CN104962492A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其固态菌剂的制备方法与应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌及其固态菌剂的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏登记号为CGMCCNO.10045。本发明还涉及所述解淀粉芽孢杆菌的固态菌剂及其制备方法及应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂发酵工艺简单，对环境污染小，能耗低，符合国家产业政策。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂的有效活菌数高，且对于植物促生、特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其固态菌剂的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其固态菌剂的制备方法与应用。
背景技术
近年来，过量滥用化肥农药等化学品所造成的药物残留、土壤污染等问题日益严峻。现代，随着人们保护环境意识的增强及对无公害农产品的日益重视,新技术、新产品研发不断深入,探寻高效、安全、环保微生物菌剂以替代或部分替代化肥和农药的研究日益增加。
芽孢杆菌是一类非常重要的植物根际促生菌资源，具有分泌IAA、改善根际营养状况和细菌活性等各种功能。同时，芽孢杆菌抗逆性强有利于工业化的大规模生产。它已成为国内外热点研究的植物根际促生菌。芽孢杆菌因生存能力强，能产酶类、抗菌脂肽等多种促生因子，正在成为国内外热点研究的植物根际促生菌。
现今，将有益芽孢杆菌制备成微生肥料是植物根际促生菌研究的必然发展方向。微生物肥料主要通过固体发酵和液体发酵两种工艺来制备。相比液体发酵，固体发酵有以下优点：(1)低成本，低能耗；(3)产品稳定易于运输，且具有大规模生产的开发前景。因此，制备芽孢杆菌固态菌剂，明确其在植物促生的效果，对提高作物产量与品质、发展生态农业具有重要意义。
目前，解淀粉芽孢杆菌的固态菌剂未见报道。
发明内容
本发明旨在克服现有技术中的空白，提供一种新的解淀粉芽孢杆菌及其固态菌剂。
本发明的目的第一目的是保护一株解淀粉芽孢杆菌，即解淀粉芽孢杆菌L-S60，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。该菌种已于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.10045。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌L-S60对植物生长具有促进作用。
本发明的第二目的是保护一种解淀粉芽孢杆菌固态菌剂的制备方法，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明提供的解淀粉芽孢杆菌L-S60，所述方法包括以下步骤：
(1)取解淀粉芽孢杆菌，进行活化、增殖后，获得有效活菌数为0.1～1.0×109cfu/ml的种子液；
(2)将所述种子液按15～35ml/100g与固体含水培养基混合均匀，将所得的混合物在30～40℃静置培养2～5d，干燥至混合物含水量为10％以下，粉碎过筛，即得。
所述步骤(1)中，活化、增殖所用的培养基优选为LB培养基。
所述步骤(1)优选为：取所述解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；取活化后的健壮、典型菌落，接种于5～15ml LB液体培养基中进行增殖，再接种于250～350ml LB液体培养基中进行培养，即可。
所述步骤(1)进一步优选为：取所述解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线，在30～40℃活化24～36h；取活化后的健壮、典型菌落，接种于10ml LB液体培养基中，在30～40℃培养24～36h；再接种于300ml LB液体培养基中，在30～40℃培养24～36h，即可。
具体而言，所述LB固体平板培养基可由以下方法制备而成：取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂18g、蒸馏水1L，pH7.0，121℃灭菌15min，冷却至50-60℃，无菌条件下倒平板，即可。
所述LB液体培养基可由以下方法制备而成：取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1L，pH 7.0，121℃灭菌15min，自然冷却，即可。
步骤(2)所述固体含水培养基由包括以下重量份的成分混合而成：花生饼粉25～55份，麦麸20～55份，棉粕11.5～40份，碳酸钠0.1～1.0份，葡萄糖0.1～1.0份，蛋白胨0.1～1.0份；还包括占全部固体物料重量之和30～60％的水。
所述固体含水培养基优选为由包括以下重量份的成分混合而成：花生饼粉25～53份，麦麸31.4～55份，棉粕11.5～17份，碳酸钠0.2～1.0份，葡萄糖0.2～1.0份，蛋白胨0.2～1.0份；还包括占全部固体物料重量之和30～45％的水。
