KR20040003855A

KR20040003855A - 고추 한별 품종 (ＣａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍＬ.ｃｖ. Ｈａｎｂｙｕｌ)으로부터 유래한리피드트랜스퍼단백질 ＣＡＬＴＰ Ⅰ·ＣＡＬＴＰⅡ·ＣＡＬＴＰⅢ을 코딩하는 유전자 및 마커로서의 활용

Info

Publication number: KR20040003855A
Application number: KR1020020038679A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 정호원
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2002-07-04
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2004-01-13

Abstract

본 발명은 고추 한별 품종에서 분리한 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 염기 서열 및 마커로서의 용도에 관한 것으로 이를 이용하면 식물병 저항성과 환경 내성을 유도할 수 있고, 식물병 저항성 또는 환경내성 품종의 육종에 적용함으로써 식물병을 방제할 수 있으며, 식물의 전신획득저항성을 유도하는 미생물 또는 물질의 선발에 이용 할 수 있는 뛰어난 효과를 제공한다.

Description

고추 한별 품종 (ＣａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍＬ. ｃｖ. Ｈａｎｂｙｕｌ)으로부터 유래한 리피드트랜스퍼단백질 ＣＡＬＴＰ Ⅰ·ＣＡＬＴＰⅡ ·ＣＡＬＴＰⅢ을 코딩하는 유전자 및 마커로서의 활용{Gene sequences of lipidtransferprotein CALTPⅠ ·CALTPⅡ ·CALTPⅢ from Capsicum annuum L. cv. Hanbyul and usage as marker thereof}

본 발명은 식물 병생성 관련 단백질을 코딩하는 유전자군의 염기서열 및 그 용도에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 고추 한별 품종에서 분리한 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 염기서열 및 마커로서의 용도에 관한 것이다.

기주식물은 식물병에 대하여 여러 가지 세포내 대사를 작동시켜 방어기작을 작동시키게 된다. 이러한 방어기작에 의해 병원균의 감염초기에 병진전을 제한시킬수 있는지의 여부에 의해 기주식물과 식물병원균간의 반응이 결정되어, 친화적반응과 불친화적반응으로 나뉘게 된다. 불친화적반응에서 식물의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하면 이에 대한 반응으로 감염부위의 세포에 국부적 세포죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 칼로스(callose)의 축적, 리그닌(lignin)화에 의한 식물세포벽의 비후화, 파이토알렉신(phytoalexin) 등의 여러 종류의 항균성물질의 생성, 병생성관련단백질[pathogenesis related(PR) protein] 생성등이 일어난다고 보고되고 있다. 또한 이러한 방어기작은 병원균의 침입뿐만이 아니라 살리실산이나 아미노부티르산등에 의해서도 나타난다고 보고되었다. 이러한 반응을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다. 이 유도저항성은 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있지만 실용적인 가치가 있다. 이러한 병원균에 대한 방어반응과 함께 냉해, 염, 건조등의 자연환경에 식물이 적응하기 위하여 다양한 생리·생화학적 변화를 동반하는데 지금까지 널리 알려진 바로는 생체내 당류 생성 증가, 세포벽의 강화등이 알려져 있다. 이러한 환경스트레스에 대한 식물의 반응은 조기에 진단하는 것이 중요하다고 알려져 있다. 식물에서 나타나는 병저항성, 또는 환경변화에 대한 내성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써 병저항성, 환경내성이 증진되는 형질전환식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하여 작동하는 식물보호 화학물질 혹은 미생물제제을 개발할 수 있다.

지난 수년동안 병생성관련단백질-1 (PR-1), 키틴가수분해효소, 그리고 글루칸가수분해효소등의 단백질이 항미생물적 효과를 가지고 있으며 이들 단백질이 식물의 병방어반응에서 중요한 역할을 한다는 사실이 알려져 왔으며 이외에도 다양한 단백질이 항미생물적 효과를 가지고 있음이 밝혀져 왔다.

최근에 들어, 리피드트랜스퍼단백질은 식물세포에서 분비되고 이들은 다시 식물세포벽의 주성분인 큐틴(cutin, 왁스(wax)층의 형성에 관여할 것이라고 보고되었으며, 이러한 식물발달과정에서의 역할 이외에 염, 건조, 냉해 등과 같은 환경 변화 적응하기 위하여 이들 유전자의 발현이 조절된다고 토마토, 옥수수등의 작물에서 보고되고 있다. 또한 무, 보리, 옥수수, 포도 등으로부터 분리한 리피드트랜스퍼단백질의 경우 생체외 조건에서 항미생물 효과를 가지고 있다고 보고되었다.

이에 본 발명은 식물의 병방어반응을 대표할 수 있는 리피드트랜스퍼단백질 유전자를 분리하여 그 염기서열을 밝히고, 이를 마커로 이용하여 식물의 분자육종프로그램에서 활용하게 하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적은 고추·세균성점무늬병원균의 특정 레이스에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종에서 분리한 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질의 염기서열을 밝히고, 다양한 생물적 ·환경적 인자에 의한 발현을 확인함으로써 달성되었다.

이하 본 발명의 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.

