CN109134625B

CN109134625B - 一种菠萝泛菌蛋白激发子hcp及其功能

Info

Publication number: CN109134625B
Application number: CN201810919191.XA
Authority: CN
Inventors: 申永瑞; 刘权; 殷奎德; 向君亮; 刘爽; 李章雷
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-08-14
Also published as: CN109134625A

Abstract

本发明涉及一种菠萝泛菌蛋白激发子Hcp，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及了上述菠萝泛菌蛋白激发子Hcp的功能以及确定了菠萝泛菌蛋白激发子Hcp的功能区KH18。本发明发现了Hcp蛋白的激发子功能，能够促进植物生长，提高植物抗病、耐盐碱、抗干旱和耐低温能力，鉴定了Hcp蛋白的功能区，为生物防治工作积累了新的材料。

Description

一种菠萝泛菌蛋白激发子HCP及其功能

技术领域

本发明属于植物保护与生物防治领域，涉及一种菠萝泛菌蛋白激发子HCP及其功能。

背景技术

植物在生长过程中与周围环境紧密关联，植物对环境影响会做出相应的反应，来避免危害发生。由此发展而来的激发子对植物病害防治和抗逆作用的研究成为一个新的研究方向。激发子是一类来自于病原物本身，能够作用于植物并诱导植物产生防卫反应的化合物。激发子是诱导植物自身免疫防卫体系发生作用，综合提高植物自身代谢水平，增强防御病害和自然胁迫的能力，进而提高作物产量和品质。激发子不作用于病原物，因此不会使病原物产生抗药性，对环境也不会产生有害影响，具有开发为综合性生物制剂的潜力。

植物病原细菌依靠自身的分泌系统向植物细胞内分泌致病蛋白，从而引起细胞病变，导致植物发生病害。迄今为止，细菌中已经发现七种不同的分泌系统，即I型-VII型。目前，与激发子功能最为相关的是III型分泌系统（Type 3 Secretion System, T3SS），著名的蛋白激发子Harpin家族就是T3SS的组成部件。该系统由Hrp基因家族编码，主要功能是组装复杂的纤毛和分泌致病蛋白。T3SS的纤毛为注射器状结构，横跨细菌的内外膜，并可穿过植物细胞的细胞壁和细胞膜，与植物细胞发生互作，激发植物的过敏反应和一系列的防卫反应。

VI型分泌系统（Type 6 Secretion System，T6SS）由15-23种不同的蛋白质组装在细菌表面形成反向的噬菌体状结构，并通过这种类似注射器的结构向宿主细胞注入效应蛋白。T6SS的结构装置与T3SS相似，都是横跨细菌细胞内膜-周质-外膜，将致病蛋白转运出去并直接到达宿主细胞内。早期的研究主要集中在T6SS在细菌间拮抗的功能，近年来陆续有报道发现T6SS参与了病原菌引发植物病害的过程，但并未见T6SS作为激发子的功能报道。

HCP蛋白是T6SS噬菌体尾部的组成部分，通过自身形成叠层六聚体环构成管状结构，在T6SS侵染宿主细胞时起到了穿透宿主细胞膜的作用。由于HCP蛋白能够在T6SS侵染植物细胞时与植物细胞膜接触，具备了引起植物的过敏反应及防卫反应的先决条件，即具备激发子功能的理论基础。但目前并未有研究报道HCP蛋白具有激发子活性。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种菠萝泛菌蛋白激发子HCP，对HCP蛋白的激发功能进行研究验证。

本发明的第二目的是提供上述菠萝泛菌蛋白激发子HCP的功能。

本发明的第三目的是提供上述菠萝泛菌蛋白激发子HCP的功能区KH18。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种菠萝泛菌蛋白激发子HCP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

二、上述的菠萝泛菌蛋白激发子HCP在激发植物功能中的应用。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物抗病性。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物抗盐碱胁迫。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物抗干旱能力。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物耐低温能力。

