KR20050031687A

KR20050031687A - 오스모틴을 코딩하는 씨에이오에스엠1 유전자 및 이를이용한 식물병저항성 탐색방법

Info

Publication number: KR20050031687A
Application number: KR1020030067924A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 홍점규; 정호원; 이병국; 이성철
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2005-04-06

Abstract

본 발명은, 고추세균성점무늬병에 대한 저항성유전자인 CAOSM1 유전자 및 이의 저항성 탐색에의 이용방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 감자의 PA35 유전자, 담배의 PR-5D 유전자, 담배의 NP24 유전자 및 토마토의 AP24 유전자와 각각 96%, 95.2%, 77.2% 및 77.2%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것으로 밝혀진 오스모틴 코딩 유전자 CAOSM1의 염기/아미노산 서열; 및 세균, 화학물질 또는 환경적 스트레스를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CAOSM1 유전자 프로브와 반응시켜 CAOSM1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 식물체 병저항성의 탐색방법에 관한 것이다.

Description

오스모틴을 코딩하는 씨에이오에스엠1 유전자 및 이를 이용한 식물병저항성 탐색방법 {CAOSM1 Gene Coding Osmotin and Screening Method of Plant Disease Using It}

본 발명은 식물병 저항성 유전자인 CAOSM1 유전자 및 이를 이용한 식물 병 저항성 탐색방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 신규 저항성 관련 유전자인 CAOSM1 유전자를 분리하여 해독(Sequencing)함으로써 그 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하고, 이 유전자를 이용하여 생물적/화학적/물리적 저항성 유도 처리시 유도저항성의 발현 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오래전부터 향신료 또는 양념으로 사용되어온 대표적인 작물로서, 그에 대한 병으로는 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 고루 다양하게 보고되어 있는데, 그중 치명적인 것으로 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균성 점무늬병 등을 들 수 있다.

고추에 대한 이러한 식물 병들을 방제하기 위해 지금까지는 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어 왔는데, 그 독성으로 인하여 병원균뿐만 아니라 주변 생태계의 생물까지도 대량 살상하여 생태계를 파괴시키고 토양과 수질을 오염시키는 폐해가 있어 왔다.

따라서, 앞으로는, 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용함으로써 농약의 사용을 가능한 줄이는 방법을 사용하는 것이 바람직하다고 할 수 있으며, 더 바람직하게는 병에 대해 저항성을 가지고 있는 저항성 품종의 개량 및 육종 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 좋다고 할 수 있다.

사실, 그동안 농약을 사용하지 않고 병해충에 의한 피해를 감소시키기 위한 노력의 일환으로 고추를 비롯한 다양한 작물 및 병원균을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 꾸준히 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작에 대한 연구가 역시 고추를 비롯한 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어 왔다.

일단 식물 병에 감염되면, 기주식물은 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 시작하는데, 이러한 방어기작에 의해 병원균 감염 초기에 기주식물과 식물병원균간의 반응이 친화적반응과 불친화적반응으로 나뉘어 결정되고, 이에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는지의 여부가 결정되는 것이다.

불친화적반응에서, 감염된 식물은 자체의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하고, 이에 대하여 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 켈러스(callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 세포벽의 비후화 등의 반응을 나타내며, 피토알렉신(phytoalexin) 등 여러 종류의 항균성 물질을 생성하고, 소위 병생성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불리우는 방어 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다.

이러한 방어 기작들은 병원균이 침입하는 경우뿐만 아니라, 살리실산이나 아미노부티르산 등 인위적인 화학적 자극에 의해서도 나타나며, 물리적 상처나 염도, pH 등의 환경적 스트레스에 의해서도 나타난다고 보고되고 있다.

이렇게 인위적인 생물학적/물리적/환경적 스트레스를 줌으로써 유도되는 저항성을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이러한 저항성 유도 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다.

이것은, 이와 같은 유도저항성이 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있으며 실용적인 가치가 있을 뿐만 아니라, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 유전공학적 식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하도록 작동하는 식물보호 화학물질을 개발하는 데에 이용될 수 있기 때문이다.

