KR100765100B1

KR100765100B1 - 고추 링-핑거 단백질 유전자 （ＣａＲＦＰ１） 및 이를이용한 식물체의 병저항성 탐색 방법 및 형질전환식물

Info

Publication number: KR100765100B1
Application number: KR1020060025077A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 홍점규
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2007-10-08
Also published as: KR20070094419A

Abstract

본 발명은 고추 한별 품종에서 분리한 식물병 방어 관련 링-핑거 도메인을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자 CaRFP1 및 상기 유전자의 염기서열에 의해 코딩되는 식물병 방어 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한 저항성 형질전환식물체 및 병원균, 화학물질 또는 환경스트레스 저항성 유도처리시 유도저항성 발현 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법도 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면, 식물체 병원균의 방어반응의 표지 및 환경 스트레스 내성 식물의 분자육종을 위한 유전재료를 제공할 수 있고, 식물병 저항성 등의 탐색을 촉진시킬 수 있는 이점이 있다.

고추, 식물병, 저항성, 링-핑거

Description

고추 링-핑거 단백질 유전자 （ＣａＲＦＰ１） 및 이를 이용한 식물체의 병저항성 탐색 방법 및 형질전환식물{Pepper RING-finger protein gene CaRFP1, useful detection method of plant disease defense responses, and transgenic plants using the same}

도 1은 본 발명에 의한 고추 링-핑거(RING-finger) 단백질 유전자 CaRFP1의 염기서열(서열번호 1)을 나타낸 도면이고,

도 2는 본 발명에 의한 고추 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸 도면이고,

도 3은 본 발명에 의한 고추 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 일차 구조에서 나타나는 독특한 도메인을 나타낸 도면이고,

도 4는 본 발명에 의한 고추 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1에 의해 코딩되는 단백질과 유사한 단백질들과의 유연관계를 나타낸 도면이고,

도 5는 본 발명에 의한 고추 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1에 의해 코딩되는 단백질의 링-핑거 도메인을 동물 및 식물 유래의 다른 단백질의 링-핑거 도메인의 아미노산 서열 비교한 도면이고,

도 6은 고추 한별 품종에 고추세균성점무늬병을 일으키는 병원성 또는 비병원성 균주를 접종한 후 시간 경과에 따라 나타나는 감수성, 저항성 반응에서의 링- 핑거 단백질 유전자 CaRFP1의 발현 양상을 나타낸 도면이고,

도 7은 고추 한별 품종에 잎 탄저병을 일으키는 곰팡이 균주를 접종한 후 시간 경과에 따라 나타나는 4 엽기와 8 엽기 고추 식물에서의 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1의 발현 양상을 나타낸 도면이고,

도 8a 내지 도 8c는 살리실산, 에틸렌, 메틸 자스모네이트, 소디움 나이트로 푸루사이트, 메틸 비올로젠, 마니톨, 염화나트륨에 의한 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 9a 및 도 9b는 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1을 이용한 형질전환 식물체 개발에 이용한 벡터와 형질전환 식물체에서의 CaRFP1 유전자 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 10은 병원성 세균 슈도모나스 시린게 패소바 토마토 DC3000 균주 감염에 대한 CaRFP1 유전자 도입 형질전환 애기장대의 병 감수성을 나타낸 도면이고,

도 11a 및 도 11b는 염화나트륨 처리에 대한 CaRFP1 유전자 도입 형질전환 애기장대의 내성을 나타낸 도면이고,

도 12a 및 도 12b는 마니톨 및 건조 처리에 대한 CaRFP1 유전자 도입 형질전환 애기장대의 내성을 나타낸 도면이다.

본 발명은 식물병 방어관련 유전자인 CaRFP1 유전자, 이를 이용한 식물체의 병저항성 탐색방법 및 분자 육종 재료인 저항성 형질전환식물의 개발에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 신규 저항성 관련 유전자인 CaRFP1 유전자를 분리하여 해독(Sequencing)함으로써 그 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하고, 이 유전자 염기 서열을 이용하여 생물적/화학적/물리적 저항성 유도 처리 시 유도저항성의 발현 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하며, 이 유전자를 이용하여 병저항성 및 환경 스트레스 내성 작물 개발의 분자 육종 재료로의 개발에 관한 것이다.

