CN113005114B - 一种酶scxc及其编码基因和在制备灭杀松材线虫产品中的应用 - Google Patents

一种酶scxc及其编码基因和在制备灭杀松材线虫产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于林业生物技术领域，公开了一种酶SCXC及其编码基因和在制备灭杀松材线虫产品中的应用，所述酶SCXC的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所提供的酶SCXC可有效杀死松材线虫，松材线虫的死亡率高达85.42%，减轻松材线虫对松树的危害，对林业生产实践有重要价值。

Description

一种酶SCXC及其编码基因和在制备灭杀松材线虫产品中的 应用
技术领域
本发明属于林业生物技术领域，具体涉及一种酶SCXC及其编码基因和在制备灭杀松材线虫产品中的应用。
背景技术
松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus Nickle）最早于1982年由日本传入我国南京中山陵，目前已经扩散到全国18个省。松材线虫本身很小，但借助于松树体内的寄生昆虫松墨天牛，通过气门进入天牛体内，或附着在天牛体表。当天牛幼虫羽化飞出寻找新的健康松树啃食时，松材线虫即通过天牛的取食伤口进入松树木质部，通过大量繁殖逐渐扩散到松树全株，使松树丧失水分运输功能，松脂分泌减少甚至停止，植株失水枯萎在30-45天死亡，3-5年可摧毁成片松林。松材线虫和松墨天牛合作导致的松树松材线虫病具有致死率高、传播速度快、极难防治等特点，我国已在1996年将其列为森林植物检疫对象。
我国对松材线虫病已经进行了几十年的研究，但是还没有发现可以应用于生产、切实可行地控制病害的防治方法。目前松材线虫病的防治对策主要是结合松材线虫病的发生规律，选择合理的检验方法，包括加强检疫工作、及时清理病死植株、科学灭杀松墨天牛以及选种抗病的树种等，但是从灭杀松材线虫本身进行防治的对策较少。因此，本发明提供了一种灭杀松材线虫的酶SCXC及其编码基因和应用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种酶SCXC。
本发明还要解决的技术问题是提供上述酶SCXC的编码基因。
本发明还要解决的技术问题是提供包含上述编码基因的重组表达载体和制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供包含上述编码基因的重组菌株。
本发明进一步要解决的技术问题是提供上述酶SCXC的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述酶SCXC的应用。
发明思路：松材线虫体表携带的伴生细菌在不同的松树品种上可能具有显著不同，但主要有3类：假单胞菌（Pseudomonas sp.）、泛菌（Pantoea sp.）和不解糖消化链球菌（Peptostreptococcus sp.），其中假单胞菌和泛菌的比例较高。本发明以松材线虫体表携带的假单胞菌出发菌株，对其进行基因工程改造，使其能够分泌一种可灭杀松材线虫的酶，能够高效针对性的杀死松材线虫，提高对松材线虫的生物防治能力。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种胞外酶SCXC，其包括440个氨基酸，未预测到信号肽序列，蛋白理论分子量为46.11 kDa。
其中，所述酶SCXC为尿囊素酶。
其中，所述酶SCXC的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：MKILIQNGRVMDPATGRDEMADIAVAAGRIIAIGNVAPDFQPNRTIDASGCVVAPGLVDLAVRLREPGQEHAGMLESEMAAAVAGGVTSLVCPPDTEPVLDEPGLVDMLKFRAEKLHQSRVFPLGALTRGLKGEVLTEMAELTESGCIGFGQAEVPILNTQVLQRALQYAATFGYTVWLRPQDPWLGKGVAASGPLATRLGLSGVSAAAETIALHTLFELMRGVKGPGPGARVHLCRLSSAAGLALVRQAKAEGLPVTCDVSVHNLHLTDVDIGYYDSRLRLQPPVRQQRDRDALRAGLADGTIDALVSDHNPVDSDAKTLPFAEAEPGATAVELLLGLACRWAQQDGLGLMQALAVLTEGPQRVLGASLGTLQASVGRLAVGGVADLVVFDPNASHRVHAQALRSQGKHTPFDGHELPVTVRATLVAGQVAHTSSPAQA（SEQ ID No.1）。
其中，所述酶SCXC的最适pH为7.0，最适温度为35℃，在生产实践中具有重要价值。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种上述酶SCXC的编码基因。
