟，颜色变红者表示能产生IAA。采用分光光度法测定OD530的值，计算菌浓度OD600值为1时单位体积菌悬液中细菌分泌IAA的量。
标准曲线的制备：按照0 10 20 30 40 50 60 70 80μg/mL的浓度配制溶液，测其OD530的吸光度作标准曲线，根据标准曲线来计算产生IAA的量。
2、实验结果及分析
从图4的结果可知，菌株SS1和菌株41C8都具备产生长素的能力。根据上述标准溶液的测定做成标准曲线为y＝0.01x-0.0737，R2＝0.9931，接着由标准曲线计算得菌株SS1产生生长素的量为45.8ug/mL，菌株41C8产生生长素的量为38.6ug/mL。
实施例5菌株的生长pH的测定
1、实验方法：
先将菌株SS1、菌株41C8进行摇瓶培养，活化扩繁，配制一系列pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的LB液体培养基，按2％的接种量于28℃温度条件下，140r/min摇床培养24小时，每个处理三个重复，培养24小时后测定OD600nm来确定最适pH值。
表5不同pH对其OD值的影响
Figure BDA0003436167310000101
2、实验结果及分析
从表5的结果可知，菌株SS1、菌株41C8在pH2-11的都可生长，对酸碱度的要求不是很高，能适应较宽的酸碱范围。
实施例6菌株SS1的耐盐性测定
1、实验方法：菌株SS1的耐盐性测定是通过以下的两种方式进行鉴定：(1)配制不同盐浓度的LB固体培养基进行划线培养(2)将已活化的菌株SS1的菌液按照1％的接种量接种到20mL到不同盐浓度的液体培养基中。于温度28℃、转速140r/min条件下摇床培养24h后，稀释涂布测其生物量，进而来确定该菌株的耐盐性。本实验中，NaCl浓度分别为100mM、300mM、600mM、900mM、1200mM、1500mM，得到如图3A的耐盐性划线图和图3B所示的不同盐浓度下的生物量图。
2、实验结果及分析：通过图2的结果可知，耐盐促生菌菌株SS1对NaCl有较宽的适应范围，其在100～900mM的盐浓度条件下均可生长，菌株SS1的耐盐性最高可达900mM，耐盐性能优异。
实施例7菌株的耐旱性测定
1、实验方法：利用PEG6000人工模拟干旱条件，将菌株SS1、菌株41C8接种于含有不同浓度的PEG6000的营养肉汤培养基(PEG6000的浓度依次分别为0g/mL、0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.35g/mL、0.4g/mL、0.45g/mL、0.5g/mL、0.55g/mL和0.6g/mL)中，配制100mL的营养肉汤液体培养基，115℃、20min灭菌处理，当温度降至80—85℃时取出，在超净台中加入不同质量的PEG6000粉末，摇匀使其融化，其中每个处理设置3个重复，接菌后进行28℃、140r/min摇床培养24小时后，测其光密度值(OD600nm)。分析菌株在不同质量浓度的PEG6000中的生长情况。
表6不同PEG6000浓度对其OD值的影响
Figure BDA0003436167310000111
2、实验结果及分析：
从表6的结果可知，菌株SS1和41C8在质量浓度为0～0.45g/mL的PEG6000培养基中都能很好地生长。当质量浓度为0.5g/mL时，菌株生长受到一定的影响，当质量浓度在0.55～0.6g/mL范围内时菌株生长受到较大抑制。
实施例8平板培养下不同pH对菌株SS1解矿物钾性能的影响
1、实验方法：先将菌株SS1进行摇瓶培养，活化扩繁，分别配制不同pH的解钾固体培养基，准备好灭菌的平板，培养基灭菌之后倒板，待凝固之后，吸取菌液1μL点到平板上，封好板放置28℃倒置培养，待有透明水解圈时，观察实验结果。
表7不同pH对菌株SS1的解钾性的影响
Figure BDA0003436167310000112
Figure BDA0003436167310000121
2、实验结果及分析：表7的结果显示，在pH2-11时，菌株SS1具有较高的解钾性，因而对植物具有较好的促生能力。
实施例9平板培养下不同pH对菌株SS1解有机磷性能的影响
1、实验方法：先将菌株SS1进行摇瓶培养，活化扩繁，分别配制不同pH的解有机磷固体培养基，准备好灭菌的平板，培养基灭完之后倒板，待凝固之后，吸取菌液1μL点到平板上，封好板放置28℃倒置培养，待有透明水解圈时，观察实验结果。
表8不同pH对菌株SS1的解磷性能的影响
不同pH处理 菌落直径(d)/cm 水解圈直径(D)/cm 溶磷指数(D/d)
pH＝2 0.6 0.82 1.36
pH＝3 0.6 0.92 1.53
pH＝4 0.6 0.92 1.53
pH＝5 0.6 1.13 1.88
pH＝6 0.6 1.34 2.23
pH＝7 0.6 1.43 2.38
pH＝8 0.6 1.23 2.05
pH＝9 0.6 1.02 1.7
pH＝10 0.6 0.89 1.48
pH＝11 0.6 0.78 1.3
2、实验结果及分析：通过表8的结果显示，在pH2-11时，菌株SS1具有较高的解磷性，因而对植物的促生能力越强。
实施例10菌株SS1、菌株41C8的拮抗性研究
1、实验方法：先将菌株SS1、菌株41C8进行摇瓶培养，活化扩繁，然后配置LB固体培养基，灭菌倒板后备用。接着分别将两株菌进行划线培养，注意两株菌之间要有交叉。