도 1은 한별 품종에 병원성의 고추·세균성점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)과 비병원성 고추·세균성점무늬병균을 접종하였을 때 감염 잎에서의 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질(lipidtransferprotein) 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 2는 한별 품종에 병원성의 고추·역병균 (Phytophthora capsici)과 비병원성의 고추·역병균을 접종하였을 때 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 3은 한별 품종의 고추열매에 고추·탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides)를 접종하였을 때 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 4는 한별 품종의 하위엽에 고추·세균성점무늬병균의 비병원성균주를 접종한 후 상위엽에서 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 5는 한별 품종의 하위엽에 식물에 대한 병원성 또는 비병원성 세균을 접종한 후, 균이 접종되지 않은 상위엽에서 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 6은 한별 품종의 잎에 에틸렌을 처리한 후 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 7은 한별 품종의 잎에 메틸자스모네이트를 처리한 후 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 8은 한별품종의 잎에 ABA를 처리한 후 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 9는 한별 품종의 식물을 건조 처리한 후 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 10은 한별 품종의 식물에 염 처리 후 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 11은 한별 품종의 식물에 냉해 처리 후 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 12는CALTP발현을 위한 발현벡터, pMBP1, pBIN35S의 제작 모식도이다.

도 13은 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105로부터 증폭시킨CALTPDNA산물의 전기영동결과를 보여주는 사진도이다.

도 14a는nptⅡ 유전자 특이적 프라이머를 이용한 재조합 담배의 유전자 PCR 분석을 보여주는 사진도이다.

도 14b는nptⅡ 유전자 특이적 프라이머를 이용한 재조합 아라비도프시스(Arabidopsis)의 유전자 PCR 분석을 보여주는 사진도이다.

도 14c는CALTPⅠ유전자 특이적 프라이머를 이용한 형질전환 아라비도프시스(Arabidopsis)의 유전자 PCR 분석을 보여주는 사진도이다.

도 15a는 형질전환된 담배 잎에서의CALTPS유전자 발현의 RNA gel blot 분석을 보여주는 사진도이다.

도 15b는 형질전환된 아라비도프시스 잎에서의CALTPS유전자 발현의 RNA gel blot 분석을 보여주는 사진도이다.

본 발명은 고추 한별 품종 유래 리피드트랜스퍼단백질 CALTPⅠ ·CALTPⅡ ·CALTPⅢ의 아미노산 서열을 각각 코딩하는 서열목록의 서열 1 ·2 ·3에 기재된 유전자 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 생물적 ·환경적 스트레스에 대해 반응하는 상기 리피드트랜스퍼 유전자중 어느 하나 이상의 유전자를 함유함을 특징으로 하는 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커를 제공한다.

아울러, 상기 기재의 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커를 숙주식물세포에 주입한 경우에 있어, 상기 마커로부터 전사된 mRNA를 확인함으로써 숙주식물세포들이 생물적 ·환경적스트레스에 노출되어 있는지 여부를 진단하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.

첫째, 고추 한별 품종의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 염기서열에 대해 설명한다.

본 발명에서 고추 한별 품종의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 염기서열을 밝히기 위하여 고추·세균성점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)에 의해 저항성 병반인 과민성 반응이 나타난 고추 한별 품종에서 mRNA를 분리하고 이로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다. 제작한 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 선발하여 이들을 나일론멤브레인에 일정하게 흡착시킨 후, 건전한 고추 잎과 과민성반응이 나타난 고추 잎으로부터 얻어진 단일가닥 cDNA 탐침자를 이용하여 리버스노던하이브리다이제이션을 수행한다. 이를 통하여 얻어진 과민성반응에서 특이적으로 축적되는 결과를 보인 개개의 cDNA 유전자 클론 중 5'-말단의 염기서열을 통해 리피드트랜스퍼단백질 유전자로 확인된 클론의 전체 염기서열을 결정한다. 이를 통하여 모두 3종류의 유전자군을 확인하였으며 이들의 이름을 순서대로 각기CALTPI, CALTPII,CALTPIII로 명명하였다.CALTPI, CALTPII, 그리고CALTPIII유전자는 각각 588, 717, 그리고 685 bp의 염기서열로 이루어져 있으며 상호 간의 염기서열 상동성은CALTPI과CALTPII의 경우는 57 %,CALTPI과CALTPII의 경우는 58 %의 상동성을 그리고CALTPII와CALTPIII의 경우에는 72 %의 염기서열 상동성을 가지는 것으로 분석된다. 이들 유전자간의 염기서열 상동성을 분석 한 결과, 흥미로운 사실 중 하나는CALTPII와CALTPIII유전자의 3' 말단 염기서열이 매우 높은 상동성을 가지는 반면 5 ' 말단 염기서열 상동성이 현저히 낮은 것으로 분석된다. 3개의CALTP유전자가 암호화하고 있는 단백질의 특성을 유추해보면CALTPI유전자의 경우에 106개의 아미노산으로 구성되며 11,291 Da의 분자량과 8.83 pI 등전점을 가지는 것으로 분석되며,CALTPII의 경우에는114개의 aa로 구성되며 11,563 Da, pI 8.15 일 것으로 분석되고, 마지막으로CALTPIII의 경우에는 114개의 aa로 구성되며 11,596 Da, pI 8.65 일 것으로 분석된다. 3개의CALTP유전자자 암호화 하고 있는 아미노산서열을 각각 상호간에 상동을 비교하고, 진뱅크(GenBank)에 등록되어있는 타작물의 유전자와 상동성을 분석한 결과,CALTPII의 아미노산 서열은CALTPIII와 72% 상동성을 보였으며 담배 유전자와는 79 % 의 상동성을, 그리고 토마토 유전자와는 80 %의 상동성을 보이는 것으로 분석된다.CALTPIII의 경우도 담배와 토마토 유전자와CALTPII유전자와 유사한 상동성을 보이는 것으로 조사된다. 또한CALTPII와CALTPIII는 사탕무우와 시금치 LTP 와 58%, 64 % 의 아미노산 상동성을 보이는 것으로 조사된다. 반면에CALTPI의 경우에CALTPII와CALTPIII와 57%, 58 % 의 상대적으로 낮은 상동성을 보였으며 타작물의 유전자와도 40 - 63 %의 상동성을 보이는 것으로 조사된다. 이를 기초로 할 때, 상기와 같이 클로닝된 고추 한별 품종의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군은 다른 식물체에 존재하는 단백질 유전자와 구별되는 신규의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군 임을 알 수 있다.