담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오래전부터 향신료 또는 양념으로 사용되어 온 대표적인 작물로서, 그에 대한 병으로는 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 고루 다양하게 보고되어 있는데, 그 중 치명적인 것으로 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균성점무늬병 등을 들 수 있다.

고추에 대한 이러한 식물 병들을 방제하기 위해 지금까지는 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어 왔는데, 그 독성으로 인하여 병원균뿐만 아니라 주변 생태계의 생물까지도 대량 살상하여 생태계를 파괴시키고 토양과 수질을 오염시키는 폐해가 있어 왔다.

따라서 앞으로는, 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용함으로써 농약의 사용을 가능한 줄이는 방법을 사용하는 것이 바람직하다고 할 수 있으며, 더 바람직하게는 병에 대해 저항성을 가지고 있 는 저항성 품종의 개량 및 육종 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 바람직하다고 할 수 있다.

사실, 그동안 농약을 사용하지 않고 병해충에 의한 피해를 감소시키기 위한 노력의 일환으로 고추를 비롯한 다양한 작물 및 병원균을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 꾸준히 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작에 대한 연구가 역시 고추를 비롯한 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어 왔다.

일단 식물이 병에 감염되면, 기주식물은 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 시작하는데, 이러한 방어기작에 의해 병원균 감염 초기에 기주식물과 식물병원균간의 반응이 친화적 반응과 불친화적 반응으로 나뉘어 결정되고, 이에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는지의 여부가 결정되는 것이다.

불친화적 반응에서, 감염된 식물은 자체의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하고, 이에 대하여 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 캘로스(callose)의 축적, 리그닌(lignin)화에 의한 세포벽의 비후화 등의 반응을 나타내며, 피토알렉신(phytoalexin) 등 여러 종류의 항균성 물질을 생성하고, 소위 병생성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불리는 방어 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다.

이러한 방어 기작들은 병원균의 침입하는 경우뿐만 아니라, 살리실산이나 아미노부티르산 등 인위적인 화학적 자극에 의해서도 나타나며, 물리적 상처나 염도, pH 등의 환경적 스트레스에 의해서도 나타난다고 보고되고 있다.

이렇게 인위적인 생물학적/물리적/환경적 스트레스를 줌으로써 유도되는 저항성을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이러한 저항성 유도 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다.

이것은, 이와 같은 유도저항성이 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있으며 실용적인 가치가 있을 뿐만 아니라, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 유전공학적 식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하도록 작동하는 식물보호 화학물질을 개발하는 데에 이용될 수 있기 때문이다.

근래, 이러한 유도저항성 연구는 유전공학적 기술의 개입에 의해 훨씬 더 그 발전 속도가 빨라졌는데, 종래에는 저항성 유도 처리를 한 후 저항성 발현 여부를 확인하기 위해 식물을 재배하고 병을 접종한 후 저항성이 나타나는지의 여부를 확인해야 했던 반면, 지금은 유도하고자 하는 저항성 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 밝혀내고 이를 이용하여 실험실 수준에서 저항성 발현 여부를 확인할 수 있게 됨으로써, 포장(Field)에서의 작물재배, 병 접종, 병반 출현 여부 확인 등의 절차를 생략할 수 있게 되었기 때문이다.

이것은 전체적인 저항성 유도 시험의 주기를 단축함으로써 종래에 비해 더 짧은 시간 내에 더 많은 시험을 할 수 있게 되었음을 의미하며, 결국 더 우수한 저항성 품종을 개발할 수 있게 되었음을 의미한다.

그러나 이것은 유도하고자 하는 유전자 서열이 밝혀지고 이에 따라 해당 유 전자의 클론이 확보되어 있다는 전제하에 가능한 것으로서, 이러한 의미에서, 식물 병에 저항성을 나타내는 다양한 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보를 축적함으로써, 이를 이용한 탐색방법을 촉진시키는 것은 시급한 당면 과제라고 할 수 있다.

수많은 병생성 관련 유전자들이 분리되어 오늘날에 이르지만 실제적으로 병저항성에 기여하는 유전자를 찾는 일은 쉽지 않다. 그러므로 이들 유전자를 모델 식물에 도입하여 병저항성의 증진 여부를 검토하는 연구가 선행될 필요가 있다. 이렇게 하여 애기장대와 같은 모델 식물을 이용한 병저항성 형질전환식물의 제조로 기능이 확인된 병생성관련 유전자들을 주요 작물에 도입하기 위한 분자 육종의 기초를 마련할 수 있다.