근래, 이러한 유도저항성 연구는 유전공학적 기술의 개입에 의해 훨씬 더 그 발전 속도가 빨라졌는데, 종래에는 저항성 유도 처리를 한 후 저항성 발현 여부를 확인하기 위해 식물을 재배하고 병을 접종한 후 저항성이 나타나는지의 여부를 확인해야 했던 반면, 지금은 유도하고자 하는 저항성 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 밝혀내고 이를 이용하여 실험실 수준에서 저항성 발현 여부를 확인할 수 있게 됨으로써, 포장(Field)에서의 작물재배, 병 접종, 병반 출현 여부 확인 등의 절차를 생략할 수 있게 되었기 때문이다.

이것은 전체적인 저항성 유도 시험의 주기를 단축함으로써 종래에 비해 더 짧은 시간 내에 더 많은 시험을 할 수 있게 되었음을 의미하며, 결국 더 우수한 저항성 품종을 개발할 수 있게 되었음을 의미한다.

그러나, 이것은 유도하고자 하는 유전자 서열이 밝혀지고 이에 따라 해당 유전자의 클론이 확보되어 있다는 전제하에 가능한 것으로서, 이러한 의미에서, 식물 병에 저항성을 나타내는 다양한 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보를 축적함으로써, 이를 이용한 탐색방법을 촉진시키는 것은 시급한 당면 과제라고 할 수 있다.

본 발명은 이와 같은 종래기술 상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 식물 병에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인 오스모틴(Osmotin)을 코딩하는 CAOSM1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이를 이용하여 식물 병에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다.

이를 위한 본 발명은, 감자의 PA35 유전자와 96%, 담배의 PR-5D 유전자와 95.2%, 담배의 NP24 유전자와 77.2%, 토마토의 AP24 유전자와 역시 77.2%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것으로 밝혀진 오스모틴 코딩 유전자 CAOSM1의 염기/아미노산 서열; 및 세균, 화학물질 또는 환경적 스트레스를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CAOSM1 유전자 프로브와 반응시켜 CAOSM1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 식물체 병저항성의 탐색방법을 제공하는 것으로 이루어진다.

본 발명은, 고추세균성점무늬병에 대한 저항성유전자인 CAOSM1 유전자 및 이의 저항성 탐색에의 이용방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 분리한 신규 저항성 관련 유전자 CAOSM1의 유전자/아미노산 서열, 및 이 유전자를 이용하여 저항성 유도 처리시 유도저항성의 발현 여부를 탐색하는 방법에 관한 것이다.

고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)의 CAOSM1 유전자는 고추세균성점무늬병에 대한 방어기작을 가지는 병생성 관련 단백질(PR protein)의 일종인 오스모틴(Osmotin)을 코딩하는 유전자로서, 대부분의 항진균성 단백질 또는 펩타이드(peptide)와 마찬가지로, 16개의 시스테인(Cysteine) 아미노산이 8개의 이황화(disulfide) 결합을 이루어 안정화된 구조를 형성하는 단백질이다.

이와 같은 오스모틴 유전자는 다른 수많은 식물들에서 이미 그 존재가 발견 및 분리되었는데, 이의 발현은 식물 병원균에 의한 감염 뿐만 아니라 비생물적인 요인들, 즉, 물리적인 상처와 염류, 자외선 등의 환경적인 요인들, 여러 가지 식물생장조절물질들을 포함하는 화학물질의 처리에 의해서도 그 발현이 유도되는 것으로 알려져 있으며, 또한, 어떤 식물체로부터 분리된 오스모틴 유전자를 다른 작물에 도입하여 병원균의 침입에 대해 증가된 저항성을 부여하는 방법으로 병저항성 작물의 분자육종 기술에 이용될 수 있음이 밝혀진 바도 있다.

이하, 본 발명의 구성은 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 고추세균성점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 의해 저항성이 유도된 한별고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 각각의 mRNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 여기에서 생성된 DNA 조각을 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지함으로써 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하여 병저항성에 관련될 것으로 추정되는 유전자를 선발하여 클론을 수득하고, 이 클론중 오스모틴 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독(Sequencing)함으로써, CAOSM1로 명명된 고추 한별품종의 오스모틴 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하는 것에 관한 것이다.

