CN110698554B

CN110698554B - 东亚飞蝗fkbp52蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110698554B
Application number: CN201910895993.6A
Authority: CN
Inventors: 王广君; 田野; 李贝贝; 涂雄兵; 农向群; 张泽华
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-22
Filing date: 2019-09-22
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-09-22
Also published as: CN110698554A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗FKBP52蛋白及其编码基因和应用。东亚飞蝗FKBP52蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过饲喂东亚飞蝗FKBP52纯化蛋白，发现经绿僵菌侵染后的蝗虫死亡率大大提高，进一步测定蝗虫体内POD和SOD的酶活力，经FKBP52处理后蝗虫体内的两种酶活力都显著降低。因此，FKBP52蛋白具有免疫抑制作用，其能够作为正调控因子加强病菌的侵入引起的免疫抑制反应。

Description

东亚飞蝗FKBP52蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗FKBP52蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

FK506结合蛋白(FK506 binding protein)是一类能与大环内酯类免疫抑制剂FK506和雷帕霉素特异性结合的高度同源的受体类蛋白家族，在原核生物与真核生物细胞中广泛存在且含量丰富，它们具有肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)活性，可催化多肽或蛋白质底物中的肽-脯氨酸顺反子的转换，从而影响其活性、磷酸化状态、蛋白质间相互作用、亚细胞定位及稳定性。FK506结合蛋白还有许多其它的重要的生理功能，如细胞周期的调节、通道活性的调节以及在发育上的作用等。

绿僵菌可通过体壁和消化道进入昆虫体内致使昆虫死亡，其侵染过程可以分泌多种胞外蛋白酶，研究表明绿僵菌作为外来物质进入东亚飞蝗的中肠，使中肠内的总蛋白酶活性增高，即绿僵菌的侵染致使东亚飞蝗体内的酶活性持续升高，产生过度免疫应答，致使蝗虫死亡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种东亚飞蝗蛋白FKBP52。

本发明的再一目的在于提供编码上述蛋白的基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述蛋白的应用。

本发明的再一目的在于提供含有上述蛋白的生防制剂。

根据本发明具体实施方式的东亚飞蝗FKBP52蛋白，其是一种FK506结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明提供东亚飞蝗FKBP52蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGATGAACGAATGCGATGTAAAACCCGCTGCCGAGGAGGTGTTGAAGCAGAAGCCGGAGGACTTGCTTATGGACGGTGGGATTTTGAAGACCATTCTTAGAGAGGGTGAGGGAGAGGAAACGCCTAGAGAGGGGTCTGAGGTGTCAGTGCACTACACGGGTGTTTTGGTGGATGGAACGAAGTTTGACAGTTCCTTGGACAGAGGGCAGCCGTTTAAGTTTGTGGTTGGCGAGGGCAAGGTGATAAAAGGCTGGGACAAAACCTTGTTGACGATGAGGCGCGGCGAGAAGTGTTCGGTTGTGTTGGAGCCGAAGTACGCGTACGGGGAGTCTGGTTCGCCTCCGAAGATTCCGCCCAACGCGACGTTGAAGTTTGAGATAGAGTTGTTGGACTTTACCAATGCGACGGACGTGTCGAAGAAGAAGGACGGGAGCGTGATGAAGACCACGTTGAAGTCTCCTGAGAAAAAGTCGTACGAGAAGCCCAATTTTGGCGCGACGTGCACGATTGCGTATTCCGTGGCGCGTTTGAGCGGGGACGTCTTGTCTCCGGAGCAGCAGTTGACGTACGTCGTGGACGAGGGTCGCTTCCCGAAGGCCGTGGAGACGGCGGTTAAGAGTTTGGTGCAGGGAGAGAGGGCGAAGTTTACGATCAAGCCCGAGCAAGCGTACGCGGATGAGGGGTGTCCCGCTCTGAACATTCCCGCTGGTGAGACGACGGTGTGGACCATCGAGCTGTGCGAGTTGCAGAAGTTGCCGTCCAGTTGGAACATGGACCTGAACGCGAAGCTCGAGGCGGCCGAGTCCGGAAAGCAGCGAGGAAACGAGCTGTTTTCGCTGGGAAAGTACAAGTACGCCGCTAAGAGGTACAAAAACTCCCTCAGCTACATAGAATACACGAGCGGCGAGGCGGATCCGGAGGTGGTCAAGAAGATCAACGACTTGAAGTCGATCTTGAATCTGAACATCTCCCAGTGCTACTTGAACCTCAAGAATCACAAGGAGGCCCTCAAGTCGGTCGAGAAAGTTTTGGAAAAAGAGCCGAATAACATAAAGGCATTGTATAGGCGTGGCATGGCCAGGATGATGAATCAGGACTGGGACCTTGCGAAGGAGGACTTTAAGAGCATATTGCAGCAGGATCCCAACCAGAGGAGTGCGATATGCAAATTGAACGAGGCGAACGCCAAGATTAAGCTCCAAAACGAAAAGGATCGCGC GATCTTCTCG AAGATGTTCCGC

