CN109679881B - 一种菠萝泛菌及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植保领域，公开了一种菠萝泛菌，为菠萝泛菌H2(Pantoea ananatis H2),保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为M2018844，本发明还提供了上述菠萝泛菌在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物以及由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病药物中的应用。本发明还提供了一种含有上述菠萝泛菌的微生物菌剂以及微生物菌剂的制备方法，并提供了上述微生物菌剂在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物以及由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病药物中的应用。本发明的菠萝泛菌P.ananatis H2能够同时对枯萎病和炭疽病具有很强的抑菌作用，且对尖孢镰刀菌的抑菌率达到92.7％，具有优良的抑菌效果，其具有良好的开发应用前景。

Description

一种菠萝泛菌及其菌剂和应用

技术领域

本发明涉及植保领域，具体涉及一种菠萝泛菌及其菌剂和其在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物以及由灰葡萄孢引起的植物灰霉病药物中的应用。

背景技术

尖孢镰刀菌(F.oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌属半知菌类(Imperfecti fungi)、从梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)。胶胞炭疽病病原菌也是农业生产上较为常见的一种真菌病原菌，它引起的梨树上的病害在黄河故道梨产区普遍发生，尤其对砀山酥梨危害明显，2008年，砀山地区暴发梨炭疽病，病果率达到70％以上，造成严重的经济损失，该病原菌同样能引起油茶叶和凤梨叶上的炭疽病等。

然而，目前以上病害防治仍以化学农药为主，而化学农药有污染环境、对人畜不安全、破坏生态环境等弊端。生物防治具有环境友好、易降解、对人畜无害等优点，是防治植物病害的可行方案。其中芽胞杆菌(Bacilus)是一类较常见的生防菌筛选对象，对其展开的生防研究较多。有研究报道，泛菌属菠萝泛菌Pantoea ananatis P-Y2-2对半夏软腐病具有很好的拮抗作用，该研究结果表明了菠萝泛菌对细菌性病原菌的生防潜力；王志刚等报道了菠萝泛菌HYL01菌株及其在促进西瓜根系生长中的应用，该申请表明菠萝泛菌对植物有一定的促生作用。然而，目前关于菠萝泛菌在多种植物真菌病害上的防治研究报道很少。

发明内容

本发明为解决上述问题，提供了一种菠萝泛菌Pantoea ananatis H2及其菌剂以及其在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物以及由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病药物中的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种菠萝泛菌，该菠萝泛菌Pantoeaananatis H2为自患病的兰花根际土壤筛选得到的，结合生理生化特征和分子特征鉴定为菠萝泛菌，并命名为Pantoea ananatis H2，其于2018年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为M2018844。

经试验证明，上述菠萝泛菌对胶胞炭疽病病原菌具有拮抗作用，本发明提供了上述菠萝泛菌在抑制胶胞炭疽病病原菌中的应用。

经试验证明，上述菠萝泛菌对尖孢镰刀菌具有抑制效果，本发明提供了上述菠萝泛菌在抑制尖孢镰刀菌中的应用。

本发明还提供了上述菠萝泛菌在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物中的应用，所述植物病害为油茶炭疽病、梨炭疽病和凤梨炭疽病。

本发明还提供了上述菠萝泛菌在制备预防或治疗由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病药物中的应用，所述植物为百合、大花蕙兰、蝴蝶兰、葡萄和金线莲。本发明还提供了一种微生物菌剂，包含上述菠萝泛菌。

本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，将上述菠萝泛菌接种于LB培养基中培养得到所述微生物菌剂。

该微生物菌剂制备方法简单，生长速度快，培养时间短，生产成本低。

本发明还提供了上述微生物菌剂在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物中的应用，其特征在于，所述植物病害为油茶炭疽病、梨炭疽病和凤梨炭疽病。

本发明还提供了上述微生物菌剂在制备预防或治疗由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病药物中的应用，其特征在于，所述植物为百合、大花蕙兰、蝴蝶兰、葡萄和金线莲。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明的菠萝泛菌P.ananatis H2分离自兰花植株根际土壤，具有稳定的生态环境和生防作用；

2、本发明的菠萝泛菌P.ananatis H2能够同时对尖孢镰刀菌和胶胞炭疽病原菌具有很强的拮抗作用，且对尖孢镰刀菌的抑菌率达到92.7％，具有优良的抑菌效果，其具有良好的开发应用前景；