所述固体含水培养基进一步优选为由包括以下重量份的成分混合而成：花生饼粉53份，麦麸35份，棉粕11.5份，碳酸钠0.5份，葡萄糖0.5份，蛋白胨0.5份；还包括占全部固体物料重量之和45％的水。
本发明在所述固体含水培养基中添加一定量的碳酸盐，可中和菌株培养过程中产生的酸性物质，确保培养基在pH值中性状态，有利于解淀粉芽孢杆菌的生长及增殖，从而获得更大量的活菌体。
所述固体含水培养基装瓶量优选1L的培养瓶瓶装200～350g，即200～350g/L；进一步优选为300g/L。若装瓶量小于200g/L，则培养过程中培养基供应不上菌株的繁殖；若大于350g/L，则培养基太满，接种后培养基透气性及散热性差，影响菌株的生长，导致活菌体含量减少。
所述固体含水培养基在与种子液混合前，在120～125℃条件下灭菌两次，每次灭菌30～45min。两次间歇灭菌可彻底的杀死固体培养基复杂的细菌及真菌，可降低发酵过程中杂菌污染率，有利于保证产品纯度。
步骤(2)所述静置培养优选为在35℃静置培养3～5天，进一步优选为在35℃静置培养3天。
本发明采用梯度挂线法对按照所述方法制备而成的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂进行活菌体计数，测得解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数可达7.0×108～3.0×1010cfu/g。
本发明的第三目的为保护所述方法制备而成的解淀粉芽孢杆菌固体菌剂。
本发明的第四目的为保护所述解淀粉芽孢杆菌固体菌剂在促进植物生长方面的应用。所述植物优选为黄瓜或番茄。具体可为黄瓜中农6号或番茄中杂9号。
所述应用具体为：在每升植物培养基质中均匀添加0.01～10g所述解淀粉芽孢杆菌固体菌剂。所述添加量优选为0.1～10g/L，进一步优选为10g/L。
本发明所采用的固体培养基原料均是采用农副产品下脚料，成本低，配方合理。解淀粉芽孢杆菌固态菌剂发酵工艺简单，不需要大型设备，对人员要求也相对较低。本发明对环境污染小，能耗低，符合国家产业政策。实验证明利用本发明方法制备的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂的有效活菌体可高达300亿cfu/g。本发明制备的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂对于植物促生具有重大价值，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。
附图说明
图1为实施例5出苗后第20天对照组和实验组植株形态示意图。
图2为实施例6出苗后第20天对照组和实验组植株形态示意图。
图3为实施例7出苗后第20天对照组和实验组植株形态示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
各实施例中，LB固体平板培养基其培养基组成及制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂18g、蒸馏水1L，pH7.0，121℃灭菌15min，冷却至50～60℃，无菌条件下倒平板，即可。
各实施例中，LB液体培养基配方及制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1L、pH 7.0，121℃灭菌15min，即可。
实施例1
取本发明所述解淀粉芽孢杆菌L-S60，按照以下步骤制备解淀粉芽孢杆菌固态菌剂：
(1)取解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线，在30℃活化24h；取活化后的健壮、典型菌落，接种于10ml LB液体培养基中，在30℃培养24h；再接种于300ml LB液体培养基中，在30℃培养24h，获得有效活菌数为3.0×108cfu/ml的种子液；
(2)将所述种子液按15ml/100g与固体含水培养基混合均匀，所述固体含水培养基由以下步骤制备而成：取花生饼粉53g、麦麸31.4g、棉粕15g、碳酸钠0.2g、葡萄糖0.2g、蛋白胨0.2g以及占全部固体物料重量之和30％的蒸馏水，搅拌均匀后，以200g/L装入培养瓶中，在121℃下间歇灭菌两次，每次灭菌30min，即得；
将种子液与固体含水培养基的混合物在30℃条件下静置培养5d，干燥至混合物含水量为8％，粉碎过筛，即得。
采用梯度挂线法对所得解淀粉芽孢杆菌固态菌剂进行活菌体计数，测得有效活菌体为2.0×109cfu/g。
实施例2
取本发明所述解淀粉芽孢杆菌L-S60，按照以下步骤制备解淀粉芽孢杆菌固态菌剂：
(1)取解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线，在30℃活化24h；取活化后的健壮、典型菌落，接种于10ml LB液体培养基中，在30℃培养24h；再接种于300ml LB液体培养基中，在30℃培养24h，获得有效活菌数为7.0×108cfu/ml的种子液；
(2)将所述种子液按20ml/100g与固体含水培养基混合均匀，所述固体含水培养基由以下步骤制备而成：取花生饼粉25g、麦麸55g、棉粕17g、碳酸钠1.0g、葡萄糖1.0g、蛋白胨1.0g以及占全部固体物料重量之和35％的蒸馏水，搅拌均匀后，以350g/L装入培养瓶中，在121℃下间歇灭菌两次，每次灭菌30min，即得；