2、实验结果及分析：如图9所示，两株菌在其划线交叉处无透明圈，也就是说两株菌可以混合生长，置于一起摇瓶培养彼此不会相互抑制其生长。即没有拮抗性，可以进行混合发酵。
实施例11菌株SS1、菌株41C8对酸性条件下烟草盆栽幼苗的影响
1、实验方法：将表面消毒后的烟草种子均匀播撒在混有细砂的灭菌花盆中，设置8个处理，分别为：
①对照(CK):对照以无菌液体培养基作为对照；
②菌SS1组，发酵完成后的菌悬液稀释10倍后进行拌种处理；
③菌41C8组：发酵完成后的菌悬液稀释10倍后进行拌种处理；
④SS1+41C8组：菌41C8、菌SS1发酵完成后的菌悬液稀释10倍后进行混合拌种处理；
⑤pH3.5组：调节土壤的pH至3.5后进行播种；
⑥pH3.5+SS1组：调节土壤的pH至3.5后，将菌悬液SS1稀释10倍进行拌种处理；
⑦pH3.5+41C8组：调节土壤的pH至3.5后，菌悬液41C8稀释10倍进行拌种处理；
⑧pH3.5+SS1+41C8组：调节土壤的pH至3.5后，菌悬液SS1和菌悬液41C8混合发酵后稀释10倍进行拌种处理。
出苗后每隔1周进行灌根处理或者无菌水处理，在其过程中保证土壤的pH稳定。然后测其幼苗的叶片数、叶面积、叶绿素含量、植株鲜重、植株鲜重；还测定其土壤指标土壤的pH、土壤酸性磷酸酶、土壤脲酶、土壤蔗糖酶、土壤过氧化氢酶，还测定其他生理指标：SOD、POD、CAT、MDA、PRO。
表9不同处理对烟草幼苗生长指标的影响
Figure BDA0003436167310000131
Figure BDA0003436167310000141
2、实验结果及分析：
(1)从表9和图12的结果可知，菌株SS1和菌株41C8单独施用或混合施用都可改善烟草幼苗的生长状况。在正常条件下，对叶片数而言，菌株SS1和菌株41C8的单独施用分别提高了19.5％与7.3％，而混合施用与对照相比提高了36.5％；而对叶面积而言，两种菌株的单独施用分别提高了50.9％与36.3％，而混合施用与对照相比提高了84.5％；对植株鲜重而言，与对照相比，菌株SS1和菌株41C8的单独施用分别提高了19.3％与14.8％，而混合施用提高了32.6％；对植株干重而言，单独施用分别提高了35.4％与32.2％，混合施用与对照相比提高了67.7％。
在酸性条件下，对叶片数而言，混合施用与对照相比提高了45.4％，单独施用分别提高了27.3％与21.2％；对叶面积而言，混合施用与对照相比提高了118％，单独施用分别提高了61.7％与56.0％；对植株鲜重而言，混合施用与对照相比提高了39.3％，单独施用分别提高了22.2％与19.3％；对植株干重而言，混合施用与对照相比提高了42.8％，单独施用分别提高了19.0％与14.2％。
综上所述，施加上述菌液之后可显著提高烟草幼苗的生长情况，对幼苗的促生效果较明显，并且在酸性条件下效果更显著。并且，菌株SS1和菌株41C8这两株菌株之间协同配合后对烟草幼苗的促生作用高于单株菌株的作用。
(2)接着测菌株对幼苗的生理指标的影响，当受到酸性土壤胁迫时，植物会出于自我保护而分泌大量的抗氧化物质，从而抵抗因胁迫引起的大量活性氧的积累。MDA含量、脯氨酸含量的提高等等都是因环境胁迫自身生理做出的改变。
如图13-18的结果可得，当施用菌液后，SOD、POD、CAT酶活性有了明显的下降，这说明了植株受胁迫的程度减弱，而脯氨酸含量的升高说明植株本身的抗逆性增强。测其土壤的pH以及相关酶活指标，结果显示，加菌之后可使其土壤的pH升高，由酸性土壤pH3.5升高到了5.2，增长率为48.5％，对于土壤的相关酶活性，土壤酶活性与植物生长和产量也密切相关，接菌处理之后与对照相比，土壤中的酶活性显著提高，对植物的抗逆促生效果也就明显的加强。
实施例12菌株SS1、菌株41C8对盐胁迫条件下玉米种子萌发的影响
1、实验方法：
材料为玉米杂交种‘郑单958’，发芽试验:选取籽粒饱满的玉米种子进行消毒处理，先将种子浸泡在2％次氯酸钠(NaClO)中消毒10min，用蒸馏水反复冲洗并在室温下浸种24h后置于培养皿中，每个培养皿(底部铺放2层滤纸)各放置20粒种子。设4个处理组，分别加入:(1)CK；(2)菌株活化为测其OD600等于1后稀释1000倍处理；(3)200mM的盐溶液，即1.17％的盐度；(4)稀释1000倍菌液加200mM盐溶液；将各处理的培养皿置于光照培养箱条件下的26℃恒温培养箱中，进行种子萌发，3次重复。每天定时记录种子发芽数，以胚根或胚芽冲破种皮2毫米为发芽标准，连续4d不再有种子发芽为萌发截止。
测定项目与方法
发芽试验测定:发芽率＝[第7d发芽种子数/培养皿内种子总数]×100％；
发芽势＝[第3d发芽的种子数/培养皿内种子总数]×100％；
发芽指数＝∑(每日发芽种子数/发芽天数)。
活力指数(活力指数＝GI×S，GI为发芽指数，S为规定日期内幼苗或幼根的长度或质量)。
表10不同处理对盐胁迫条件下种子萌发的影响
Figure BDA0003436167310000151
Figure BDA0003436167310000161
2、实验结果及分析
