CN115094002B - 一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海洋微生物及其筛选方法与应用 - Google Patents
一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海洋微生物及其筛选方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海洋微生物及其筛选方法与应用，具体地是从海洋淤泥中筛选到一株对指状青霉具有较好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HY 2‑1，该菌株源于生境相对特殊的海洋环境，其生长特性表现出良好的盐耐受性；该菌株可产表面活性素和丰原素等脂肽类活性化合物；该菌株发酵上清液对指状青霉具有明显的拮抗作用，而且能够有效降低柑橘的失重率和腐烂率，减缓柑橘中可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸、总糖的分解，从而减缓柑橘果实营养的流失。可见该菌株不仅可以丰富柑橘绿霉病拮抗微生物资源的来源，也可为开发成柑橘保鲜剂奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及菌株分离技术领域，具体是一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海洋微生物及其筛选方法与应用。
背景技术
柑橘类水果风味独特，果实含有大量维生素C、类胡萝卜素、果胶等生物活性物质，深受消费者的喜爱。由于柑橘营养成分丰富，在柑橘采摘、运输及储存过程中，容易受到病原体的感染，其中由指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病是采后柑橘最具破坏性的病害，占柑橘储藏过程因真菌性病害造成腐烂损失的60-80％。目前，对于柑橘绿霉病的防治主要采用化学杀菌剂如抑霉唑、噻苯咪唑、咪鲜胺等，但这些化学农药的过渡使用往往容易导致病原真菌的耐药性，且对人体健康存在一定的风险，因此寻求绿色安全可靠的生物防治方法成为了研究者们的关注热点。
对柑橘绿霉病的生物防治方法主要包括使用植物提取物、抗菌肽及拮抗微生物等，其中以使用拮抗微生物的方法研究最多。开展柑橘绿霉病微生物防治的首要工作是获得对病原真菌具有拮抗活性且能适应柑橘贮藏运输环境的拮抗微生物。近年来，已从陆地环境如根际土壤、柑橘果实和叶片等处分离出大量拮抗柑橘绿霉病菌的微生物，主要为细菌、酵母菌和放线菌。由于对陆地资源进行了广泛的微生物筛选和研究，发现新的微生物变得越来越困难。海洋蕴含着丰富的微生物资源，海洋微生物生活在高盐、低温、无光照、寡营养等极端环境中，这些环境决定了其与陆地微生物生长代谢的差别，使得其具有产生独特生物活性化合物的潜力。海洋微生物已被证实是生物活性化合物的重要来源，其代谢产物具有多种药理活性，包括抗癌、抗菌、抗肿瘤等，被喻为生产天然产物的微生物工厂。
目前，对于柑橘绿霉病菌具有拮抗作用的菌株大多筛选自陆地环境，鲜有从海洋环境中筛选拮抗菌株的报道。海洋与陆地有较大的环境差别，演化出了独特的代谢能力，因此从海洋中有望筛选到抑菌活性物质结构或功能相对新颖的拮抗菌株。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海洋微生物及其筛选方法与应用。
本发明的技术解决方案如下：
一种海洋微生物，命名为解淀粉芽孢杆菌HY2-1(Bacillus amyloliquefaciensHY2-1)，于2021年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211637。
进一步地，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，从海底淤泥中分离筛选得到。
