CN104694430A - 解淀粉芽孢杆菌植物亚种zfh-3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3及其应用，该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)，其保藏编号为：CGMCC No.9884。该菌株对多种农作物病原菌具抑制显著的抑制作用，特别能有效防治水果的采后病害，很好的用于柑桔青霉病、柑桔绿霉病、柑桔蒂腐病、柑桔酸腐病、柑桔炭疽病，香蕉炭疽病、香蕉轴腐病，草莓灰霉病、草莓软腐病等病原真菌的生物防治，显著降低水果果实采后病害的发生，延长贮藏期和货架期，减少化学药物使用量。菌株培养条件简单、繁殖速度快、易于工业化生产及推广应用，具有良好的开发应用前景。

Description

解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3及其应用
技术领域
本发明属于水果保鲜、采后病害防治领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3及其应用，尤其是在水果如柑橘、香蕉、草莓采后主要病害防治与保鲜中的应用。
背景技术
水果采后病害是影响水果产业健康发展的主要因素，也是水果采后贮运研究的重点。柑桔采后病害主要有青霉病、绿霉病、蒂腐病、酸腐病和炭疽病。香蕉采后病害主要是轴腐病(冠腐病)、炭疽病，草莓采后不耐贮，易腐烂，主要是灰霉病、软腐病。大部分的水果采后病害为侵染性病害，大多从脐部、蒂部和伤口入侵，并可通过病果接触交叉传染，造成采后果实在贮运期内的腐烂变质，失去食用价值，腐烂率一般为10％～30％，会造成严重的经济损失。
为提高水果采后病害防治技术水平、减少化学杀菌剂使用、减少环境污染、降低抗药性，保证食品安全，开发有效、安全、生态的生物防治保鲜产品具有重要意义。
我国水果采后病害的生物防治研究起步较晚、基础较差，现有的研究也大部分还是基础理论研究，从生防菌筛选鉴定、果蔬适应性、生物防治机理、基因诱变改进等方面进行了系列研究与报道，应用性研究较少，较少能实现产业化。另一方面，我国在水果采前的生物防治的基础理论及应用研究较深入，发酵工艺、产品生产等工业化条件较成熟，已有产业化产品，为采后生物防治技术的产业化提供了可能。
解淀粉芽孢杆菌是重要的植物病害拮抗菌，普遍存在于土壤、果蔬与植物的表面及组织内，是动植物的有益菌，生态、环保，对人无毒、安全，较多研究及专利报道了其在农作物病害、土壤微生物及促植物生长、土壤肥力改良，水产养殖等方面的应用，应用范围广、生长适应性强，易在任何介质定殖、繁殖，易大量培养、生产工艺简单，产业化可行性高。
目前解淀粉芽孢杆菌用于采后病害生物防治报道较少，更未有市场化的果蔬采后病害生物防治解淀粉芽胞杆菌类产品，为此开发含解淀粉芽孢杆菌用于水果采后病害防治保鲜的生物产品具重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种可有效防治水果采后病害的生物防治菌。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，该亚种菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)，其保藏编号为：CGMCC No.9884，保藏日为2014年10月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个发明目的是提供一种上述解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3原粉的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3原粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)、活化菌种
活化解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，待解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在LB固体培养基上的菌落乳白色，圆形，明显突起，表面光滑，不透明，边缘整齐；
(2)、一级种子液的制备
选取LB固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，将一级种子摇瓶在32℃、180r/min下培养14小时，得到一级种子液；
(3)、二级种子液的制备
种子罐中的培养基仍为LB液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中培养，培养结束时得到二级种子液；
(4)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌液发酵
将步骤(3)所得解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的二级种子液，按照接种量为1％接入发酵罐中，在发酵培养基下培养，得到发酵成熟菌剂(主要为芽孢)；
(5)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌原粉
步骤(4)所得的发酵成熟菌剂经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3原粉。
所述步骤(1)中所述LB培养基配方(g/L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，溶剂为水，pH7.0-7.2，固体培养基在液体培养基中加2％琼脂；
所述步骤(3)中所述种子罐的接种量为0.5-1％(V/V)；培养条件为：通气比1：1，搅拌转速为250-400r/min，培养温度32℃，罐压0.05Mpa，培养12小时；所述二级种子液的活菌含量为1-3×108cfu/mL，OD值0.85；