其中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：ATGAAGATCCTGATTCAAAACGGCCGCGTCATGGACCCGGCCACCGGCCGCGACGAGATGGCCGACATCGCGGTTGCCGCCGGTCGCATCATCGCCATCGGCAACGTGGCGCCCGATTTCCAGCCCAACCGCACCATCGACGCCAGCGGCTGCGTGGTGGCCCCGGGCCTGGTGGACCTGGCGGTGCGCCTGCGCGAGCCGGGCCAGGAGCACGCCGGCATGCTGGAGAGCGAGATGGCCGCGGCGGTGGCCGGTGGCGTCACCTCCCTGGTCTGCCCCCCCGACACCGAGCCGGTGCTGGACGAGCCCGGCCTGGTGGACATGCTCAAGTTCCGTGCCGAGAAGCTGCACCAGTCGCGCGTGTTCCCGCTGGGCGCGCTCACGCGCGGCCTCAAGGGCGAGGTGCTCACCGAGATGGCCGAGCTCACCGAGTCGGGCTGCATCGGCTTCGGACAGGCCGAGGTGCCGATTCTCAACACGCAGGTGCTGCAGCGCGCCCTGCAGTACGCGGCCACCTTCGGCTACACCGTGTGGCTGCGCCCGCAAGACCCCTGGCTGGGCAAGGGCGTGGCCGCCAGCGGCCCGCTGGCCACGCGCCTGGGCCTCTCGGGTGTGTCGGCGGCGGCCGAGACCATCGCGCTGCACACCCTGTTCGAGCTGATGCGTGGCGTCAAGGGCCCCGGTCCGGGCGCGCGCGTGCACCTGTGCCGCCTCAGCAGCGCCGCCGGCCTGGCCCTGGTGCGCCAGGCCAAGGCCGAGGGCCTGCCCGTCACCTGCGACGTGAGCGTGCACAACCTGCACCTCACCGACGTGGACATCGGCTACTACGACAGCCGCCTGCGCCTGCAGCCGCCGGTGCGCCAGCAGCGCGACCGCGACGCGCTGCGCGCGGGTCTGGCCGACGGCACCATCGATGCCCTGGTGTCCGACCACAACCCGGTGGACAGCGACGCCAAGACCCTGCCCTTTGCCGAGGCCGAGCCTGGCGCCACCGCGGTGGAGCTGTTGCTGGGCCTGGCCTGCCGCTGGGCGCAGCAAGACGGCCTGGGCCTGATGCAGGCGCTGGCCGTGCTCACCGAAGGGCCGCAGCGCGTGCTGGGCGCCAGCCTGGGCACCCTGCAGGCCAGCGTGGGCCGACTGGCCGTAGGTGGCGTGGCCGACCTGGTGGTGTTCGACCCCAACGCCTCGCACCGCGTGCACGCCCAGGCCCTGCGCAGCCAGGGCAAGCACACGCCGTTTGACGGGCACGAGCTGCCCGTCACCGTGCGGGCCACGCTGGTGGCTGGTCAGGTGGCGCACACCTCGTCGCCGGCCCAGGCG（SEQ ID No.2）。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了包含上述编码基因的重组表达载体。
其中，所述重组表达载体的质粒为pVLT33。
其中，所述重组表达载体的制备方法为将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示编码基因插入到质粒pVLT33的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到重组表达载体pVLT33-SCXC。
优选地，所述重组表达载体的制备方法为将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示编码基因插入到质粒pVLT33的BamHI和SmaI限制性酶切位点之间，得到重组假单胞菌表达载体pVLT33-SCXC。
为了解决上述第四个技术问题，本发明公开了包含上述编码基因的重组菌株。
其中，所述重组菌株为包含上述编码基因的假单胞菌。
优选地，所述重组菌株为包含上述编码基因的假单胞菌YL880。
为了解决上述第五个技术问题，本发明公开了制备上述酶SCXC的方法，所述酶SCXC为在重组菌株中表达得到。
优选地，所述制备上述酶SCXC的方法包括如下步骤：
（1）将包含编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
（2）培养重组菌株，诱导重组菌株中酶SCXC表达；
（3）分离、纯化所表达的酶SCXC（即，酶SCXC母液）。
步骤（1）中，所述宿主细胞为假单胞菌；优选地，所述宿主细胞为假单胞菌YL880感受态细胞。
为了解决上述第六个技术问题，本发明公开了上述酶SCXC在制备灭杀松材线虫产品中的应用。
其中，所述酶SCXC母液可以直接用作灭杀松材线虫的产品，也可根据需要将酶SCXC母液稀释后用作灭杀松材线虫的产品。
其中，所述稀释为用Tris-HCl稀释。
其中，所述稀释为将酶SCXC母液稀释2-100 v/v倍；优选为2-20 v/v倍。
其中，上述编码基因在制备灭杀松材线虫产品中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，上述重组表达载体在制备灭杀松材线虫产品中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，上述重组菌株在制备灭杀松材线虫产品中的应用也在本发明的保护范围之内。其中，所述灭杀松材线虫的产品可以直接加入到松材线虫中，培养，灭杀松材线虫。