둘째, 세균성 병원균, 난균류, 진균류 병원균에 의한 고추식물에서의 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 유도 ·발현에 대해 상세히 설명한다.

병에 대하여 저항성인 식물체는 병원체의 침입 ·감염 시 다양한 방어반응을 나타내는데, 세균성 병원균 및 난균류 병원균의 침입 시 고추 식물의 잎과 줄기, 열매에서 리피드트랜스퍼단백질 유전자군이 차별적으로 유도·발현된다. 이 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 유도와 발현은 감염된 부위에 나타나는 국부저항성 및 전신획득 저항성을 나타내어주는 분자적 표지로 볼 수 있다.

고추·세균성점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria), 고추·역병균 (Phytophthora capsici), 그리고 고추·탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides)을 접종한 감염된 식물조직에서 세 개의 리피드트랜스퍼단백질 유전자가 다양한 식물병원균의 침입에 대하여 차별적으로 유도·발현된다. 또한, 병원성균과 비병원성균에 대해 세 개의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현이 다르게 나타나는 것을 알 수 있다.

고추·세균성점무늬병균이 감염된 식물의 잎에서,CALTPI유전자의 경우에 친화적 상호작용에서 접종 후 18시간 이후에 매우 약한 발현 양상을 보이는 반면에, 불친화적 상호작용의 경우에 접종 후 24시간에 이후에CALTPI유전자의 발현이 친화적 상호작용의 발현보다 상대적으로 강하게 나타난다. 하지만CALTPII와CALTPIII유전자는 친화적, 불친화적 상호작용 모두에서 강한 발현 양상을 나타내며 불친화적 상호작용에서 접종 후 6시간째 그 발현이 빠르게 일어나는 것으로 확인된다.

고추·역병균이 감염된 고추 식물 줄기에서는 친화적 상호작용에서CALTPI유전자는 접종 후 36 시간에 강한 발현 양상을 나타내지만, 48 시간이 지난 후에는 급격한 감소를 나타내는 것으로 관찰된다. 반면에, 불친화적 상호작용에서는 접종 48 시간이 지난 후에CALTPI유전자가 줄기에서 강하게 발현되고 있음을 알 수 있다.CALTPII유전자의 경우에는 친화적 상호작용을 보이는 줄기에서는 건전 줄기에 존재하는 전사수준을 나타내는 반면에, 불친화적 상호작용에서는 접종 24 시간 후에 전사체의 강한 발현 양상을 확인 할 수 있다.CALTPIII유전자의 경우에는, 친화적 상호작용에서 접종 후 12시간째 그 발현을 관찰 할 수 있었으며 반면에 불친화적 상호작용에서는 접종 후 12시간째에 그 발현이 시작되어 24시간까지 높은 수준의 발현 양상을 보이는 것을 알 수 있다.

또한, 고추 탄저병에 감염된 식물 열매에서는CALTPI유전자는 탄저병균에감염된 파란 열매에서 접종 후 24 시간에 발현이 나타나고 있으며, 48시간까지 그 양상이 지속되며, 72시간째에 감소하고 있음을 알 수 있다. 반면에 빨간 열매에서는 접 종 후 72시간째에 유전자의 발현이 나타나고 있다.CALTPII와CALTPIII유전자의 경우에 탄저병균이 감염된 파란 열매에서 접종 후 그 발현이 건전 열매보다 강하게 증가하고 있으며 반면에CALTPI유전자와는 다르게 탄저병균에 감염된 빨간 열매에서는 발현하고 있지 않는다.

셋째, 병원성 세균 또는 비병원성 세균 처리에 의한 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 전신적 발현에 대해 상세히 설명한다.