3、本发明的微生物菌剂制作容易，生长速度快，液体培养代谢产物只需要在液体培养基中培养10-24h即可获得很好的拮抗效果，相比一般细菌、真菌大大缩短了培养时间，降低了生产成本；

4、本发明的菠萝泛菌P.ananatis H2具有溶磷固氮、分泌植酸酶的能力，能够促进植物的生产，在农业生产上有较大的应用价值。

附图说明

图1为本发明菠萝泛菌P.ananatis H2菌落和革兰氏染色后显微形态示意图；

图2为本发明菠萝泛菌P.ananatis H2溶磷作用示意图；

图3为本发明菠萝泛菌P.ananatis H2固氮作用示意图；

图4为本菠萝泛菌P.ananatis H2产植酸酶能力示意图；

图5为本发明菠萝泛菌P.ananatis H2的无菌滤液对胶胞炭疽病病原菌(Colletotrichum.Gloeosporioides)的抑菌效果图；

图6为本发明菠萝泛菌P.ananatis H2的无菌滤液对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑菌效果图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1胶胞炭疽病病原菌和尖孢镰刀菌拮抗菌的筛选和鉴定

1、拮抗菌的筛选

a.拮抗菌的分离纯化

取患病的兰花植株根际土样10g加入到盛有90mL无菌水和30～50颗玻璃珠的三角瓶中，制成1:10浓度的悬浮液，在28℃，180rpm摇床中震荡20～30min后，将菌液放置在75～85℃的水浴锅中保持12～18min。将1mL土壤悬浮液移入盛有9mL无菌水的试管中，制成10^-2的菌悬液，依次稀释，制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液。梯度稀释后，分别吸取100μL稀释倍数为10^-3-10^-6的菌悬液均匀涂布在分离培养基-牛肉膏蛋白胨培养基上，培养基配方如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH为7.2～7.4。将涂布有菌悬液的平板置于30℃培养箱中1周，24h后随即观察分离培养基上菌落状态，用三步划线法进行分离纯化，统一编号登记。菌种保藏：接种斜面后，可在4℃短暂保藏，用50％(V/V)甘油作为保护剂，可在-80℃长久保藏。

b.拮抗菌的初筛

采用点接法初筛，先筛选出能拮抗胶胞炭疽病病原菌(Colletotrichum.Gloeosporioides)的细菌，将打好直径为7mm的胶胞炭疽病病原菌菌饼放置在PDA平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌等距离(距平板中央1.5cm)点接拮抗细菌(依次选择H1、H2、H3…H15中的4个菌株)，置于28℃恒温培养箱培养，5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复三次。然后进一步筛选出能拮抗尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的拮抗细菌，将打好直径为7mm的病原菌并放置PDA平板中心，然后用无菌亚恰蘸取待测菌等距离(距平板中央1.5cm)点接拮抗菌，置于25℃恒温培养箱中培养，5天后观察抑菌带有无及其大小，每个处理重复3次，进一步筛选抑菌直径大于5mm的菌株。

c.拮抗菌的复筛

采用培养法复筛：分别将初筛筛得的拮抗菌滤液与约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央分别放入直径为7mm的胶胞炭疽病病原菌菌饼和尖孢镰刀菌饼，以无菌水为对照，每个处理重复三次。5天后测量病原菌菌落直径，筛选出同时对胶胞炭疽病病原菌和尖孢镰刀菌具有拮抗作用的菌株，为菌株H2。

2、拮抗菌株H2的鉴定

a.拮抗菌株H2的形态学和生理生化特征

菌株H2形态：筛选出的拮抗菌株H2在LB固体培养基上生长为黄色，不透明，菌落呈近圆形，表面光滑湿润，显微镜下观察单个菌为杆状，周生鞭毛运动，无芽孢，革兰氏染色为红色，属于革兰氏阴性菌，照片如图1所示。

菌株H2生理生化特征：

利用无机磷培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)来检测该细菌是否具有溶磷的能力，结果如图2所示，该菌能够在无机磷培养基上产生透明圈，具有溶磷能力。

利用阿须贝氏培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)来检测该菌是否具有固氮的能力，结果如图3所示，该菌能在无氮培养基上生长，具备固氮能力。

