CN110452898A

CN110452898A - 东亚飞蝗fkbp46蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110452898A
Application number: CN201910835042.XA
Authority: CN
Inventors: 王广君; 田野; 李贝贝; 涂雄兵; 农向群; 张泽华
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2019-11-15

Abstract

本发明属于农业生物领域，具体涉及东亚飞蝗FKBP46蛋白及其编码基因和应用。本发明的东亚飞蝗FKBP46蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过饲喂FKBP46纯化蛋白，并测定蝗虫体内POD和SOD的酶活力，发现经绿僵菌侵染后的蝗虫死亡率大大提高，且经FKBP46处理后蝗虫体内的两种酶活力都显著降低。因此，FKBP46蛋白具有免疫抑制作用，其能够作为正调控因子加强病菌的侵入引起的免疫抑制反应。

Description

东亚飞蝗FKBP46蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物领域，具体涉及东亚飞蝗FKBP46蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

绿僵菌可通过体壁和消化道进入昆虫体内致使昆虫死亡，其侵染过程可以分泌多种胞外蛋白酶，会导致蝗虫体内的保护酶的酶活性先升高后降低至使蝗虫免疫降低，导致蝗虫的死亡。

FK506结合蛋白(FK506 binding protein)是一类能与大环内酯类免疫抑制剂FK506和雷帕霉素特异性结合的高度同源的受体类蛋白家族，在原核生物与真核生物细胞中广泛存在且含量丰富。FK506结合蛋白具有肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)活性，可催化多肽或蛋白质底物中的肽-脯氨酸顺反子的转换，从而影响蛋白活性、磷酸化状态、蛋白质间相互作用、亚细胞定位及稳定性。FK506结合蛋白还有许多其它的重要的生理功能，如细胞周期的调节、通道活性的调节以及在发育上的作用等。当大环内酯类免疫抑制剂FK506与FK506结合蛋白结合后，FK506特有的立体化学结构就抑制了FK506结合蛋白的肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)活性，进而发挥其免疫抑制效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种东亚飞蝗FKBP46蛋白。

本发明的再一目的在于提供上述蛋白的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述蛋白的应用。

本发明的再一目的在于提供含有上述蛋白的生防制剂。

根据本发明具体实施方式的东亚飞蝗FKBP46蛋白，其是一种FK506结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明提供东亚飞蝗FKBP46蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGTTTTGGGCACTTGTTTTGGAGCCAGGAAAGAAATATGCACAAACCGTGTCAAAACCATTCCACATATCAATGGCTTCTCTTGATGTAGTGCATTCTGAAAATGAATTGGTGACAGTGAATGTTAACTTCCAGAATGCTGAGTTTATTCTGTGTAATCTACAGAAAAATAAAATTCTTCAGACGTCTCTAGATCTAAACTTTGAGGCAGGAGACAGGATTGCATTCTATACCTCGGGAAAGGGTCGTGTACATTTAACAGGTTATCTAATAGACGACGACGATGTTGACGACGATTTGGATATCGACGCGGAAGCGGAAGAATCGGAAGAAGACGTAACCCCTCAGAAAAATGCTATTAAAGCCAATAAACAAGAAAAGCGGAAGAGTGTGGGACAGACTCCGGGAAAACCAGTATTGAAAAAGAGTAAAATGGACAGTGAAGACGAAGACGGAGTGACGACGGTGATGATTTTGATGACGACGGTGACAGTGATCTCGAAAGCCTAGGAGACAGTGATGAGGAAATGGAAGTAGAAAGTGAAGAAGATGATGGGGAAGAGGATGAGGACTCTGAACTTGAAGAAACACCACCACAGAAACATCAACAAGGAAAGAAAAAAGAGAAACAGAGTGCACAAAAACAGCTACAGGATAAACAAACAAATACTCCAAATGAAATGAAAAAGAAGAAGAACAAGGGGCATGACGCTGCAACTCCAAACACTCCCACTGTTCAGGCAAATGGAACTCCAGAAACACAATCAGGAAAGAAAAATAAGAAGAAAGGTGGTGAAACGCCTGGGGACAAAGGTGCCAATACTCCAAAACCACCTCAGGCTGGGTCACCTCAGACACCGCAGAAGAAGCTCCTGGAGGGCGGAGTGGCTGTGGAAGATACTGTCGTCGGCTCCGGTCCGGTGGCAAAGCCTGGCAGATTCGTAACTGTGTACTACACAGGCCGTTTGAAGCAGAATAACAAGAAGTTTGATGAAACTGTGCAAGGGCCTGGCTTCAAATTTAGACTGGGGAAAGGTGAGGTAATAAAAGGATGGGACATTGGAGTTACAGGAATGAAAGTTGGAGGAAAGAGGAAACTTATTATTCCACCTCACATGGCGTACGGAGCCAAAGGTTCGCCACCAGTTATTCCACCCAACAGTGCGTTAGTATTTGAAGTGGAACTAAAGAATGTAAACTAA

