CN103173380B

CN103173380B - 一株活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN103173380B
Application number: CN201210573809.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡燕飞; 李永涛; 孙礼勇; 黄娟; 孔德颖; 赵凤仪
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: Guangdong Runhua Environmental Protection Industry Co. Ltd.
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-12-26
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2032-12-26
Also published as: CN103173380A

Abstract

本发明公开了一株活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌及其应用。该菌株于2012年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号CGMCCNo.6127，其16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。该菌能够明显活化土壤养分，提高土壤磷和氮有效性，改善土壤微生物群落组成，提高土壤微生物群落多样性和均匀度，提高土壤微生物代谢活性等，从而提升土壤肥力，进而促进农作物生长，有利于农业的可持续发展和利用，在生产实践中具有广泛的应用前景。

Description

一株活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)NC-1及其在活化土壤养分、提高土壤肥力、改善土壤微生态结构，进而促进农作物生长方面的应用。

背景技术

在农作物生长过程中，主要的营养元素，如N、P、K等绝大部分都是通过根系从土壤中吸收，N、P、K营养供应充足与否是制约其实现潜在生产能力、发挥生态效能的主要限制因素之一。为了满足植物生存所需的N、P、K等营养元素，工业化肥一直被认为是实现这一目的的主要途径。然而，随着化肥使用量的不断增大，负面影响日益明显，如成本高、对非再生能源消耗大，污染空气、土壤及水质、危害农牧业等食品安全，破坏土壤结构及微生物区系和多样性等。

随着根际微生物的研究，人们发现植物根际存在具有生物固氮、溶磷、解钾及分泌植物激素的菌株。一般而言，根际促生细菌是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益的细菌统称，其促进植物生长的作用及机理一般可以概括为以下几个方面：(1)分泌植物促生物质；(2)改善植物根际的营养环境；(3)对作物病害的生物控制作用；(4)对污染物的降解等。

磷素是植物生长不可缺少的三大营养元素之一，对作物生长十分重要。农作物要获得高产，就必须向土壤中补充磷肥。由于土壤中含有大量的铁、铝等金属离子，施入土壤中的水溶性磷肥很快被这些离子固定，丧失其有效性，致使土壤中施入的磷肥有75%~90%都变成难溶的无效磷沉积在土壤中，导致磷肥的当季利用率仅为10%~25%。

氮肥是农业增产中效果最突出的一类肥料，对农业生产一直发挥着重要作用。在1960－1995年间，全球氮肥施用量增长了7倍，到2050年将继续增长3倍。我国拥有占全球7%的耕地面积，养育着占全球22%的人口，为满足粮食增长的需求，中国化学氮肥年消耗量约占全球的30%，成为全球氮肥施用最多的国家。在氮肥大量投入的同时，肥料效益降低的问题日益突出。据估测，我国氮肥的平均吸收率仅为30%~35%，一般比发达国家低10~15个百分点，而且氮肥过量使用造成的环境压力也越来越引起人们的关注。

为了解决土壤养分的有效性低及其过量施用的问题，目前实际可行的办法就是在土壤中施入微生物菌肥，利用其中的活化菌株将土壤中难溶态养分转化为植物可利用态。鉴于活化土壤养分微生物的种类多样，且不同菌株之间的活化能力有较大差异，高效活化养分菌的筛选工作尤为重要。目前研究的活化养分菌多为好氧菌，缺氧菌也有少量报道，而能在好氧和缺氧条件下皆具有高效提高土壤肥力和促进农作物生长功能的活化养分菌尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可以在好氧和缺氧条件下活化土壤养分的细菌，该菌能够有效提高土壤中磷和氮的有效性，提高土壤的肥力，促进农作物的生长，从而提高肥料的利用率，节约矿产资源，改善生态环境，有利于农业生产的可持续发展。

本发明的另一目的是提供上述菌株的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明通过分离筛选得到一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)NC-1，简称NC-1菌。该菌株已于2012年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6127，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明分离的蜡状芽孢杆菌NC-1的生物学特征：

该菌株筛选自广东省广州市华南农业大学农场水稻根际土壤中，为革兰氏阳性菌，在牛肉膏蛋白胨培养基上培养12h，在显微镜下观察菌体以单个排列；培养24h，菌体以单个、成对或链状排列，芽孢中生或近中生，芽孢数90%以上，芽孢形成后菌体不膨大，菌体为杆状，无荚膜，有运动性，好氧或兼性。在营养琼脂培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落。

