ES2201053T3 - Plantas transgenicas resistentes a los hongos. - Google Patents
Plantas transgenicas resistentes a los hongos.Info
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Abstract
ORGANISMO RESISTENTE PATOGENO TRANSGENE CUYO GENOMA CONTIENE AL MENOS DOS GENES DIFERENTES BAJO CONTROL DE PROMOTORES ACTIVOS CON EFECTO INHIBIDOR PATOGENO. ESTE ORGANISMO SE CARACTERIZA POR MEDIO DE UN EFECTO INHIBIDOR PATOGENO SINERGISTICO. EL EFECTO APARECE ESPECIALMENTE CUANDO SE CODIFICAN LOS GENES PARA LOS PRODUCTOS DE GENE QUITINASA (CHIS, CHIG), GLUCANASA (GLUG), INHIBIDOR DE SINTESIS DE PROTEINA (PSI) Y PROTEINA (AFP) ANTIFUNGAL.
Description
Planta transgénica resistente a los hongos.
La presente invención trata de una planta
transgénica resistente a los hongos así como de un procedimiento
para su producción.
En el estado de la técnica se conoce que el
ataque de patógenos a una planta causa una serie de reacciones
diversas. A éstas pertenecen, por ejemplo, los cambios en la
estructura de la pared celular, la síntesis de fitoalexina con
efecto antimicrobiano, la acumulación de las llamadas proteínas PR
("Pathogenesis-related"), inhibidores de
proteasa y enzimas con funciones hidrolíticas (Hahlbrock y
Grisenbach en Ann. Rev. Plant. Physiol., 30, (1979),
105-130).
Muchos patógenos (hongos e insectos) presentan
quitina como parte integrante de su pared celular. Por el contrario,
las plantas no poseen quitina. Se ha detectado ahora en algunos
casos que tras un ataque patógeno las plantas producen quitinasas
intensivamente. Las quitinasas pertenecen a los enzimas con
funciones hidrolíticas y catalizan la degradación de la quitina. Se
puede mostrar ahora que mediante la producción de quitinasas las
plantas presentan mayor resistencia frente a los patógenos.
Además, se conoce el uso de un gen de plantas de
cebada, cuyo producto génico codifica un inhibidor de la
proteinsintasa de los hongos. La incorporación de un gen inhibidor
apropiado en plantas transgénicas ha llevado a una resistencia
mejorada a los hongos.
Finalmente también se ha conocido que el uso de
un polipéptido de Aspergillus giganteus puede proteger a las
plantas de un ataque por hongos a causa de su actividad
antifúngica.
Sin embargo, frente a este estado de la técnica
existe la necesidad de crear otros organismos transgénicos
resistentes a los patógenos. Además son especialmente deseables
organismos tales, que su resistencia frente a los organismos
conocidos aumente en conjunto o se amplíe en referencia al número de
los patógenos posibles.
Este problema se resuelve mediante una planta
transgénica resistente a los hongos con las características de la
reivindicación 1.
La invención fundamenta el sorprendente resultado
de que la incorporación en el genoma de una planta de al menos un
par de genes diferentes, como los definidos en la reivindicación 1,
que codifican proteínas con efecto inhibidor de hongos, ayuda a la
planta a conseguir una resistencia frente a hongos, que en cada
caso va mucho más allá de un efecto aditivo del gen.
En las reivindicaciones subordinadas se indican
otras formas de realización de la invención.
Los genes codifican productos génicos que reducen
la vitalidad de los hongos. En particular estos genes pueden ser de
origen fúngico, bacteriano y vegetal, animal o viral. Los productos
génicos tienen las propiedades que estimulan la resistencia a los
hongos. Los productos génicos son la quitinasa (ChiS), el inhibidor
de la síntesis de proteínas (PSI) y la proteína antifúngica
(AFP).
La planta transgénica resistente a los hongos es
preferiblemente una planta de tabaco, patata, fresa, maíz, colza o
tomate.
Se describen también vectores de transferencia de
ADN con secuencias de ADN insertadas, como las que se indican
detalladamente en esta descripción.