进一步的，所述的激发植物功能为促进植物生长。

三、上述的菠萝泛菌蛋白激发子HCP的功能区KH18，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

首先将HCP（SEQ ID NO:1，GenBank登录号：WP_013026243.1）的编码基因（SEQ IDNO:2，GenBank登录号：NC_013956.2）进行全基因合成并亚克隆到pET28a载体上，转化到BL21（DE3）感受态细胞中，获得HCP蛋白的表达菌。通过IPTG诱导表达和His-Tag亲和纯化得到HCP的重组蛋白样品。

随后对蛋白激发子HCP 对植物的激发功能进行了细致的研究，发现该蛋白能够提高植物体内与抗逆相关的蛋白酶活性，促进玉米的生长，提高烟草对病原菌丁香假单胞菌的抗性，提高玉米的耐盐碱胁迫的能力，提高玉米的抗干旱和耐低温能力。

最后，本发明还通过三维结构模拟，分析预测了HCP蛋白的功能区，通过过敏反应实验确认多肽KH18为HCP蛋白的激发功能活性区域。

采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了HCP蛋白的激发子功能，能够促进植物生长，提高植物抗病、耐盐碱、抗干旱和耐低温能力，鉴定了HCP蛋白的功能区，为生物防治工作积累了新的材料。

附图说明

图1为HCP重组蛋白纯化样品的SDS-PAGE结果。M为蛋白质分子量Marker，1为经过亲和纯化的洗脱样品；

图2为HCP重组蛋白引发番茄的过敏反应。CK为对照处理，1为重组HCP蛋白处理。

图3为HCP重组蛋白激发烟草对丁香假单胞菌的抗性。1为CK，2为重组HCP蛋白。

图4为HCP蛋白的三维结构模型。KH18为预测的激发子功能区。

图5为多肽KH18引发番茄的过敏反应。CK为对照处理，1为多肽KH18处理。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。

本发明中生物材料的来源：

1、所用的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.3070。

2、多肽为委托上海楚肽生物科技有限公司合成。

实施例1

蛋白激发子HCP的原核表达与分离纯化。

将HCP蛋白（GenBank登录号为WP_013026243.1）的基因序列（GenBank登录号为NC_013956.2）交由北京华大基因生物有限公司进行全基因合成，并亚克隆到pET28a载体上，转化BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性克隆。经IPTG诱导进行原核表达，收集菌体，超声破碎后的上清液使用His-Tag亲和纯化柱进行亲和纯化，洗脱样品进行SDS-PAGE，检测重组HCP蛋白。将HCP蛋白浓度调整至1mg/mL，进行过敏反应测试。用注射器在番茄叶片注射20μL，以20mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）为CK。由结果可以看出，HCP重组蛋白已成功获得（图1），并具备引起番茄叶片过敏反应的效果（图2）。

实施例2

蛋白激发子HCP对番茄的防御性蛋白酶活性的影响。

将纯化后的蛋白激发子HCP样品（50μg/mL）涂抹至番茄叶片上，重复三个叶片，以20mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）为CK。24小时后取 0.5g新鲜番茄叶片，加3mL Tris缓冲液（50mM pH=7.8）研磨，4℃下10000g离心10min，取上清酶液用于酶活测定。

超氧化物歧化酶（SOD）比活性测定：取50μL上清酶液，CK为50μL Tris缓冲液（50mMpH=7.8），分别加入3mL反应液（50mM Tris缓冲液:130mM甲硫氨酸:750μM四氮唑蓝:100μMEDTA-Na₂:20μM 核黄素:H₂O=15:3:3:3:3:2.5），混匀后在 4000LUX光照度下反应30min，于560nm下进行比色。以放在黑暗处遮光放置30min的试管调零。

SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A_CK-A_E）×V/（W×0.5×Vt×A_CK）。