本发明还公开了一种海洋微生物的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一：将海底淤泥加入无菌水中，混合均匀梯度稀释到10-4，吸取10-3、10-4稀释液分别涂布在改良LB固体培养基、高氏一号培养基的平板上，培养至菌落出现并计数，挑取单菌落进行划线纯化，将纯化的单菌落接种到改良LB液体培养基中培养，所得菌液冷冻保存，获得菌株；
步骤二：采用平板对峙法，将步骤一中所得的菌株，分别接种于装有改良LB液体培养基的锥形瓶中，活化，分别取活化后的菌液，涂布于改良LB固体培养基中，获得单菌落，将单菌落分别点接于含指状青霉孢子悬液的PDA培养基中，培养，初筛获得对指状青霉具有拮抗效果的海洋细菌；
步骤三：将初筛获得的具有拮抗指状青霉效果的海洋细菌分别接种于改良LB液体培养基中，活化，将活化后的菌液按规定的接种量接种于发酵培养基中，继续培养，取发酵液于高速离心，无菌过滤，得无菌的发酵上清液，利用牛津杯法检测发酵上清液的抑菌效果，筛选得到解淀粉芽孢杆菌HY2-1。
进一步地，所述改良LB液体培养基包括：蛋白胨，酵母浸粉，MgCl2，MgSO4，KCl，CaCl2，NaCl，蒸馏水，pH 7.0，其中所述改良LB固体培养基在所述改良LB液体培养基基础上添加20g琼脂，121℃灭菌20min。
进一步地，所述高氏一号培养基包括：可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、FeSO4、MgCl2，MgSO4，KCl，CaCl2，NaCl，琼脂，蒸馏水，pH 7.2，121℃灭菌20min。
进一步地，所述PDA培养基包括：去皮土豆，葡萄糖，蒸馏水，其中固体培养基添加琼脂20g，121℃灭菌20min；
进一步地，所述发酵培养基包括：葡萄糖，蔗糖，蛋白胨，硫酸铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰，硫酸锌，蒸馏水，pH 7.0-7.2，115℃灭菌30min。
本发明还公开了一种海洋微生物在拮抗柑橘绿霉病上应用。
进一步地，所述柑橘绿霉病的致病菌为指状青霉。
本发明还公开了一种海洋微生物在柑橘保鲜剂上的应用。
本发明的有益效果是：本发明筛选到一株对指状青霉具有较好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌HY 2-1(Bacillus amyloliquefaciens HY 2-1)。该微生物分离自广东省湛江市北部湾海域的海底淤泥(20°33′04.97675″N，109°37′00.73894″E)，源于生境相对特殊的海洋环境，其生长特性表现出良好的盐耐受性。解淀粉芽孢杆菌HY 2-1可产表面活性素(surfactin)和丰原素(fengycin)等脂肽类活性化合物。解淀粉芽孢杆菌HY 2-1发酵上清液对指状青霉具有明显的拮抗作用(抑菌圈直径达到21.88±0.19mm)，而且能够有效降低柑橘的失重率和腐烂率，减缓柑橘中可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸、总糖的分解，从而减缓柑橘果实营养的流失。可见解淀粉芽孢杆菌HY 2-1不仅可以丰富柑橘绿霉病拮抗微生物资源的来源，也可为开发成柑橘保鲜剂奠定基础。
附图说明
图1为拮抗指状青霉海洋细菌的初筛示意图；
图2为菌株HY 2-1发酵上清液对指状青霉的抑制效果图；
图3为菌株HY 2-1在改良的LB培养基、光学显微镜(10×100)及扫描电镜下的形态观察；其中，a:改良的LB培养基,b光学显微镜(10×100)，c扫描电镜；
图4为菌株HY 2-1的PCR扩增产物电泳图；
图5为基于16S rDNA序列构建的菌株HY 2-1系统发育树；
图6为不同氯化钠浓度对解淀粉芽孢杆菌HY 2-1生长的影响曲线图；
图7为解淀粉芽孢杆菌HY2-1抑菌活性粗提物MALDI-TOF-MS分析图谱；
图8为解淀粉芽孢杆菌HY2-1发酵上清液对柑橘果实失重率和腐烂率的影响关系图；
图9为解淀粉芽孢杆菌HY2-1发酵上清液对柑橘果实品质的影响关系图；其中，(a)发酵上清液对柑橘可溶性固形物的影响；(b)发酵上清液对柑橘可滴定酸含量的影响；(c)发酵上清液对柑橘抗坏血酸含量的影响；(d)发酵上清液对柑橘总糖含量的影响。