식물은 외부로부터의 특정한 자극에 의해 내재되어있는 병저항성 반응이 전신적으로 유도·발현되어 병원균의 칩입으로부터 자신을 보호하는 일종의 면역반응을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 전신적 획득저항성은 살리실산, 비티에이치, 아미노부티르산 등과 같은 화합물에 의해 유도되어지며 또한 다양한 미생물에 의해서도 유도되어진다고 알려져 있다. 그리고 이러한 전신적획득저항성은 일련의 생화학적 변화로부터 기인하는데 이러한 변화중 대표적인 것이 다양한 병생성관련 단백질의 전신적 유도·축적이라고 할 수 있다.

고추식물에서 전신적획득저항성의 발현 여부 및 세종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 전신적 발현여부를 평가하기 위하여 식물병원세균과, 비병원세균, 부생균을 식물의 하위엽에 접종하고 접종되지 않은 상위엽에서의 유전자 발현을 평가 한 결과, 상기 세종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자가 상위 엽에서 모두 발현되고 있음을 알 수 있으며 접종 후 시간별로 그 유도발현이 지속되고 있음을 알 수 있다.

넷째, 식물체의 비생물적 유도체에 의한 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 유도??발현에 대해 상세히 설명한다.

식물병 저항성 유도 물질로 알려진 여러 가지 물질을 통하여 이 유전자가 어떠한 기작을 통하여 발현되어 병저항성을 유도하는지 확인하기 위하여 이 물질들을 식물체에 처리한 후 노던 블럿팅 (northern blotting)을 실시한다. 그 결과 에틸렌, 메틸자스모네이트, ABA를 처리한 식물의 잎에서 리피드트랜스퍼단백질 유전자군이 강하게 유도 ·발현됨을 알 수 있다. 반면에 살리실산은 상기 유전자의 발현 유도에 전혀 영향을 미치지 못하는 것을 확인 할 수 있다. 이 결과로 상기 유전자 발현은 기존에 알려진 살리실산 신호전달 과정보다는 에틸렌이나 자스모네이트, ABA에 의한 신호전달 과정과 관계가 있다는 것을 나타내 주고 있다. 에틸렌, 메틸자스모네이트, ABA을 처리한 후 시간별로 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰한 결과, 고추 리피드트랜스퍼단백질 유전자군은 처리 후 6시간부터 축적되기 시작하여 18 시간에 계속하여 증가하며 24시간까지 그 발현 수준을 유지하는 것을 알 수 있다.

다섯째, 건조, 염, 냉해 등 환경 스트레스에 의한 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 유도 ·발현에 대해 상세히 설명한다.

식물이 생장하는데 중요한 수분과 관련된 다양한 환경요인 가운데 건조, 염, 냉해 등이 중요한 억제 요인이라고 할 수 있다. 이러한 환경 스트레스에 처한 식물을 조기에 진단하고 이에 대한 식물의 내성을 이해하기 위하여 다양한 환경 스트레스를 식물에 가한 후 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 유도 ·발현을 조사한다.CALTPI과CALTPIII유전자의 경우에는 세가지 처리에서 모두 처리 후 시간이 경과함에 따라 그 발현이 증가됨을 알 수 있으며CALTPII의 경우에는 염처리시 그 발현이 건전한 식물보다 증가하는 경향을 나타내나, 건조 그리고 냉해 처리에 의해서는 오히려 그 발현이 감소하고 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다.

실시예 1 : 리피드트랜스퍼단백질 유전자군 및 이들의 염기서열 결정

고추 (Capsicum annuum) 한별 품종에 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)의 비병원성균주를 접종하고 18시간 동안 습실처리하여 과민성 반응이 나타난 식물체에서 RNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 제작한 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 선발하여 이들을 나일론멤브레인에 일정하게 흡착시킨 후, 건전한 고추 잎과 과민성반응이 나타난 고추 잎으로부터 얻어진 단일가닥 cDNA 탐침자를 이용하여 리버스노던하이브리다이제이션(디퍼런셜 하이브리다이제이션)을 수행하였다. 이를 통하여 얻어진 과민성반응에서 특이적으로 축적되는 결과를 보인 개개의 cDNA 유전자 클론 중 5'-말단의 염기서열을통해 리피드트랜스퍼단백질 유전자로 확인된 세 개 클론의 전체 염기서열을 결정하였다. 서열목록의 서열1, 2, 3은 고추 한별 품종으로부터 분리한 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 염기서열을 나타낸 것이다.