所述步骤(4)中所述发酵培养基的配方(重量百分比)：玉米淀粉3％，豆粕粉3％，酵母膏0.9％，氯化钠0.25％，碳酸钙0.25％，硫酸镁0.4％，磷酸氢二钾0.3％，pH7.2-7.5，121℃灭菌30min；培养条件为：通气比为1：0.7，搅拌转速为180r/min、罐压0.05MPa、培养温度32℃、培养时间为48h，发酵过程中根据泡沫情况流加消泡剂；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3活芽孢含量为30～40×108cfu/mL；
所述步骤(5)中所述离心式喷雾塔的干燥条件为：进风口温度为180-200℃，出风口温度为80-85℃，菌原粉中含水量小于5％(W/W)，活芽孢含量2000×108cfu/g。
本发明所述的可有效防治水果采后贮藏病害的物质主要指解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株本身及其产生的所有物质。
本发明的第三个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在防治水果采后病害中的应用。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在防治水果采后病害中的应用。
其中，所述病害为青霉病、绿霉病、蒂腐病、酸腐病、炭疽病，炭疽病、轴腐病，灰霉病或软腐病。
其中，所述水果为柑桔，所述病害为柑桔青霉病、柑桔绿霉病、柑桔酸腐病、柑桔炭疽病或柑桔蒂腐病。
其中，所述水果为香蕉，所述病害为香蕉炭疽病或轴腐病。
其中，所述水果为草莓，所述病害为草莓灰霉病或软腐病。
本发明具有下列优点和效果：
解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3是珠海真绿色技术有限公司从食用真菌根部分离筛选到的对多种植物病原菌具抑菌作用的菌株，通过获得的16S rDNA和gyrB基因片段，在NCBI上BLAST搜索和比对，并结合菌的形态、生理生化，判定为一新的解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株，并于2014年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9884。
本发明的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3是从食用真菌类根中部分离筛选到的对多种植物病原菌具抑菌作用的生防菌，取自自然。解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3是动植物的有益菌，较多研究及专利已报道了其在农作物病害、土壤微生物及促植物生长、土壤肥力改良，水产养殖等方面的应用，生态、环保，对人无毒、安全，应用范围广、生长适应性强，在任何介质都易于定殖、繁殖，易大量培养、生产工艺简单，产业化可行性高。关于在农产品采后病害防治即采后水果保鲜应用研究报道较少，鉴于解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3对水果采后病害的有效抑制作用，对人无毒、有利于环境，安全、生态、环保等优点，用于水果采后病害防治，能减少化学药剂保鲜带来的食品安全、药物残留、环境污染等问题，减少化学药剂使用量，确保食品安全、环境友好、生态安全。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
保藏信息：
解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)，其保藏编号为：CGMCCNo.9884，保藏日为2014年10月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是本发明实施例解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的菌体形态(×1000倍)。
图2是本发明实施例解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的菌落形态。
具体实施方式
一、ZFH-3的制备及鉴定
解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3
1、样品采集
从福建省三明市大田县老树林采集土壤样品、收集担子菌纲伞菌红菇科食用真菌，自然晒干；剪下食用真菌根部，研磨成粉，混合均匀，得食用真菌根部样品；土壤样品研磨成粉，混合均匀，得土壤样品；
2、菌株的分离和抗性菌筛选的与纯化
(1)样品稀释：分别从混合均匀的2个样品(真菌根部样品和土壤样品)中，各称取5g溶解到装有45ml无菌水的三角瓶中，150rp振荡器振荡成均匀的10-1稀释液，然后用1ml移液枪吸取该稀释液1ml至装有9ml无菌水的试管中，充分摇匀，即制成10-2的样品稀释液，并依次稀释至10-5；
(2)培养基准备：
①NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCL5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，PH7.0；
②PDA培养基：葡萄糖20g，去皮马铃薯200g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，PH7.0；
③将配制好的NA培养基、PDA培养基灭菌，于45℃-55℃倾倒至无菌的培养基；
(3)菌种分离、筛选及纯化：分别吸取上述2种样品的不同稀释倍数的稀释液0.1ml，均匀涂布于冷却好的PDA培养基、NA培养基，放置28℃培养箱中倒置培养5天，每天观察并挑选长势良好、对周边菌具明显拮抗作用的菌落于PDA培养基培养；