다음에, 본 발명은, 상기와 같이 서열이 제공된 CAOSM1 유전자를 이용하여 건전한 고추식물에서 기관 특이적인 오스모틴 발현 여부를 확인함으로써 건전 식물에서는 오스모틴이 발현되지 않는 기관을 선정하고, 병원성 균주 또는 비병원성 균주를 접종한 고추 개체에서 선정된 기관에 대해 상기 CAOSM1 유전자를 프로브로 이용하여 오스모틴 발현 여부를 확인하는 것으로 이루어지는, 저항성 탐색방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 화학물질, 물리적 상처, 환경적 스트레스 등 병원성 세균이 아닌 비생물적 유도방법을 식물체에 적용하고, 이에 대하여 상기 저항성 탐색방법을 이용하여 오스모틴 발현 여부를 확인함으로써, 더 용이하고 시간을 절약할 수 있는 새로운 저항성 탐색/유도 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

이하, 실시예로써 본 발명을 더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것을 뿐, 본 발명의 범위를 이에 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] CAOSM1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정

식물의 병생성 관련 단백질(PR protein)중 하나인 오스모틴(Osmotin) 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 한별품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)에 고추세균성점무늬병의 비병원성균인 BV5-4a(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain BV5-4a)를 접종하고 18시간 동안 습실처리한 후 저항성 병반인 과민성반응이 나타난 식물체를 꺼내어 잎을 수거하였다.

다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction)증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

다음에, 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나이트란막에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추세균성점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하고, 여기에서 생성되는 DNA 조각을 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 상기 cDNA와 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.

하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주가 접종된 식물체의 DNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병저항성에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.

수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 오스모틴(Osmotin) 코딩 유전자임 확인하고 CAOSM1 유전자로 명명하였다.

이 유전자에서 유추한 아미노산 서열을 다른 작물에서 발견된 오스모틴의 아미노산 서열과 비교한 결과, 감자의 PA35 유전자와 96%, 담배의 PR-5D 유전자와 95.2%, 담배의 NP24 유전자와 77.2%, 토마토의 AP24 유전자와 역시 77.2%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것임을 알 수 있었다.

확인된 CAOSM1 유전자의 서열과 그로부터 추론된 아미노산 서열을 도 1에 나타내고 서열목록으로 제출하였다.

[실시예 2] CAOSM1 유전자의 발현 탐색 방법

상기 실시예 1에서 수득한 CAOSM1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 하기와 같이 시험하였다.

먼저, CAOSM1 유전자의 고추식물에서 기관 특이적 발현 양상을 알아보기 위해, 상기 실시예 1에서 수득된 CAOSM1 유전자를 이용하여, 각각 고추의 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 파란열매 및 빨간열매에 대한 노던블러팅(northern blotting)을 수행하였다. 그 결과 CAOSM1 유전자는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 고추의 잎, 줄기, 꽃, 푸른열매에서는 발현되지 않았고, 뿌리와 붉은열매에서는 항상 발현되었다.

따라서, CAOSM1을 코딩하는 저항성 유전자 탐색 시험에는 고추의 잎, 줄기, 꽃 또는 푸른열매를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었는데, 본 발명에서는 잎과 줄기를 사용하였다.

다음에, 상기 실시예 1에서 수득된 CAOSM1 유전자를 이용한 구체적인 저항성 탐색방법을 제공하기 위하여, 하기와 같이 고추세균성점무늬병균, 고추탄저병균 및 고추역병균에 대한 노던블러팅(Northern Blotting) 시험을 수행하였다.

각 노던블러팅 수행시 25S 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.

[단계 1]

고추 세균성 점무늬병균 중 식물체와 친화적 반응을 나타내는 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 1분지기 고추식물체 잎의 뒷면에 배큠인필트레이션(vacuum-infiltration) 방법으로 접종하고, 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리하였다.

접종 6, 12, 18, 24, 30 시간 후에 각각 잎을 채취하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음에, 실시예 1에서 수득된 CAOSM1 유전자를 ³²P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (Dextran Sulfate)]에 첨가하고 65℃에서 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이렇게 ³²P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이트란막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이트란막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 ³²P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

이와 같이 고추세균성점무늬병균의 병원성균주 접종 후 나타나는 친화적반응과 비병원성균주 접종 후 나타나는 불친화적반응에서 CAOSM1 유전자의 발현 양상을 도 3a에 나타내었다.

시험 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, CAOSM1 유전자는 친화적 반응에서 접종 후 6시간부터 발현되기 시작하여 18시간이 되면서 그 발현 양이 증가하였으며, 이 발현은 접종 후 30 시간 까지 유지되었다.