실시예 2 : 세균성 병원균, 난균류, 진균류 병원균에 의한 고추식물에서의 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 유도·발현

첫째, 고추·세균성점무늬병원균 중 고추 식물의 한별 품종과 친화적 반응을 나타내는 병원성 균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양하여 5X10⁸cfu/ml의 농도로 6엽기 식물체에 진공펌프에 연결된 분무기를 이용하여 인필트레이션하여 접종하고 18시간 동안 습실처리를 하였다. 접종 후 6, 12, 18, 24, 30시간 후에 고추 잎을 취하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이론멤브레인 (Hybond N+)으로 전이시켰다. 실시예 1에서 수득된 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드 벡터[pBlue-script SK(-)]를 제한효소EcoRI과HindIII,EcoRI과PstI, 그리고EcoRI과XbaI으로 각각 절단하고 이 DNA 단편만을 회수하여³²P로 표지한 후, 반응액 (0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% dextran sulfate)에서 65??C에서 16-24시간 동안 하이브리다이제이션을 수행하였다. 그 결과 친화적 불친화적 상호반응 모두에서 세종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자가 유도 발현됨을 알 수 있었으며 불친화적 상호반응에서 그 발현 시간이 보다 빠르고 발현 양 또한많은 것을 알 수 있었다. 도 1은 고추 한별 품종이 세균성점무늬병균에 의해 감염되었을 때 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 유도·발현 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 건전은 병 접종이 않된 식물체를 나타내고 친화적 상호반응은 병원성 균주를 접종하여 식물에 감수성 병징이 나타나는 경우를 말하며 불친화적 상호반응은 비병원성균주를 접종하여 식물에 저항성 과민반응이 나타나는 경우를 의미하며 숫자는 접종한 후 시간별로 발현되는 양상을 말해준다.

둘째, 고추·역병균 중 식물에 친화적 반응을 나타내는 S197 균주와 불친화적 반응을 나타내는 CBS178.26 균주를 고추 줄기에 접종하고 시간 별로 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이론멤브레인(Hybond N+)으로 옮겨준 후 상기 첫째에 기재되어 있는 방법으로 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과CALTPI과CALTPIII는 불친화적 상호반응에서 강한 유도현상을 나타내었으며CALTPII의 경우에는 고추줄기에서 건전한 조직 이상의 발현을 보이지 않음을 알 수 있었다. 도 2는 고추·역병에 의해 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 건전은 병접종이 안된 식물체를 나타내고 친화적 상호반응은 병원성 균주를 접종하여 식물에 감수성 병징이 나타나는 경우를 말하며 불친화적 상호반응은 비병원성균주를 접종하여 식물에 저항성 과민반응이 나타나는 경우를 의미하며, 숫자는 접종한 후 시간별로 발현되는 것을 말해준다.

셋째, 고추·탄저병균중 덜 익은 파란고추에 친화적 반응을 나타내는 균주를 파란 고추와 붉은 고추열매에 접종한 후 날짜별로 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이론멤브레인(Hybond N+)으로 옮겨준 후 상기 첫째에 기재되어 있는 방법으로 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과CALTPI의 경우에 붉은 열매에서 접종 후 72시간에 그 발현이 나타남을 알 수 있었으며, 다른 두 개의 유전자는 붉은 열매에서는 발현되지 않음을 알 수 있었다. 또한 파란 열매에서는 세 종류의 유전자가 모두 병 감염이후 유도·발현됨을 알 수 있었다. 도 3은 고추 탄저병에 대한 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 건전은 병접종이 안된 식물체를 나타내고 숫자는 접종한 후 날짜별로 발현되는 것을 말해준다.

실시예 3 : 병원성 세균 또는 비병원성 세균 처리에 의한 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 전신적 발현

첫째, 고추식물의 1, 2엽에 고추세균성점무늬병균의 비병원성균주를 접종하고 18시간 동안 습실처리한 후, 2일동안 정상적 생육조건에서 식물을 배양하였다. 비병원세균을 접종한 지 만 3일이 된 후 접종 한 식물로부터 3, 4, 5, 그리고 6엽을 각각 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이론멤브레인(Hybond N+)으로 옮겨준 후 상기 실시예 2의 첫째에 기재되어 있는 방법과 같은 방법으로 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 병원균이 접종되지 않은 상위엽 모두에서 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자가유도·발현됨을 알 수 있었다. 도 4는 고추 하위엽에 비병원성 세균 감염에 대한 상위엽에서의 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 건전은 병 접종되지 않은 식물체의 잎을 의미하며 숫자는 하위엽에 접종된 식물의 상위엽을 의미한다. 둘째, 고추식물의 1엽에 세균성점무늬병균의 병원성, 비병원성, 근권부생세균인 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomanas fluorescens)를 접종하고 시간별로 식물의 접종되지 않은 2엽을 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이론멤브레인(Hybond N+)으로 옮겨준 후 상기 실시예 2의 첫째에 기재된 방법으로 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 각기 다양한 세균의 감염에 의해서 리피드트랜스퍼단백질 유전자가 전신적으로 발현됨을 알 수 있었으며, 특히 비병원성세균의 감염에 의해 전신적 발현이 시간이 경과함에도 불구하고 지속되고 있음을 알 수 있었다. 도 5는 고추 하위엽의 다양한 세균 감염에 대한 상위엽에서의 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현을 시간별로 나타낸 것이다. 건전은 병 접종되지 않은 식물체의 잎을 의미하며 M은 물을 처리한 식물의 잎을, 숫자는 접종한 후 시간별로 발현되는 것을 말해준다. 또한, 국부적은 세균이 접종되어진 식물의 하위엽을 의미하며 전신적은 세균이 감염되지 않은 식물의 상위엽을 의미한다.