(4)拮抗菌株验证及纯化：将所挑选出的培养于PDA培养基、能快速生长繁殖且可能具拮抗作用的菌落，利用实验已有菌株，验证对柑桔酸腐病菌、蒂腐病菌、青绿霉菌、炭疽病菌，香蕉轴腐病、炭疽病，草莓灰霉病、软腐病等预拮抗试验；并就拮抗作用最好、最具产业化前景的1个菌株于PDA培养基上培养纯化，并命名菌株ZFH-3；
3、菌株的鉴定
(1)、菌落形态：解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3，革兰氏阳性，芽饱椭圆形，中生或端生，孢囊不膨大；菌体呈杆状，0.7-0.9μm×1.8-3.0μm，单个、成对或栅栏状排列。菌落乳白色，圆形，表面光滑稍突，不透明，边缘整齐，直径约1mm。见图1、图2。
图1为解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的菌体形态(普通生物显微镜1000倍下拍摄)。
图2为解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的菌落形态(普通照相机拍摄)。
(2)、ZFH-3的生理活性特征见下表1：
表1
(3)、ZFH-3的16S rDNA系列分析，如序列表中序列1所示：
(4)、ZFH-3的gyrB基因系列分析，如序列表中序列2所示：
(5)、ZFH-3鉴定结论
根据菌株ZFH-3的形态学、生理生化鉴定及16rDNA、gyrB基因系列分析，最终鉴定ZFH-3为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)，并命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号：CGMCC No.9884，保藏日期为2014年10月30日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。
二、解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3原粉的制备
1、解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3的活化
取一支解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3的冷冻干燥管，先用75％酒精沿冷冻干燥管尖头端擦下灭菌，酒精干后，再用酒精灯烧冷冻干燥管的尖头，最后用摄子打破冷冻干燥管尖头，无菌操作方式挑取解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3菌粉至250mL三角瓶中稀释，32℃、150r/min均匀振荡0.5h。用无菌吸管吸取0.1mL菌液，在LB固体培养基中划线培养24h-36h，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3在LB固体培养基上菌落乳白色，圆形，明显突起，表面光滑，不透明，边缘整齐。
LB培养基配方(g/L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，溶剂为水，pH7.0-7.2。固体培养基在液体培养基中加2％琼脂。
2、一级种子液的制备
挑取LB固体培养基上的单菌落接种于一级种子摇瓶中，摇瓶体积为250mL，一级种子LB液态培养基(121℃，灭菌20min)的装液量50ml。将一级种子摇瓶在32℃、180r/min下培养14h，得到一级种子液。
3、二级种子液的制备
种子罐中的培养基仍为LB液体培养基，121℃，灭菌20min。将一级种子液接入种子罐中，接种量为0.5-1％(V/V)，培养条件为：通气比1：1，搅拌转速为250-400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，培养时间为12h。培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1-3×108cfu/mL，OD值在0.85左右，此时菌种活力强。
4、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌液发酵
发酵培养基配方(重量百分比)：玉米淀粉3％，豆粕粉3％，酵母膏0.9％，氯化钠0.25％，碳酸钙0.25％，硫酸镁0.4％，磷酸氢二钾0.3％，pH7.2-7.5，121℃，灭菌30min。
将解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3的二级种子液，按照接种量为1％(V/V)接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1：0.7，搅拌转速为180r/min、罐压0.05MPa、培养温度32℃、培养时间为48h左右，发酵过程中根据泡沫情况流加消泡剂。下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准。成熟发酵液中解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3活芽孢含量为30～40×108cfu/mL，得发酵成熟菌剂。
5、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌原粉
发酵成熟成熟菌剂(活芽孢含量为30～40×108cfu/mL)经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得液固混合物。将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到该菌原粉。