根据本发明的具体实施方式的重组表达载体和重组菌株。本发明构建了Pet-21b原核表达载体，经诱导，获得原核表达重组融合蛋白，利用镍柱回收纯化技术，获得目的蛋白。

根据本发明具体实施方式的制备东亚飞蝗FKBP52蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)用包含东亚飞蝗FKBP52蛋白编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导表达东亚飞蝗FKBP52蛋白；

(3)分离纯化东亚飞蝗FKBP52蛋白。

本发明提供东亚飞蝗FKBP52蛋白的应用，尤其是用于防治蝗虫，特别是东亚飞蝗方面。

根据本发明具体实施方式的生防制剂，其中含有东亚飞蝗FKBP46蛋白。当东亚飞蝗FKBP46蛋白与绿僵菌联合使用时，可显著提高蝗虫的杀灭率。

本发明的有益效果：

本发明通过饲喂东亚飞蝗FKBP52纯化蛋白，发现经绿僵菌侵染后的蝗虫死亡率大大提高，进一步测定蝗虫体内POD和SOD的酶活力，经FKBP46处理后蝗虫体内的两种酶活力都显著降低。因此，FKBP46蛋白具有免疫抑制作用，其能够作为正调控因子加强病菌的侵入引起的免疫抑制反应。

附图说明

图1显示FKBP52的PCR产物电泳分析结果，其中，1泳道为DL2000 plus marker，2为FKBP52；

图2显示FKBP52基因表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中，1泳道为FKBP52表达产物，泳道为pet-21b表达产物，3泳道为蛋白标准品；

图3显示FKBP52处理后东亚飞蝗的死亡率；

图4显示FKBP52处理后东亚飞蝗的POD活力；

图5显示FKBP52处理后东亚飞蝗的SOD活力。

具体实施方式

材料与主要试剂

将绿僵菌菌株接种到马铃薯琼脂培养基(PDAY)平板上，25℃下培养14d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。

将东亚飞蝗纯化种群在人工气候培养箱中孵化温度(30士2)℃，相对湿度(60士5)％，光周期14L:10D孵化后，将同一时间孵化的蝗蛹转移到60cm×50cm×70cm规格的养虫笼中饲养，光周期14L:10D，温度为(30士2)℃。