其中，所述灭杀松材线虫的产品与松材线虫的用量比为2-5 μL：1条。
其中，所述培养的pH为2-8；优选地，所述培养的pH为6-8；进一步优选地，所述培养的pH为7。
其中，所述培养的温度为20-40℃；优选地，所述培养的温度为30-40℃；进一步优选地，所述培养的温度为35℃。
其中，所述灭杀松材线虫的产品也可以直接喷洒在含有松材线虫的树木上使用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明所提供的酶SCXC可有效杀死松材线虫，松材线虫的死亡率高达85.42%，减轻松材线虫对松树的危害，对林业生产实践有重要价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为SDS-PAGE检测结果。
图2为灭杀松材线虫的酶SCXC的最适pH和pH稳定性情况。
图3为灭杀松材线虫的酶SCXC的最适温度和温度稳定性情况。
图4为不同处理液对松材线虫的灭杀结果（横坐标为1-96孔的编号）。
图5为酶SCXC母液不同稀释浓度对松材线虫的灭杀结果。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所述“%”，如无特殊说明，均为质量百分比。
实施例1 灭杀松材线虫的酶SCXC表达载体的构建及其在假单胞菌中的表达
试验材料和试剂。菌株及载体：假单胞菌YL880（具体为草假单胞菌Pseudomonaspoae CCTCC S2014366 购自于中国典型培养物保藏中心）、表达载体pVLT33；酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶；假单胞菌YL880的培养基为LB液体培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH=7）。
转化载体的构建。以氢噬胞菌（Hydrogenophaga atypical）的反转录cDNA为模板，用引物SCXCG-F和SCXCG-R扩增得到杀死松材线虫的酶基因SEQ ID No.2，引物分别引入BamHI和SmaI酶切位点。用BamHI、SamI限制性内切酶和连接酶将SEQ ID No.2基因片段与载体pVLT33连接，得到pVLT33-SCXC转化载体，在假单胞菌中表现为卡那霉素抗性。
SCXCG-F：5’-CGCGGATCCATGAAGATCCTGATTCAAAACGG-3’。SCXCG-R：5’-TCCCCCCGGGCGCCTGGGCCGGCGACGAGGTGTGCGCCACCTGACCAGCCA -3’。
重组表达载体pVLT33-SCXC的构建。将pVLT33-SCXC转化载体在42℃热激后转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在氨苄青霉素抗性的LB平板上培养过夜，随机挑取10个单克隆进行PCR检测，产物通过琼脂糖凝胶电泳，对扩增条带在1.3 k处的克隆进行测序分析，将测序正确的克隆转接入含氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃、250 r/min摇床培养过夜。待菌体长成后提取菌液质粒，即完成重组表达载体pVLT33-SCXC的构建。
假单胞菌YL880感受态细胞的制备。自-70 ℃取出甘油保存的假单胞菌YL880，LB培养基平板划线，30 ℃ 培养活化；挑单菌落接入10 mL液体LB培养基中，30 ℃ 200 r/min培养14 h；按体积比1：100的接种量接入新鲜的液体LB培养基中，30 ℃ 200 r/min培养1-2h 至OD600为0.5左右，将菌液转移到50 mL离心管中，冰浴20 min；4 ℃ 7000×g 离心10min 收集菌体。无菌蒸馏水洗涤菌体3次，4 ℃ 7000×g离心10 min，再用CaCl2溶液轻轻洗涤一次；冰浴预冷的CaCl2溶液处理菌体1 h，4 ℃ 7000×g 离心10 min；加入0.7 mL CaCl2和0.3 mL 50%甘油，轻轻重悬菌体，按每管200 μL分装，置于-70℃冰箱保存。
转化与菌株筛选。从-70 ℃冰箱取出假单胞菌YL880感受态细胞，室温下融化，在200 μL感受态细胞加入10 μL pVLT33-SCXC重组表达载体，30 ℃水浴中静置30-60 min，然后再30 ℃、200r/min 摇床中培养3-5 h，涂布含10 μg/mL卡那霉素的LB平板，30 ℃培养过夜。待平板长出单克隆后，随机挑取10个单克隆进行PCR检测并提取质粒酶切验证。将验证无误的重组菌株YL880在30 ℃ 200 r/min培养6 h左右至OD600 约为1.0时，加入1M的IPTG至溶液浓度为0.1 mM，继续培养6 h，诱导溶液产生酶SCXC，8000 rpm离心5 min收集菌体，超声波破碎后，12000 rpm离心20 min，收集上清。上清液通过SDS-PAGE检测，确认蛋白诱导后，用于进一步纯化，SDS-PAGE检测结果见图1中1通道电泳图谱，2通道为对照组，属于未重组菌株假单胞菌YL880的菌体破碎离心上清液的SDS-PAGE检测结果。