经过序列测定，该蜡状芽孢杆菌NC-1的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

NC-1菌的培养方法，其培养基的成分为牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，或按照此比例配制成的培养基，pH值为7.0~7.2。菌株保藏按常规菌种保藏温度保藏。

上述NC-1菌可以增加土壤中磷的溶解性，尤其对于难溶性无机磷，效果显著，使土壤中有效磷含量大大提高，该NC-1菌可用于增加土壤磷有效性。

上述NC-1菌还可以用于促进农作物如玉米和/或水稻的生长。

该NC-1菌还能够增加土壤微生物活性、增加土壤微生物群落多样性和均匀度，和优化土壤微生物群落组成。

基于NC-1菌以上各方面的功能及用途，可以将其制备成生物菌剂或生物肥料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

发明人经过大量的实验研究，筛选出蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus NC-1。该菌株不仅可以活化土壤养分，提高肥料的有效性及利用率，还可以促进农作物的生长，提高土壤微生物的多样性，对节约矿产资源、改善土壤微生态环境和促进土壤可持续利用具有重要的意义。

附图说明

图1. NC-1菌革兰氏染色显微照片。

图2. NC-1菌芽孢染色显微照片，图中蓝色部分为芽孢。

图3. 不同菌株在磷酸钙培养基下产水溶性磷含量的对比图，横坐标为菌株编号，纵坐标为水溶性磷浓度。

图4. 不同菌株在磷酸钙培养基下产微生物磷含量的对比图，横坐标为菌株编号，纵坐标为微生物磷浓度。

图5. 为NC-1菌促进玉米生长盆栽效果对比图。

图6. 为NC-1菌促进水稻生长盆栽效果对比图，左边三盆为CK组，右边三盆为NC-1组。

图7. 为NC-1菌处理土壤微生物群落AWCD值变化曲线图，CK为对照组。

图8. 为NC-1菌处理土壤细菌DGGE指纹图谱，CK为对照组。

具体实施方式

实施例1蜡状芽孢杆菌NC-1的分离、纯化和鉴定

（1）分离

配制难溶无机磷培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.03g，酵母膏0.4g，磷酸钙5g，蒸馏水1L，pH值7.0~7.5。

以广东省广州市华南农业大学农场水稻田采集的土壤为筛选土样，采用平板涂布法，准确称取待测土样10.0g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中（加玻璃珠），摇床振荡30min，使微生物充分分散，静置20~30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10³~10⁵稀释度，用移液枪分别移取稀释液0.1mL，涂布在难溶无机磷培养基平板上，28℃倒置培养7d，逐日观察溶磷圈，记录溶磷菌菌落(d)和溶磷圈直径(D)。筛选出有解磷圈的细菌菌株编号为a-3、a-4、a-5、a-6、a-7、a-8和a-9菌，其中a-8的解磷效果最强，对a-8菌进行纯化。

（2）纯化

营养琼脂培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，pH值7.0~7.2。

将筛选出的a-8菌菌株利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂培养基斜面上。

实施例2 特性鉴定

（1）菌体形态特征

a-8菌为革兰氏阳性菌，有芽孢，芽孢形成后菌体不膨大。菌体为杆状，无荚膜，有运动性，需氧。革兰氏染色效果见图1，菌体被染成蓝紫色，芽孢未着色。芽孢染色效果见图2，菌体呈黄棕色，芽孢为浅蓝色。

（2）菌落形态特征

在营养琼脂培养基上形成的菌落为圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落。

（3）分子生物学特性

采用Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒（Bio-rad公司）提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物F63（CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC, SEQ ID NO:2）和R1087（CTC GTTGCG GGA CTT ACC CC, SEQ ID NO:3），常规PCR扩增细菌的16S rDNA，在1000bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明菌株的16S rDNA序列和与GenBank中蜡状芽孢杆菌具有较高的同源性，其相似度为100%。结合上述的菌落形态、16S rDNA序列分析的结果以及参照《伯杰细菌鉴定手册》进行生理生化实验，鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），命名为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus NC-1，简称NC-1菌。

实施例3 NC-1菌在难溶性无机磷培养基培养下的产水溶性磷的效果实验

三角瓶中装入50mL已灭菌的难溶无机磷培养基（磷酸钙的浓度为5.0g/L），分别加入实施例1中的分离步骤所筛选出的a-3、a-4、a-5、a-6、a-7、a-8（即NC-1菌）和a-9菌（接种量5环），制成菌液后28℃，70rpm，摇床培养7d。将培养后的菌液在10000rpm、4℃离心15min，取上清液用钼锑抗比色法测定水溶性磷含量（单位为mg/L，即表示每升样品中所含水溶性磷的毫克数），设不接任何菌的培养基为对照，每个处理重复3次。试验结果见表1和图3。结果表明：NC-1菌的水溶性磷含量最高，达到100.62mg/L。