본 발명은 이와 같은 종래기술 상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 식물병 및 환경 스트레스에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 방어관련 유전자의 하나인 링-핑거 단백질을 코딩하는 CaRFP1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaRFP1 유전자 염기서열을 이용하여 식물병에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 식물체의 병저항성 탐색방법을 제공하며, 이 유전자를 이용하여 환경스트레스 내성 형질전환 식물체를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 상기 목적은, 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 mRNA를 분리한 다음 cDNA 라이브러리를 제조한 후 이를 스크린하여 신규 병방어 관련 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1을 선발한 후 그 염기서열을 결정하고, 고추에 병원균 또는 화학물질을 접종 또는 처리하여 상기 CaRFP1 유전자의 발현 여부를 조사함으로써 달성하였다.

본 발명은 또한 상기 유전자를 이용하여 병 접종, 저항성 유도 물질 처리 시의 발현 여부로 식물체 병저항성을 탐색하는 방법 및 이 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터 및 환경스트레스 내성 형질전환 식물을 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명은 고추세균성점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 의해 저항성이 유도된 한별고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추 식물에서 얻은 각각의 mRNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하는 과정에서 생성되는 DNA 조각을 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지함으로써 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하여 병저항성에 관련될 것으로 추정되는 유전자를 선발하여 클론을 얻고, 이 클론 중 링-핑거 단백질 코딩 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독(nucleotide sequencing)함으로써, CaRFP1으로 명명하고 서열번호 1을 부여하였다(도 1 참조).

본 발명에 의한 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)의 CaRFP1 유 전자는 고추세균성점무늬병에 대한 방어기작을 가지는 병생성 관련 단백질(PR rotein)의 일종인 링-핑거 단백질을 코딩하는 유전자이다. GenBank 검색결과 이 유전자와 유사한 염기서열 또는 아미노산 서열을 가지는 다른 식물 유전자가 애기장대, 벼, 수수에서 밝혀져 있다. 이들 유전자 또한 링-핑거 단백질을 코딩하리라 예상되지만 그 단백질의 기능을 알 수 없는 것들이다.

본 발명에 의한 상기 CaRFP1 유전자의 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)은 도 2에 나타나 있다. 상기 CaRFP1 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 484 개의 아미노산으로 구성되며, 분자량인 약 53 kDa 정도의 염기성 단백질을 구성한다. 상기 아미노산 서열에 존재하는 세린-리치 도메인 (5번부터 45 번 아미노산), 본빌레브란트인자 A(von Willebrand Factor A; VWFA) 도메인 (114번부터 286번 아미노산), 시스테인-리치의 링-핑거 도메인(441번부터 474번 아미노산)은 이 CaRFP1 유전자가 특이한 구조의 단백질을 코딩하는 것을 보여준다(도 3 참조).

이와 같은 링-핑거 단백질은 고추 식물 이외에 다른 동물, 식물들에서 그 존재가 발견 및 분리되었으나, 전체적으로 볼 때 CaRFP1 유전자에 의해 코딩되는 아미노산과 비슷한 아미노산 구조를 지닌 단백질에 대한 연구 보고는 없다(도 4 및 도 5 참조).

다음에, 본 발명은, 상기와 같이 서열이 제공된 CaRFP1을 유전자를 이용하여 병원성 균주 또는 비병원성 세균 균주, 곰팡이 균주, 화학물질, 환경스트레스를 접종 또는 처리한 식물에서 링-핑거 단백질 유전자의 유도발현 여부를 확인하는 식물 체 병저항성, 화학물질 및 환경 스트레스 내성 탐색방법을 제공한다.

본 발명에 의한 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1이 다양한 식물병원균, 화학물질 또는 환경스트레스에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 6 내지 8 참조). 따라서, 본 발명에 의한 유전자 CaRFP1은 식물체의 병저항성 탐색방법에 이용될 수 있다.

보다 구체적으로 병원균, 화학물질 또는 환경스트레스 등을 접종 또는 처리한 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나일론막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CaRFP1 유전자 프로브와 반응시켜 CaRFP1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는 식물체의 병저항을 탐색할 수 있다.