根据本发明的具体实施方式的重组表达载体和重组菌株。本发明构建了pET21b-FKBP46原核表达载体，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得原核表达重组融合蛋白，利用镍柱回收纯化技术，获得目的蛋白。

根据本发明具体实施方式的制备东亚飞蝗FKBP46蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)用包含东亚飞蝗FKBP46蛋白编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导表达东亚飞蝗FKBP46蛋白；

(3)分离纯化东亚飞蝗FKBP46蛋白。

本发明提供东亚飞蝗FKBP46蛋白的应用，尤其是用于防治蝗虫，特别是东亚飞蝗方面。

根据本发明具体实施方式的生防制剂，其中含有东亚飞蝗FKBP46蛋白。当东亚飞蝗FKBP46蛋白与绿僵菌联合使用时，可显著提高蝗虫的杀灭率。本发明的生防制剂可用于防治其他害虫，如棉铃虫等。

本发明的有益效果：

本发明通过饲喂FKBP46纯化蛋白，发现经绿僵菌侵染后的蝗虫死亡率大大提高，进一步测定蝗虫体内POD和SOD的酶活力，经FKBP46处理后蝗虫体内的两种酶活力都显著降低。因此，FKBP46蛋白具有免疫抑制作用，其能够作为正调控因子加强病菌的侵入引起的免疫抑制反应。

附图说明

图1显示FKBP46的PCR产物电泳分析结果，其中，1泳道为DL2000 plus marker，2为FKBP46；

图2显示FKBP46基因表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中，1泳道为FKBP46表达产物，泳道为pet-21b表达产物，3泳道为蛋白标准品；

图3显示FKBP46处理后东亚飞蝗的死亡率；

图4显示FKBP46处理后东亚飞蝗的POD活力；

图5显示FKBP46处理后东亚飞蝗的SOD活力。

具体实施方式

材料与试剂

将绿僵菌接种到马铃薯琼脂培养基(PDAY)平板上，25℃下培养14d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。

将东亚飞蝗纯化种群在人工气候培养箱中孵化温度(30士2)℃，相对湿度(60士5)％，光周期14L:10D孵化后，将同一时间孵化的蝗蛹转移到60cm×50cm×70cm规格的养虫笼中饲养，光周期14L:10D，温度为(30士2)℃。

实施例1获得FKBP46基因和蛋白

1.1FKBP46基因的克隆

用trizol溶液提取东亚飞蝗中肠中的总RNA，用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，并以此为模板进行PCR克隆。

目的基因的引物序列为F:5'CG GGATCC GATGTTTTGGGCACTTGTTTTGG 3'(下划线表示设计的BamHⅠ酶切位点)；R:5'CCC AAGCTT GTTTACATTCTTTAGTTCCAC 3'(下划线表示设计的HindⅢ酶切位点)。

将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，并进行电泳分析，结果如图1所示。FKBP46基因编码400个氨基酸残基。