酶SCXC的纯化。采用镍柱纯化方法，Ni2+-NTA亲和层析柱填料在20%的乙醇中保存，首先去除乙醇，用5倍体积的超纯水冲洗。然后以两倍柱体积的20 mM Tris-HCl（pH7.5）平衡柱子，将含有酶SCXC的上清液上样至Ni2+-NTA亲和层析柱，4 ℃孵育1 h，以5倍柱体积的20 mM Tris-HCl（pH 7.5，50 mM 咪唑）洗去杂蛋白，然后以400 mM Tris-HCl（pH7.5，400 mM咪唑）进行梯度洗脱，洗脱液经酶活测定以及SDS-PAGE电泳，检测结果见图1中3通道电泳图谱。收集合并洗脱液，4℃条件下，以截留分子量50 kDa的透析袋在透析液（配方见表1）中透析过夜去除咪唑，将透析过的洗脱液作为酶SCXC母液用于酶学特性的研究。
表1 透析液成分及浓度
Figure 690365DEST_PATH_IMAGE002
实施例2 灭杀松材线虫的酶SCXC的最适pH和温度
（1）灭杀松材线虫的酶SCXC的最适pH。配置0.1 M 13种不同pH（2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8）的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将培养的无菌鲜活的松材线虫接种到96孔细胞板中，平均每孔10条，每种pH设置12孔，向每孔中分别加入20 μL本发明的酶SCXC母液、30 μL无菌水以及50 μL的缓冲液，35 ℃连续培养30 min。从96孔板的微孔中吸出松材线虫悬液，向孔中加入无菌水并清洗出剩余的线虫，然后在显微镜下统计线虫的死亡率。结果如图2显示，当pH值为7.0时，酶SCXC灭杀松材线虫的效果最好。
（2）灭杀松材线虫的酶SCXC的最适温度。配置0.1 M pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将培养的无菌鲜活的松材线虫接种到96孔细胞板中，平均每孔10条，每张细胞板使用12孔，向每孔中分别加入20 μL本发明的酶SCXC母液、30 μL无菌水以及50 μL的缓冲液。然后将96孔板分别置于20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃水浴锅中连续培养30 min。从96孔板的微孔中吸出松材线虫悬液，向孔中加入无菌水并清洗出剩余的线虫，然后在显微镜下统计线虫的死亡率。结果如图3显示，当温度为35 ℃时，酶SCXC灭杀松材线虫的效果最好。
实施例3 灭杀松材线虫的酶SCXC的杀松材线虫效果
（1）酶SCXC母液的杀松材线虫效果。将培养的无菌鲜活松材线虫接种到2个96孔细胞板中，平均每孔10条，每孔加入50 μL pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，另外第一板向每孔添加50 μL本发明的酶SCXC母液，第二板每孔加入50 μL的无菌水作为对照，在35℃条件下培养48 h。从96孔板的微孔中吸出松材线虫悬液，向孔中加入无菌水并清洗出剩余的线虫，然后在显微镜下统计线虫的死亡率。2张96孔细胞板各孔内线虫的死亡率统计结果如图4显示，加入本发明的酶SCXC母液后，松材线虫的平均死亡率高达85.42%，而加入无菌水的松材线虫基本都保持活性，平均死亡率只有18.85%左右，因此，本发明的酶SCXC母液具有较高的灭杀松材线虫的作用。
（2）酶SCXC稀释液的杀松材线虫效果。分别取酶SCXC母液1 mL、5 mL、10 mL、20mL、30 mL、40 mL、50 mL，各加入400 mM Tris-HCl至总体积为100 mL，配成体积终浓度分别为1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%的酶SCXC母液的稀释液。将培养的无菌鲜活松材线虫接种到96孔细胞板中，平均每孔10条，每个浓度的酶SCXC稀释液和对照组分别设置12孔，每孔加入50 μL pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后向实验组每孔添加50 μL不同浓度的酶SCXC稀释液，对照组每孔加入50 μL无菌水，在35 ℃条件下培养48 h。从96孔板的微孔中吸出松材线虫悬液，向孔中加入无菌水并清洗出剩余的线虫，然后在显微镜下统计线虫的死亡率。不同浓度酶SCXC稀释液杀死松材线虫的死亡率统计结果如图5显示，随着酶SCXC浓度的降低，松材线虫的死亡率从82.74%降低到31.25%，但均显著高于对照组16.28%，因此，本发明的酶SCXC母液在实际应用中可以根据需要经稀释后使用，在减轻成本的同时保证灭杀松材线虫的效果。
本发明提供了一种酶SCXC及其编码基因和在制备灭杀松材线虫产品中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 江苏聚庚科技有限公司
<120> 一种酶SCXC及其编码基因和在制备灭杀松材线虫产品中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> Hydrogenophaga atypical
<400> 1