具体实施方式
以下以具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1土样来源
土样采自广东省湛江市北部湾海域的五个海底淤泥，各土样的经纬度分别如下：20°33′08.42467″N，109°36′51.68500″E；20°33′01.52869″N，109°37′09.79277″E；20°33′04.97675″N，109°37′00.73894″E；20°31′52.78761″N，109°38′13.75760″E；20°29′09.04517″N，109°38′26.98106″E。
1.1.2供试菌株
柑橘绿霉病致病菌-指状青霉(Penicillium digitatum)
1.1.3主要培养基
改良LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，MgCl2 2.1g，MgSO4 4.2g，KCl 0.9g，CaCl21.2g，NaCl 36.5g，蒸馏水1L，pH 7.0，其中固体培养基添加20g琼脂，121℃灭菌20min；
高氏一号培养基：可溶性淀粉20g、KNO3 1.0g、K2HPO4 0.5g、FeSO4 0.01g、MgCl22.1g，MgSO4 4.7g，KCl 0.9g，CaCl2 1.2g，NaCl 30g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2，121℃灭菌20min；
PDA培养基：去皮土豆(八层纱布过滤)200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，pH自然，其中固体培养基添加琼脂20g，121℃灭菌20min；
发酵培养基：葡萄糖30g，蔗糖30g，蛋白胨20g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，硫酸锰0.01g，硫酸锌0.01g，蒸馏水1L，pH 7.0-7.2，115℃灭菌30min。
1.2试验方法
1.2.1海洋微生物的分离筛选
称取所采五个海底淤泥样各10g，分别加入装有90mL无菌水(带玻璃珠)的三角瓶中，混合均匀梯度稀释到10-4。吸取10-3、10-4稀释液分别涂布在改良LB、高氏一号培养基平板上，28℃培养至菌落出现并计数。挑取单菌落进行划线纯化三次，将纯化的单菌落接种到改良LB液体培养基中培养，所得菌液加入到含25％(V/V)甘油的冻存管中于-80℃保存。
1.2.2指状青霉孢子悬液的制备
取指状青霉斜面(18*180mm)，使用20mL无菌水倒入斜面刮下孢子，制备成孢子悬液，使用血球计数板计数，调整孢子浓度为1×108spores/mL，于4℃冰箱保存备用。
1.2.3指状青霉拮抗菌的初筛
采用平板对峙法，将筛选获得的海洋细菌分别接种于装有50mL改良LB液体培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、160r/min活化12h，分别取菌液100μL，涂布于改良LB固体培养基中，获得单菌落。将单菌落分别点接于含1％(V/V)指状青霉孢子悬液的PDA培养基中，于30℃培养48h，观察拮抗效果。
1.2.4指状青霉拮抗菌的复筛
将初筛获得的具有拮抗指状青霉效果的海洋细菌分别接种于装有50mL改良LB液体培养基的250mL锥形瓶中于30℃、160r/min活化12h，将活化后的菌液按2％的接种量(V/V)接种于装有40mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，继续于30℃、160r/min培养48h，发酵液于10 000r/min离心20min，取发酵上清液于0.22μm滤头过滤，即得无菌的发酵上清液(Cell-free supernatant,CFS)，以不接菌的发酵培养基培养液作为对照组(Control check,CK)。利用牛津杯法检测发酵上清液的抑菌效果：按1％的接种量(V/V)将指状青霉孢子悬液接种至冷却到50℃的PDA琼脂培养基中，摇匀后倒平板，待平板凝固后，均匀放置牛津杯，加入CFS200μL，于培养箱中培养48h至出现抑菌圈，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，每株菌重复3次。