1..2构建重组表达载体

将纯化产物连接到Pmd19-T Vector载体。并将连接产物加入前期已制备的感受态细胞DH5α中，将LB固体培养基上培养的阳性克隆菌株测序。

将测序成功的重组基因提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切，将酶切的产物连接到PET-21b质粒载体中，转入感受态细胞BL21中，获得PET21b-FKBP46菌株。

1.3重组蛋白的诱导表达和纯化

取重组基因的阳性克隆菌株在LB/Amp液体培养基中37℃，培养至OD值为0.5-0.6，然后加IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，27℃诱导过夜后，用5％浓缩胶和12％分离胶进行SDS-PAGE电泳分析蛋白样品。将诱导蛋白3500rpm离心10min收集菌体。加入预冷的20mMTris-Hcl缓冲液重悬菌体。冰上超声裂解菌体(300w，超声持续5s，暂停5s，重复99个循环)。4℃,12000rpm，离心10min，回收上清，再用镍柱亲和层析进行纯化，用一系列的Washing Buffer充分清洗，再用Binding BufferI洗脱，收集洗脱液，用SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白。

结果如2所示，蛋白分子质量为43.6KD，等电点为4.93。

实施例2验证FKBP46蛋白的功能

2.1测定FKBP46和绿僵菌处理后的毒力

将预先饥饿处理12h的东亚飞蝗3龄蝗虫每30头放入无菌的塑料筐中，以背板点滴的方式接种绿僵菌，加入处理好的饵剂2g，饵剂中绿僵菌和FKBP46蛋白浓度见表1，24h后将饵剂取出，以新鲜麦苗饲喂至实验结束，每日检测蝗虫的死亡率。试验在35℃,16L:8D下室内进行，重复三次。东亚飞蝗经FKBP46蛋白处理后的死亡率如表2、图3所示。

表1各组处理成分及浓度

注：饵剂是含有5％植物油的无菌麦麸

表2 FKBP46处理后东亚飞蝗的死亡率

由表2可知，经绿僵菌点滴处理后的第3天开始直到第10天，东亚飞蝗的死亡率显著高于对照(P＜0.05),FKBP46蛋白处理组与对照无显著差异(P＞0.05)，经过FKBP46蛋白和绿僵菌共同处理后的死亡率显著高于对照(P<0.05)，与绿僵菌处理组相比其死亡率具有显著差异(P＜0.05)。在第10天，绿僵菌单独处理组的蝗虫死亡率达为60％，而绿僵菌与FKBP46处理组中蝗虫死亡率为93.33％。

2.2FKBP46蛋白和绿僵菌处理后酶活力测定

将3-4龄的蝗虫分装，每个处理3个重复，每筐装15头蝗虫，饥饿处理24小时。按照不同的处理，进行饲喂不同处理的饵剂，如表1所示。饲喂24h后正常喂食无处理的饵剂，从第二天开始每组处理取3头，于液氮中研磨，加入预冷的20m MTris-Hcl缓冲液4℃、15000rpm离心20min，取上清液作为酶提取液。用POD和SOD试剂盒分别测定POD和SOD酶活性。

以牛血清蛋白BSA为标准蛋白，参照Bradford方法测定，处理组和对照组均重复3次。

如图4所示，绿僵菌单独处理组飞蝗过氧化物酶活性变化呈现先降低后升高再降低的趋势，FKBP46与绿僵菌共同处理组过氧化物酶则呈现持续降低的趋势。处理第3-5天，FKBP46与绿僵菌共同处理组过氧化物酶活性明显低于绿僵菌单独处理组，且二者之间存在显著性差异(p<0.05)。FKBP46单独处理组，第3、第5天，与对照组之间无显著性差异(p>0.05)，第2、第4天则存在显著性差异(p<0.05)。