A_CK为CK处理组的光吸收值，A_E为上清酶液处理的光吸收值，W、FW为样品鲜重，V为样品总体积，Vt为酶液用量。

过氧化氢酶（CAT）活性测定：取上清酶液100μL加入比色杯中，CK为50μL Tris缓冲液（50mM pH=7.8），然后迅速加入3 mL反应液（100mM H₂O₂:50mM Tris=1:4），读取240nm下的光吸收值，每隔一分钟读取一次数值，共读取3次。

CAT活性（△240/min·gFW）=△240×V/Vt/W。

△240为每分钟吸光值的变化差值，W、FW为样品鲜重，V为酶液总体积，Vt为测定用酶液体积。

过氧化物酶（POD）活性测定：取 50μL上清酶液加入比色杯中，对照加入 50μL的Tris缓冲液（50mM pH=7.0），然后快速加入3mL反应液（50mL Tris缓冲液+28μL愈创木酚+19μL 30% H2O2），读取470nm下的光吸收值，每隔一分钟读取一次数值，共读取3次。

POD活性（△470/min·gFW）=△470×V/Vt/W。

△470为每分钟吸光值的变化差值，W、FW为样品鲜重，V为酶液总体积，Vt为测定用酶液体积。

结果显示（表1），与CK相比，HCP处理的番茄的蛋白酶活性均具有明显提升，其中，SOD活性提升了39.3%，具有极显著性差异（p<0.01）；CAT活性提升了38.3%，具有显著性差异（p<0.05）；POD活性提升了136.8%，具有极显著性差异（p<0.01）。由于以上几种蛋白酶均是植物体内与逆境胁迫相关的防御性蛋白酶，因此可以说明蛋白激发子HCP能够激发番茄的防卫反应。

表1 蛋白激发子HCP对番茄的防御性蛋白酶活性的影响

处理	SOD活性（U/g·FW）	CAT活性（△240/min·gFW）	POD活性（△470/min·gFW）
				CK	35.17 ±3.06B	7.47±0.93b	16.33±2.08B
HCP	49.00 ±2.65A	10.33±1.04a	38.67±1.53A

实施例3

蛋白激发子HCP促进玉米生长的作用。

取健康饱满的玉米种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中进行催芽，出芽后转移至100mL三角瓶，加Hogland营养液进行培养，每瓶6株玉米。玉米生长7天时使用蛋白激发子HCP样品（50μg/mL）涂抹至玉米叶片，以Tris缓冲液（20mM Tris，pH 7.5）为对照，每个处理重复三次。7天后统计玉米株高和鲜重。由结果可见（表2），经过蛋白激发子HCP处理的玉米植株株高和鲜重均明显高于CK处理组，其中株高提升了20.3%，达到显著差异（p<0.05），鲜重提升了78.6%，达到极显著差异（p<0.01）。这说明蛋白激发子HCP能够促进玉米生长。

表2 蛋白激发子HCP促进玉米生长的结果

处理	株高（cm）	鲜重（g）
			CK	25.40±1.97b	1.68±0.07B
HCP	30.57±0.45a	3.00±0.13A

实施例4

蛋白激发子HCP提高烟草抗病性的作用。

将纯化后的蛋白激发子HCP样品（50μg/mL）涂抹至烟草叶片上，重复三个叶片，以Tris缓冲液（20mM Tris，pH 7.5）为对照。处理1天后接种病原菌。丁香假单胞菌在LLB培养基（蛋白胨10/L、酵母粉5g/L、NaCl 0.5g/L，pH 7.2）中培养至OD₆₀₀为0.5，使用蒸馏水稀释100倍，使用1mL无针头注射器在烟草背面进行注射接种。接种后三天观察病斑形成情况。从图3中可以看出，经过HCP处理的烟草叶片上病斑面积明显减小，且发病程度也轻于对照，说明HCP能够激发烟草对丁香假单胞菌的抗性。