Además, es objeto de la invención un
procedimiento para la producción de plantas resistentes a los
hongos, como las que aquí se describen, transfiriéndose en el
genoma de una planta al menos 1 gen que codifican una proteína con
efecto inhibidor de los hongos, como se define en la reivindicación
1 y la planta resistente a los hongos se obtiene
- (a)
- por cruzamiento de la planta dado el caso con otra planta transgénica, que contiene al menos un gen distinto, que codifican una proteína distinta con efecto inhibidor de los hongos como en la reivindicación 1 y a continuación selección o
- (b)
- por transformación de la planta con al menos un gen distinto, que codifican una proteína distinta con efecto inhibidor de los hongos como la definida en la reivindicación 1. El procedimiento puede emplearse con vectores de transferencia de ADN con secuencias de ADN insertadas correspondientes a un gen con efecto inhibidor de los hongos, como los descritos aquí.
Finalmente es objeto de la invención un
procedimiento para la producción de plantas resistentes a los
hongos, empleándose para la transformación en el genoma de una
planta, vectores que comprenden más de un gen con efecto inhibidor
de los hongos.
\newpage
Los efectos sinérgicos pudieron obtenerse muy
especialmente con plantas transgénicas resistentes a los hongos, a
las que se transfirieron o transfeccionaron secuencias de genes,
que codificaban proteínas de los protocolos de secuencia A a C
añadidos o bien se correspondían con éstas.
De la bacteria del suelo Serratia
marcescens se aisló un fragmento de ADN de 1,8 kb de tamaño, que
codificaba para una quitinasa, llamada ChiS. Estudios in
vitro con proteína ChiS purificada mostraron que en bajas
concentraciones ya puede inhibir eficazmente el crecimiento de los
hongos. La causa de la inhibición es que la proteína ChiS dispone
de una actividad quitinasa, con la que pueden destruir las puntas
del micelio de los hongos. De este modo el hongo no puede seguir
creciendo y es inhibido.
El gen PSI procede de la cebada y codifican una
proteína que inhibe la síntesis de proteínas de los hongos. Según
las pruebas in vitro ya son suficientes pequeñas
concentraciones de PSI para inhibir diversos hongos, como por
ejemplo Rhizoctonia solani.
Del caldo de fermentación de Aspergillus
giganteus puede aislarse y secuenciarse un polipéptido, que
dispone de actividad antifúngica. Este polipéptido es apropiado
como agente antifúngico, por ejemplo, como agente de pulverización
y como conservante para productos técnicos y alimentos y piensos.
Además, puede combinarse con otras sustancias pesticidas, abonos o
reguladores del crecimiento. Las actividades de inhibición frente a
los hongos se han probado, entre otros, contra diferentes tipos de
Aspergillus, Fusarias, Phytophthora y
Trichophyton.
A partir de determinados tipos de cebada se
aíslan dos genes que codifican una quitinasa (ChiG) o bien glucanasa
(GluG). La proteína ChiG o GluG purificada inhibe in vitro
diversos hongos patógenos de plantas (entre otros, Rhizoctonia
solani) (véase R. Leah y col., Journal of Biological Chemistry,
Vol. 266, nº 3 (1991), páginas 1564-1573).
Los inventores han descubierto ahora de forma
totalmente sorprendente que como mínimo la expresión combinada doble
de PSI, AFP, ChiS, ChiG o GluG lleva a efectos sinérgicos con
respecto a la resistencia a los hongos adquirida por las plantas
transgénicas. En especial en la combinación mejoran claramente los
efectos de las sustancias individuales. Pertecen a éstas la
resistencia frente al ataque de los hongos Rhizoctonia solani,
Sclerotinia, Botrytis, etc.
Las combinaciones según la invención son (ADN y/o
polipéptidos):
(combinaciones
dobles)
| ChiS, PSI; | |
| PSI, AFP; |
(combinaciones
triples)
| ChiS, | GluG, PSI; |
| GluG, PSI, AFP; PSI, ChiG, AFP; |
(combinaciones de
cuatro)
ChiS, GluG, PSI, AFP; ChiS, GluG, PSI, ChiG;
(combinaciones de
cinco)
ChiS, GluG, PSI, AFP, ChiG.
Además, es objeto de la invención el uso
combinado de las proteínas con efecto inhibidor de los hongos,
preferiblemente ChiS, PSI y AFP, contra los hongos. El uso
combinado significa aquí también que al menos una primera sustancia
inhibidora de los hongos se expresa de la planta y al menos una
segunda sustancia que tiene efecto inhibidor de los hongos se
aporta a la planta desde fuera.