结合表10和图10的结果可知，菌株SS1和菌株41C8单独施用或混合施用都可增加玉米的发芽指标。在正常条件下，对于发芽率来说，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了30.29％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了17.20％和12.59％；对于发芽势来说，施菌处理高于CK，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了43.86％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了31.14％和26.20％；对于发芽指数来说，混合施用效果最佳，且比CK增加17.39％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了9.48％和5.76％；对于活力指数来说，混合施用效果最佳，与CK相比增加33.52％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了22.91％和12.58％。
在盐胁迫条件下，对于发芽率来说，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了50.74％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了31.55％和29.17％；对于发芽势来说，施菌处理高于CK，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了74.95％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了43.50％和36.08％；对于发芽指数来说，混合施用效果最佳，且比CK增加82.0％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了49.10％和35.3％；对于活力指数来说，混合施用效果最佳，与CK相比增加36.04％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了21.37％和15.08％。
综上，上述两种促生菌均能促进玉米种子萌发，并且混合施用比单独施用效果更好，且在盐胁迫条件下比在正常条件下对玉米种子的萌发效果更好。
实施例13菌株SS1、菌株41C8对干旱胁迫条件下玉米种子萌发的影响
1、实验方法：
材料为玉米杂交种‘郑单958’，发芽试验:选取籽粒饱满的玉米种子进行消毒处理，先将种子浸泡在2％次氯酸钠(NaClO)中消毒10min，用蒸馏水反复冲洗并在室温下浸种24h后置于培养皿中，每个培养皿(底部铺放2层滤纸)各放置20粒种子。设4个处理组，分别加入：(1)CK；(2)菌株活化为测其OD600等于1后稀释1000倍处理；(3)0.3g/ml的PEG6000溶液；(4)加有PEG6000(浓度为0.3g/ml)的稀释1000倍的菌液；将各处理的培养皿置于光照培养箱条件下的26℃恒温培养箱中，进行种子萌发，3次重复。每天定时记录种子发芽数，以胚根或胚芽冲破种皮2毫米为发芽标准，连续4d不再有种子发芽为萌发截止。结果见图11。
测定项目与方法
发芽试验测定:发芽率＝[第7d发芽种子数/培养皿内种子总数]×100％；
发芽势＝[第3d发芽的种子数/培养皿内种子总数]×100％；
发芽指数＝∑(每日发芽种子数/发芽天数)。
活力指数(活力指数＝GI×S，GI为发芽指数，S为规定日期内幼苗或幼根的长度或质量)。
表11不同处理对干旱胁迫条件下种子萌发的影响
处理 发芽率％ 发芽势％ 发芽指数 活力指数
CK 82.11±1.57d 58.23±0.98d 3.48±1.98d 201.15±0.03d
SS1 94.56±1.68b 68.45±1.32b 4.78±1.67b 248.34±0.17b
41C8 92.69±1.48c 65.45±1.89c 4.36±1.78c 240.12±0.23c
SS1+41C8 98.98±1.36a 76.22±2.03a 6.56±1.89a 267.02±0.45a
PEG6000 61.20±1.89h 45.60±1.85h 1.45±1.83h 153.34±0.56h
SS1+PEG6000 74.99±1.72f 55.89±2.21f 2.45±1.67f 178.02±0.13f
41C8+PEG6000 72.09±1.56g 52.31±2.10g 2.06±1.53g 170.20±0.18g
SS1+41C8+PEG6000 80.78±1.34e 61.67±2.31e 2.72±1.42e 208.45±0.34e
2、实验结果及分析
从表11的结果可知，菌株SS1和菌株41C8单独施用或混合施用都可增加玉米的发芽指标。在正常条件下，对于发芽率来说，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了20.52％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了15.20％和12.89％；对于发芽势来说，施菌处理高于CK，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了30.86％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了17.54％和12.20％；对于发芽指数来说，混合施用效果最佳，且比CK增加88.59％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了37.18％和25.36％；对于活力指数来说，混合施用效果最佳，与CK相比增加32.72％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了23.91％和19.48％。