1.2.5菌株HY 2-1的形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析
将保存的菌株划线接种于改良LB培养基中，30℃培养24h，观察菌落形态特征。挑取平板中的单菌落，经过革兰氏染色后于光学显微镜观察菌落形态结构。使用扫描电镜对菌株进行观察。参考《常见细菌系统鉴定手册》对菌株的部分生理生化进行鉴定。
将菌株HY 2-1斜面刮入装有20mL无菌水(含玻璃珠)的三角瓶中，接入1mL于改良LB培养基培养12h，使用基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA模板，分别使用通用引物
27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3′)进行PCR扩增。体系为：模板5μL，细菌通用引物27F、1492R各取2μL，2×Taq PCR Master Mix 25μL，无菌双蒸水16μL，总体积为50μL。条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，退火55℃ 15s，72℃延伸30s，循环34次；之后72℃延伸5min，于4℃保存。将扩增片段经1wt％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA测序。将测序结果于NCBI数据库进行比对，选取比对后菌株的16S rDNA序列，使用MEGA-X软件绘制系统发育树。
1.2.6菌株HY 2-1对盐的耐受性
配置氯化钠浓度分别为5、10、20、30、40、50、70、90、110、130、150、170、200g/L的发酵培养基，将菌株HY2-1于改良LB培养基活化12h，活化的菌液按2％的接种量(V/V)接种于上述不同氯化钠浓度的发酵培养基(装液量40mL/250mL)中，发酵48h后于600nm处测定各培养液吸光度，记录OD值。
1.2.7菌株HY 2-1所产抑菌活性物质的分析
接入装液量为50mL/250mL三角瓶的改良LB培养基中，于30℃、160r/min摇床培养24h，将活化的菌株培养液吸取1mL，再次接入新鲜的改良LB培养基(50ml/250ml三角瓶)，于相同条件继续培养至20h对数生长期，取培养液于4℃、10000r/min离心10min，收集菌体；提取菌株HY2-1高质量DNA，构建DNA文库，将构建的DNA文库转移到PromethION测序仪进行实时单分子测序，对测序数据进行组装校正，得到基因组序列；将菌株HY2-1基因组序列上传antiSMASH 6.0软件，通过软件在线预测菌株HY2-1的次级代谢产物类型。
抑菌活性物质的提取、活性检测和质谱分析：采用盐酸沉淀和甲醇提取法对抑菌活性物质进行提取。取1L解淀粉芽孢杆菌HY2-1发酵上清液，边搅拌边加入6mol/L的HCl，调pH至2.0，4℃下沉淀12h；将盐酸沉淀液于8000r/min离心15min，收集沉淀，加入5倍体积的甲醇抽提沉淀，相同转速离心15min，上清液用滤纸过滤获得甲醇抽提液，使用甲醇重复抽提沉淀；将甲醇抽提液挥干甲醇，获得活性粗提物。称取适量粗提物干粉，使用PBS溶解，溶解液于0.22μm滤头过滤除菌，制备20mg/mL的粗提液，使用牛津杯法检测其对指状青霉的抑菌活性；取20mg/mL粗提物进行MALDI-TOF-MS质谱分析，使用线性模式中正离子模式，测试基质为CHCA。
1.2.8菌株HY2-1对采后柑橘自然贮藏期间的保鲜效果测定
1.2.8.1柑橘的预处理
砂糖橘清水洗干净晾干后使用盐擦拭表面，放入蒸馏水中洗净表面残留盐，使用2％次氯酸钠溶液浸泡砂糖橘5min，使用蒸馏水洗净后于通风处晾干。挑取大小均一和无损伤的果实作为试验材料。
1.2.8.2柑橘果实处理及贮藏