Entre los medios según la invención cuentan
aquellos que contienen las proteínas mencionadas arriba al menos en
una combinación doble. Los medios según la invención pueden contener
otras sustancias además de las proteínas. Estas otras sustancias
pueden ser pesticidas, abonos y/o reguladores del crecimiento, los
medios según la invención pueden disponerse además en diferentes
formulaciones, como concentrados, emulsiones, polvo, formulaciones
con excipientes, mezclas con otras sustancias, etc. Es
especialmente preferible la combinación ChiS/PSI y AFP/PSI. Estas
proteínas pueden emplearse con efectividad para la inhibición del
crecimiento de Rhizoctonia solani, especialmente en cultivos
de planta de tabaco.
También es objeto de la invención el uso de
secuencias de ADN en un procedimiento según la invención, que
codifica al menos un polipéptido de las secuencias A a C, o bien una
planta resistente a los hongos, que contienen en su genoma al menos
dos genes diferentes bajo el control de promotores activos con
efecto inhibidor de los hongos, como los que se definen en la
reivindicación 1. La invención describe además secuencias de ADN
que se hibridan con una secuencia de ADN que codifican polipéptidos
de las secuencias de aminoácidos A a C, pudiendo ser esta secuencia
de ADN de origen sintético o semisintético y pudiendo estar
relacionada con la secuencia de ADN mencionada anteriormente
mediante mutaciones, sustituciones de nucleótidos, deleciones de
nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de series de
nucleótidos y codificar para un polipéptido con actividad
inhibidora de los hongos. Se describe además otra molécula de ADN
recombinante, que contiene al menos una secuencia de ADN según las
realizaciones anteriores, pudiéndose encontrar esta molécula de ADN
como vector de clonación o de expresión.
También se describen los correspondientes
organismos huésped y huéspedes intermedios que son transformados con
una molécula de ADN recombinante según las realizaciones anteriores.
Como huéspedes intermedios de la producción de una planta
transgénica resistente a los hongos son preferibles cepas de
bacterias, en especial cepas de las denominadas agrobacterias.
Además, son objeto de la invención las plantas
transgénicas resistentes a los hongos obtenidas mediante los
procedimientos según la invención, en especial las plantas de
tabaco, patata, maíz, guisantes, colza y tomate.
Las secuencias de ADN descritas se transfieren
por regla general junto con un promotor. Las secuencias promotoras
son reconocidas por el aparato de transcripción de la planta y en
consecuencia llevan a una expresión constitutiva en la planta de
los genes unidos a ellas. Sin embargo, el promotor puede ser
inducible por un patógeno y/o inducible por una lesión (WUNI) y/o
específico de un tejido y/o específico de desarrollo.
Los trabajos de ingeniería genética necesarios
para la ejecución de la invención, especialmente para la expresión
de genes en plantas, son conocidos en general. Por ejemplo, en la
publicación de Maniatis y col. en "Molecular cloning: A
laboratory manual", Cold Spring Harbour (1982).
La invención se explica con más detalle en los
ejemplos siguientes.
Todos los procedimientos estándar de biología
molecular se llevaron a cabo, si no se indicaba nada más, como se
describe en Maniatis y col. en "Molecular cloning: A laboratory
manual", Cold Spring Harbour, (1982).
El ADN que codifican las secuencias de
aminoácidos A a C se clonó en primer lugar de forma conocida y
después se transfirió mediante conjugación a A. Tumefaciens LBA 4404
(A. Hoekema y col., Nature 303, 179-180).
Esto tuvo lugar según el procedimiento descrito por Van Haute y col.
en EMBO J. 2, 411-418 (1983).
La verificación de la transferencia de ADN en la
agrobacteria tuvo lugar mediante el aislamiento del ADN de las
agrobacterias según el procedimiento descrito por Ebert y col. en
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 5745-5749
(1987). El corte de restricción del ADN, la transferencia a la
membrana N-Hybond (Amersham) y la hibridación frente
a una sonda de ADN marcada radioactivamente informaron sobre una
transferencia de ADN exitosa en la agrobacteria.
Por medio de la agrobacteria transformada se
transformaron por su parte las plantas de tabaco, colza, fresa,
tomate y patata.
Las agrobacterias LBA 4404 necesarias para la
infección se fijaron en un medio antibiótico selectivo (P.