상기 식물병원균은 고추세균성점무늬병의 병원성균 또는 비병원성균, 탄저병균일 수 있고, 상기 화학물질은 살리실산, 에틸렌, 메틸자스모네이트, 메틸비올로젠, 마니톨, 염화나트륨 중 하나일 수 있다. 상기 환경스트레스는 건조처리일 수 있다.

다음에, 본 발명은, 상기와 같이 염기서열이 제공된 CaRFP1를 유전자를 이용하여 재조합 벡터를 제조하여 식물체를 형질전환시켜서, 병방어반응 및 환경스트레스 내성 증가를 통하여 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다.

도 9a 및 도 9b는 링-핑거 단백질 유전자 CaRFP1을 이용한 형질전환 식물체 개발에 이용한 벡터와 형질전환 식물체에서의 CaRFP1 유전자 발현 유도 결과를 나타낸 도면이다. 도 10 내지 12b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 의한 CaRFP1 유전 자가 도입된 형질전환 애기장대는 화학물질 또는 환경스트레스 처리에 대해 내성을 나타낸다.

이하, 실시예들을 통해 본 발명을 더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 링-핑거 단백질을 코딩하는 CaRFP1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열 결정

식물의 병생성 관련 단백질(PR protein) 중 하나인 링-핑거 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 한별품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)에 고추세균성점무늬병의 비병원성균인 BV5-4a(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain BV5-4a)를 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성반응이 나타난 식물체를 대상으로 잎을 수거하였다.

다음에, 수거된 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction)증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

다음에, 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나일론막에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추세균성점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하고, 여기에서 생성되는 DNA 조각을 디옥시제닌 (digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 상기 cDNA와 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.

하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주가 접종된 식물체의 DNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 cDNA를 병저항성에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 획득하였다.

획득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5‘-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 링-핑거 단백질 코딩 유전자임 확인하고 CaRFP1 유전자로 명명하였다.

이 CaRFP1 유전자에서 유추한 아미노산 서열을 다른 식물에서 발견된 링-핑거 단백질의 아미노산 서열과 비교한 결과, 애기장대, 벼, 수수의 단백질과 낮은 수준의 상동성을 나타냄으로써 신규인 것임을 알 수 있었다(도 2 내지 도 4 참조).

이들 다른 식물 유래의 링-핑거 단백질들은 특성 분석이 이루어 지지 않았다. 다만 링-핑거 도메인만 비교하여 보면, 애기장대, 벼, 밀, 인간, 제브라피쉬, 쥐에서 유래한 E3 ligase의 링-핑거 도메인과 유사성을 가지고 있었다(도 5 참조).

확인된 CaRFP1 유전자의 염기서열을 도 1에 나타내고 서열번호 1로 표시하고, 상기 CaRFP1 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 도 2에 나타나 있으며 서열번호 2로 표시하고 서열목록으로 제출하였다.

[실시예 2] CaRFP1 유전자의 발현 탐색 방법

상기 실시예 1에서 수득한 CaRFP1 유전자를 이용하여 식물체의 저항성을 탐색하기 위하여 하기와 같이 시험하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 수득된 CaRFP1 유전자를 이용한 구체적인 식물체의 저항성 탐색방법을 제공하기 위하여, 하기와 같이 고추세균성점무늬병균, 잎 탄저병균 및 화학 물질 처리에 대한 노던블러팅(Northern Blotting) 시험을 수행하였다.

각 노던블러팅 수행시 25S 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.

[실험예 1] 세균성 병원균에 의한 CaRFP1 유전자의 유도 발현

고추세균성점무늬병균 중 식물체와 친화적 반응을 나타내는 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 1 분지기 고추식물체 잎의 뒷면에 배큠-인필트레이션(vacuum-infiltration) 방법으로 접종하고, 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실 처리하였다.

접종 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간 후에 각각 잎을 채취하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나일론막(Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음에, 실시예 1에서 수득된 CaRFP1 유전자를 ³²P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (Dextran Sulfate)]에 첨가하고 65℃에서 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이렇게 ³²P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나일론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나일론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 ³²P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

이와 같이 고추세균성점무늬병균의 병원성균주 접종 후 나타나는 친화적 반응과 비병원성균주 접종 후 나타나는 불친화적 반응에서 CaRFP1 유전자의 발현 양상을 도 6에 나타내었다. 도 6에서 숫자는 접종한 후 고추잎 채취시까지의 경과시간을 나타낸다.