在干旱胁迫条件下，对于发芽率来说，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了31.90％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了22.56％和17.79％；对于发芽势来说，施菌处理高于CK，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了35.27％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了22.56％和14.70％；对于发芽指数来说，混合施用效果最佳，且比CK增加87.50％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了68.96％和42.06％；对于活力指数来说，混合施用效果最佳，与CK相比增加35.93％，单独施用菌株SS1与菌株41C8分别提高了16.09％和10.90％。
综上所述，两种促生菌均能促进玉米种子萌发且混合施用比单独施用效果更好，且在干旱胁迫条件下比正常条件下对玉米种子的萌发促进效果更好。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株蜡样芽孢杆菌SS1、微生物菌剂及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1649
<212> DNA
<213> 16S rDNA gene of Bacillus cereus SS1(蜡样芽孢杆菌SS1的16S rDNA)
<400> 1
tccgtggggg gtgctataca tgcagtcgag cgaatggatt aagagcttgc tcttatgaag 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gataacattt tgaaccgcat ggttcgaaat tgaaaggcgg 180
cttcggctgt cacttatgga tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420
agaacaagtg ctagttgaat aagctggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggtg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccatgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 720
aactgacact gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgaagttaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctaaca ctgggaactg aagacacggt ccagactcct acgggaggcc 1020
agcagtaggg atctcgcaat tggacgaagt tctgacgagc acgccggcgt gaggtgatga 1080
aggcttcggg tcgtaaactc tgtgttaggg aagaacaagt gctagttgaa taagctggca 1140
cttgacggta cctaacccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 1200
gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggt ggtttcttaa 1260
gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag 1320
tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tatggaggaa 1380
caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg taactgacac tgaggcgcga aagcgtgggg 1440
agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 1500
agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 1560
ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 1620
ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttac 1649
<210> 2
<211> 1253
<212> DNA
<213> gyrB gene of Bacillus cereus SS1(蜡样芽孢杆菌SS1的gyrB)
<400> 2
cacgggggaa gggggggtta taaagtttct ggtggttaca tggtcgttgg ggcatcggtt 60