砂糖橘果实分三组处理：(1)对照(清水)；(2)菌株HY2-1发酵上清液；(3)抑霉唑稀释800倍水溶液。将砂糖橘在上述3种处理液中浸泡1min，置通风处晾干，装入聚乙烯塑料薄膜袋中，在T＝16℃、RH:85-90％的条件下进行贮藏，每隔10d随机取出三组中5个果实测定柑橘果实品质。另外，分别取50个果实用于失重率和腐烂率的计算。
1.2.8.3柑橘果实失重率和腐烂率的计算
1.2.8.4柑橘果实品质的测定
(1)柑橘果实可溶性固形物含量的测定
随机取5个柑橘，去皮取赤道部果肉，于研钵中研磨成匀浆，四层纱布过滤，取滤液100μL使用数显折光仪进行测定。
(2)柑橘果实可滴定酸含量的测定
柑橘果实可滴定酸的测定采用NaOH(0.1mol/L)滴定法。取不同处理的柑橘，去皮取10g果肉于研钵中，加入30mL蒸馏水，研磨均匀，倒入50mL离心管中，于80℃水浴提取30min，冷却后使用蒸馏水定容至100mL。取20mL提取液，以NaOH进行滴定，将测定的总酸换算为柠檬酸，其换算系数为0.064，计算方式如下：
(3)柑橘果实维生素C含量的测定
维生素C含量的测定采用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定法。对0.2mg/mL的抗坏血酸进行标定，求得1mL染料相当于抗坏血酸的毫克数为0.088mg，用T表示。取10g果肉于研钵中，加入等量2％草酸(W:V)，研磨成匀浆，用1％草酸定容至100mL，静置10min，于四层纱布过滤，所得滤液8000r/min离心5min：取10mL上清液，其中含样品1g，以蒸馏水为空白对照，滴定方式同标准品的滴定。维生素C含量计算方式如下：
(4)柑橘果实总糖含量的测定
果实总糖含量测定采用硫酸-苯酚法。使用蔗糖作为标准液，以蔗糖的含量(μg)为横坐标，490nm处吸光度为纵坐标，制作标准曲线。取柑橘果肉10g于研钵中，研磨均匀，于四层纱布过滤，取滤液稀释一定倍数，取稀释液1mL进行测定，方法同标准曲线测定的方法相。柑橘果实总糖含量的计算方法为：
2结果与分析
2.1指状青霉拮抗菌株的初筛
从5个海泥样品中筛选出四株菌(分别编号为HY 2-1、HY 4-2、HY 8-4-1、HY 8-7)具有拮抗指状青霉的能力，其拮抗效果如图1所示。选择上述四株菌作为初筛菌株，用于进一步的复筛。
2.2指状青霉拮抗菌株的复筛
对初筛获得的4株拮抗菌进行复筛，其对指状青霉的抑菌结果如表1所示。由表1可知，4株拮抗菌的CFS中仅有编号为HY 2-1和HY 4-2两株菌对指状青霉具有明显的抑菌作用，编号为HY 8-4-2和HY 8-7的菌株抑菌圈只有牛津杯直径的大小(6.8mm)。菌株HY 2-1的抑菌圈直径大于HY 4-2，且差异具有显著性(P<0.05)，因此最终选择HY 2-1作为最终的指状青霉拮抗菌株。菌株HY 2-1发酵上清液对指状青霉的抑菌效果如图2所示。
表1 4株拮抗菌复筛结果
注：抑菌圈直径表示为“平均值±标准差”，不同小写字母表示差异具有显著性，P<0.05
2.3柑橘绿霉病拮抗菌株HY 2-1的鉴定
2.3.1菌株HY 2-1形态学观察
拮抗菌HY 2-1在改良LB平板上的单菌落特征为：乳白色，表面光滑，菌落边缘整齐，较湿润，菌落直径相对较小(图3a)；对该菌进行革兰氏染色，于光学显微镜观察，菌株为短杆状，为革兰氏阳性菌(图3b)；由扫描电子显微镜观察可知，该菌株边缘整齐，呈典型的短杆状(图3c)。
2.3.2菌株HY 2-1生理生化特性
菌株HY 2-1的生理生化鉴定结果如表2所示，结果显示，菌株HY 2-1能够利用葡萄糖、木糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇作为唯一碳源，吲哚实验和甲基红试验呈阳性，能液化明胶，水解淀粉，还原硝酸盐，V-P实验、脲酶和接触酶实验为阴性，不能利用柠檬酸盐。
表2菌株HY 2-1的生理生化特性
注：“+”表示反应呈阳性；“-”表示反应呈阴性
2.3.3菌株HY 2-1分子生物学鉴定
以细菌16S通用引物27F和1492R为引物，菌株HY 2-1基因组DNA为模板，PCR扩增电泳检测结果如图4；由图4可知，用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测到条带1有一条单一的DNA片段条带，与DNA Marker相比较，PCR扩增的DNA片段条带在1500bp附近，长度约1500bp左右。