将种子液与固体含水培养基的混合物在30℃条件下静置培养4d，干燥至混合物含水量为5％，粉碎过筛，即得。
采用梯度挂线法对所得解淀粉芽孢杆菌固态菌剂进行活菌体计数，测得有效活菌体为8.6×109cfu/g。
实施例3
取本发明所述解淀粉芽孢杆菌L-S60，按照以下步骤制备解淀粉芽孢杆菌固态菌剂：
(1)取解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线，在30℃活化24h；取活化后的健壮、典型菌落，接种于10ml LB液体培养基中，在35℃培养24h；再接种于300ml LB液体培养基中，在30℃培养24h，获得有效活菌数为1.0×109cfu/ml的种子液；
(2)将所述种子液按30ml/100g与固体含水培养基混合均匀，所述固体含水培养基由以下步骤制备而成：取花生饼粉53g、麦麸35g、棉粕11.5g、碳酸钠0.5g、葡萄糖0.5g、蛋白胨0.5g以及占全部固体物料重量之和45％的蒸馏水，搅拌均匀后，以300g/L装入培养瓶中，在121℃下间歇灭菌两次，每次灭菌45min，即得；
将种子液与固体含水培养基的混合物在35℃条件下静置培养3d，干燥至混合物含水量为8％，粉碎过筛，即得。
采用梯度挂线法对所得解淀粉芽孢杆菌固态菌剂进行活菌体计数，测得有效活菌体为2.5×1010cfu/g。
实施例4
取本发明所述解淀粉芽孢杆菌L-S60，按照以下步骤制备解淀粉芽孢杆菌固态菌剂：
(1)取解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线，在40℃活化36h；取活化后的健壮、典型菌落，接种于10ml LB液体培养基中，在40℃培养36h；再接种于300ml LB液体培养基中，在40℃培养36h，获得有效活菌数为8.0×108cfu/ml的种子液；
(2)将所述种子液按30ml/100g与固体含水培养基混合均匀，所述固体含水培养基由以下步骤制备而成：取花生饼粉53g、麦麸35g、棉粕11.5g、碳酸钠0.5g、葡萄糖0.5g、蛋白胨0.5g以及占全部固体物料重量之和45％的蒸馏水，搅拌均匀后，以350g/L装入培养瓶中，在121℃下间歇灭菌两次，每次灭菌45min，即得；
将种子液与固体含水培养基的混合物在40℃条件下静置培养3d，干燥至混合物含水量为10％，粉碎过筛，即得。
采用梯度挂线法对所得解淀粉芽孢杆菌固态菌剂进行活菌体计数，测得有效活菌体为7.0×108cfu/g。
实施例5
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂在番茄工厂化育苗中的应用
实验组：将每升育苗基质与0.1g实施例3提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。
对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。
出苗后第20天对照组和实验组植株的形态如图1所示。
出苗后第20天，测量植株生长的各个参数，结果见表1(进行三次重复实验，每次重复实验每组测量15株穴盘苗，结果取平均值)。每升育苗基质与0.1g芽孢杆菌固态菌剂混合的实验组对番茄穴盘苗促生有效果但并不明显。
表1：出苗后第20天实验组和对照组番茄的各个参数的测量结果
出苗后第20天，将各组的栽培基质干燥，检测其中速效氮的含量、速效磷的含量和速效钾的含量。检测速效氮的含量的方法为碱解扩散法，检测速效磷的含量的方法为0.5mol/L碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，检测速效钾的含量的方法为1mol/L醋酸铵浸提-火焰光度计法；结果见表2。与对照相比，每升育苗基质与0.1g芽孢杆菌固态菌剂混合的实验组栽培基质中速效氮磷钾含量有所增加，但并不明显。
表2：芽孢杆菌固态菌剂对栽培基质中速效氮磷钾含量的影响
速效氮含量(mg/g) 速效磷含量(mg/g) 速效钾含量(mg/g)
对照组 12.5±0.98a 11.0±0.45a 19.7±0.93a
实验组 15.1±0.67a 12.8±0.65a 22.5±0.87a
实施例6
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂在番茄工厂化育苗中的应用
实验组：将每升育苗基质与10g实施例3提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。
对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。
出苗后第20天对照组和实验组植株的形态如图2所示。
出苗后第20天，测量植株生长的各个参数，结果见表3(进行三次重复实验，每次重复实验每组测量15株穴盘苗，结果取平均值)。每升育苗基质与10g芽孢杆菌固态菌剂混合的实验组可显著促进番茄穴盘苗的生长，具有良好的促生效果。
表3：出苗后第20天实验组和对照组植株的各个参数的测定结果
出苗后第20天，将各组的栽培基质干燥，检测其中速效氮的含量、速效磷的含量和速效钾的含量。检测速效氮的含量的方法为碱解扩散法，检测速效磷的含量的方法为0.5mol/L碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，检测速效钾的含量的方法为1mol/L醋酸铵浸提-火焰光度计法；结果见表4。与对照相比，每升育苗基质与10g芽孢杆菌固态菌剂混合的实验组可明显提高栽培基质中速效氮、速效磷和速效钾的含量。