불친화적 반응에서 CAOSM1 유전자의 발현은 친화적 반응에서처럼 접종 후 6시간부터 나타나지만 이미 그 발현 양이 친화적 반응에서보다 상당히 증가된 상태에 도달하였는데, 불친화적 반응에서의 CAOSM1 유전자의 발현은 6시간 이전에 나타나는 것으로 생각되었다. 접종 후 12 시간이 되면 그 발현이 상당히 증가하고 이 시간까지 mRNA의 축적량은 친화적 반응에서의 mRNA 축적량보다 훨씬 많았다. 접종 후 18 시간이 되면 불친화적 반응에서는 비병원성 세균의 감염에 의해 고추식물의 잎 조직에서 과민성 반응(hypersensitive response)이 나타났는데, 이때 CAOSM1 유전자의 발현은 잎 조직의 괴사와 시간을 같이하여 줄어들었다.

이상과 같은 결과로 볼 때, 식물-병원균 상호 작용에서 나타나는 병방어관련유전자의 전형적인 발현 양상과 마찬가지로, CAOSM1 유전자는 친화적 반응에서보다 불친화적반응에서 더욱 빠르고 강하게 발현됨을 알 수 있었다.

[단계 2]

고추 탄저병을 접종하기 위하여, 고추탄저병균 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)를 오트밀 배지에서 5일간 관처리 조건에서 배양한 후, 포자를 수거하여 5×10⁵분생포자/ml의 농도로 현탁액을 제조한 다음 4엽기 및 8엽기 고추식물에 분무 살포하여 접종하고, 접종한 식물을 98% 상대 습도가 유지되는 습실에서 36시간 동안 배양하여 병 감염이 용이한 조건을 만들어 주었다.

접종 12, 24, 36, 48, 72 시간 후에 접종된 고추 잎을 채취하여 RNA를 추출하고, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써 CAOSM1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

시험 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 4엽기식물에서는 12시간에 약간의 발현이 검출된 후 72시간까지 완만한 발현의 증가를 나타내었으며, 8엽기 식물에서는 12시간에 4엽기식물에서보다 강한 발현을 보인 후 그 증가 정도가 4엽기 식물에서보다 높게 나타나 접종후 72시간에 이르면 매우 강한 발현을 나타내었다.

이렇게 볼 때, 고추 탄저병균의 감염에 대한 고추식물의 반응은 생육기에 따라 다르게 나타남을 알 수 있으며, 고추식물에 나타나는 탄저병에 대한 성체 저항성에 이 오스모틴 유전자 CAOSM1이 기여하고 있음을 알 수 있었다.

[단계 3]

고추역병균을 접종하기 위하여, 고추역병균 파이토프소라 갭시시(Phytophthora capsici)의 병원성 균주 S197과 비병원성균주 CBS178.26을 오트밀 배지에서 28℃하에 7일간 배양한 후 3일간 광처리하여 유주자낭을 형성시키고, 여기에 물을 부어 4℃에서 1시간 동안 처리한 다음, 상온에서 1시간 동안 배양하여 유주자가 유주낭으로부터 유출되도록 하였다.

이렇게 유출된 유주자를 이용하여 10⁵ 유주자/ml 농도의 유주자 현탁액을 준비하고, 이를 살균된 솜에 적셔 상처를 낸 6엽기 고추식물의 줄기에 감고 셀로판테이프를 감아 습한 상태를 유지시켜 주었다.

접종 12, 24, 36, 48 시간 후에 각각 고추 줄기를 채취하여 RNA를 추출하고, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써 CAOSM1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.

시험 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 친화적 반응에서 12시간에 발현되나 불친화적인 반응에서는 발현되지 않았으며, 그 이후 24-48시간에 친화적 반응과 불친화적 반응에서의 CAOSM1의 발현의 차이는 나타나지 않았다.

[단계 4]

오스모틴 유전자 CAOSM1의 병원균에 의한 유도 발현이 전신적으로 나타나는 지를 알아보기 위하여, 고추세균성점무늬병균인 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아의 병원성 또는 비병원성 균주와 고추에 병을 일으키지 못하는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)를 고추의 1엽에 접종하였다.

접종 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20시간 후에 각각 접종한 잎과 접종하지 않은 제 2엽에서 RNA를 추출한 후, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써 CAOSM1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

시험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 고추세균성점무늬병의 친화적, 불친화적 반응과 비병원성 세균인 슈도모나스 플루오레슨스의 감염에 의하여 국부적, 전신적으로 발현되는 양상을 보임으로써, 이 유전자가 국부적 획득 저항성뿐만 아니라, 전신적 획득 저항성의 분자적인 검정 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

[실시예 3] 화학적 유도체에 의한 CAOSM1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CAOSM1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여, 에틸렌(ethylene), 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate) 및 엡시식 산(abscisic acid)에 대하여 저항성 유도 시험을 수행하였다.