将菌株HY 2-1的16S rDNA序列，通过在线程序NCBI中的BLAST与Genbank中的其它保藏序列进行比较，将比对结果使用MEGA X软件中的Neighbor-joining方法构建系统发育树，结果如图5所示。由图5可知，菌株HY 2-1与已公布的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)(GenBank登录号MN174660.1)聚为一簇，同源性为99.93％，确定菌株HY 2-1为解淀粉芽孢杆菌，将其命名为解淀粉芽孢杆菌HY 2-1(Bacillusamyloliquefaciens HY 2-1)，其16S rDNA序列已提交至NCBI，GenBank登录号为MZ709015，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.4解淀粉芽孢杆菌HY 2-1对盐的耐受性
不同氯化钠浓度对解淀粉芽孢杆菌HY 2-1生长的影响如图6所示。由图6可知，添加不同浓度的氯化钠对解淀粉芽孢杆菌HY 2-1的生长具有先促进后抑制的作用。当氯化钠浓度为5g/L时，菌体浓度达到最大值，与不添加氯化钠相比，菌体浓度显著增加；继续增加氯化钠含量至10和20g/L，菌体浓度开始呈下降的趋势但始终高于不添加氯化钠组，直至氯化钠浓度增加至30g/L时，菌体浓度才开始小于不添加氯化钠组；菌体在130g/L氯化钠浓度下仍有一定的生长，而当氯化钠浓度达到150g/L及以上时，菌体生长才完全被抑制。以上结果表明，海洋来源的解淀粉芽孢杆菌HY 2-1具有良好的盐耐受性，而且盐浓度在20g/L范围内对菌体生长反而有明显的促进作用。
2.5解淀粉芽孢杆菌HY 2-1所产的抑菌活性物质分析
2.5.1次级代谢产物合成基因簇预测
通过antiSMASH 6.0软件在线预测解淀粉芽孢杆菌HY2-1的次级代谢产物合成基因簇，发现该菌株基因组中含有编码多种脂肽类和聚酮类活性物质的相关合成基因簇，如表3所示。在解淀粉芽孢杆菌HY2-1预测到的8个次级代谢产物合成基因簇中，罗克霉素(locillomycin)、大环内酯H(Macrolactin H)、杆菌素(bacillaene)、丰原素(fengycin)、地非西丁(Difficidin)、铁载体(bacillibactin)、杆菌溶素(bacilysin)等7个次级代谢产物的基因簇与已知基因簇具有100％相似性，表面活性素(surfactin)基因簇与已知基因簇具有91％同源性。
表3解淀粉芽孢杆菌HY 2-1的次级代谢产物基因簇预测
2.5.2活性粗提物的MALDI-TOF-MS质谱分析
对解淀粉芽孢杆菌HY 2-1活性粗提物进行MALDI-TOF-MS质谱分析，如图7所示。由图7可知，解淀粉芽孢杆菌HY 2-1活性粗提物在m/z值为1044.689和1058.707处有离子峰出现，该处离子峰对应脂肽类表面活性素(surfactin)的相对分子质量；在m/z值为1463.836、1471.816、1485.832处有离子峰出现，该处离子峰对应脂肽类丰原素(fengycin)的相对分子质量。以上表明解淀粉芽孢杆菌HY 2-1可产表面活性素和丰原素等脂肽类活性成分，这与菌株基因组测序预测的次级代谢产物合成基因簇分析结果是相一致的。
2.6解淀粉芽孢杆菌HY 2-1的柑橘贮藏保鲜应用
2.6.1解淀粉芽孢杆菌HY 2-1发酵上清液的柑橘贮藏保鲜效果
使用解淀粉芽孢杆菌HY 2-1无菌发酵上清液(CFS)浸泡柑橘果实，以清水浸泡作为空白对照，抑霉唑浸泡作为阳性对照，其对柑橘果实的失重率和腐烂率如图8所示。由图8a可知，在储藏期40d内，随着时间的增加，柑橘失重率呈现不断增大的趋势，CFS和抑霉唑稀释800倍水溶液均能降低柑橘的失重率，且在第30d开始，与清水组相比，CFS和抑霉唑处理组失重率显著低于清水处理组(P<0.05)。在储藏第40d，清水、抑霉唑、CFS处理组的果实失重率分别为1.46％、1.27％和1.21％。由图8b可知，在储藏期40d内，柑橘腐烂率随着时间的增加逐渐增大，CFS和抑霉唑稀释800倍水溶液均能降低柑橘的腐烂率，且在第20d开始，与清水组相比，CFS和抑霉唑处理组腐烂率显著低于清水处理组(P<0.05)。在储藏第40d，清水、抑霉唑、CFS处理组的果实腐烂率分别为11.33％、4.67％和4.66％。在储藏期间，CFS和抑霉唑稀释800倍水溶液对柑橘失重率和腐烂率的影响两者差异不显著(P>0.05)，这表明CFS与抑霉唑稀释800倍水溶液对柑橘的保鲜具有同等效力，这为解淀粉芽孢杆菌HY2-1开发为生物保鲜剂提供了基础。