Zambrinsky y col. en EMBO J., 1, 147-152
(1983)), sedimentaron mediante centrifugación y crecieron en un
medio YEB sin antibióticos (YEB = 0,5% de extracto de carne; 0,2%
de extracto de levadura; 0,5% de peptona; 0,5% de sacarosa:
MgSO_{4} 2 mM). Tras una nueva sedimentación y asimilación en
MgSO_{4} las bacterias pueden ser usadas para la infección.
Para la infección se empleó el llamado
procedimiento de los discos de hoja.
Para la infección de los discos de hoja se
emplearon hojas estériles. Se sumergen trozos de hoja de
aproximadamente 1 cm de tamaño en la suspensión de agrobacterias
descrita previamente y a continuación se introduce en medio 3MS
(medio según T. Murashige y F. Skoog en Physiol. Plant., 15,
473-497 (1962); 3MS = MS + sacarosa al 3%). Tras
dos días de incubación con 16 horas de luz y 25ºC a 27ºC se
introdujeron los trozos de hoja en medio MSC16 (según T. Murashige
(véase arriba); MSC16 = MS + 0,5 \mug/ml BAP + 0,1 \mug/ml NAA +
100 \mug/ml sulfato de canamicina + 500 \mug/ml claforan). Tras
4-6 semanas se cortaron los brotes aparecidos y se
pusieron en medio MSC15 (según Murashige (véase arriba); MSC15 = MS
+ sacarosa 2%, 500 \mug/ml claforan + 100 \mug/ml sulfato de
canamicina. Los brotes con formación de raíces se analizaron
adicionalmente.
\newpage
Las plantas monocotiledóneas (entre otras, el
maíz), pero también en parte las plantas dicotiledóneas se
transformaron por medio de transferencia génica directa en
protoplastos. A continuación, estos protoplastos se regeneraron en
plantas intactas (Ejemplo: J. Potrykus en Biotechnology 8
(1990) 535).
Con objeto de investigar, las plantas
transgénicas obtenidas se infectaron con el hongo Rhizoctonia
solani. Para ello se cultivaron cultivos de hongos y se
mezclaron a fondo en unidades de tierra. Esta tierra se distribuyó
en una bandeja y se plantó junto con las plantas a estudiar.
Para la evaluación se asignó a cada planta de una
bandeja un valor de 0 a 3. De ahí se pudo calcular un índice para
cada línea de plantas, que resultara de la suma de los valores. La
clasificación es como sigue:
- 0 = sin síntomas (sana)
- 1 = tamaño ligeramente reducido (frente un control no infectado); ninguno o un muy pequeño ataque visible.
- 2 = fuerte reducción en el crecimiento; síntomas de ataque fuerte.
- 3 = muerte
La valoración tiene lugar durante 14 días después
del inicio de la serie de pruebas.
Primero debería mostrarse una vez que las
proteínas empleadas aquí tienen efectos sinérgicos en su
combinación. Por ello se llevaron a cabo pruebas in vitro de
crecimiento de hongos.
En este caso se añadió una cantidad definida de
micela de hongo Rhizoctonia solani con 100 \mul de solución
patata-dextrosa y se incubó a 25ºC en placas de
microtitulación. Ahí correlaciona linealmente el crecimiento de los
hongos con el incremento de la densidad óptica a 405 nm. El efecto
inhibidor de las proteínas puede probarse por medio de un
incremento pequeño de la densidad óptica.
A partir de un cultivo líquido de R.
solani se tomaron 2-3 bolitas de micela, se
añadieron a un vaso Eppendorf con 100 \mul de medio KGB y se
homogeneizaron con cuidado en un mortero de vidrio. Esta suspensión
se mezcló entonces con 10 ml de medio KGB y se pasó a través de un
filtro estéril de 100 \mum. La densidad óptica de esta suspensión
de fragmentos de micela (alícuota de 100 \mul) se ajustó mediante
adición de medio a un valor de 0,06-0,07 a 405
nanometros. Cada 100 \mul se añadieron a una placa de
microtitulación y se completó con las proteínas a probar. Para cada
prueba se midieron 7 paralelas. Sirven como controles las pruebas
que se completaron con las cantidades correspondientes de tampón.
Las placas se incubaron durante 48 horas a 25ºC en la oscuridad y
la densidad óptica de los cultivos se midió en intervalos
regulares.