각각의 저항성 유도 시험은 4 엽기의 고추식물을 이용하여 수행되었으며, 각 노던블러팅 수행시 25S 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.

에틸렌 처리를 위해서는, 고추 식물을 500 mL의 유리병에 옮기고 뚜껑을 막은 후, 뚜껑에 있는 실리콘에 5 μl/l의 에틸렌을 주입하였다.

메틸자스모네이트 처리를 위해서는, 25 μM 농도의 메틸자스모네이트를 고추식물의 잎과 줄기에 골고루 엽면살포한 후 비닐로 싸 주었다.

앱시식 산은 100 μM의 농도로 준비하고 폿트에 있는 고추식물을 뽑아 그 뿌리를 용액에 담그었다.

각각의 화학물질을 처리하고 에틸렌과 메틸자스모네이트는 2, 6, 12, 18, 24시간, 앱시식산은 1, 2, 6, 12, 18, 24시간 후에 각각 고추식물의 잎과 줄기를 채취하여 이로부터 RNA를 분리한 다음, 상기 실시예 2, 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써 CAOSM1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

시험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 식물병방어반응에 관련되어 있는 식물체내의 식물 호르몬이자 신호 전달 물질(signal molecules)의 일종인 에틸렌(ethylene), 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 엡시식 산(abscisic acid)의 외부적인 처리에 의하여 CAOSM1 유전자의 발현이 강하게 유도됨이 관찰되었다.

에틸렌의 경우, CAOSM1 유전자는 처리 2시간에 발현된 후, 18시간에 가장 강하게 발현되고, 24시간이 되면 그 발현이 약간 감소하는 경향을 보였고, 메틸 자스모네이트의 경우, CAOSM1 유전자는 2시간에 발현 후, 6시간부터 24시간까지 강한 발현을 나타내었으며, 앱시식산의 경우, CASOM1 유전자가 잎 조직에서는 발현되지 않았지만 줄기에서는 1시간 후부터 강하게 발현되어 18시간까지 지속되고, 24시간에 약간 감소하였다.

[실시예 4] 환경적 스트레스에 의한 CAOSM1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CAOSM1 유전자가 환경적 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[단계 1]

본 발명의 CAOSM1 유전자가 염 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

염도별 CAOSM1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 0, 1, 10, 100, 200 mM의 염화나트륨 수용액에 4엽기 고추식물체의 뿌리를 담그어 흡수시키는 방법으로 염을 처리하고, 18시간 경과 후 그 잎과 줄기를 수거하였다. 이중 200mM의 염화나트륨에 처리한 고추식물은, 시간별 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 처리후 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간째에 각각의 잎과 줄기를 수거하였다.

수거된 각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 2의 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 염 스트레스 처리후 CAOSM1의 시간별, 농도별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 6a에 나타내었다.

시험 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 염화나트륨 농도가 커지면 잎과 줄기 모두에서 오스모틴 유전자가 유도됨을 알 수 있었는데, 특히 잎의 경우, CAOSM1의 발현은 100-200mM의 고농도의 NaCl 처리에서만 나타나며 200mM NaCl의 처리시 처리 12시간에 CAOSM1의 mRNA가 발현되는 것으로 나타났고, 줄기의 경우, 처리 1시간 만에 발현이 되어 24시간까지 매우 강한 발현을 보이며 급격하게 증가하는 것으로 나타남으로써, 결과적으로, CAOSM1의 발현은 고추 식물의 잎 조직에서보다 줄기 조직에서 매우 강하게 발현됨을 알 수 있었다.

[단계 2]

본 발명의 CAOSM1 유전자가 건조 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

4엽기 고추 식물이 심겨 있는 폿트에 물을 주지 않고 계속 관찰을 하였으며, 시들음 증상이 나타나는 첫날을 1일로 하여 2, 3, 4일이 지난 후 고추 식물의 잎과 줄기 조직에서 샘플을 채취하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 2의 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 건조 스트레스 처리 후 시간경과에 따른 CAOSM1의 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.