2.6.2解淀粉芽孢杆菌HY 2-1发酵上清液对柑橘果实品质的影响
衡量柑橘果实品质的指标为可溶性固形物、抗坏血酸及总糖含量，可滴定酸是衡量果实风味的重要指标，解淀粉芽孢杆菌HY 2-1无菌发酵上清液(CFS)对柑橘储藏期间果实品质的影响如图9所示。由图9a可知，采后砂糖橘在储藏期间可溶性固形物的含量总体呈现下降趋势，在第30d抑霉唑和CFS处理组的可溶性固形物达到最小值，分别为30％和27.67％，清水处理组的可溶性固形物在第40d达到最小值。在第40d，抑霉唑和CFS处理组的可溶性固形物含量显著增加，表明储藏后期抑霉唑和CFS处理可以减缓可溶性固形物的分解，且抑霉唑的作用较CFS明显。由图9b可知，采后砂糖橘在储藏期可滴定酸含量随着时间的增加呈现下降趋势，在第20d开始抑霉唑和CFS处理组可滴定酸含量均高于清水对照组，表明抑霉唑和CFS处理能够抑制可滴定酸的分解，从而保持柑橘原有的风味，且二者的效果差异不显著。由图9c可知，采后砂糖橘在储藏期间抗坏血酸的含量呈现先下降后上升的趋势，在第40d三种处理的果实抗坏血酸含量达到最大值，并且抑霉唑和CFS处理的果实抗坏血酸含量均大于清水处理组，由此可推测，抑霉唑和CFS处理的果实能够减缓抗坏血酸的分解，进而减缓果实营养的流失。由图9d可知，采后砂糖橘在储藏期间总糖的含量呈现先下降后上升的趋势，总糖含量在第30d达到最小值，抑霉唑处理组总糖含量在储藏期间均大于清水对照组，而CFS处理组除第30d略有下降外，其余时间段均大于清水处理组，由此表明抑霉唑和CFS处理能够减缓砂糖橘中糖的分解。
3结论
细菌是生防微生物的重要资源，其中解淀粉芽孢杆菌是目前生物防治研究较多的生防细菌。已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌对多种植物病原真菌具有拮抗作用，具有广谱抗真菌活性。解淀粉芽孢杆菌在拮抗柑橘绿霉病菌方面也有报道，例如从田间分离到的解淀粉芽孢杆菌Bs43，其菌悬液对指状青霉的抑菌圈直径达28mm；从柑橘根际土壤分离到一株解淀粉芽孢杆菌DH-4，对指状青霉的抑菌圈直径达到5.56±0.05cm。
在本研究中，筛选到一株对指状青霉具有较好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌HY 2-1(Bacillus amyloliquefaciens HY 2-1)，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 20211637。与分离自陆地的解淀粉芽孢杆菌相比，海洋微生物适应了高盐、寡营养等特殊生存环境，在抗逆性方面具有一定优势，由此产生的活性物质往往具有耐受温度、耐盐、pH范围广等特点。解淀粉芽孢杆菌HY 2-1分离自生境相对特殊的海洋环境，且对指状青霉具有明显的拮抗作用(抑菌圈直径达到21.88±0.19mm)，可见该菌不仅可以丰富柑橘绿霉病拮抗微生物资源的来源，也可为开发成柑橘保鲜剂奠定基础。
对解淀粉芽孢杆菌HY2-1进行全基因组测序，发现该菌株基因组中含有编码多种脂肽类和聚酮类活性物质的相关合成基因簇，其中罗克霉素(locillomycin)、大环内酯H(Macrolactin H)、杆菌素(bacillaene)、丰原素(fengycin)、地非西丁(Difficidin)、铁载体(bacillibactin)、杆菌溶素(bacilysin)等7个次级代谢产物的基因簇与已知基因簇具有100％相似性，表面活性素(surfactin)基因簇与已知基因簇具有91％同源性。经MALDI-TOF-MS质谱分析，解淀粉芽孢杆菌HY2-1可产表面活性素(surfactin)和丰原素(fengycin)这两种脂肽类化合物。