Si dos proteínas actúan juntas en la inhibición
del crecimiento de los hongos de forma aditiva sinérgica o
antagónica, se calcula a partir de los datos medidos con ayuda de
la fórmula de Colby descrita a continuación y aplicada en general
(S. R. Colby en Wheeds, 15 (1967),
20-22).
Por ello, primero fue necesario calcular la
inhibición del crecimiento E (el rendimiento esperado) a esperar
teóricamente en un comportamiento aditivo. Este viene dado por:
E = W1 + W2 - ((W1 x W2) /
100)
Ahí W1 y W2 indican los rendimientos de las
proteínas solas, en las que la variación porcentual de la curva de
crecimiento (en presencia de la proteína) se entiende a partir del
control no tratado. El rendimiento para una proteína (en un momento
determinado de la curva de crecimiento) viene dado por:
W1 = (OD(K) -
OD(P)) / OD(K) x 100
\hskip1cm(porcentaje)
En este caso OD(K) es la densidad óptica
del control no tratado y OD(P) es la densidad óptica del
cultivo tratado con la proteína.
Así, en el uso combinado de dos proteínas fueron
posibles las siguientes afirmaciones: Si el rendimiento G medido en
el experimento es igual al valor esperado E, se trata de un
comportamiento aditivo. En cambio, si G es mayor que E, se trata de
un comportamiento sinérgico.
\newpage
Con el uso de este modelo de pruebas se
produjeron sorprendentemente para las proteínas ChiS, PSI, AFP, ChiG
y GluG empleadas en el ejemplo efectos de inhibición sinérgicos
frente a diversos hongos, alcanzándose este efecto tanto por la
combinación de dos tipos de proteínas como por la combinación de
varias de las proteínas citadas arriba.
Por ejemplo, a partir de la combinación de las
proteínas ChiS y PSI, o bien la combinación de las proteínas AFP y
PSI se obtuvieron los siguientes valores frente al hongo
Rhizoctonia solani (según dos concentraciones diferentes de
ChiS y AFP a una concentración constante de RIP):
Los valores esperados fueron: E1 = 29,9% y E2 =
44,5%
Los valores medidos fueron: G1 = 60,4% y G2 =
64,1%
Las proteínas ChiS y PSI también cooperan en la
inhibición del crecimiento de R. solani de forma
sinérgica.
La Fig.1 muestra los resultados que se obtuvieron
con la combinación de proteínas así como con las sustancias solas.
Según la figura se combinan diferentes concentraciones de ChiS (0,5
\mug/ml o 0,05 \mug/ml) con proteína PSI
(1,0 \mug/ml).
(1,0 \mug/ml).
Los valores esperados fueron: E1 = 39,9% y E2 =
41,9%
Los valores medidos fueron: G1 = 57,7% y G2 =
65,4%
La combinación de AFP y PSI muestra también una
inhibición sinérgica del crecimiento del hongo R. solani. En
la Fig. 2 se indican los resultados de las pruebas a diferentes
concentraciones de AFP (0,4 \mug/ml o 0,04 \mug/ml) combinado
con proteína PSI (1,0 \mug/ml).
Para obtener los organismos según la invención
con secuencias de ADN con cooperación sinérgica se produjeron
primero plantas transgénicas que al menos contenían uno de los genes
de cooperación sinérgica.
Primero se fusionó un gen ChiS con secuencias de
regulación de la planta.
Un gen ChiS de 1,8 Kb de tamaño se secuenció
mediante el uso de oligonucleótidos sintéticos según el
procedimiento de di-desoxisecuenciación de Sanger y
col. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, (1977),
5463-5467.
El promotor 35S procedente del virus del mosaico
de la coliflor (CamV) (400 pb (según Töpfer y col. en Nucl. Acid.
Res., 15 (1987) 5890)) se fusionó transcripcionalmente con el
gen ChiS. En 3' del gen ChiS se empleó la señal de terminación de
0,2 Kb de tamaño del gen 35S del CamV, cuya funcionalidad es
conocida en plantas dicotiledóneas. El gen quimérico
35S-ChiS se clonó en el vector pLS034, se
transformó en plantas de tabaco y patata por medio del sistema de
transformación del Agrobakterium tumefaciens y se regeneraron
las plantas resistentes a la kanamicina.