利用植酸酶检测培养基(葡萄糖30g、七水硫酸铵5g、氯化钾0.5g、植酸钙1g、七水硫酸镁0.5g、硫酸锰0.05g、七水氯化铁0.05g、琼脂18g，定容至1000mL，pH调至7.0)检测该菌是否具有分泌植酸酶能力，结果如图4所示，该菌能产生较大的透明圈，说明该菌具有很强的分泌植酸酶的能力。

该菌株最适生长温度为27～30℃，氧化酶反应阴性，接触酶阳性，能分别利用甘油、D-阿拉伯糖、山梨醇、纤维二糖、乳糖、有分泌纤维素酶的能力。

b.拮抗菌株H2的分子学鉴定

将菌株H2进行培养，提取DNA，进行16S rDNA测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示(片段长度为1440bp)，

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将SEQ ID NO:1所示的序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST分析，选取7株菌株用Clustal X2.1进行多序列比对分析，菌株H2与GenBank中登录号为KY458565.1(P.ananatis strain AS01)菌株聚类到一起，且同源性达到98％，一般认为16S rDNA序列同源性大于97％，可认为属于同一个种。

结合上述形态和部分生理生化特征，判断该拮抗菌株H2属于菠萝泛菌，命名为菠萝泛菌P.ananatis H2。

实施例2利用菠萝泛菌P.ananatis H2制备微生物菌剂

将LB平板或者斜面上的H2菌落挑取一环转接到试管活化，30℃摇床培养16h，转速150rpm，试管中LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0；活化后的菌液按照1％-3％的接种量接种到装有100mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，转速150rpm，35℃摇床培养10h-24h，当菌含量大于2×10⁸cfu/mL以上即可获得发酵菌液，储存作为微生物菌剂。

实施例3菠萝泛菌P.ananatis H2对胶胞炭疽病病原菌的拮抗作用

1、将实施例2制得的微生物菌剂经过经过10000r/min室温离心20min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，得到拮抗菌滤液；

2、取拮抗菌滤液与灭菌后约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的胶胞炭疽病病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复，5天后测量病原菌菌落直径。

无菌滤液抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－0.7)×100％。

结果如图5显示，菠萝泛菌P.ananatis H2对胶胞炭疽病病原菌的抑菌率均达到70.58％。

实施例4菠萝泛菌P.ananatis H2对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑菌效果

1、将实施例2制得的微生物菌剂经过经过10000r/min室温离心20min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，得到拮抗菌滤液；

2、取拮抗菌滤液与灭菌后约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复，5天后测量病原菌菌落直径。

无菌滤液抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－0.7)×100％。

结果如图6所示，菠萝泛菌P.ananatis H2对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑菌率均达到92.7％。

实施例5菠萝泛菌P.ananatis H2对胶胞炭疽病原菌引起的离体梨叶片炭疽病的防治作用

在LB培养液中接种菠萝泛菌P.ananatis H2，30℃、180r/min振荡培养16h，获得拮抗菌株的活菌悬液备用。在健康的梨植株上，采取生长良好且大小相似的叶片，用流水轻轻冲洗数次，然后在75％的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗干净后，放在无菌滤纸上晾干。将拮抗菌株发酵液用无菌棉花均匀涂抹在梨叶片上，将叶片放入铺有无菌滤纸(滤纸用无菌水完全浸湿)的培养皿中，48h后在叶片上接种一块直径为6mm的胶胞炭疽病原菌菌丝块。以在无菌水中浸泡作为对照。每处理重复3次，25℃培养3d后，检查叶片发病情况，计算防治效果。防治效果(％)＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100。

试验结果如表1所示，菠萝泛菌P.ananatis H2对离体梨叶片炭疽病有较好的防治效果。对照组梨叶片发病严重，病原菌菌丝茁壮，病部表面产生浓密灰色霉层，后期凡菌丝触及的地方叶片腐烂。与对照组相比，拮抗菌株处理叶片上出现较小水渍状病斑，无菌丝生长，生防菌对炭疽病的发生和蔓延起到了有效的控制作用，其病原菌接种后3d防病效果为42.46％，5d防病效果为41.07％。