表1 不同菌种处理的水溶性磷含量（mg/L）

编号

a-3

a-4

a-5

a-6

a-7

a-8 (NC-1)

a-9

水溶性磷

29.36±1.34e

12.81±0.51b

21.09±1.16c

5.91±0.42a

63.84±2.02f

100.61±3.70g

25.68±1.03d

注：数据为3次重复的平均值±标准差，表中同行不同字母者，表示在0.05水平差异显著（DMRT法）。

实施例4 NC-1菌在难溶性无机磷培养基培养下的产微生物磷的效果实验

将实施例3中a-3~a-9菌培养液离心后的沉淀用溶菌液处理（5mg溶菌酶加入到1mL TEN溶液中），37℃水浴1h，然后4℃，10000rpm离心15min，取上清液用钼锑抗比色法测定微生物磷含量（单位为mg/L，即表示每升样品中所含微生物磷的毫克数）。试验结果见表2和图4。结果表明：NC-1菌的微生物磷含量最高，达到56.49mg/L。

表2 不同菌种处理的微生物磷含量（mg/L）

编号

a-3

a-4

a-5

a-6

a-7

a-8(NC-1)

a-9

微生物磷

49.13±1.28e

28.92±0.76b

39.93±1.59d

31.66±1.77c

32.58±0.75c

56.49±1.92f

12.81±0.35a

实施例5 NC-1菌促玉米生长盆栽效果实验

采用NC-1菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组（第1组取3.0kg土壤加入NC-1菌发酵液30mL（发酵培养基成分同营养琼脂培养基），用NC-1表示，第2组取3.0kg土壤加入已灭活的NC-1菌发酵液3mL作为空白对照，用CK表示），每个处理组重复4次。各处理组土壤分别加入尿素326mg、磷酸钙145mg和氯化钾238mg。玉米水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，两天后露出芽播种至苗床中。当苗约25cm高，移苗至盆中，每盆2棵苗。每天浇水适量，每盆的水量要相同均匀，注意不要使水流出盆底以免肥料损失而造成误差。2011年5月11日测量玉米株高（玉米地面到玉米叶片捋直后叶尖端的高度）。2011年5月9日测量玉米叶片（包括长出的所有叶片）。结果表明（表3、图5）：加入NC-1菌能够显著促进土壤有效磷的释放及玉米的生长。与对照相比，施用NC-1菌土壤有效磷含量增加了48%。

表3不同菌株活化磷效果及对玉米的促生效果对比表

注：数据为4次重复的平均值±标准差，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著（T检验）。

实施例6 NC-1菌促水稻生长盆栽效果实验

采用NC-1菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组（方法同实施例5），每个处理组重复4次。各处理组土壤分别加入尿素326mg、磷酸钙145mg和氯化钾238mg。水稻水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，两天后露出芽播种至苗床中。当苗约25cm高，移苗至盆中，每盆2棵苗。每天浇水适量，使土层表面和水面之间的距离约3cm。在抽穗期测量水稻株高（地面到叶片捋直后叶尖端的高度），在灌浆期测量水稻有效分蘖数。结果表明（表4、图6）：加入NC-1菌能够显著促进土壤有效磷的释放及水稻的生长。与对照相比，施用NC-1菌土壤有效磷含量增加了42%。

表4 不同菌株活化磷效果及对水稻的促生效果对比表

实施例7 NC-1菌促土壤肥力的效果实验

采用实施例5中两种处理（NC-1菌和空白对照）培养后的玉米土壤进行试验，每种处理的土壤重复4次。有机质的测定采用重铬酸钾容量法—外加热法，全氮量采用半微量开氏法，碱解氮采用碱解扩散法。结果表明（表5）：加入NC-1菌显著提高了土壤中的有机质和碱解氮量，全氮量虽未显著提高，但其平均值高于对照。综上所述，NC-1菌可显著提升土壤的有机质和氮素肥力。结合实施例3、4、5和6的结果，更好地表明了NC-1菌在好氧和缺氧条件下，能显著提升土壤的肥力并促进农作物（玉米和水稻）的生长。