실시예 4 : 식물체의 비생물적 유도체에 의한 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 유도 ·발현

첫째, 식물체에 병 저항성을 유도한다고 알려진 여러 가지 물질 (에틸렌 가스, 메틸 자스모네이트, ABA) 을 식물에 처리한 시간별로 식물체로부터 총 RNA를 분리하였다. 각 물질의 처리는 다음과 같다. 에틸렌 가스 처리는 500ml 정도의 마개가 있는 유리병에 5 ul / liter의 양이 되도록 주사기를 통하여 가스를 주입하였다. 메틸자스모네이트와 ABA 는 각각 100 uM 농도롤 식물에 엽면살포하였다. 각 유도물질을 처리한 후 일정한 시간이 경과함에 따라 각각의 식물에서 잎을 취하여 이로부터 RNA를 순화하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나일론멤브레인 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후 상기 실시예 2의 첫째에 기재된 방법으로 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 건전한 잎에서 발현되지 않는CALTPI과CALTPII유전자의 경우에 각각의 처리에 의해 시간이 경과함에 따라 유전자의 발현이 증가하였다. 반면에 건전한 식물의 잎에서 발현되고 있는CALTPII유전자의 경우에는 각각의 처리에 따라 그 발현이 감소하고 있는 것을 알 수 있었다. 도 6은 에틸렌을 처리한 후 시간대별로 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 결과를 나타낸 것이다. 에틸렌은 5 ul / liter로 처리되었고 건전는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다. 도 7은 메틸자스모네이트를 처리한 후 시간대별로 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 식물에 메틸자스모네이트를 100 ??M로 처리하였다. 건전는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다. 도 8은 ABA를 처리한 후 시간대별로 리피드트랜스퍼단백질 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 식물에 ABA를 100 μM로 처리하였다. 건전는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

실시예 5 : 환경 스트레스에 의한 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 유도·발현

첫째, 건조, 염, 냉해 등 수분 스트레스를 포함하는 환경의 변화에 따른 세 종류의 리피드트랜스퍼단백질의 발현 결과를 평가하고자, 건조 처리의 경우는 고추식물의 생장과정에 물을 주지 않고 길러, 눈으로 시들음 증상이 확인되는 시점을 1일로 결정하여 날짜별로 평가하였다. 염 처리의 경우에는 100 mM의 소디움클로라이드를 처리하여 시간별로 그 발현 양을 평가하였으며, 또한 1, 10, 100, 200 mM 로 농도별 처리하여 18시간 후에 그 발현량을 평가하였으며, 냉해 처리의 경우에는 섭씨 4도 조건에서 식물을 배양 한 후 시간별로 발현 양을 평가하였다. 각 시간별로 RNA를 분리하여, 이를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나일론멤브레인 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후 상기 실시예 2의 첫째에 기재된 방법과 같은 방법으로 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과CALTPI과CALTPIII은 세가지 처리 모두에서 그 발현이 시간이 지남에 따라 증가 함을 확인 할 수 있었으며CALTPII의 경우에는 염 처리시에는 그 발현이 건전 식물에서 보다 증가함을 알 수 있었으나 건조나 냉해 처리에 대해서는 오히려 그 발현 양이 감소함을 알 수 있었다. 도 9는 건조 처리한 후 날짜별로 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 결과를 나타낸 것이다. 건전은 건전한 식물의 잎을 의미하며 숫자는 처리 후 경과한 날짜를 의미한다. 도 10은 염 처리 후 시간병로 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 결과를 나타낸 것이다. 건전은 건전한 식물의 잎을 의미하며 숫자는 처리 후 경과한 시간과 처리 농도를 의미한다. 도 11은 냉해 처리한 후 시간별로 리피드트랜스퍼단백질 유전자군의 발현 결과를 나타낸 것이다. 건전은 건전한 식물의 잎을 의미하며 숫자는 처리 후 경과한 시간을 의미한다.

실시예 6: 담배 및 아라비도프시스(Arabidopsis) 형질전환용 식물발현 바이너리 벡터(binary vector) 구축

고추와 고추·세균성점무늬병균 사이의 불친화적 상호작용에서 발현뿐만 아니라 고추·역병균과 탄저병균의 칩입에도 강하게 발현하는CALTP유전자의 생물학적 기능을 밝히기 위해 담배 xanthi-nc 품종(Nicotiana tabacumcv. xanthi nc)과 아라비도프시스(Arabidopsis) 생태형 Col-O에 고추CALTP유전자를 도입하였다. 식물형질전환용 바이너리 벡터(binary vector)로는 담배의 경우에 pMBP1을, 아라비도프시스(Arabidopsis)의 경우에는 pBIN35S 벡터를 사용하였다. 재조합 식물 발현 바이너리 벡터(Recombinant plant expression binary vector)를 제조하기 위하여 pBluscript SK(-) 벡터의EcoRI,XhoI 위치에 삽입되어져 있는 CALTP 유전자의 양 말단을 pBluscript SK(-) 벡터의 MCS영역에 존재하는BamHI과KpnI으로 절단하여CALTP유전자의 cDNA 절편을 확보하였다. 동일한 제한효소를 이용하여 pMBP1 과 pBin35S 벡터를 절단하여, T4 DNA 리가제(ligase)를 이용하여CALTPcDNA 절편을 식물 발현 바이너리 벡터(plant expression binary vector)에 도입하였다(도 12).