离心式喷雾塔中的干燥条件为：进风口温度为180-200℃，出风口温度为80-85℃。菌原粉中含水量小于5％(W/W)，活芽孢含量2000×108cfu/g。
三、解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3对采后病菌的平板抑菌作用
解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的活化：从解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的斜面种子管中，用无菌接种针挑取单落至PDA固态培养基划线培养24h-36h，培养温度28℃，解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在PDA长势好，菌落乳白色，圆形，明显突起，表面光滑，不透明，边缘整齐。
选取柑桔酸腐病菌、柑桔蒂腐病菌、青霉菌、绿霉菌、柑桔炭疽病菌、轴腐病菌、香蕉炭疽病菌、草莓灰霉病菌、软腐病菌的斜面种子管，用无菌接种针挑取菌落至PDA固态培养基中培养5天，培养温度28℃。选取长势良好培养基，待用。
平板对峙法：将PDA平板上培养5天的柑桔酸腐病菌、蒂腐病菌、青绿霉菌、炭疽病菌，香蕉轴腐病、炭疽病，草莓灰霉病、软腐病病原真菌打成直径5mm的菌饼，接种于制作好的PDA培养基中央，然后将在PDA培养基上活化24h的解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3接种于距菌饼2.5cm处，每个PDA平板接种4个点，重复3次，以接无菌水为空白对照。置于培养箱28℃下培养，待对照中病原菌长满培养皿后，测量处理组菌落直径和对照菌落直径，并计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-原菌饼直径)*100％。
表2平板抑菌作用
从解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3菌对采后病菌的平板抑菌作用结果(表2)可知：ZFH-3对水果采后病害：青霉病、绿霉病、炭疽病、蒂腐病、酸腐病、轴腐病、灰霉病、软腐病具明显的抑制作用，即主要对香蕉、柑桔、草莓采后病原菌具较强的抑制作用，特别是对柑桔酸腐病、香蕉轴腐病、草莓灰霉病抑菌率最明显，分别达到79.6％、79.54％、77.87％。
三、解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)ZFH-3对贮藏柑橘、香蕉、草莓的采后病害防治效果
1、将制好的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌粉稀释成107cfu/ml，108cfu/ml，109cfu/ml不同浓度的菌液，添加少量Tween 20，备用。
2、柑桔果实选用广东四会产沙糖桔，成熟度90％以上，挑选大小及色泽相同、无机械伤、无病虫害的果实，洗净待用。
3、香蕉果实于采自广东省中山坦洲，品种为巴西蕉，蕉果成熟度75-80％，除去病虫、机械伤果，将蕉果分为小、大梳果，随机分样备用。
4、草霉果实购于广东省珠海鹤州北，成熟度90％以上，挑选大小及色泽相同、无机械伤、无病虫害的果实，洗净待用。
5、将洗净凉干的3种果实，分别用菌液107cfu/ml，108cfu/ml，109cfu/ml、清水浸泡1-2min后装筐，于通风处自然凉干，每处理60个果，设5个重复。处理后放置于消毒后的空置房，开窗通风。3天后挑出机械伤腐烂果，并用厚度为0.03mm的聚乙烯袋单果包装或整齐放置于保鲜膜盒，装筐置于15-25℃，相对湿度(RH)75-90％条件下贮藏，观察发病腐烂情况。沙糖桔在贮藏20天后统计不同处理组沙糖橘的发病腐烂情况。香蕉于贮藏15天统计不同处理组的发病腐烂情况。草莓于贮藏10天观察不同处理组的发病腐烂情况。
从107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml不同浓度的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3对柑桔采后病害防治及保鲜效果(表3)可知：ZFH-3用于采后柑桔病害防治效果明显，不同浓度的ZFH-3菌液处理量与对照组都达差异显著水平，107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml不同浓度的ZFH-3，浓度越高病害防治保鲜效果越明显。从不同病害的情况来看，对酸腐病、炭疽菌的防治效果最佳，特别是109cfu/ml的ZFH-3可基本控制酸腐、炭疽病害的发生。
表3不同浓度的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3对柑桔采后病害防治效果
ZFH-3用于香蕉采后病害主要是炭疽病及轴腐病(冠腐病)，且实验也发现香蕉发病果存在并发病害，果上既发炭疽病，也发轴腐病。从表4可知，15天贮藏结果可知，清水组发病率达62.78％，107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml组的ZFH-3，香蕉发病率分别为25.56％、21.11％、15％，不同浓度的ZFH-3与对照组差异显著，浓度越高病害防治保鲜效果越明显。清水组炭疽病、轴腐病发病率为42.78％、26.67％，109组的ZFH-3病害率最低分别为12.78％、8.33％，较清水组降低了70.13％、68.77％。这可能与表皮及伤口易于ZFH-3粘着生长，利于生防机制的发挥有关。
表4不同浓度的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3对香蕉采后病害防治效果