시험 결과, 고추 식물에 물을 주지 않은 채로 식물 생육상에 두면 7일 만에 처음으로 위조증상이 나타났으며, 도 6b에 나타난 바와 같이, 잎에서는 건조 4일 만에 약한 발현을 보였으나 줄기 조직에서는 위조된지 1-3일 동안 매우 강한 발현을 나타내다가 4일째 되어서는 약간 그 유전자의 발현이 줄어들었다.

[단계 3]

본 발명의 CAOSM1 유전자가 저온 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

4엽기 고추 식물을 4℃로 유지되는 항온실에 넣고 1, 2, 6, 12, 18, 24시간이 지난 후 고추 식물의 잎과 줄기 조직에서 샘플을 채취하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 2의 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 저온 스트레스 처리 후 시간경과에 따른 CAOSM1의 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 6c에 나타내었다.

시험 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이, 잎과 줄기 모두에서 CASOM1 유전자가 활성화되었는데, 잎에서의 유전자 발현이 18시간에 일시적으로 나타났다 24시간에 줄어드는 반면, 줄기에서는 이 유전자의 발현이 처음 1시간에 나타나 꾸준하게 증가하여 24시간까지 강한 발현을 나타내었다.

[단계 4]

본 발명의 CAOSM1 유전자가 상처 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추식물에 상처 스트레스를 처리하기 위해 식물체의 잎을 핀으로 찔러 잎 전체에 걸쳐 상처를 낸 후 각각 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 시간이 지나 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 2 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 상처 스트레스 처리 후 시간경과에 따른 CAOSM1의 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 6d에 나타내었다.

시험 결과, 도 6d에 나타난 바와 같이, CAOSM1 유전자의 mRNA가 상처에 의해서도 잎에 축적되었는데, 이의 발현은 상처를 받은 제 1엽보다 상처를 입지 않은 제 2엽에서 강하게 나타남으로써, CAOSM1 유전자가 병원균 감염과 더불어 물리적인 상처에 의해서도 전신적인 발현을 보임을 알 수 있었다.

이상과 같이 본 발명이 완성됨으로써, 감자의 PA35 유전자와 96%, 담배의 PR-5D 유전자와 95.2%, 담배의 NP24 유전자와 77.2%, 토마토의 AP24 유전자와 역시 77.2%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것으로 밝혀진 오스모틴 코딩 유전자 CAOSM1의 염기/아미노산 서열; 및 세균, 화학물질 또는 환경적 스트레스를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CAOSM1 유전자 프로브와 반응시켜 CAOSM1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 식물체 병저항성의 탐색방법이 제공될 수 있게 되었다.

본 발명이 완성됨으로써, 식물 병에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인 오스모틴(Osmotin)을 코딩하는 CAOSM1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이를 이용하여 식물 병에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공할 수 있게 된 것이다.

도 1은 본 발명 CAOSM1 유전자의 염기서열과 이 염기서열에 따른 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 2는 건전한 고추식물의 각 기관별 오스모틴 유전자 CAOSM1 발현을 나타낸 것이고,

도 3a는 고추 한별품종에 고추세균성점무늬병을 일으키는 병원성 또는 비병원성 균주를 처리한 후 시간 경과에 따라 나타나는 CAOSM1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이고,

도 3b는 고추 한별품종에 탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 코코데스를 식물에 처리한 후 잎에서 시간 경과에 따라 나타나는 CAOSM1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이고,

도 3c는 고추 한별품종에 고추역병을 일으키는 파이토프소라 캡시시의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물에 처리한 후 시간 경과에 따라 나타나는 CAOSM1유전자의 발현 양상을 나타낸 것이고,

도 4는 고추세균성점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아의 병원성 또는 비병원성 균주와 고추에 병을 일으키지 못하는 세균인 슈도모나스 플루오레슨스를 처리한 후 접종 잎과 접종하지 않은 제 2엽에서의 CAOSM1의 발현 양상을 나타낸 것이고,

도 5는 에틸렌, 메틸 자스모네이트, 엡시식 산에 의한 오스모틴 유전자 CAOSM1의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

도 6a는 염화나트륨 스트레스를 고추식물에 처리한 후 잎과 줄기에서 발현되는 오스모틴 유전자 CAOSM1의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

도 6b는 건조 스트레스를 고추식물에 처리한 후 잎과 줄기에서 발현되는 오스모틴 유전자 CAOSM1의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

도 6c는 저온 스트레스를 고추식물에 처리한 후 잎과 줄기에서 발현되는 오스모틴 유전자 CAOSM1의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

도 6d는 상처 스트레스를 고추식물에 처리한 후 잎과 줄기에서 발현되는 오스모틴 유전자 CAOSM1의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.