도 12의 방법을 통하여 제조된CALTP유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터(recombinanat plant expression vector;pMBP1::CALTP or pBIN::CALTP)을 전기천공(electroporation)방법을 통하여 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주에 형질전환 하였다. 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens) EHA105 균주를 50 ug/ml의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 YEP 배지에서 선발한 후, 형질전환된 세균으로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. 이렇게 분리한 플라스미드 DNA를 주형으로 하고CALTP유전자 특이적 프라이머 조합을 이용하여CALTP유전자 부위를 PCR 방법을 통하여 증폭함으로써 재조합 식물 발현 벡터(recombinant plant expression vector)에CALTP유전자가 올바르게 삽입되었는지를 확인하였다(도 13).

도 13에서 볼 수 있듯이 고추식물로부터 분리한 세 종류의CALTP유전자가 삽입된 다수의 형질전환 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens) EHA 105 균주를 얻을 수 있었으며, 또한 35S 프로모터 특이적 프라이머와CALTP유전자 특이적 프라이머를 이용한 증폭산물의 염기서열 분석을 통하여CALTP유전자가 올바른 방향으로 삽입된 T-DNA를 함유하고 있는 형질전환 세균을 최종적으로 선발하여 담배 및 애기장대의 형질전환에 사용하였다. 또한 고추 리피드트랜스퍼단백질의 생물학적 기능을 밝히는데 도움이 되고자 일반적으로 식물형질전환시 대조구로 이용되는 유전자인 베타-글루쿠로니데이즈 (β-glucuronidase, GUS)유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 함께 제조하여 네가티브(nagative) 대조구로 이용하고자 하였다.

실시예 7: 형질전환 담배 및 아라비도프시스(Arabidopsis) 제조

CALTP유전자의 담배식물에서의 안정적 발현 및 담배형질전환체의 구축을 위해서 담배 Xanthi 품종 (Nicotiana tabacumcv. Xanthi)을 선택하였으며 도 12와 도 13의 방법으로 제조, 구축한 아그로박테리움 튜메파시엔스(A.tumafaciens) EHA105를 이용하였다. 담배의 형질전환을 위하여, 먼저 0.5 cm²크기의 어린 식물의 잎 절편(leaf disk)을 형질전환 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens) EHA 105 균주와 함께 28℃, 3일간 암 상태에서 함께 배양하여 세균의 식물조직으로의 감염을 유도하였다. 3일이 지난 후 이 잎 절편을 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 MS 액체배지와 살균수로 세척하여 식물조직에 남아있는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 완전 제거한 후, 잎 절편(leaf disk)을 카베니실린(carbenicillin) 250 mg/l, 카마마이신(kanamycin) 100 mg/l, BA 2 mg/l, NAA 0.1 mg/l이 포함된 MS 고체배지에 치상하여 슈팅(shooting)을 유도하였다. 이후 형성된 슈트(shoot)를 잎 절편(leaf disk)으로부터 분리하여 신선한 배지로 옮기고, 약 1∼2 주 후 다시 뿌리 유도 배지(root induction media; 250 mg/l 카베니실린과 100 mg/l 카나마이신을 포함한 MS 고체배지)로 옮겼다. 위 과정을 통하여 현재CALTPII유전자가 삽입된 모두 5개의 독립적(independent) 형질전환체 5개를 얻을 수 있었다. 도 14a는CALTPII유전자가 삽입된 독립된 T1 형질전환식물로부터 분리한 genomic DNA를 주형으로 하고 바이너리 벡터(binary vector)에 존재하는 식물에 카나마이신 저항성을 부여하는NPTII유전자 특이적 프라이머 조합(NPTII S: 5'-GAGGCTATTCGGCCTATGACTG-3, NPTII AS: 5'-ATCGGGAGCGG CGATACCGTA-3')을 이용한 각각의 형질전환 식물의 T-DNA 삽입여부 평가 결과를 보여주고 있다. 도 14a에서 볼수 있듯이 카나마이신(kanamycin)을 첨가한 MS 배지로부터 선발한 5개의 독립적 형질전환체 모두에서NPTII유전자의 삽입이 확인된 것으로 보아 최종적으로CALTPII유전자가 삽입된 5개의 형질전환체를 획득하게 되었다.