Met Lys Ile Leu Ile Gln Asn Gly Arg Val Met Asp Pro Ala Thr Gly
1 5 10 15
Arg Asp Glu Met Ala Asp Ile Ala Val Ala Ala Gly Arg Ile Ile Ala
20 25 30
Ile Gly Asn Val Ala Pro Asp Phe Gln Pro Asn Arg Thr Ile Asp Ala
35 40 45
Ser Gly Cys Val Val Ala Pro Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Arg Leu
50 55 60
Arg Glu Pro Gly Gln Glu His Ala Gly Met Leu Glu Ser Glu Met Ala
65 70 75 80
Ala Ala Val Ala Gly Gly Val Thr Ser Leu Val Cys Pro Pro Asp Thr
85 90 95
Glu Pro Val Leu Asp Glu Pro Gly Leu Val Asp Met Leu Lys Phe Arg
100 105 110
Ala Glu Lys Leu His Gln Ser Arg Val Phe Pro Leu Gly Ala Leu Thr
115 120 125
Arg Gly Leu Lys Gly Glu Val Leu Thr Glu Met Ala Glu Leu Thr Glu
130 135 140
Ser Gly Cys Ile Gly Phe Gly Gln Ala Glu Val Pro Ile Leu Asn Thr
145 150 155 160
Gln Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Tyr Ala Ala Thr Phe Gly Tyr Thr
165 170 175
Val Trp Leu Arg Pro Gln Asp Pro Trp Leu Gly Lys Gly Val Ala Ala
180 185 190
Ser Gly Pro Leu Ala Thr Arg Leu Gly Leu Ser Gly Val Ser Ala Ala
195 200 205
Ala Glu Thr Ile Ala Leu His Thr Leu Phe Glu Leu Met Arg Gly Val
210 215 220
Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ala Arg Val His Leu Cys Arg Leu Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ala Gly Leu Ala Leu Val Arg Gln Ala Lys Ala Glu Gly Leu Pro
245 250 255
Val Thr Cys Asp Val Ser Val His Asn Leu His Leu Thr Asp Val Asp
260 265 270
Ile Gly Tyr Tyr Asp Ser Arg Leu Arg Leu Gln Pro Pro Val Arg Gln
275 280 285
Gln Arg Asp Arg Asp Ala Leu Arg Ala Gly Leu Ala Asp Gly Thr Ile
290 295 300
Asp Ala Leu Val Ser Asp His Asn Pro Val Asp Ser Asp Ala Lys Thr
305 310 315 320
Leu Pro Phe Ala Glu Ala Glu Pro Gly Ala Thr Ala Val Glu Leu Leu
325 330 335
Leu Gly Leu Ala Cys Arg Trp Ala Gln Gln Asp Gly Leu Gly Leu Met
340 345 350
Gln Ala Leu Ala Val Leu Thr Glu Gly Pro Gln Arg Val Leu Gly Ala
355 360 365
Ser Leu Gly Thr Leu Gln Ala Ser Val Gly Arg Leu Ala Val Gly Gly
370 375 380
Val Ala Asp Leu Val Val Phe Asp Pro Asn Ala Ser His Arg Val His
385 390 395 400
Ala Gln Ala Leu Arg Ser Gln Gly Lys His Thr Pro Phe Asp Gly His
405 410 415
Glu Leu Pro Val Thr Val Arg Ala Thr Leu Val Ala Gly Gln Val Ala
420 425 430
His Thr Ser Ser Pro Ala Gln Ala
435 440
<210> 2
<211> 1320
<212> DNA
<213> Hydrogenophaga atypical
<400> 2