시험 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, CaRFP1 유전자가 세균성점무늬병 감염에 의해 빠르고 강하게 발현되었다. CaRFP1 유전자 또한 지금까지 알려진 고추 병방어 관련 유전자들의 발현에서처럼 친화적 반응에서 보다 불친화적 반응에서 빠르고 강하게 발현되었다. 버퍼인 10 mM MgCl₂ 만을 모크(mock)로 고추 잎에 인필트레이션한 경우는 CaRFP1 유전자 발현이 유도되지 않았다.

친화적 반응에서 접종 후 2 시간에 약하게 발현되고 18 시간까지 그 발현 양이 증가, 유지되다가 24 시간이 되면 그 발현양이 약간 감소하였다. 불친화적 반응에서 CaRFP1 유전자의 mRNA는 접종 후 0.5 시간에 처음으로 관찰되고, 2-6 시간에 발현이 뚜렷하게 증가 하였으며, 12-18 시간에 이르러 최대로 강한 발현을 나타내었다. 불친화적인 균주 접종 24 시간 후에는 18 시간보다 그 발현양이 약간 감소되었으나, 친화적 반응에서의 발현보다는 매우 강하게 나타났다.

이상과 같은 결과로 볼 때, 식물-병원균 상호 작용에서 나타나는 병방어 관련 유전자의 전형적인 발현 양상과 마찬가지로, CaRFP1 유전자는 친화적 반응에서 보다 불친화적 반응에서 더욱 빠르고 강하게 발현됨을 알 수 있었다.

[실험예 2] 곰팡이 균주에 의한 CaRFP1 유전자의 유도 발현

고추 잎 탄저병을 일으키는 곰팡이 균주 Colletotrichum coccodes 2-25의 균사 현탁액을 오트밀 아가 배지에서 5 일간 배양한 후, 5x10⁵ cfu/㎖의 분생 포자의 농도로 4 엽기와 8 엽기의 고추 식물체 잎에 분무 방법으로 접종하고, 28℃, 100 % 상대습도 조건에서 30 시간 동안 습실 처리하였다.

접종 12, 24, 36, 48, 72 시간 후에 각각 잎을 채취하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기 영동한 후 나일론막으로 전이시켰다.

시험 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, CaRFP1 유전자는 고추 잎 탄저병 감염에 대하여 4 엽기와 8 엽기의 고추 식물에서 모두 유도 발현되었다. 다만 8 엽기 고추 식물에서의 발현이 4 엽기 고추 식물에서의 발현보다 약간 강하였다.

이상과 같은 결과로 볼 때, 병원균에 대한 식물의 성체 식물 저항성 발현에 있어, CaRFP1 유전자는 어린 식물에서보다 성체 식물에서 더욱 강하게 발현됨을 알 수 있었다.

[실험예 3] 화학적 유도체에 의한 CaRFP1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CaRFP1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여, 살리실산 (salicylic acid), 에틸렌(ethylene), 메틸자스모네이트(methyl jasmonate), 소 디움나이트로푸루사이트 (sodium nitropurusside), 메틸비올로젠 (methyl viologen), 마니톨 (mannitol) 및 염화나트륨 (sodium chloride)에 대하여 유전자 발현 유도 시험을 수행하였다.

각각의 유전자 발현 유도 시험은 4 엽기의 고추식물을 이용하여 수행되었으며, 각 노던블러팅 수행시 25S 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.

살리실산 처리를 위해서는, 5 mM 농도의 살리실산을 식물의 잎과 줄기에 골고루 엽면 살포하였다.

에틸렌 처리를 위해서는, 고추 식물을 500 mL의 유리병에 옮기고 뚜껑을 막은 후, 뚜껑에 있는 실리콘을 통해 5 μl/l의 에틸렌을 병 속으로 주입하였다.

메틸자스모네이트 처리를 위해서는, 25 μM 농도의 메틸자스모네이트를 고추식물의 잎과 줄기에 골고루 엽면 살포한 후 비닐로 싸 주었다.

소디움나이트로푸루사이트 처리를 위해서는, 100 μM의 농도의 소디움 나이트로 푸루사이트를 식물의 잎과 줄기에 골고루 엽면 살포하였다.

메틸비올로젠 처리를 위해서는, 100 μM의 농도의 메틸비올로젠을 식물의 잎과 줄기에 골고루 엽면 살포하였다.