应用解淀粉芽孢杆菌HY2-1的发酵上清液浸泡柑橘，探讨其对柑橘贮藏保鲜的效果。结果表明，解淀粉芽孢杆菌HY2-1发酵上清液能够有效降低柑橘的失重率和腐烂率，并且能够减缓柑橘中可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸、总糖的分解，从而减缓柑橘果实营养的流失。因此，解淀粉芽孢杆菌HY2-1具有开发为柑橘保鲜剂的潜力。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东海洋大学
<120> 一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海洋微生物及其筛选方法与应用
<130> 解淀粉芽孢杆菌HY2-1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1444
<212> DNA
<213> 广东海洋大学
<400> 1
cccgggcgcg tctatactgc agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120
ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg 180
gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca 240
aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360
gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac 420
aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540
aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 600
tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 720
acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct 1260
gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt atgagccagc cgccgaacta 1440
accc 1444
Claims (3)
1.一株解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens ）菌株 HY2-1，所述菌株的保藏编号为 CCTCC NO：M 20211637。
2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株 HY2-1在拮抗指状青霉上的应用。
3.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株 HY2-1的无菌发酵上清液在制备柑橘保鲜剂上的应用。
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| 拮抗菌Bs43的鉴定、抑菌机理及其对采后柑橘绿霉病的生防效果;吕捷等;《果树学报》;第31卷(第05期);第852-892页 * |
| 柑桔绿霉病拮抗细菌的筛选、鉴定及其抑制效果;郝卫宁等;《中国生物防治学报》;第27卷(第02期);第284-288页 * |
| 柑橘绿霉病拮抗细菌的筛选及其抑制效果;安国栋等;《华中农业大学学报》;第32卷(第03期);第52-56页 * |
| 柑橘酸腐病拮抗菌的筛选及其对柑橘品质的影响;李登勇等;《安徽农业科学》;第47卷(第08期);第186-191页 * |
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