表4：芽孢杆菌固态菌剂对番茄栽培基质中速效氮磷钾含量的影响
速效氮含量(mg/g) 速效磷含量(mg/g) 速效钾含量(mg/g)
对照组 12.5±0.98b 11.0±0.45b 19.7±0.93b
实验组 94.4±1.78a 26.9±0.96a 141.7±4.98a
实施例7
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂在黄瓜工厂化育苗中的应用
实验组：将每升育苗基质与10g实施例3提供的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。
对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。
出苗后第20天对照组和实验组植株的形态如图3所示。
出苗后第20天，测量植株生长的各个参数，结果见表5(进行三次重复实验，每次重复实验每组测量15株穴盘苗，结果取平均值)。每升育苗基质与10g芽孢杆菌固态菌剂混合的实验组可显著促进番茄穴盘苗的生长，具有良好的促生效果。
表5：出苗后第20天实验组和对照组黄瓜的各个参数的测量结果
株高(cm) 茎粗(mm) 叶面积(cm2) 地上部干重(g) 地下部干重(g)
对照组 16.80±0.72b 3.16±0.06b 49.40±1.79b 0.24±0.01b 0.030±0.003b
实验组 20.61±0.88a 3.57±0.06a 66.16±1.63a 0.28±0.01a 0.040±0.003a
表1～5中所列结果为平均值±标准误，每列数字后相同字母表示在0.05水平上无显著差异。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，其保藏登记号为CGMCCNO.10045。
2.一种解淀粉芽孢杆菌固态菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，进行活化、增殖后，获得有效活菌数为0.1～1.0×109cfu/ml的种子液；
(2)将所述种子液按15～35mL/100g与固体含水培养基混合均匀，将所得的混合物在30～40℃静置培养2～5d，干燥至混合物含水量为10％以下，粉碎过筛，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述固体含水培养基包括以下重量份的成分：花生饼粉25～55份，麦麸20～55份，棉粕11.5～40份，碳酸钠0.1～1.0份，葡萄糖0.1～1.0份，蛋白胨0.1～1.0份；还包括占全部固体物料重量之和30～60％的水。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述固体含水培养基包括以下重量份的成分：花生饼粉25～53份，麦麸31.4～55份，棉粕11.5～17份，碳酸钠0.2～1.0份，葡萄糖0.2～1.0份，蛋白胨0.2～1.0份；还包括占全部固体物料重量之和30～45％的水。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：将固体含水培养基混合均匀后，以200～350g/L装入培养瓶中。
6.根据权利要求3～5任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述固体含水培养基在与种子液混合前，在120～125℃条件下间歇灭菌两次，每次灭菌30～45min。
7.根据权利要求2～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述静置培养具体为：在35℃条件下静置培养3～5d。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线，在30～40℃活化24～36h；取活化后的健壮、典型菌落，接种于10ml LB液体培养基中，在30～40℃培养24～36h；再接种于300ml LB液体培养基中，在30～40℃培养24～36h，获得有效活菌数为0.1～1.0×109cfu/ml的种子液；
(2)将所述种子液按15～30ml/100g与固体含水培养基混合均匀；所述固体含水培养基由包括以下步骤的方法制备而成：取花生饼粉25～53份、麦麸31.4～55份、棉粕11.5～17份、碳酸钠0.2～1.0份、葡萄糖0.2～1.0份、蛋白胨0.2～1.0份以及占全部固体物料重量之和30～45％的蒸馏水，混合均匀后，以200～350g/L装入培养瓶中，在121℃条件下间歇灭菌两次，每次灭菌30～45min，即得；
将种子液与固体含水培养基的混合物在35℃条件下静置培养3～5d，干燥至混合物含水量为5～10％，粉碎过筛，即得。
9.权利要求2～8任意一项所述方法制备而成的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂。
10.权利要求9所述解淀粉芽孢杆菌固态菌剂在促进植物生长中的应用，其特征在于，在每升植物培养基质中添加0.01～10g所述解淀粉芽孢杆菌固态菌剂。
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