마니톨 처리를 위해서는, 고추 식물을 폿트에서 조심스럽게 꺼내어 400 mM 농도의 마니톨에 뿌리를 담갔다.

염화나트륨 처리를 위해서는, 고추 식물을 폿트에서 조심스럽게 꺼내어 400 mM 농도의 염화나트륨에 뿌리를 담갔다.

각각의 화학물질을 처리하고 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간 후에 각각 고추식물의 잎을 채취하여 이로부터 RNA를 분리한 다음, 상기 실시예 4, 실험예 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써 CaRFP1 유전자의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 8a 내지 도 8c에 나타내었다.

시험 결과, 도 8a 내지 도 8c에 나타난 바와 같이, 식물병 방어반응에 관련되어 있는 식물체내의 식물 호르몬이자 신호 전달 물질(signal molecules)의 일종인 살리실산, 에틸렌(ethylene), 메틸자스모네이트(methyl jasmonate)와 환경 스트레스인 메틸비올로젠 (methyl viologen), 마니톨 (mannitol) 및 염화나트륨 (sodium chloride)의 외부적인 처리에 의하여 CaRFP1 유전자의 발현이 유도됨이 관찰되었다. 그러나 소디움나이트로푸루사이트 (sodium nitropurusside)에 의해서는 발현이 유도되지 않았다.

살리실산의 처리에 반응하여 2 시간에 빠르고 강하게 발현되고, 5 시간에 최대로 발현되다가 10 시간에 20 시간에 걸쳐서 발현이 다소 감소되었다. 에틸렌의 처리에 반응하여 2 시간에 발현, 10 시간까지 발현이 증가하다가 20 시간에는 감소경향을 보였다. 메틸 자스모네이트에 의해서도 2 시간에 발현, 5 시간 이후로는 감소경향을 보였다. 메틸 비올로젠의 처리로 처리 3 시간에서 12 시간까지 배우 약한 발현이 관찰되었다. 마니톨 처리로 1 시간에 발현이 유도되었으며, 6 시간까지 약간 증가하며, 이후에는 감소 경향을 나타내었다. 염화나트륨 처리로 3 시간에 처음으로 유전자 발현이 일어났으며, 6 시간에서 24 시간에는 발현이 뚜렷하게 증가하였다.

이상과 같은 결과로 볼 때, CaRFP1 유전자는 식물 외부로부터 유래한 다양한 종류의 신호전달경로에 의해 시간적인 양적인 차이를 보이며 발현이 활성화됨을 알 수 있었다.

[실시예 3] CaRFP1 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 CaRFP1 유전자 이용한 형질전환 식물체 제조의 방법을 하기와 같이 시험하였다.

CaRFP1 유전자를 pBIN35S 바이너리 벡터에 도입하기 위해 pBluescript SK(-) vector에 삽입되어 있는 이 유전자를 제한효소 BamHI과 SacI의 제한 효소를 달아 증폭해 내고, pBIN35S 벡터에 라이게이션(ligation)하였다(도 9a 참조).

이 벡터 구성물(construct)을 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105 균주에 도입한 후 리팜피신과 카나마이신이 포함된 YEB 배지에서 형질 전환된 EHA105 균주를 선발하였다. 이 아그로박테리움을 배양한 후 꽃침지(Floral dipping) 방법을 통하여 애기장대를 형질 전환하였다. T₁ 종자를 수확하여 카나마이신이 포함된 MS 배지에 파종하여 형질전환 식물체를 선발하여 각 형질전환 식물체 라인에서 CaRFP1 유전자가 정상적으로 발현됨을 관찰하였다(도 9b 참조). 대부분의 실험은 T₂ 또는 T₃ 종자를 가지고 수행되었다.

[실험예 1] 병원성 슈도모나스 시린게 패소바 토마토 DC3000 균주에 대한 병방어 반응

슈도모나스 시린게 패소바 토마토 DC3000 균주를 King's B 배지에서 배양한 후 수거하여 10⁵ cfu/ml 농도로 세균 현탁액을 준비하였다. 바늘이 없는 1 ml 짜리 주사기를 이용하여 야생형과 형질전환 애기장대 식물체의 잎의 뒷면에 세균 현탁액을 인필트레이션 하였고, 식물을 습실 상에서 생육하여 병 진전을 관찰하였다. 접종한 잎을 취하여 10 mM MgCl₂로 마쇄 후 시리얼 희석한 용액을 King's B 배지에 도말하여 식물 잎 조직 내에서의 세균의 생장을 모니터링 하였다.