实施例5

蛋白激发子HCP促进玉米耐盐碱胁迫的作用。

取健康饱满的玉米种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中进行催芽，出芽后转移至100mL三角瓶，加Hogland营养液进行培养，每瓶10株玉米。玉米生长7天时使用蛋白激发子HCP样品（50μg/mL）涂抹至玉米叶片，以Tris缓冲液（20mM Tris，pH 7.5）为对照，加入15mM的NaHCO₃（pH 8.5）进行盐碱胁迫，每个处理重复三次，7天后观察植株萎蔫程度，统计植株存活率。结果发现CK组的植株存活率为20.0%，HCP处理组的植株存活率为66.7%（表2），表明HCP能够提升玉米耐盐碱胁迫的能力。

表3 蛋白激发子HCP提高玉米耐盐碱胁迫能力的结果

处理	存活数（株）	存活率（%）
			CK	2.00±1.00B	20.0
HCP	6.67±0.58A	66.7

实施例6

蛋白激发子HCP促进玉米抗干旱的作用。

取健康饱满的玉米种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中进行催芽，出芽后转移至三角瓶，加Hogland营养液进行培养，每瓶6株玉米。玉米生长7 天时使用蛋白激发子HCP样品（50μg/mL）涂抹至玉米叶片，以Tris缓冲液（20mM Tris，pH 7.5）为对照，将Hogland营养液替换为15%的PEG8000溶液，7天后统计幼苗存活率和叶片抗衰度。计算幼苗抗旱综合系数。各处理均重复3次。

幼苗存活率（%）＝（

）×0.5×100

叶片抗衰度（%）＝（叶片绿色段长/叶片全长）×100

幼苗抗旱综合系数＝（苗存活率+叶片抗衰度）/2

对玉米进行PEG干旱胁迫后，对照组的玉米大部分萎蔫时，而蛋白激发子HCP处理组的玉米生长良好，仍保持直立状态。蛋白激发子HCP处理的玉米幼苗存活率比对照提高73.1% ，叶片抗衰度提高94.2%，苗抗旱综合系数从35.61提高到65.45，均达到极显著差异（p<0.01）（表3）。说明蛋白激发子HCP激发了玉米抗旱性的提升。

表4 蛋白激发子HCP提高玉米抗旱性的结果

处理	幼苗存活率（%）	叶片抗衰度（%）	幼苗抗旱综合系数
				CK	40.82±1.31B	23.31±1.15B	35.61±2.20B
HCP	70.64±2.68A	45.26±3.32A	65.45±3.32 A

实施例7

蛋白激发子HCP促进玉米耐低温的作用。

取健康饱满的玉米种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中进行催芽，出芽后转移至三角瓶，加Hogland营养液进行培养，每瓶6株玉米。玉米生长7天时使用蛋白激发子HCP样品（50μg/mL）涂抹至玉米叶片，以Tris缓冲液（20mM Tris，pH 7.5）为对照，转移至低温培养箱（16℃）中进行生长，7天后统计植株株高和鲜重。由结果可以看出（表4），经过蛋白激发子HCP处理的玉米植株在低温条件下生长明显优于CK，株高提升了51.0%，达到极显著差异（p<0.01），鲜重提升了55.7%，达到显著差异（p<0.05），说明蛋白激发子HCP能够提高玉米在低温下的耐低温能力。

表5 蛋白激发子HCP提高玉米耐低温能力的结果

处理	株高（cm）	鲜重（g）
			CK	10.37±0.31B	1.06±0.27b
HCP	15.66±0.83A	1.65±0.22a

实施例8

HCP蛋白激发子活性功能区的鉴定。

将HCP蛋白使用SWISS-MODEL进行三维结构模型模拟，获得HCP蛋白的空间结构（图4），对三级结构进行分析，选取一段氨基酸序列KH18作为可能的功能区（表6），利用固相多肽合成技术进行合成，合成的多肽N端乙酰化，C端酰胺化，纯度达到95%以上。多肽以1mg/mL的终浓度溶解于20mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中，进行过敏反应测试。用注射器在番茄叶片注射20μL，以20mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）为CK。结果显示（图5），KH18能够引起番茄叶片的过敏反应，具备激发子活性。因此，确定多肽KH18为HCP蛋白的激发子活性功能区。该功能区的鉴定摒除了HCP蛋白中与激发功能无关的冗余氨基酸序列，在进行重组表达时能够大幅度降低无效表达产物的比例，且由于其自身片段更小，更适合与其它功能的多肽进行融合表达，形成多功能蛋白产物。