En las plantas obtenidas pudo detectarse tanto el
gen ChiS como el correspondiente ARNm, así como la proteína
producida genéticamente.
A partir de semillas maduras de cebada
(Hordeum vulgare L.cv.P iggy) fue aislado primeramente
PoliA^{+}^{-}ARN y se archivó en un banco de genes ADNc en
fagos \lambda-gt-11. Los detalles
del procedimiento se toman de R. Lea en Plant. Biol.,
12 (1989), 673-682. Con la ayuda de
anticuerpos PSI monoespecíficos fueron identificados los clones
ADNc.
A continuación de esto se aislaron los fagos
\lambda-gt-11 PSI positivos, se
volvieron a clonar y se secuenciaron según el procedimiento arriba
citado de didesoxisecuenciación de Sanger y col. El ADN clonado en
E. Coli se transfirió entonces al Agrobakterium
tumefaciens LBA4404 mediante conjugación, del modo descrito
arriba.
Tanto el gen transferido como el ARNm y el
producto génico pudieron detectarse en las correspondientes plantas
transgénicas de tabaco, patata, colza, fresa y tomate.
La secuencia de ADNc de los péptidos antifúngicos
está dotada de terminaciones para la clonación en el vector, que
pueden ligarse en los sitios de corte de restricción BamH1 y Sal1.
Como vector de clonación se empleó pDH51 (Pietrzak y col. en Nucl.
Acids Res. 14 (1986), 5857). El vector pDH51 se abrió con
los enzimas de restricción BamH1 y Sal1 entre el promotor y el
terminador. El vector pDH51 es un derivado de pUC18, que contiene
las secuencias del promotor y terminador del 35S transcriptazo
procedente del virus del mosaico de la coliflor. Estas secuencias
son reconocidas por el aparato transcriptor de la planta y conducen
a una fuerte expresión constitutiva en la planta del gen asociado a
ellas. El ADN del péptido antifúngico se clona entonces en el
vector sobre el sitio de corte BamH1 y Sal1.
Finalmente, la unidad de transcripción -promotor,
gen y terminador- se separa del vector con el enzima de restricción
EcoRI y se clona en un vector de transformación de la planta. Como
vector de transformación de la planta pueden emplearse, por ejemplo,
los vectores siguientes o bien sus derivados:
pOCA18 (Olszewski y col. en Nucl. Acids Res.,
16 (1988), 10765) pPCV310 (Koncz y Shell en MGG 204 (1986),
383) y pBin19 (Bevan y col., Nucl. Acids. Res. 12 (1984) 8711).
Después de que se ligara la unidad de
transcripción y el vector sobre el sitio de corte de EcoRI, se
conjugó la construcción en la cepa de Agrobacterias MP90RK (Koncz y
Shell (véase arriba)) o IHA101 (Hood y col. en J. Bacteriol.
168 (1986), 1291).
Las plantas transgénicas de tabaco, patata,
fresa, colza y tomate fueron transformadas entonces según los
procedimientos descritos arriba. Los brotes transformados se
seleccionan por la resistencia transferida frente al antibiótico
kanamicina. Mediante el análisis de ADN (Southern Blotting),
análisis de ARN (Northern Blotting) y análisis de proteínas con
anticuerpos específicos (Western Blotting) se comprobó y confirmó la
expresión de las proteínas antifúngicas en las plantas útiles
transformadas.
De forma análoga a las plantas descritas
anteriormente se pudieron obtener plantas transgénicas ChiG o GluG,
que eran tanto Southern, Northern como Western positivas.
Los genes antes mencionados pudieron integrarse
mediante transferencia génica directa en el genoma de plantas
monocotiledóneas, como por ejemplo maíz. En este caso se obtuvieron
plantas transgénicas que eran tanto Southern, como Northern y
Western positivas.
Las plantas de tabaco, maíz, colza, fresa, patata
y tomate obtenidas anteriormente se cruzaron entre sí y se
seleccionaron de plantas que contuvieran al mismo tiempo los genes
de resistencia a los hongos de ambos progenitores. Además, de este
modo se obtuvieron plantas transgénicas que fueron transformadas
primero con uno y luego con otro o varios genes. Finalmente fueron
transformadas plantas con vectores, que aún contuvieran genes de
resistencia diferentes. Con estos productos vegetales se realizaron
pruebas de resistencia a los hongos. Sorprendentemente se observan
en todos los casos no sólo efectos aditivos concernientes a la
resistencia a los hongos, sino efectos sinérgicos.