比较不同处理间超氧化物歧化酶SOD活性，如图5所示，FKBP46与绿僵菌共同处理后飞蝗超氧化物歧化酶SOD活性总体呈现降低趋势，绿僵菌单独处理后超氧化物歧化酶SOD活性总体呈现先降低后升高再降低趋势。处理后第3-5天，FKBP46与绿僵菌共同处理超氧化物歧化酶SOD活性明显低于其它处理组，且与其它处理组存在显著性差异(p<0.05)，FKBP46单独处理组超氧化物歧化酶则未发生明显变化。第4天，绿僵菌单独处理组与FKBP46单独处理组两者之间无显著性差异(p>0.05)，与FKBP46和绿僵菌共同处理存在显著性差异(p<0.05)。处理第5天，绿僵菌单独处理组与FKBP46单独处理组之间存在显著性差异(p<0.05)。FKBP46和绿僵菌共同处理组超氧化物歧化酶SOD活性明显低于FKBP46单独处理组，且二者之间存在显著性差异(p<0.05)。

氧化还原反应是昆虫体内重要的化学反应之一，决定着昆虫的生长与死亡。氧化还原反应产生的活性氧会对虫体造成伤害，引起体内脂质过氧化、DNA突变和酶失活等。在长期的发育进化过程中，昆虫形成了一套完整的保护系统，来清除各种活性氧。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)作为昆虫体内氧化自由基的清除系统，能够协调体内氧自由基处于一种动态平衡状态，使机体免受伤害。

绿僵菌侵染能使蝗虫体内保护酶发生一系列的变化，会导致蝗虫体内的保护酶的酶活性先升高后降低，最终导致蝗虫免疫降低导致蝗虫死亡。本发明的蛋白FKBP46与绿僵菌共同处理后较绿僵菌单独处理组，蝗虫体内的两种保护酶活力都显著降低，与FKBP46免疫抑制作用相对应，证明FKBP46基因能够有效抑制蝗虫的免疫反应促进绿僵菌的侵染，因此，能够作为正调控因子加强病菌的侵入引起的免疫抑制反应。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 东亚飞蝗FKBP46蛋白及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400> 1

Met Phe Trp Ala Leu Val Leu Glu Pro Gly Lys Lys Tyr Ala Gln Thr

1 5 10 15

Val Ser Lys Pro Phe His Ile Ser Met Ala Ser Leu Asp Val Val His

20 25 30

Ser Glu Asn Glu Leu Val Thr Val Asn Val Asn Phe Gln Asn Ala Glu

35 40 45

Phe Ile Leu Cys Asn Leu Gln Lys Asn Lys Ile Leu Gln Thr Ser Leu

50 55 60

Asp Leu Asn Phe Glu Ala Gly Asp Arg Ile Ala Phe Tyr Thr Ser Gly

65 70 75 80

Lys Gly Arg Val His Leu Thr Gly Tyr Leu Ile Asp Asp Asp Asp Val

85 90 95

Asp Asp Asp Leu Asp Ile Asp Ala Glu Ala Glu Glu Ser Glu Glu Asp

100 105 110

Val Thr Pro Gln Lys Asn Ala Ile Lys Ala Asn Lys Gln Glu Lys Arg

115 120 125

Lys Ser Val Gly Gln Thr Pro Gly Lys Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys

130 135 140

Met Asp Ser Glu Asp Glu Asp Gly Asp Asp Asp Gly Asp Asp Phe Asp

145 150 155 160

Asp Asp Gly Asp Ser Asp Leu Glu Ser Leu Gly Asp Ser Asp Glu Glu

165 170 175

Met Glu Val Glu Ser Glu Glu Asp Asp Gly Glu Glu Asp Glu Asp Ser

180 185 190

Glu Leu Glu Glu Thr Pro Pro Gln Lys His Gln Gln Gly Lys Lys Lys

195 200 205

Glu Lys Gln Ser Ala Gln Lys Gln Leu Gln Asp Lys Gln Thr Asn Thr

210 215 220

Pro Asn Glu Met Lys Lys Lys Lys Asn Lys Gly His Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Pro Asn Thr Pro Thr Val Gln Ala Asn Gly Thr Pro Glu Thr Gln Ser

245 250 255

Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Gly Gly Glu Thr Pro Gly Asp Lys Gly