实施例1获得FKBP52基因和蛋白

1.1FKBP52基因的克隆

用trizol溶液提取东亚飞蝗中肠中的总RNA，用反转录试剂盒反转录合成cDNA的一条链，并以此为模板进行PCR克隆。

目的基因的引物序列：

F:5'-CG GAATTC GTCAACAATGATGAACGAATGC-3'，(下划线表示设计的EcoRI酶切位点)；

R:5'-CCC AAGCTT GCGGAACATCTTCGAGAAG-3'。(下划线表示设计的HindⅢ酶切位点)。

利用上述引物进行PCR扩增，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化。

目的序列经分析为1242bp，如图1所示。

1.2构建重组表达载体

将纯化产物连接到Pmd19-T Vector载体，并将连接产物加入感受态细胞DH5α中，将LB固体培养基上培养的阳性克隆菌株送去测序。

将测序成功的重组基因提取质粒，用EcoRI和HindⅢ进行酶切，将酶切的产物连接到PET-21b质粒载体中，转入大肠杆菌。即PET21b-FKBP52菌株。

1.3重组蛋白的诱导表达和纯化

取重组基因的阳性克隆在LB/Amp液体培养基中37℃，培养至OD值为0.5-0.6，然后加IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，27℃诱导过夜后，用5％浓缩胶和12％分离胶进行SDS-PAGE电泳分析蛋白样品。将诱导蛋白3500rpm离心10min收集菌体。加入预冷的20mM Tris-Hcl缓冲液重悬菌体。冰上超声裂解菌体(300w，超声持续5s，暂停5s，重复99个循环)。4℃,12000rpm，离心10min，回收上清，再用镍柱亲和层析进行纯化，用一系列的Washing Buffer充分清洗，再用Binding BufferI洗脱，收集洗脱液，用SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白。

结果如图2所示，经纯化回收得到纯化蛋白分子质量为46.2KD，等电点为8.23。

实施例2验证FKBP52蛋白的功能

2.1测定FKBP52和绿僵菌处理后的毒力

将预先饥饿处理12h的东亚飞蝗3龄蝗虫每30头放入无菌的塑料筐中，以背板点滴的方式接种绿僵菌，加入处理好的饵剂2g，24h后将饵剂取出，饵剂中绿僵菌和FKBP52蛋白浓度见表1，以新鲜麦苗饲喂至实验结束，每日检测蝗虫的死亡率。试验在35℃，16L:8D下室内进行，重复三次。

表1各组处理成分及浓度

注：饵剂是含有5％植物油的无菌麦麸

东亚飞蝗经FKBP52蛋白处理后的死亡率如表2、图3所示：

表2 FKBP52处理后东亚飞蝗的死亡率

注:表中数值为平均值±标准差，同列数据中不同小写字母表示0.05水平差异显著。

经绿僵菌点滴处理后的第3天开始直到第10天，东亚飞蝗的死亡率显著高于对照(P＜0.05)，FKBP52蛋白处理组与对照无显著差异(P＞0.05)，经过FKBP52蛋白和绿僵菌共同处理后的死亡率显著高于对照(P<0.05)，与绿僵菌处理组相比其死亡率具有显著差异(P＜0.05)。在第10天，绿僵菌单独处理组的蝗虫死亡率达为60％，而绿僵菌与FKBP52处理组中蝗虫死亡率为93.33％。

2.2FKBP52蛋白处理后东亚飞蝗的活力测定

将3-4龄的蝗虫分装，每个处理3个重复，每筐装15头蝗虫，饥饿处理24小时。按照不同的处理，进行饲喂不同处理的饵剂(方法同表1)。饲喂24h后正常喂食无处理的饵剂，从第二天开始每组处理取3头，于液氮中研磨，加入预冷的20mMTris-Hcl缓冲液4℃、15000rpm离心20min，取上清液作为酶提取液。用POD和SOD试剂盒分别测定POD和SOD酶活性。

以牛血清蛋白BSA为标准蛋白，参照Bradford方法测定，处理和对照均重复3次。

结果如图4所示，绿僵菌单独处理组飞蝗过氧化物酶活性变化呈现先降低后升高再降低的趋势，而FKBP52与绿僵菌共同处理组过氧化物酶则呈现持续降低的趋势。处理第3-5天，FKBP52与绿僵菌共同处理组过氧化物酶活性明显低于绿僵菌单独处理组，且二者之间存在显著性差异(p<0.05)。FKBP52单独处理组，第3、第5天，与对照组之间无显著性差异(p>0.05)，第2、第4天则存在显著性差异(p<0.05)。

从图5中比较不同处理间超氧化物歧化酶SOD活性发现，FKBP52与绿僵菌共同处理后飞蝗超氧化物歧化酶SOD活性总体呈现降低趋势，绿僵菌单独处理后超氧化物歧化酶SOD活性总体呈现先降低后升高再降低趋势。处理第3-5天，FKBP52与绿僵菌共同处理超氧化物歧化酶SOD活性明显低于其它处理，且与其它处理组存在显著性差异(p<0.05)，FKBP52单独处理组超氧化物歧化酶则未发生明显变化。第4天，绿僵菌单独处理组与FKBP52单独处理组两者之间存在显著性差异(p<0.05)，与FKBP52和绿僵菌共同处理存在显著性差异(p<0.05)。处理第5天，绿僵菌单独处理组与FKBP52单独处理组之间无显著性差异(p>0.05)。FKBP52和绿僵菌共同处理组超氧化物歧化酶SOD活性明显低于FKBP52单独处理组，且二者之间存在显著性差异(p<0.05)。