Por ejemplo, una planta de tabaco que expresa
ChiS y PSI presenta esencialmente una mayor resistencia frente al
ataque de Rhizoctonia que las plantas que expresan sólo ChiS
o PSI o la que resultaría a partir de la resistencia aditiva.
Un efecto inhibidor sinérgico resulta también de
la expresión combinada de tabaco PSI y AFP transgénico frente al
ataque de Rhizoctonia solani. También la combinación de dos o
varios genes distintos (ChiS, RIP, AFP, ChiG y GluG) en las más
diferentes plantas transgénicas llevó a efectos inhibidores
sinérgicos frente a diversos hongos.
Mientras que las plantas de tipo salvaje en
pruebas con 20 plantas de semillero presentan valores índice de 38 a
46, se demuestra en el tabaco transgénico según la invención, que
éste en presencia del hongo Rhizoctonia solani crece tan bien
como las plantas control (valor índice 10-12), que
fueron cultivadas en suelo libre de Rhizoctonia.
Protocolos de secuencia 1 a 3
(AFP)
Sec. IDNº.: 1 a 3
\hskip1cm(1)
Tipo de secuencia: secuencia de nucleótidos
completa con la proteína correspondiente, proteína efectiva en
cuanto se codifica mediante un marco de lectura abierto, (3).
Longitud de la secuencia: 51 aminoácidos
\hskip1cm(3)
Forma de la cadena: cadena simple
Topología: lineal
Tipo de molécula: ADNc
Procedencia nativa: caldo de fermentación de
Aspergillus giganteus.
Nombre: Péptido antifúngico (AFP)
Características (1): Marco de lectura abierto de
177 nucleótidos; el aminoácido N-terminal de la
proteína efectiva está marcado con *.
Propiedades: agente antifúngico, especialmente
frente a Rhizoctonia solani, diferentes tipos de
Aspergillus, Fusarias y Tricophyton.
SEC ID Nº
1
SEC ID Nº 2 (Secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº:
1)
SEC ID Nº:
3
Protocolos de secuencia 4 a 7
(PSI)
Sec. IDNº.: 4 a 7
Tipo de secuencia: nucleótido con la
correspondiente proteína.
Longitud de la secuencia: 1078 pares de bases (6
y 7 = clon PSI-ADNc incompleto)
Forma de la cadena: cadena simple
Topología: lineal
Tipo de molécula: ADN complementario
Procedencia nativa: semillas de cebada
(Hordeum vulgare L.cv.Piggy)
Procedencia experimental directa: banco de genes
ADNc en fagos \lambda-gt-11.
Nombre: Inhibidor de la síntesis de
proteínas.
Características:
Región 5' no traductora de 42 pb de longitud.
Marco de lectura abierto de 843 pares de bases (el codón de
detención está marcado con una estrellita)
Terminación 3' no traducida de 193 pares de bases
de longitud, las posibles señales de poliadenilación están
subrayadas.
Propiedades:
Antifúngico eficaz, especialmente frente a
esporas de Trichoderma reesii y fusarium
sporotrichoides, así como Rhizoctonia solani.
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\newpage
SEC ID Nº:
4
SEC ID Nº: 5 (Secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº:
4)
SEC ID Nº:
6
\newpage
SEC ID Nº: 7 (Secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº:
6)
Protocolo de secuencia 8
(ChiS)
Sec. IDNº.: 8
Tipo de secuencia: nucleótido
Forma de la cadena: cadena simple (la cadena
activada es cadena doble)
Topología: lineal
Tipo de molécula: ADNc
Procedencia experimental directa: plásmido pLChiS
de la cepa A 5187 de E. coli
Procedencia nativa: banco de cósmidos de
Serratia Marcescens
Nombre: Proteína ChiS (quitinasa)
Propiedades: Exoquitinasa
\newpage
SEC ID Nº:
8
\newpage
Protocolo de secuencia 9 y 10
(ChiG)
Sec. IDNº.: 9 y 10
Tipo de secuencia: nucleótido
Longitud de la secuencia: 1013 nucleótidos
Tipo de molécula: ADNc
Procedencia nativa: semillas de cebada
(Hordeum vulgare L.)