260 265 270

Ala Asn Thr Pro Lys Pro Pro Gln Ala Gly Ser Pro Gln Thr Pro Gln

275 280 285

Lys Lys Leu Leu Glu Gly Gly Val Ala Val Glu Asp Thr Val Val Gly

290 295 300

Ser Gly Pro Val Ala Lys Pro Gly Arg Phe Val Thr Val Tyr Tyr Thr

305 310 315 320

Gly Arg Leu Lys Gln Asn Asn Lys Lys Phe Asp Glu Thr Val Gln Gly

325 330 335

Pro Gly Phe Lys Phe Arg Leu Gly Lys Gly Glu Val Ile Lys Gly Trp

340 345 350

Asp Ile Gly Val Thr Gly Met Lys Val Gly Gly Lys Arg Lys Leu Ile

355 360 365

Ile Pro Pro His Met Ala Tyr Gly Ala Lys Gly Ser Pro Pro Val Ile

370 375 380

Pro Pro Asn Ser Ala Leu Val Phe Glu Val Glu Leu Lys Asn Val Asn

385 390 395 400

<210> 2

<211> 1202

<212> DNA

<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400> 2

atgttttggg cacttgtttt ggagccagga aagaaatatg cacaaaccgt gtcaaaacca 60

ttccacatat caatggcttc tcttgatgta gtgcattctg aaaatgaatt ggtgacagtg 120

aatgttaact tccagaatgc tgagtttatt ctgtgtaatc tacagaaaaa taaaattctt 180

cagacgtctc tagatctaaa ctttgaggca ggagacagga ttgcattcta tacctcggga 240

aagggtcgtg tacatttaac aggttatcta atagacgacg acgatgttga cgacgatttg 300

gatatcgacg cggaagcgga agaatcggaa gaagacgtaa cccctcagaa aaatgctatt 360

aaagccaata aacaagaaaa gcggaagagt gtgggacaga ctccgggaaa accagtattg 420

aaaaagagta aaatggacag tgaagacgaa gacggagtga cgacggtgat gattttgatg 480

acgacggtga cagtgatctc gaaagcctag gagacagtga tgaggaaatg gaagtagaaa 540

gtgaagaaga tgatggggaa gaggatgagg actctgaact tgaagaaaca ccaccacaga 600

aacatcaaca aggaaagaaa aaagagaaac agagtgcaca aaaacagcta caggataaac 660

aaacaaatac tccaaatgaa atgaaaaaga agaagaacaa ggggcatgac gctgcaactc 720

caaacactcc cactgttcag gcaaatggaa ctccagaaac acaatcagga aagaaaaata 780

agaagaaagg tggtgaaacg cctggggaca aaggtgccaa tactccaaaa ccacctcagg 840

ctgggtcacc tcagacaccg cagaagaagc tcctggaggg cggagtggct gtggaagata 900

ctgtcgtcgg ctccggtccg gtggcaaagc ctggcagatt cgtaactgtg tactacacag 960

gccgtttgaa gcagaataac aagaagtttg atgaaactgt gcaagggcct ggcttcaaat 1020

ttagactggg gaaaggtgag gtaataaaag gatgggacat tggagttaca ggaatgaaag 1080

ttggaggaaa gaggaaactt attattccac ctcacatggc gtacggagcc aaaggttcgc 1140

caccagttat tccacccaac agtgcgttag tatttgaagt ggaactaaag aatgtaaact 1200

aa 1202

Claims

1.东亚飞蝗FKBP46蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.东亚飞蝗FKBP46蛋白编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白。

3.根据权利要求2所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白编码基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白编码基因的重组菌株。

6.制备权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(2)培养重组菌株，诱导表达东亚飞蝗FKBP46蛋白；

(3)分离纯化东亚飞蝗FKBP46蛋白。

7.权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白的应用。

8.权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白在防治蝗虫或棉铃虫中的应用。

9.一种生防制剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP46蛋白。

10.根据权利要求9所述的生防制剂，其特征在于，所述生防制剂还包括绿僵菌。