<110> KOREA CHUNGANG EDUCATIONAL FOUNDATION <120> CAOSM1 Gene Coding Osmotin and Screening Method of Plant Disease Using It <130> 01 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 985 <212> DNA <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <400> 1 gcacgatggg tcacttgaca acttgtttag tgttcttcct ccttgccttt gtgacttaca 60 cttatgcatc tggtgtattt gaggtccaca acaactgccc ttacaccgta tgggccgcag 120 caaccccggt gggtggtggc aaacttctcg agagaggtca gagttggtgg ttctgggccc 180 cgccgggcac taaaatggca cgtatatggg gtcgtactaa ttgcaacttt gatggtgctg 240 gtagaggttg gtgccagact ggtgattgtg gtggggtctt agaatgcaaa ggttggggta 300 aaccaccaaa caccttagct gaatacgcct tgaaccaatt cagcaaccta gatttctggg 360 acatttcagt aatcgatgga ttcaacatcc ctatgtcttt tggaccaact aagcctgggc 420 ctggaaaatg tcatccaatt caatgtgttg ctaatataaa tggtgaatgc cctggttcac 480 ttagggtacc tggtggatgt aacaacccat gtaccacatt tggaggacaa caatattgtt 540 gcacccaagg tccatgtggt ccaacggact tgtcaagatt tttcaaacaa agatgtcctg 600 atgcatatag ttaccctcaa gatgatccaa caagtacatt tacttgccaa agttggacta 660 ctgattacaa agttatgttc tgtccttatg gttctactca caatgaaaca tcaagtttcc 720 cattggagtt gcctacaagt acacatgaag ttgcttaagt aaattcatga gtgaggtagc 780 catctctttt tgttcaattt ggttgagttt tgtcataaag ccttgattac cccatttctt 840 ttagtttgtt ttttaggtgg taagttttga aaacggttaa tcactcaatc acaattgtac 900 tttgtgttac acatgatgtt ttaaattttt actcaaagtc aaagtgcatt tttagaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 985 <210> 2 <211> 251 <212> PRT <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <400> 2 Met Gly His Leu Thr Thr Cys Leu Val Phe Phe Leu Leu Ala Phe Val 1 5 10 15 Thr Tyr Thr Tyr Ala Ser Gly Val Phe Glu Val His Asn Asn Cys Pro 20 25 30 Tyr Thr Val Trp Ala Ala Ala Thr Pro Val Gly Gly Gly Lys Leu Leu 35 40 45 Glu Arg Gly Gln Ser Trp Trp Phe Trp Ala Pro Pro Gly Thr Lys Met 50 55 60 Ala Arg Ile Trp Gly Arg Thr Asn Cys Asn Phe Asp Gly Ala Gly Arg 65 70 75 80 Gly Trp Cys Gln Thr Gly Asp Cys Gly Gly Val Leu Glu Cys Lys Gly 85 90 95 Trp Gly Lys Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asn Gln Phe 100 105 110 Ser Asn Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Val Ile Asp Gly Phe Asn Ile 115 120 125 Pro Met Ser Phe Gly Pro Thr Lys Pro Gly Pro Gly Lys Cys His Pro 130 135 140 Ile Gln Cys Val Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys Pro Gly Ser Leu Arg 145 150 155 160 Val Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys Thr Thr Phe Gly Gly Gln Gln 165 170 175 Tyr Cys Cys Thr Gln Gly Pro Cys Gly Pro Thr Asp Leu Ser Arg Phe 180 185 190 Phe Lys Gln Arg Cys Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gln Asp Asp Pro 195 200 205 Thr Ser Thr Phe Thr Cys Gln Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Lys Val Met 210 215 220 Phe Cys Pro Tyr Gly Ser Thr His Asn Glu Thr Ser Ser Phe Pro Leu 225 230 235 240 Glu Leu Pro Thr Ser Thr His Glu Val Ala *** 245 250

Claims

고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 오스모틴(Osmotin)을 코딩하는 하기의 유전자 CAOSM1의 염기 서열.