Nombre: ChiG (quitinasa G)
Características:
Región inicial 5' no traductora de 63 pb de
longitud, marco de lectura abierto de 798 pb, terminación 3' no
traducida de 152 pb de longitud, los codones de detención de lectura
están marcados con una estrellita, las posibles secuencias de
péptidos señal están subrayadas, la secuencia de aminoácidos
derivada de una preproteína quitinasa de 26 kD con 266 aminoácidos
se indica debajo de la secuencia de nucleótidos, la secuencia
subrayada rica en AT en la posición 905 es probablemente una señal
de poliadenilación.
Propiedades: antifúngico eficaz, especialmente
frente a Trichoderma reesii y fusarium
sporotrichoides, así como Rhizoctonia solani y
Botrytis cinerea.
SEC ID Nº:
9
\newpage
SEC ID Nº: 10 (Secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº:
9)
Protocolos de secuencia 11 y 12
(GluG)
Sec. IDNº.: 11 y 12
Tipo de secuencia: nucleótido con la
correspondiente proteína.
Longitud de la secuencia: 1249 nucleótidos
Tipo de molécula: ADNc
Procedencia nativa: semillas de cebada
(Hordeum vulgare L.)
Nombre: GluG (glucanasa)
Características:
Región inicial 5' no traductora de 48 pb de
longitud, marco de lectura abierto de 1002 bp, terminación 3' no
traducida de 199 pb de longitud, la secuencia subrayada rica en At
entre la posición 1083 y 1210 son probablemente señales de
poliadenilación, la secuencia de aminoácidos derivada de la
preproteína codificada de 334 aminoácidos se indica debajo de la
secuencia de nucleótidos.
\newpage
SEC ID Nº: 12 (Secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº:
11)
Claims (5)
1. Planta transgénica resistente a los hongos,
cuyo genoma contiene al menos dos secuencias de genes diferentes,
que codifican proteínas con efecto inhibidor de los hongos, bajo
control de promotores activos, caracterizada porque las
secuencias de ADN codifican:
- (a)
- al menos una proteína PSI que contiene la secuencia de aminoácidos según la secuencia ID Nº 4, y
- (b)
- una proteína ChiS que contiene la secuencia de aminoácidos del producto génico de la secuencia según la secuencia ID Nº 8 o una proteína AFP que contiene la secuencia de aminoácidos según la secuencia ID Nº 3.
2. Planta resistente a los hongos según la
reivindicación 1, obteniéndose la planta de modo que en el genoma de
una planta se transfiere al menos un gen que codifican una proteína
con efecto inhibidor de los hongos y la planta resistente a los
hongos se obtiene
- (a)
- por cruzamiento de la planta dado el caso con otra planta transgénica, que contiene al menos un gen distinto que codifican una proteína distinta con efecto inhibidor de los hongos y a continuación selección o
- (b)
- por transformación de la planta con al menos un gen distinto, que codifican una proteína distinta con efecto inhibidor de los hongos.
3. Planta según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque es una planta de tabaco, patata, fresa,
maíz, colza o tomate.
4. Procedimiento para la producción de plantas
resistentes a los hongos según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque se transfiere en el genoma de una
planta al menos un gen, que codifican una proteína con efecto
inhibidor de los hongos como se define en la reivindicación 1 y la
planta resistente a los hongos se obtiene
- (a)'
- por cruzamiento de la planta dado el caso con otra planta transgénica, que contiene al menos un gen distinto que codifican una proteína distinta con efecto inhibidor de los hongos y a continuación selección o
- (b)'
- por transformación de la planta con al menos un gen distinto, que codifican una proteína distinta con efecto inhibidor de los hongos como se define en la reivindicación 1.
5. Procedimiento para la producción de una planta
con resistencia a los hongos mejorada, comprendiendo el
procedimiento la transformación de una planta con al menos dos
secuencias de genes diferentes que codifican proteínas con efecto
inhibidor de los hongos, bajo el control de promotores activos, con
la medida de que las secuencias de ADN codifican:
- (a)
- al menos una proteína PSI que contiene la secuencia de aminoácidos según la secuencia ID Nº 4, y
- (b)
- una proteína ChiS que contiene la secuencia de aminoácidos del producto génico de la secuencia según la secuencia ID Nº 8 o una proteína AFP que comprende la secuencia de aminoácidos según la secuencia ID Nº 3.
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