氧化还原反应是昆虫体内重要的化学反应之一，决定着昆虫的生长与死亡。氧化还原反应产生的活性氧会对虫体造成伤害，引起体内脂质过氧化、DNA突变和酶失活等。在长期的发育进化过程中，昆虫形成了一套完整的保护系统，来清除各种活性氧。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)作为昆虫体内氧化自由基的清除系统，能够协调体内氧自由基处于一种动态平衡状态，使机体免受伤害。

绿僵菌侵染能使蝗虫体内保护酶发生一系列的变化，会导致蝗虫体内的保护酶的酶活性先升高后降低，最终导致蝗虫免疫降低导致蝗虫死亡。本发明的蛋白FKBP52与绿僵菌共同处理后较绿僵菌单独处理组，蝗虫体内的两种保护酶活力都显著降低，与FKBP52免疫抑制作用相对应，证明FKBP52基因能够有效抑制蝗虫的免疫反应促进绿僵菌的侵染，因此，能够作为正调控因子加强病菌的侵入引起的免疫抑制反应。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 东亚飞蝗FKBP52蛋白及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 414

<212> PRT

<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400> 1

Met Met Asn Glu Cys Asp Val Lys Pro Ala Ala Glu Glu Val Leu Lys

1 5 10 15

Gln Lys Pro Glu Asp Leu Leu Met Asp Gly Gly Ile Leu Lys Thr Ile

20 25 30

Leu Arg Glu Gly Glu Gly Glu Glu Thr Pro Arg Glu Gly Ser Glu Val

35 40 45

Ser Val His Tyr Thr Gly Val Leu Val Asp Gly Thr Lys Phe Asp Ser

50 55 60

Ser Leu Asp Arg Gly Gln Pro Phe Lys Phe Val Val Gly Glu Gly Lys

65 70 75 80

Val Ile Lys Gly Trp Asp Lys Thr Leu Leu Thr Met Arg Arg Gly Glu

85 90 95

Lys Cys Ser Val Val Leu Glu Pro Lys Tyr Ala Tyr Gly Glu Ser Gly

100 105 110

Ser Pro Pro Lys Ile Pro Pro Asn Ala Thr Leu Lys Phe Glu Ile Glu

115 120 125

Leu Leu Asp Phe Thr Asn Ala Thr Asp Val Ser Lys Lys Lys Asp Gly

130 135 140

Ser Val Met Lys Thr Thr Leu Lys Ser Pro Glu Lys Lys Ser Tyr Glu

145 150 155 160

Lys Pro Asn Phe Gly Ala Thr Cys Thr Ile Ala Tyr Ser Val Ala Arg

165 170 175

Leu Ser Gly Asp Val Leu Ser Pro Glu Gln Gln Leu Thr Tyr Val Val

180 185 190

Asp Glu Gly Arg Phe Pro Lys Ala Val Glu Thr Ala Val Lys Ser Leu

195 200 205

Val Gln Gly Glu Arg Ala Lys Phe Thr Ile Lys Pro Glu Gln Ala Tyr

210 215 220

Ala Asp Glu Gly Cys Pro Ala Leu Asn Ile Pro Ala Gly Glu Thr Thr

225 230 235 240

Val Trp Thr Ile Glu Leu Cys Glu Leu Gln Lys Leu Pro Ser Ser Trp

245 250 255

Asn Met Asp Leu Asn Ala Lys Leu Glu Ala Ala Glu Ser Gly Lys Gln

260 265 270

Arg Gly Asn Glu Leu Phe Ser Leu Gly Lys Tyr Lys Tyr Ala Ala Lys

275 280 285

Arg Tyr Lys Asn Ser Leu Ser Tyr Ile Glu Tyr Thr Ser Gly Glu Ala

290 295 300

Asp Pro Glu Val Val Lys Lys Ile Asn Asp Leu Lys Ser Ile Leu Asn

305 310 315 320

Leu Asn Ile Ser Gln Cys Tyr Leu Asn Leu Lys Asn His Lys Glu Ala

325 330 335

Leu Lys Ser Val Glu Lys Val Leu Glu Lys Glu Pro Asn Asn Ile Lys

340 345 350

Ala Leu Tyr Arg Arg Gly Met Ala Arg Met Met Asn Gln Asp Trp Asp

355 360 365

Leu Ala Lys Glu Asp Phe Lys Ser Ile Leu Gln Gln Asp Pro Asn Gln

370 375 380