gtaaatgctc tatcaacaga attagaagta tttgtacatc gtgaaggtaa aatccattac 120
caaaaatacg aaagaggtat tccggttgcg gatttaaaag tcattggtga caccgatcaa 180
acaggaacaa taactcgatt taaaccagat ccggaaattt tccaagaaac aacagtatac 240
gattttgata cgctagcaac tcgtatgcgt gaattagcgt ttttaaatcg taatattaaa 300
ttaataattg aagataaacg tgaacataag caaaagaaag aattccatta cgaaggtgga 360
attaaatcat acgttgagca tttaaatcgc tcaaaacaac cgattcatga agagcctgtg 420
tacgtagaag gttcaaaaga tggtattcag gttgaggttt ctcttcaata taacgaagga 480
tacacaaata atatttactc atttacgaat aacatccata cgtatgaagg tggtacacat 540
gaggtaggtt ttaaaacagc tttaactcgt gtaatcaacg actatggtcg taaaaatagc 600
attttaaaag atgcggacag taatttaact ggtgaggatg ttcgtgaagg tttaacagca 660
attgtatcaa tcaagcatcc aaatccacaa ttcccattcc caaaaatacg aagaggtatt 720
ccggttgcgg atttaaaagt cattgggaca ccgatcaaca ggaacataac tcgatttaca 780
ccagatccgg aaatttccaa gaaacatcag tatacgattt tgatacgcta gcaactcgta 840
tgcgtgaatt agcgttttta aatcgtaata ttaaattaat aattgaagat aaacgtgaac 900
ataagcaaaa gaaagaattc cattacgaag gtggaattaa atcatacgtt gagcatttaa 960
atcgctcaaa acaaccgatt catgaagagc ctgtgtacgt agaaggttca aaagatggta 1020
ttcaggttga ggtttctctt caatataacg aaggatacac aaataatatt tactcattta 1080
cgaataacat ccatacgtat gaaggtggta cacatgaggt aggttttaaa acagctttaa 1140
ctcgtgtaat caacgactat ggtcgtaaaa atagcatttt aaaagatgcg gacagtaatt 1200
taactggtga ggatgttcgt gaaggtttaa cagcaattgt atcaatcaag cat 1253
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列27F(27F)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列1492R(1492R)
<400> 4
tacggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> gyrBUP1(gyrBUP1)
<400> 5
gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a 41
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> gyrBUP2(gyrBUP2)
<400> 6
agcagggtac gcatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44

Claims (5)

1.一株蜡样芽孢杆菌，其特征在于，被命名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）SS1，其保藏号为CGMCC No.23509。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，活性成分包括如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，活性成分还包括一株氧化微杆菌41C8，保藏号为CGMCCNo.21585。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂的剂型为水剂、粉剂或颗粒剂。
5.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌或如权利要求2-4中任一项所述的微生物菌剂在促进植物在酸性条件下生长的应用；所述植物为烟草。
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