草莓是一种非跃变性浆果，果皮薄、组织娇嫩，极不耐贮藏，易遭受病原菌如灰霉病、软腐病的侵染而腐烂。室温放置10天，草莓发病率达100％(如表5所示)，主要病害为灰霉病、软腐病，发病率分别为67.78％、33.33％，少部分果存在交叉病害。107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml，3个不同浓度的ZFH-3能有效的、不同程度的减少病害发生，不同浓度间呈梯度关系，浓度越大对病害的防控效果越好。其中107cfu/ml组ZFH-3减少了草莓65％的发病率，控制灰霉病、软腐病发病率24.44％、12.22％，109cfu/ml组ZFH-3效果最明显，发病率、灰霉病、软腐病分别为14.44％、10％、5％。
表5不同浓度的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3对草莓采后病害防治效果

Claims (8)

1.一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，其特征在于：该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)，其保藏编号为：CGMCC No.9884。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株原粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)、活化菌种
活化解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，待解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在LB固体培养基上菌落乳白色，圆形，明显突起，表面光滑，不透明，边缘整齐；
(2)、一级种子液的制备
选取LB固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，将一级种子摇瓶在32℃、180r/min下培养14小时，得到一级种子液；
(3)、二级种子液的制备
种子罐中的培养基仍为LB液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中培养，培养结束时得到二级种子液；
(4)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌液发酵
将步骤(4)所得解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的二级种子液，按照接种量为1％接入发酵罐中，在发酵培养基下培养，得到发酵成熟菌剂；
(5)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌原粉
步骤(4)所得的发酵成熟菌剂经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3原粉。
3.如权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株原粉的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中所述LB培养基配方(g/L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，溶剂为水，pH7.0-7.2，固体培养基在液体培养基中加2％琼脂；
所述步骤(3)中所述种子罐的接种量为0.5-1％(V/V)；培养条件为：通气比1：1，搅拌转速为250-400r/min，培养温度32℃，罐压0.05Mpa，培养12小时；所述二级种子液的活菌含量为1-3×108cfu/mL，OD值0.85；
所述步骤(4)中所述发酵培养基的配方(重量百分比)：玉米淀粉3％，豆粕粉3％，酵母膏0.9％，氯化钠0.25％，碳酸钙0.25％，硫酸镁0.4％，磷酸氢二钾0.3％，pH7.2-7.5，121℃灭菌30min；培养条件为：通气比为1：0.7，搅拌转速为180r/min、罐压0.05MPa、培养温度32℃、培养时间为48h，发酵过程中根据泡沫情况流加消泡剂；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3活芽孢含量为30～40×108cfu/mL；
所述步骤(5)中所述离心式喷雾塔的干燥条件为：进风口温度为180-200℃，出风口温度为80-85℃，菌原粉中含水量小于5％(W/W)，活芽孢含量2000×108cfu/g。
4.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株在防治水果采后病害中的应用。
5.如权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株在防治水果采后病害中的应用，其特征在于：所述病害为青霉病、绿霉病、蒂腐病、酸腐病、炭疽病，炭疽病、轴腐病，灰霉病或软腐病。
6.如权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株在防治水果采后病害中的应用，其特征在于：所述水果为柑桔，所述病害为柑桔青霉病、柑桔绿霉病、柑桔酸腐病、柑桔炭疽病或柑桔蒂腐病。
7.如权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株在防治水果采后病害中的应用，其特征在于：所述水果为香蕉，所述病害为香蕉炭疽病或轴腐病。
8.如权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株在防治水果采后病害中的应用，其特征在于：所述水果为草莓，所述病害为草莓灰霉病或软腐病。
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