시험 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 야생형 식물에 비해 형질전환체 식물들은 슈도모나스 시린게 패소바 토마토 DC3000 균주의 감염에 대해 더욱 감수성으로 나타났다.

[실험예 2] 염화나트륨에 의한 스트레스 내성

야생형과 형질전환 애기장대 식물체를 150 mM 염화나트륨이 포함된 MS 배지에서 생육하여, 본엽이 정상적으로 형성된 유묘의 수를 비교하였다. 성체 식물의 잎을 300 mM 염화나트륨 용액에 띄운 후 고농도의 염류의 처리에 대한 애기장대 식물의 잎 상태를 관찰하였다.

시험 결과, 도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, 야생형 식물에 비해 형질전환체 식물들은 염화나트륨 처리에 대해 내성을 보였다. 150 mM 염화나트륨 배지에서 형질전환 식물체는 야생형 식물체에 비하여 높은 수준의 본엽 형성률을 나타내었다. 300 mM 염화나트륨 용액에 띄운 야생형 식물의 잎 조직은 엽록소가 빠지면서 백화현상을 나타내었으나, 형질전환체 식물들은 라인별로 정도의 차이가 있으나 훨씬 저항성을 나타내었다(도 11a 및 도 11b 참조).

[실험예 3] 건조에 의한 스트레스 내성

야생형과 형질전환 식물체로부터 잎을 취하여 40% 상대 습도 조건에서 잎을 건조시키면서 생체중의 변화를 관찰하였다.

시험 결과, 도 12a 및 도 12b에 나타난 바와 같이, 야생형 식물의 잎에서는 시간의 경과에 따라 급격한 생체중의 감소를 보였으나, 형질전환 식물체는 상대적으로 완만한 감소를 나타내었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종으로부터 식물병 방어반응에 관련된 신규한 단백질 유전자를 분리하여 그 염기서열을 결정하고 그에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 기존의 링-핑거 단백질과는 구별되는 구조를 지닌 링-핑거 단백질유전자를 이용한 형질전환 벡터 및 형질전환 식물체를 제공한다.

따라서 본 발명은 상기 CaRFP1 유전자는 식물체 병원균, 화학물질, 및 환경스트레스에 대한 방어반응의 표지 및 식물병 감수성, 고염류 및 건조 내성 작물의 분자육종을 위한 유전재료로 이용될 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 식물병 방어 세포막 단백질 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 식물병원균, 화학물질 및 환경스트레스에 의한 식물체의 방어반응 여부 탐색방법을 제공함으로써 저항성 품종 개발을 촉진시킬 수 있는 효과가 있으므로 식물육종산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 분리된 서열번호 1의 염기서열을 갖는 식물병 방어 관련 링-핑거 단백질 유전자(CaRFP1).
제1항 기재의 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 식물병 방어 관련 링-핑거 단백질.
제1항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제1항 기재의 유전자 또는 제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 박테리아.
제1항 기재의 유전자 또는 제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 애기장대.
식물체의 저항성 탐색방법에 있어서,

고추세균성점무늬병의 병원성균, 비병원성균, 고추잎 탄저병균 중 하나를 접종한 고추의 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나일론막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 제1항 기재의 CaRFP1 유전자 프로브와 반응시켜 CaRFP1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는 식물체의 저항성 탐색방법.
식물체의 저항성 탐색방법에 있어서,

살리실산, 에틸렌, 메틸자스모네이트, 메틸 비올로젠, 마니톨, 염화나트륨 중 어느 하나를 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나일론막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 제1항 기재의 CaRFP1 유전자 프로브와 반응시켜 CaRFP1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는 식물체의 저항성 탐색방법.
식물체의 병방어반응 및 환경스트레스 내성 탐색방법에 있어서,

제1항 기재의 CaRFP1 유전자를 이용하여 제조한 형질전환 식물체와 야생형 식물체에 병원균 접종 또는 환경스트레스 물질 처리 후 병원균 수, 본엽 형성률 또는 생체중 감소의 반응 차이를 측정하는 단계를 포함하는 식물체의 병방어반응 및 환경스트레스 내성 탐색방법.