表6 预测的HCP蛋白激发子活性的功能区

二级结构	位置	氨基酸序列	命名
				α-螺旋	61-78	KIDKAVTALLKNCASGKH	KH18

本发明发现了一种未知功能的蛋白HCP的蛋白激发子活性，并进一步确认了该蛋白对植物的激发功能，包括促进植物生长，提高植物抗病、耐盐碱、抗干旱和耐低温能力，此外还鉴定了HCP蛋白的激发子活性功能区，为生物防治工作积累了新的材料。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 一种菠萝泛菌蛋白激发子Hcp及其功能

<130> B008

<141> 2018-08-14

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 160

<212> PRT

<213> 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)

<400> 1

Met Ala Ile Asp Met Tyr Leu Lys Val Asp Gly Ile Thr Gly Glu Ser

1 5 10 15

Lys Asp Ser Asn His Thr Gly Trp Ile Asp Ile Thr Ser Phe Ser Trp

20 25 30

Gly Ala Asn Gln Pro Gly Asn Met Ser Val Gly Gly Gly Gly Gly Ala

35 40 45

Gly Lys Val Asn Phe Asn Asp Leu His Ile Asn Ala Lys Ile Asp Lys

50 55 60

Ala Val Thr Ala Leu Leu Lys Asn Cys Ala Ser Gly Lys His Val Thr

65 70 75 80

Lys Val Glu Val Ser Val Cys Lys Ala Gly Gly Thr Gln Ile Glu Tyr

85 90 95

Thr Arg Ile Thr Leu Glu Asp Val Leu Val Thr Asn Val Gln Phe Val

100 105 110

Gly Ser Glu His Asp Asp Thr Leu Gly Val Thr Tyr Ala Phe Gln Ala

115 120 125

Ala Lys Val Lys Gln Gln Tyr Trp Glu Gln Ser Ser Ser Gly Gly Lys

130 135 140

Gly Ala Glu Ser Ser Ala Gly Trp Asn Ile Lys Glu Asn Lys Glu Ala

145 150 155 160

<210> 2

<211> 483

<212> DNA

<213> 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)

<400> 2

atggctattg atatgtattt gaaggtagac ggtattactg gtgaatctaa agattcaaac 60

cataccggct ggattgatat tacctctttc tcctggggcg ctaatcagcc gggtaatatg 120

agcgtgggcg gcggcggcgg tgctggtaaa gtaaacttca acgacctgca cattaatgcc 180

aaaatcgaca aggctgtcac tgcgctgttg aaaaactgtg ccagtggtaa gcacgtcact 240

aaggttgaag tttcagtttg caaggctggc ggtacgcaaa tcgagtacac ccgcatcacc 300

ctggaagacg tgctggtcac caacgtacag ttcgtgggct ctgagcacga tgatacgctg 360

ggcgtaacct atgcattcca ggctgcgaaa gtgaaacagc agtactggga gcagagctct 420

tctggcggta aaggcgcaga aagcagcgct ggctggaata tcaaagagaa caaagaagca 480

taa 483

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)

<400> 3

Lys Ile Asp Lys Ala Val Thr Ala Leu Leu Lys Asn Cys Ala Ser Gly

1 5 10 15

Lys His

Claims

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的菠萝泛菌蛋白激发子HCP在提高番茄体内防御性蛋白酶活性中的应用。

2.一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的菠萝泛菌蛋白激发子HCP在提高烟草抗病性中的应用。

3.一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的菠萝泛菌蛋白激发子HCP在促进玉米生长、或促进玉米耐盐胁迫、或促进玉米抗干旱、或促进玉米耐低温中的应用。

4.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的菠萝泛菌蛋白激发子HCP的功能区KH18，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。