atgaagatcc tgattcaaaa cggccgcgtc atggacccgg ccaccggccg cgacgagatg 60
gccgacatcg cggttgccgc cggtcgcatc atcgccatcg gcaacgtggc gcccgatttc 120
cagcccaacc gcaccatcga cgccagcggc tgcgtggtgg ccccgggcct ggtggacctg 180
gcggtgcgcc tgcgcgagcc gggccaggag cacgccggca tgctggagag cgagatggcc 240
gcggcggtgg ccggtggcgt cacctccctg gtctgccccc ccgacaccga gccggtgctg 300
gacgagcccg gcctggtgga catgctcaag ttccgtgccg agaagctgca ccagtcgcgc 360
gtgttcccgc tgggcgcgct cacgcgcggc ctcaagggcg aggtgctcac cgagatggcc 420
gagctcaccg agtcgggctg catcggcttc ggacaggccg aggtgccgat tctcaacacg 480
caggtgctgc agcgcgccct gcagtacgcg gccaccttcg gctacaccgt gtggctgcgc 540
ccgcaagacc cctggctggg caagggcgtg gccgccagcg gcccgctggc cacgcgcctg 600
ggcctctcgg gtgtgtcggc ggcggccgag accatcgcgc tgcacaccct gttcgagctg 660
atgcgtggcg tcaagggccc cggtccgggc gcgcgcgtgc acctgtgccg cctcagcagc 720
gccgccggcc tggccctggt gcgccaggcc aaggccgagg gcctgcccgt cacctgcgac 780
gtgagcgtgc acaacctgca cctcaccgac gtggacatcg gctactacga cagccgcctg 840
cgcctgcagc cgccggtgcg ccagcagcgc gaccgcgacg cgctgcgcgc gggtctggcc 900
gacggcacca tcgatgccct ggtgtccgac cacaacccgg tggacagcga cgccaagacc 960
ctgccctttg ccgaggccga gcctggcgcc accgcggtgg agctgttgct gggcctggcc 1020
tgccgctggg cgcagcaaga cggcctgggc ctgatgcagg cgctggccgt gctcaccgaa 1080
gggccgcagc gcgtgctggg cgccagcctg ggcaccctgc aggccagcgt gggccgactg 1140
gccgtaggtg gcgtggccga cctggtggtg ttcgacccca acgcctcgca ccgcgtgcac 1200
gcccaggccc tgcgcagcca gggcaagcac acgccgtttg acgggcacga gctgcccgtc 1260
accgtgcggg ccacgctggt ggctggtcag gtggcgcaca cctcgtcgcc ggcccaggcg 1320

Claims (10)

1.一种酶SCXC，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种权利要求1所述酶SCXC的编码基因。
3.根据权利要求2所述编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
4.包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的质粒为pVLT33。
6.权利要求4所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示编码基因插入到质粒pVLT33的限制性酶切位点之间，得到重组表达载体。
7.包含权利要求2所述编码基因的重组菌株。
8.根据权利要求 7所述重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为包含所述编码基因的假单胞菌。
9.一种制备权利要求1所述酶SCXC的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将包含编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
（2）培养重组菌株，诱导酶SCXC表达；
（3）分离、纯化所表达的酶SCXC。
10.权利要求1所述酶SCXC，或权利要求2或3所述编码基因，或权利要求4或5所述重组表达载体，或权利要求7或8所述重组菌株在制备灭杀松材线虫产品中的应用。
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