表1菠萝泛菌P.ananatis H2对梨离体叶片炭疽病的生防效果

实施例6菠萝泛菌P.ananatis H2对由尖孢镰刀菌(F.oxysporum)引起的离体葡萄叶片枯萎病的防治作用。

在LB培养液中接种菠萝泛菌P.ananatis H2，30℃、180r/min振荡培养16h，获得拮抗菌株的活菌悬液备用。在健康的葡萄植株上，采取生长良好且大小相似的叶片，用流水轻轻冲洗数次，然后在75％的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗干净后，放在无菌滤纸上晾干。将拮抗菌株发酵液用无菌棉花均匀涂抹在葡萄叶片上，将叶片放入铺有无菌滤纸(滤纸用无菌水完全浸湿)的培养皿中，48h后在叶片上接种一块直径为6mm的尖孢镰刀菌菌丝块。以在无菌水中浸泡作为对照。每处理重复3次，25℃培养3d后，检查叶片发病情况，计算防治效果。防治效果(％)＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100。

试验结果如表2所示，菠萝泛菌P.ananatis H2对离体葡萄叶片枯萎病有较好的防治效果。对照组枯萎病叶片发病严重，病原菌菌丝茁壮，后期凡菌丝触及的地方叶片腐烂。与对照组相比，拮抗菌株处理叶片上出现较小的病斑，无菌丝生长，生防菌对枯萎病的发生和蔓延起到了有效的控制作用，其病原菌接种后3d防病效果为46.85％，5d防病效果为36.53％。

表2菠萝泛菌P.ananatis H2对葡萄离体叶片枯萎病的生防效果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北工程学院

<120> 一种菠萝泛菌及其菌剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)

<400> 1

catgatcaag tggtagcgcc ctcccgaagg ttaagctacc tacttctttt gcaacccact 60

cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgt ggcattctga 120

tccacgatta ctagcgattc cgacttcacg gagtcgagtt gcagactccg atccggacta 180

cgacgcactt tatgaggtcc gcttgctctc gcgaggtcgc ttctctttgt atgcgccatt 240

gtagcacgtg tgtagcccta ctcgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc 300

ctccggttta tcaccggcag tctcctttga gttcccgacc gaatcgctgg caacaaagga 360

taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatttca caacacgagc tgacgacagc 420

catgcagcac ctgtctcacg gttcccgaag gcaccaaagc atctctgcta aattctctgg 480

atgtcaagag taggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540

tgtgcgggcc cccgtcaatt catttgagtt ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt 600

cgacttaacg cgttagctcc ggaagccact cctcaaggga acaacatcca cgtcgacatc 660

gtgtacggcg tggagtacca gagtatataa tcttgtgtgc tccccacgct ctcgcacatg 720

agcgtcagtg ttcgtccagg gggccgcgtt cgccaccggt attcttccag atctctacgc 780

acatcaccgc tacacacgga attctacccc cctctacgag agtcaagcct gccagtttca 840

aatgcagttc ccaggttaag cccggggatt tcacatatga gttaacagac cgcgtgcgtg 900

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cacggagtta gccggtgctt cttttgcggg taacgtcaat caacacggtt attaaccaca 1020

tcgccttcct ccccgctgaa agtactttac aacccgaagg ccttcttcat acacgcggca 1080

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agtggttatc cccctctatc gggcagatcc ccagacacta ctcacccgtc cgccactcgt 1380

cacccgagga gcaagctcct ctgtgctacc gtccgactgc atggtaggct gcgcaaggcc 1440

Claims (7)

1.一种菠萝泛菌，其特征在于，为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)H2,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为M2018844。

2.一种如权利要求1所述的菠萝泛菌在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物中的应用，其特征在于，所述植物病害为梨炭疽病。

3.一种如权利要求1所述的菠萝泛菌在制备预防或治疗由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病药物中的应用，其特征在于，所述植物为葡萄。

4.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的菠萝泛菌。

5.一种如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将所述菠萝泛菌接种于LB培养基中培养得到所述微生物菌剂。

6.一种如权利要求4所述的微生物菌剂在制备预防或治疗由胶胞炭疽病病原菌引起的植物病害药物中的应用，其特征在于，所述植物病害为梨炭疽病。

7.一种如权利要求4所述的微生物菌剂在制备预防或治疗由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病药物中的应用，其特征在于，所述植物为葡萄。

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