1 GCACG

6 ATG GGT CAC TTG ACA ACT TGT TTA GTG TTC

36 TTC CTC CTT GCC TTT GTG ACT TAC ACT TAT

66 GCA TCT GGT GTA TTT GAG GTC CAC AAC AAC

96 TGC CCT TAC ACC GTA TGG GCC GCA GCA ACC

126 CCG GTG GGT GGT GGC AAA CTT CTC GAG AGA

156 GGT CAG AGT TGG TGG TTC TGG GCC CCG CCG

186 GGC ACT AAA ATG GCA CGT ATA TGG GGT CGT

216 ACT AAT TGC AAC TTT GAT GGT GCT GGT AGA

246 GGT TGG TGC CAG ACT GGT GAT TGT GGT GGG

276 GTC TTA GAA TGC AAA GGT TGG GGT AAA CCA

306 CCA AAC ACC TTA GCT GAA TAC GCC TTG AAC

336 CAA TTC AGC AAC CTA GAT TTC TGG GAC ATT

366 TCA GTA ATC GAT GGA TTC AAC ATC CCT ATG

396 TCT TTT GGA CCA ACT AAG CCT GGG CCT GGA

426 AAA TGT CAT CCA ATT CAA TGT GTT GCT AAT

456 ATA AAT GGT GAA TGC CCT GGT TCA CTT AGG

486 GTA CCT GGT GGA TGT AAC AAC CCA TGT ACC

516 ACA TTT GGA GGA CAA CAA TAT TGT TGC ACC

546 CAA GGT CCA TGT GGT CCA ACG GAC TTG TCA

576 AGA TTT TTC AAA CAA AGA TGT CCT GAT GCA

606 TAT AGT TAC CCT CAA GAT GAT CCA ACA AGT

636 ACA TTT ACT TGC CAA AGT TGG ACT ACT GAT

666 TAC AAA GTT ATG TTC TGT CCT TAT GGT TCT

696 ACT CAC AAT GAA ACA TCA AGT TTC CCA TTG

726 GAG TTG CCT ACA AGT ACA CAT GAA GTT GCT

756 TAA

759 GTAAA TTCAT GAGTG AGGTA GCCAT CTCTT

789 TTTGT TCAAT TTGGT TGAGT TTTGT CATAA

819 AGCCT TGATT ACCCC ATTTC TTTTA GTTTG

849 TTTTT TAGGT GGTAA GTTTT GAAAA CGGTT

879 AATCA CTCAA TCACA ATTGT ACTTT GTGTT

909 ACACA TGATG TTTTA AATTT TTACT CAAAG

939 TCAAA GTGCA TTTTT AGAAA AAAAA AAAAA

969 AAAAA AAAAA AAAAA AA
제 1항 기재의 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul) 유래 식물병 저항성 오스모틴(Osmotin) 유전자 CAOSM1에 의해 코딩되는 하기의 아미노산 서열.

1 M G H L T T C L V F

11 F L L A F V T Y T Y

21 A S G V F E V H N N

31 C P Y T V W A A A T

41 P V G G G K L L E R

51 G Q S W W F W A P P

61 G T K M A R I W G R

71 T N C N F D G A G R

81 G W C Q T G D C G G

91 V L E C K G W G K P

101 P N T L A E Y A L N

111 Q F S N L D F W D I

121 S V I D G F N I P M

131 S F G P T K P G P G

141 K C H P I Q C V A N

151 I N G E C P G S L R

161 V P G G C N N P C T

171 T F G G Q Q Y C C T

181 Q G P C G P T D L S

191 R F F K Q R C P D A

201 Y S Y P Q D D P T S

211 T F T C Q S W T T D

221 Y K V M F C P Y G S

231 T H N E T S S F P L

241 E L P T S T H E V A

251 *
세균 또는 화학물질을 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 제 1항 기재의 CAOSM1 유전자 프로브와 반응시켜 CAOSM1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는,

식물체의 병저항성 탐색방법.
제 3항에 있어서,

상기 세균은 고추세균성점무늬병, 고추탄저병 또는 고추역병의 병원성 또는 비병원성 세균중 어느 하나임을 특징으로 하는,

식물체의 병저항성 탐색방법.
환경적 스트레스 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 제 1항 기재의 CAOSM1 유전자 프로브와 반응시켜 CAOSM1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는,

식물체의 병저항성 탐색방법.
제 5항에 있어서,

상기 환경적 스트레스는 염 스트레스, 건조 스트레스, 저온 스트레스 또는 상처 스트레스중 어느 하나임을 특징으로 하는,

식물체 병저항성 탐색방법.