表5 NC-1菌株促土壤肥力效果对比表

实施例8 利用Biolog分析NC-1菌对土壤微生物群落多样性的改良效果试验

采用实施例5中两种处理，具体操作如下：称取相当于10g烘干土样的新鲜土壤加入到装有100mL灭菌生理盐水(0.85%)的250mL三角瓶中；在旋涡震荡机上震荡1min后，在冰水浴中静置1min；重复3次；静置2min，取5mL上述土壤浸提液加入45mL灭菌生理盐水(0.85%)中，混匀后，重复此步骤，将稀释1000倍后的NC-1菌液加入Biolog Eco板中，每孔加150μL，将接种的微平板在30℃培养箱培养，用未加入菌种的土壤作为空白对照，分别于0、24、48、72、96h用酶标仪读取590nm下的吸光值计算土壤微生物群落多样性的公式见表6。7）：各处理AWCD值随时间的增加而增加，且加入菌种(NC-1组)处理的土壤微生物群落多样性各项指标（土壤微生物代谢活性AWCD，土壤微生物多样性指数Shannon，土壤微生物丰富度Richness）均显著高于未加入菌种的土壤（对照组，用CK表示），达到显著性差异（P<0.05）。说明NC-1菌显著地提高了土壤微生物多样性（见图7）。

表6 计算微生物多样性指数的公式

表7 不同处理土壤微生物群落多样性指数（72h）

处理	AWCD	Shannon(H)	Richness
				CK	0.65±0.28 a	1.22±0.09 a	27.33±1.53 a
NC-1	0.86±0.10 b	1.34±0.02 b	30.67±0.58 b

注：数据为3次重复的平均值±标准差，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著（T检验）。

实施例9 利用DGGE分析NC-1菌对土壤微生物群落多样性的改良效果试验

尽管Biolog技术常被用于研究土壤微生物群落功能，但其表征的只是土壤中生长快速或富营养微生物的活性，而不能反映土壤中缓慢或不可培养微生物活性。为此，利用DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，变性梯度凝胶电泳）技术来全面解析土壤微生物群落结构。采用NC-1菌和空白对照（实施例5中的两个处理组）进行效果对比试验，每个处理4个重复。

选取试剂盒法提取土壤样品（实施例5）DNA。选取细菌通用引物F338-GC（5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’，SEQ ID NO:4）和R518（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’，SEQ ID NO:5）对16s rDNA基因V3区片段进行扩增，扩增产物片段长约230bp。对PCR扩增产物进行DGGE操作，变性剂范围为30%-60%。电泳完毕后，用SYBR green I（1：10000，体积比）染色0.5h后，于凝胶成像系统中拍照（图8）。微生物结构多样性指数的计算公式见表8。结果表明（表9）：同实施例8一致，加入菌种（NC-1组）处理的土壤微生物群落多样性各项指标（土壤微生物多样性指数Shannon-Wiener，土壤微生物丰富度Richness，土壤微生物均匀度Evenness）中，除了E值没有差异性变化，H值和S值均显著高于未加入菌种的土壤(对照组，用CK表示），达到显著性差异(P<0.05)。实施例8的Biolog数据说明NC-1菌显著地提高了土壤中可培养微生物多样性，而DGGE数据表明了土壤中全部微生物（可培养和不可培养）的多样性均得到显著性的提升，微生物群落结构发生了显著的变化，产生了新的优势微生物种群（如图8中的DNA条带1, 2和3）。

表8 计算微生物群落多样性指数的公式

表9 不同处理土壤微生物群落多样性指数（72h）

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一株活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1022

<212> DNA

<213> Bacillus cereus NC-1

<400> 1

ggcagtgcgg gtgctataat gcagtcgagc gaatggatta agagcttgct cttatgaagt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt gaaccgcatg gttcgaaatt gaaaggcggc 180

ttcggctgtc acttatggat ggacccgcgt cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa 420

gaacaagtgc tagttgaata agctggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540

cgtaaagcgc gcgcaggtgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600

agggtcattg gaaactggga gacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta 720

actgacactg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gaagttaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgagaac cttaccaggt 960

cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggcttctcct tcgggagcag agtgacagtg 1020

tt 1022

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggcctaac acatgcaagt c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcgttgcgg gacttacccc 20

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagcag 57

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

attaccgcgg ctgctgg 17

Claims

1.一株活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）NC-1，于2012年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.6127。

2.权利要求1所述活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：培养基的成分为牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，或按照此比例配制成的培养基，pH值为7.0~7.2。

3.权利要求1所述活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌在增加土壤磷有效性中的应用。

4.权利要求1所述活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌在促进玉米或水稻生长中的应用。

5.权利要求1所述活化土壤养分的蜡状芽孢杆菌在增加土壤微生物活性、增加土壤微生物群落多样性和均匀度，和优化土壤微生物群落组成中的应用。