아라비도프시스(Arabidopsis)의 경우에는, 도 12와 도 13에서의 방법을 통하여 확보한 형질전환 아라비도프시스 튜메파시엔스(A. tumefaciens) EHA105 균주를 이용한 아라비도프시스 플로랄 디핑(Arabidopsis floral dipping) 방법을 통하여 형질전환을 실시하였다. 먼저 재조합 유전자가 삽입된 세균을 50 ug/ml 카나마이신(kanamycin) 과 적당량의 리팜피신(rifampicin)이 첨가된 배지에서 배양 한 후, 5% 설탕용액을 이용하여 OD600 = 0.8 정도로 희석하고 0.05 % 정도의 silwet L-77 또는 적당한 전착제를 첨가하여 세균액을 준비하였다. 그리고 형진전환에 사용될 아라비도프시스(Arabidopsis)를 준비하기 위해서는 1차 꽃대를 제거한 후 다수의 2차 꽃대가 형성된 식물을 이용하였으며 이때 식물은 다수의 미성숙 꽃과 소수의 수분단계에 있는 꽃을 가지고 있는 것을 사용하였다. 이렇게 준비한 식물을 세균현탁액에 2간 담궈 준 후 다습한 조건에서 16- 24 시간동안 방치하여 세균의 식물내 진입을 용이하게 하였다. 이후 정상적 생육 조건에서 씨가 성숙할 때까지 배양 한 후 이로부터 다수의 씨를 얻을 수 있었다. 이렇게 확보된 씨앗을 50 ug/L 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 MS배지에 살균 후 치상하여 22도, 16시간 명조건에서 배양하여CALTPI유전자가 삽입된 형질전환 식물을 확보하였다.

도 14b는 도 14a에서 설명하고 있듯이 확보된 T1 세대의 독립적 형질전환 식물의 genomic DNA을 이용한 PCR 증폭 결과를 보여주고 있으며 확보한 5개의 형질전환 식물 모두에 T-DNA의 삽입여부를 증명하였다. 또한CALTPI유전자 특이적 프라이머 조합을 이용하여 독립적인 5개의 아라비도프시스(Arabidopsis) T1 세대로부터CALTP유전자 단편을 PCR 증폭을 통하여 분리하였으며 이를 클로닝하여 염기서열을 분석하여 고추CALTPI유전자의 아라비도프시스(Arabidopsis) 유전체(genome) 내 삽입을 증명하였다 (도 14c).

실험예 1: 형질전환 담배와 아라비도프시스(Arabidopsis)에서의 RNA 젤 블라팅(RNA gel blotting)을 이용한 발현 분석

CALTPI과CALTPII유전자가 삽입된 담배와 아라비도프시스(Arabidopsis) T1 세대의 식물로부터 이들 유전자의 안정적 발현을 평가하기 위하여 RNA 젤 블라팅 분석(RNA gel blotting analysis)을 실시하였다. 담배의 경우는 구아니딘 이소씨아네이트-페놀-클로로폼 추출(Guanidin isothianate-phenol-chloroform extraction) 방법을 통하여 총 RNA을 분리하였으며 아라비도프시스(Arabidopsis) 경우는 트리졸 식물 RNA 분리 용액(TriZol Plant RNA isolation solution; Invtrogene)을 사용하여 총 RNA을 순수분리하였다. 분리한 RNA는 1.2 % 포름알데히드 아가로스 젤(formaldehyde agarose gel)에서 분리한 후 나일론-막(Nylon-membrane)에 흡착시켜 이용하였다. 또한CALTPI과CALTPII유전자의 암호화 지역(coding region)을 탐침(probe)으로 사용하였으며 RNA 젤 블라팅(RNA gel blotting)의 온도조건은 65℃를 이용하였으며 세척(washing)은 2 X SSC, 0.1 % SDS, 그리고 0.1 X SSC, 0.1 % SDS를 이용한 일반적 조건을 따랐다.

도 15a, 도 15b에서 볼 수 있듯이 독립적인 T1 세대로부터 분리한 RNA를 이용한 노던 블라팅(northern blotting) 결과, 각각의 형질전환체의 잎에서 발현량의 약간의 차이가 존재함에도 불구하고 삽입한CALTPI(아라비도프시스, 도 15b),CALTPII(담배, 도 15a) 가 안정적으로 발현하고 있음을 확인 할 수 있었다.

상기의 실시예에 의하여 고추에서 저항성 반응인 과민성 반응에서 발현이 유도되는 본 발명의 리피드트랜스퍼단백질 유전자 산물은 식물병 저항성과 환경 내성을 유도할 수 있고, 식물병 저항성 또는 환경내성 품종의 육종에 적용함으로써 식물병을 방제할 수 있으며, 이를 이용하여 식물의 전신획득저항성을 유도하는 미생물 또는 물질 선발에 이용 할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 식물재배산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

고추 한별 품종 유래 리피드트랜스퍼단백질 CALTPⅠ의 아미노산 서열을 코딩하는 서열목록의 서열 1에 기재된 유전자 염기서열.
고추 한별 품종 유래 리피드트랜스퍼단백질 CALTPⅡ의 아미노산 서열을 코딩하는 서열목록의 서열 3에 기재된 유전자 염기서열.
고추 한별 품종 유래 리피드트랜스퍼단백질 CALTPⅢ의 아미노산 서열을 코딩하는 서열목록의 서열 5에 기재된 유전자 염기서열.
생물적 ·환경적 스트레스에 대해 반응하는 제 1항, 제 2항 또는 제 3항 기재의 리피드트랜스퍼 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자를 함유함을 특징으로 하는 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커.
제 4항 기재의 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커를 숙주식물에 도입한경우에 있어, 상기 마커로부터 전사된 mRNA를 확인함으로써 숙주식물들이 생물적 ·환경적스트레스에 노출되어 있는지 여부를 진단하는 방법.