Arg Ser Ala Ile Cys Lys Leu Asn Glu Ala Asn Ala Lys Ile Lys Leu

385 390 395 400

Gln Asn Glu Lys Asp Arg Ala Ile Phe Ser Lys Met Phe Arg

405 410

<210> 2

<211> 1242

<212> DNA

<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400> 2

atgatgaacg aatgcgatgt aaaacccgct gccgaggagg tgttgaagca gaagccggag 60

gacttgctta tggacggtgg gattttgaag accattctta gagagggtga gggagaggaa 120

acgcctagag aggggtctga ggtgtcagtg cactacacgg gtgttttggt ggatggaacg 180

aagtttgaca gttccttgga cagagggcag ccgtttaagt ttgtggttgg cgagggcaag 240

gtgataaaag gctgggacaa aaccttgttg acgatgaggc gcggcgagaa gtgttcggtt 300

gtgttggagc cgaagtacgc gtacggggag tctggttcgc ctccgaagat tccgcccaac 360

gcgacgttga agtttgagat agagttgttg gactttacca atgcgacgga cgtgtcgaag 420

aagaaggacg ggagcgtgat gaagaccacg ttgaagtctc ctgagaaaaa gtcgtacgag 480

aagcccaatt ttggcgcgac gtgcacgatt gcgtattccg tggcgcgttt gagcggggac 540

gtcttgtctc cggagcagca gttgacgtac gtcgtggacg agggtcgctt cccgaaggcc 600

gtggagacgg cggttaagag tttggtgcag ggagagaggg cgaagtttac gatcaagccc 660

gagcaagcgt acgcggatga ggggtgtccc gctctgaaca ttcccgctgg tgagacgacg 720

gtgtggacca tcgagctgtg cgagttgcag aagttgccgt ccagttggaa catggacctg 780

aacgcgaagc tcgaggcggc cgagtccgga aagcagcgag gaaacgagct gttttcgctg 840

ggaaagtaca agtacgccgc taagaggtac aaaaactccc tcagctacat agaatacacg 900

agcggcgagg cggatccgga ggtggtcaag aagatcaacg acttgaagtc gatcttgaat 960

ctgaacatct cccagtgcta cttgaacctc aagaatcaca aggaggccct caagtcggtc 1020

gagaaagttt tggaaaaaga gccgaataac ataaaggcat tgtataggcg tggcatggcc 1080

aggatgatga atcaggactg ggaccttgcg aaggaggact ttaagagcat attgcagcag 1140

gatcccaacc agaggagtgc gatatgcaaa ttgaacgagg cgaacgccaa gattaagctc 1200

caaaacgaaa aggatcgcgc gatcttctcg aagatgttcc gc 1242

Claims

1.东亚飞蝗FKBP52蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.东亚飞蝗FKBP52蛋白编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP52蛋白。

3.根据权利要求2所述的东亚飞蝗FKBP52蛋白编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的东亚飞蝗FKBP52蛋白编码基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的东亚飞蝗FKBP52蛋白编码基因的重组菌株。

6.制备权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP52蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用包含东亚飞蝗FKBP52蛋白编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

（2）培养重组菌株，诱导表达东亚飞蝗FKBP52蛋白；

（3）分离纯化东亚飞蝗FKBP52蛋白。

7.权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP52蛋白在防治蝗虫中的应用。

8.一种生防制剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的东亚飞蝗FKBP52蛋白。

9.根据权利要求8所述的生防制剂，其特征在于，所述生防制剂还包括绿僵菌。